PLOS ONE: miR-30b, régulée à la baisse dans le cancer gastrique, favorise l'apoptose et supprime la croissance des tumeurs par le ciblage Plasminogen Activator Inhibitor-1

Résumé

Contexte

Le cancer gastrique est l'un des la plupart des maladies malignes courantes dans le monde. De nouvelles preuves ont montré que les microARN (miARN) sont associés au développement et la progression tumorale. Nos études antérieures ont révélé que H. pylori de l'infection était capable d'induire une altération de l'expression de miR-30b dans les cellules épithéliales gastriques. Cependant, on sait peu sur le rôle potentiel de miR-30b dans le cancer gastrique.

Méthodes

Nous avons analysé l'expression de miR-30b dans des lignées cellulaires de cancer gastrique et les tissus de cancer de l'estomac humain. Nous avons examiné l'effet de mimétiques miR-30b sur l'apoptose des cellules cancéreuses gastriques in vitro par cytométrie de flux (FCM) et la caspase 3/7 des essais d'activité. Nude modèle de xénogreffe de souris a été utilisé pour déterminer si miR-30b est impliqué dans la tumorigenèse du cancer gastrique. La cible de miR-30b a été identifié par l'analyse bioinformatique, dosage de la luciférase et Western blot. Enfin, nous avons effectué l'analyse de corrélation entre miR-30b et son expression cible dans le cancer gastrique.

Résultats

miR-30b était significativement régulée à la baisse dans les cellules de cancer gastrique et les tissus de cancer gastrique humain. l'expression forcée de miR-30b a promu l'apoptose de cellules de cancer gastrique in vitro, et miR-30b pourrait inhiber de manière significative la tumorigénicité d'un cancer gastrique, en augmentant la proportion de l'apoptose des cellules cancéreuses in vivo. De plus, l'activateur du plasminogène inhibiteur-1 (PAI-1) a été identifié comme cible potentielle de miR-30b et miR-30b niveau était inversement corrélée avec l'expression du PAI-1 dans le cancer gastrique. En outre, le silençage de PAI-1 était capable de phénocopie l'effet de miR-30b surexpression sur la régulation de l'apoptose des cellules cancéreuses, et la surexpression de PAI-1 pourrait supprimé pour effet de favoriser l'apoptose des cellules par miR-30b, ce qui indique le PAI-1 est potentiellement impliqués dans l'apoptose miR-30b-induite sur les cellules cancéreuses.

Conclusion

miR-30b peut fonctionner comme un gène suppresseur de tumeur dans le cancer gastrique nouveau en ciblant le PAI-1 et de régulation de l'apoptose cellules cancéreuses. miR-30b pourrait servir de biomarqueur potentiel et cible thérapeutique contre le cancer gastrique

Citation:. Zhu E-D, Li N, Li B-S, Li W, Zhang W-J, Mao X-H, et al. (2014) miR-30b, régulée à la baisse dans le cancer gastrique, favorise l'apoptose et supprime la croissance des tumeurs par le ciblage Plasminogen Activator Inhibitor-1. PLoS ONE 9 (8): e106049. doi: 10.1371 /journal.pone.0106049

Editeur: Gerolama Condorelli, Université Federico II de Naples, Italie, Italie

Reçu: 7 mai 2014; Accepté le 28 Juillet 2014; Publié le 29 Août, 2014

Droit d'auteur: © 2014 Zhu et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données:. La auteurs confirment que toutes les données sous-jacentes les résultats sont entièrement disponibles sans restriction. Toutes les données pertinentes sont dans le ses fichiers de renseignements à l'appui du papier et

Financement:. Ce travail a été soutenu par le National Natural Science Foundation de Chine (n ° 81202310), Fondation de la recherche scientifique Innovation de la troisième université médicale militaire (No. 2009XQN20). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique est responsable d'environ 738 000 décès dans le monde par an, et il a été reconnu comme la troisième principale cause de décès lié au cancer chez les hommes [1]. le diagnostic précoce et le traitement ont conduit à d'excellentes attentes pour la survie à long terme et de bon pronostic, alors que les perspectives pour les patients atteints de cancer gastrique avancé reste faible. Comme d'autres cancers, le développement du cancer gastrique est considérée comme multifactorielle. Helicobacter pylori (H. Pylori)
infection a été reconnu comme un important déclencheur du cancer gastrique [2]. Bien que de nombreuses modifications génétiques et épigénétiques ont été rapportés dans le cancer gastrique, le mécanisme moléculaire qui sous-tend le développement du cancer gastrique reste incertaine.

microARN (miARN) sont de petits ARN non codants qui régulent l'expression des gènes posttranscriptionally. miARN mature peut se lier spécifiquement à 3 'UTR de l'ARNm cible cellulaire à son tour, déclenche la dégradation de l'ARNm ou l'inhibition de la traduction [3], [4]. miARN agissent comme des régulateurs clés dans une grande variété de processus biologiques, y compris le développement, la différenciation cellulaire, l'apoptose, le métabolisme et la transduction du signal [5], [6]. Il a été démontré que 50% des miARN sont souvent situés dans des régions génomiques associées au cancer ou dans des sites fragiles [7]. L'évidence croissante a montré que miARN aberrants expression est en corrélation avec divers cancers humains et indique que miARN peuvent fonctionner comme des oncogènes ou des gènes suppresseurs de tumeur [8] - [10]. Récemment, un nombre important de miARN déréglementés dont miR-106b-25 cluster, miR-21, miR-218, miR-7, et miR-335 ont été identifiés comme des modulateurs de croissance cellulaire, l'apoptose, la migration ou l'invasion dans le cancer gastrique le développement [11] - [15]. Ces résultats suggèrent que les miARN peuvent jouer un rôle crucial dans la pathogenèse du cancer gastrique.

Nos études antérieures ont révélé que H. pylori de l'infection était capable d'induire l'expression altérée des miARN dans les cellules épithéliales gastriques dont miR-155, miR-146a et miR-30b, miARN peut fonctionner en tant que nouveaux régulateurs négatifs pour affiner H. l'inflammation induite par des pylori [16], [17]. De plus, nous avons démontré que miR-146a peut jouer un rôle potentiel dans le développement du cancer gastrique par la modulation de la prolifération et l'apoptose des cellules cancéreuses gastriques [18]. Notamment, nous avons aussi trouvé miR-30b pourrait réguler le processus de autophagie pendant H. pylori
persistent infection, ce qui contribue à la persistance de la H. Les infections pylori de [19]. Toutefois, le rôle de miR-30b dans le cancer gastrique est encore largement inconnu.

inhibiteur de l'activateur du plasminogène 1 (PAI-1) est le principal inhibiteur de sérine protéase de type tissu (t-PA) et de type urokinase ( u-PA), activateur du plasminogène, et joue donc un rôle important dans le système plasminogène-plasmine [20]. Des études précédentes ont illustré le PAI-1 est un facteur de mauvais pronostic dans plusieurs tumeurs communes, et est associée à une invasion et les métastases du cancer [21]. Récemment, de nombreux groupes ont également ont montré que le PAI-1 peut favoriser la croissance tumorale par l'inhibition de l'apoptose cellulaire. Par exemple, l'addition d'un type sauvage stable de PAI-1 à la lignée cellulaire du cancer de la prostate humain PC-3, la lignée cellulaire de leucémie promyélocytaire humaine HL-60, et même des cellules non tumorales, a entraîné une inhibition significative de l'apoptose [22] . Lorsqu'elle est injectée par voie sous cutanée dans des souris nude avec PAI-1 surexprimant cellules de fibrosarcome murin, les tumeurs ont été rapidement mis en place, tandis que PAI-1 des cellules déficientes avaient un tumorigénicité supprimé [23]. Un autre rapport a montré que l'inhibition génétique et pharmacologique de PAI-1 dans des lignées cellulaires tumorales humaines (HT-1080, A549, HCT-116 et MDA-MB-231) a augmenté l'apoptose spontanée et de façon intéressante, implanté PAI-1 knock-down HT- 1080 cellules PAI-1 souris knock-out ont entraîné une diminution de la tumorigenèse et la survie prolongée par comparaison avec les souris de contrôle [24]. Ces études fournissent des preuves importantes que le PAI-1 exerce un rôle protecteur contre l'apoptose des cellules tumorales.

Dans l'étude actuelle, nous avons découvert que miR-30b était significativement régulée à la baisse dans les cellules de cancer de l'estomac et des tissus tumoraux. L'expression ectopique de miR-30b pourrait favoriser l'apoptose des cellules de cancer gastrique in vitro, et miR-30b pourrait inhiber de manière significative la tumorigénicité des cancers gastriques chez nue modèle de xénogreffe de souris. Par ailleurs, le PAI-1 a été identifié comme étant les cibles potentielles de miR-30b et miR-30b peut induire l'apoptose et inhiber la croissance tumorale en réprimant l'expression de PAI-1. Nos résultats suggèrent que miR-30b peut fonctionner comme un gène suppresseur de tumeur roman dans le cancer gastrique et peut être une cible thérapeutique potentielle pour le cancer gastrique.

Déclaration d'éthique de matériaux et méthodes

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvés par le comité d'éthique et expérimental animal de la troisième université médicale militaire. Toute chirurgie animale a été réalisée sous anesthésie pentobarbital de sodium, et tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance. L'étude portant sur des échantillons de tissus a été approuvé par le Comité d'éthique à la troisième université médicale militaire, et le consentement éclairé a été obtenu de tous les patients avant leur participation.

Les spécimens de tissus

Au total, les tissus de cancer gastrique et les tissus non tumoraux adjacents ont été obtenus chez des patients atteints de cancer gastrique primaire subissant une gastrectomie radicale à l'hôpital Sud-Ouest, troisième université médicale militaire, la Chine et les caractéristiques clinico-pathologiques des patients atteints de cancer gastrique sont résumées dans le tableau 1. Après l'ablation chirurgicale, les tissus ont été congelés immédiatement dans de l'azote liquide et stockés à -80 ° C. L'étude a été approuvée par le comité d'éthique à la troisième université médicale militaire, et le consentement éclairé a été obtenu de tous les patients avant la participation.

Les lignées cellulaires et la culture
cellulaire

Toutes les lignées cellulaires utilisées dans cette étude ont été obtenus à partir de Shanghai type Culture Collection de l'Académie chinoise des sciences (Shanghai, Chine), les humains gastriques cellules cancéreuses lignes AGS a été cultivé dans le F12 de Ham (Hyclone) moyenne avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS), d'autres lignées cellulaires de cancer gastrique MKN45 , HGC-27, BGC-823, CGS-7901 et humaines embryonnaires de rein (HEK), des cellules 293 ont été cultivées dans du DMEM (Hyclone) avec 10% de FBS, ils ont tous été maintenues dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO _{2 à 37 ° C, comme décrit précédemment.}

RT-PCR quantitative

ARN total a été extrait avec du réactif Trizol (Invitrogen), suivi d'une transcription inverse en utilisant des dosages TaqMan miARN (Ambion), avec U6 petits ARN nucléaire comme une référence normalisée interne. Les réactions qRT-PCR ont été effectuées en utilisant les paramètres suivants: 95 ° C pendant 2 min suivi de 40 cycles de 95 ° C pendant 15 s et 60 ° C pendant 30 s. qRT-PCR analyse de l'ARNm de PAI-1 ont été effectuées en utilisant des kits PrimeScript RT-PCR (Takara), selon les paramètres suivants: 95 ° C pendant 30 s, suivie par 40 cycles de 95 ° C pendant 5 s, 60 ° C, pendant 5 s et 72 ° C pendant 30 s. Le niveau de l'ARNm de β-actine a été utilisée comme contrôle interne. Les séquences des amorces utilisées sont présentées dans le tableau 2.

Nord
blot

de petite taille ARNs a été isolé en utilisant le kit d'isolation d'ARN MIRVANA (Ambion). Trois paires d'échantillons cliniques ont été choisis au hasard parmi les 21 patients pour l'analyse Northern blot ultérieure. Northern blot a été réalisée selon la procédure standard à celle décrite précédemment [17]. Les sondes d'ADN antisens d'oligonucléotides utilisés pour la détection miR-30b et U6 snRNA sont les suivantes: miR-30b (5'- AGCTGAGTGTAGGATGTTTACA-3 ') et U6 (5'-ATATGGAACGCTTCACGAATT-3')

transfection des cellules.

imite miR-30b, brouillés miR-commande, duplex miR-30b chimiquement modifiées (agomir), miR-contrôle chimiquement modifiées brouillé, PAI-1 siRNA, ou siRNA contrôle négatif ont été achetés chez GenePharma (Shanghai GenePharma Co . Ltd., Chine). PAI-1 (Serpine1) Human ADNc ORF Clone a été acheté chez Origène (Origene Technologies, Beijing, Chine). Les transfections ont été effectuées en utilisant Lipofectamine 2000 (Invitrogen) selon le protocole du fabricant.

Cellule apoptose dosage par la FCM

cellules SGC-7901 ou HGC-27 ont été ensemencées dans une plaque de 12 puits à une appropriée densité et cultivées à 30% de confluence après 24 h. Ensuite, les cellules ont été transfectées avec mimétiques miR-30b ou miR-commande et le milieu a été remplacé par du DMEM exempt de sérum pendant 48 heures. Pour les expériences de co-transfection avec miR-30b et de PAI-1 vecteur exprimant, les cellules CGT-7901 ont été transfectées avec mimétiques miR-commande ou de miR-30b, puis avec PAI-1 clone vecteur humain ADNc ORF (indiquée comme PAI-1) ou vecteur vide 24 h plus tard. 24 h après le vecteur transfection, le milieu a été remplacé avec du DMEM exempt de sérum pendant 24 heures. Finalement, les cellules ont été appliqués à l'analyse de l'apoptose. Pour l'analyse de la FCM, un kit Annexin V-FITC Apoptosis Detection I (BD Pharmingen) a été utilisé, puis analysées par cytométrie de flux (BD FACSCantoTM II).

Caspase-Glo 3/7 Assay

l'activité de la caspase-3/7 a été détectée en utilisant la caspase-Glo 7/3 Assay (Promega). Ajouter 100 pi de Caspase-Glo 3/7 réactif à la plaque blanche à 96 puits à parois, le contenu des puits mélanger délicatement, puis incuber les puits à température ambiante pendant 30 min. La luminescence a été détectée en utilisant la Glomax-96 luminomètre pour microplaques (Promega).

essais de tumorigénicité chez

Les souris de souris nude utilisé dans cette expérience ont été maintenues dans des conditions exemptes d'agents pathogènes spécifiques. Viable mimics- miR-30b et miR-témoins transfectées des cellules CGT-7901 (1 x 10 ^{6) ont été mis en suspension dans 100 pl de PBS et ensuite injecté par voie sous- cutanée dans chaque côté du flanc postérieur de la même femelle BALB /c athymiques souris nude à 4 à 6 semaines d'âge, comme décrit précédemment [25]. La croissance tumorale et de l'état, y compris la santé générale et le comportement des souris ont été examinés tous les trois jours pendant 4 semaines. Les souris tumorales beared ne présentent pas de signes de douleur ou de détresse tels que la perte de poids ou des changements de comportement, de sorte que toutes les souris ont été sacrifiées par CO _{2 asphyxie au jour 28 post-injection. Le volume de tumeur (V) a été surveillée en mesurant la longueur (L) et la largeur (W) avec des pieds à coulisse et calculé avec la formule (L x W 2) x 0,5.}}

coloration TUNEL

Les tumeurs ont été récoltées à 26 jours, et fixé dans une solution de formaldéhyde à 10%, puis noyé dans de la paraffine. Sections (5 um d'épaisseur) qui avait été déparaffinées et réhydratées ont été colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine. les cellules tumorales apoptotiques ont été colorées par la méthode in situ terminale désoxynucléotidyltransférase médiée dUTP nick étiquetage final (TUNEL) à l'aide d'un kit in situ de détection de mort cellulaire (POD, Roche Diagnostics Co.). Contrôle négatif a été soumis à la même coloration pour TUNEL sans TdT. Les images ont été recueillies à l'aide d'un microscope avec un grossissement × 200.

Construction de plasmides

La construction de divers rapports luciférase vecteurs pour cible miR-30b a été réalisée comme décrit précédemment [16], [26] et la construction contenant la région de graine mutant a été généré en tant que témoin. Les séquences des oligonucléotides utilisés sont présentés dans le tableau 2.

dosage de la luciférase et la GFP répression des expériences

cellules HEK-293 ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits à 5000 cellules par puits le jour avant la transfection. Les cellules ont été transfectées avec chaque vecteur luciole rapporteur luciférase, Renilla vecteur de contrôle de la luciférase, PRL-TK (Promega), et imite miR-30b ou miR-commande (GenePharma). Le dosage de la luciférase a été réalisée en utilisant le système de dosage de rapporteur double luciférase (Promega).

Pour les expériences GFP de répression, cellules HEK-293 ont été ensemencées en plaque 12 puits à 1 x 10 ^{5 par puits la jour avant la transfection, puis ont été cotransfecté avec les imite miR-30b ou miR-contrôle avec différents vecteurs GFP rapporteurs. Les cellules ont été soumises à une cytométrie en flux, et les données ont été analysées en utilisant le logiciel CellQuest Pro.}

Western Blot

Les cellules traitées ont été lavées avec du PBS glacé et lysées par un tampon de lyse cellulaire (Transpercer). Après centrifugation à 12 000 tpm pendant 15 min à 4 ° C, la concentration en protéine a été mesurée par le kit de dosage de protéine BCA (Pierce). Des lysats de protéines cellulaires ont été séparées à 12% de SDS sur gel de polyacrylamide dénaturé, puis transférés sur une membrane de difluorure de polyvinylidène. Les membranes ont été bloquées avec 5% de lait écrémé sec dans une solution saline tamponnée au Tris, pH 7,4, contenant 0,05% de Tween 20 et ont été incubées avec des anticorps primaires pour le PAI-1 (1:1000, Abcam) et β-actine (1:1000 Santa Cruz) à 4 ° C pendant une nuit, respectivement. Les membranes ont été lavées et incubées avec des anticorps à la peroxydase de raifort conjuguée à 1:5000 secondaire (Santa Cruz), selon les instructions du fabricant. La protéine d'intérêt a été visualisé en utilisant ECL Western substrat buvard (Pierce) et le système de documentation ChemiDoc XRS Gel (BioRad).

L'analyse statistique

Les résultats sont exprimés en moyenne ± écart-type (SD) à partir d'au moins trois expériences indépendantes. test t de Student a été appliqué pour analyser les différences entre les groupes. La relation entre le niveau miR-30b et PAI-1expression a été analysée en utilisant la corrélation de Pearson. L'analyse statistique a été réalisée avec le logiciel SPSS (version 17). Les différences statistiques ont été déclarées significative à P
< 0,05. données statistiquement significatives sont indiquées par des astérisques ( P
< 0,05 (*), P
<. 0,01 (**)

Résultats

diminution de l'expression de miR-30b dans des lignées cellulaires de cancer gastrique humain et des échantillons de tissus GC

Pour déterminer le rôle de miR-30b dans la pathogenèse du cancer de l'estomac, nous avons analysé les niveaux de miR-30b dans diverses cellules de cancer gastrique, y compris HGC-27, AGS, BGC-823 et SGC-7901. Comme le montre la figure 1A, l'expression de miR-30b était significativement régulée à la baisse dans quatre lignées de cellules par rapport à un pool de cinq tissus gastriques non tumorales ( P
<.. 0,01)

L'expression de miR-30b a été examiné dans 21 GC appariés et les tissus gastriques non tumorales adjacentes par TaqMan quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR) Comme le montre sur la figure 1B, la diminution de miR-30b a été trouvée chez 18 des 21 patients (85,7%) comparativement à des tissus non tumorales correspondantes. en outre, le diagramme de dispersion a montré que miR-30b était significativement régulée à la baisse dans les échantillons de cancer gastrique par rapport à la muqueuse gastrique normale, avec un 6,28 fois diminution moyenne ( P
= 0,002) (figure 1C). Pour valider les données d'expression acquises de qRT-PCR, 3 des 21 paires d'échantillons ont été choisi au hasard pour déterminer le niveau de miR-30b en utilisant le boulon du Nord. Nous avons également constaté la diminution de l'expression cohérente de miR-30b dans le cancer gastrique par rapport aux tissus gastriques non tumorales (figure 1D). Ces résultats suggèrent que l'expression de miR-30b est souvent régulé à la baisse dans le cancer gastrique et peut-être impliqué dans le développement du cancer gastrique.

surexpression de miR-30b augmente l'apoptose des cellules cancéreuses gastriques

l'une des caractéristique du cancer est sa capacité à échapper à l'apoptose [27], de sorte que nous avons examiné l'effet de miR-30b sur gastrique cellules cancéreuses apoptose. SGC-7901 ou HGC-27 cellules ont été transfectées avec imite miR-30b ou brouillés miR-contrôle et la validité de miR-30b expression ectopique a été confirmée par qRT-PCR (figure 2A). Ensuite, l'effet de miR-30b sur l'apoptose de la CGT-7901 ou HGC-27 des cellules a été évaluée par cytométrie de flux (FCM) d'analyse et de caspase 3/7 des essais d'activité. Comme cela est représenté sur la figure 2B et 2C, on a trouvé que la proportion de cellules apoptotiques a augmenté de façon significative dans SGC-7901 ou HGC-27 des cellules transfectées avec mimétiques miR-30b par rapport aux cellules de contrôle transfectées miR (16,08% contre
8,25% pour les cellules SGC-7901, et 17,83% par rapport
10,87% à HGC-27 cellules). En outre, une augmentation significative de l'activité de la caspase-3/7 a été trouvé dans les cellules SGC-7901 ou HGC-27 transfectées avec miR-30b par rapport aux transfectants miR-contrôle ( P
< 0,01, figure 2D). Au-dessus des résultats révèle que la surexpression de miR-30b peut favoriser l'apoptose du cancer gastrique in vitro.

miR-30b supprime la tumorigénicité et favorise l'apoptose des cellules in vivo

Pour déterminer en outre si miR-30b est impliqués dans la tumorigenèse du cancer gastrique, nue modèle de xénogreffe de souris a été utilisé. Parce que nous avons constaté que miR-30b a joué un rôle plus important dans la promotion de SGC-7901 cellules apoptose que HGC-27 cellules in vitro, nous explorons le rôle de miR-30b dans la tumorigenèse du cancer gastrique en utilisant des cellules SGC-7901. miR-Control- et miR-30b-transfectées cellules SGC-7901 ont été injectés sous-cutanée dans chaque flanc postérieur des mêmes souris nues. Les souris ont été suivies pour l'observation de la croissance de la xénogreffe pendant 4 semaines. Il a été constaté que l'introduction de miR-30b dans les cellules CGT-7901 conduit à une réduction significative de la taille du volume tumoral (figure 3A et 3B), des cellules et des tumeurs dérivées de miR-30b traitées SGC-7901 a augmenté plus lentement par rapport au témoin groupe pendant toute la période de croissance tumorale (figure 3C, le panneau de gauche). Lorsque les tumeurs ont été récoltées, le volume moyen des tumeurs dérivées du groupe imite miR-30b était seulement 27,87% de celle dans le groupe miR-commande (figure 3C, panneau de droite, P
< 0,01). Les tumeurs ont été récoltées à 26 jours à partir de deux côtés du flanc postérieur de la même souris, l'apoptose in situ, ont été mesurées par la méthode TUNEL. Comme cela est représenté sur la figure 3D, les sections tumorales provenant mimétiques miR-30b traitées présentaient des xénogreffes augmenter de manière significative dans les cellules TUNEL-positives. Ces résultats suggèrent fortement que l'introduction de miR-30b pourrait inhiber la croissance du cancer de l'estomac en favorisant l'apoptose des cellules cancéreuses.

PAI-1 est un gène cible candidat de miR-30b

Pour évaluer davantage la la fonction de miR-30b, il est important de déterminer les ARNm de l'hôte sont régulés par miR-30b. Dans notre étude précédente, nous avons examiné le profil d'expression d'ARNm dans les cinq paires de tissus tumoraux primaires de patients atteints d'un cancer de l'estomac et des tissus non apparié utilisant des puces à ADN tumoraux. Au total, nous avons trouvé 303 gènes surexprimés (fold change > 2, P
< 0,05) dans les tissus de cancer gastrique par rapport aux tissus non-tumorales (données non représentées). Considérant l'expression régulée à la baisse de miR-30b dans le cancer gastrique, nous nous sommes concentrés sur la liste des gènes montrant une augmentation des expressions et sélectionné les 30 meilleurs augmentation des gènes dans le cancer gastrique, puis déterminer si ces gènes étaient des cibles potentielles de miR-30b en utilisant l'algorithme de prédiction , TargetScan. Chose intéressante, nous avons constaté que le PAI-1 gène qui a été régulé à la hausse dans les puces à ADN (3,83 fois, P
= 0,04) pourrait être un gène cible probable de miR-30b (figure 4A). Pour répondre directement si miR-30b se lie à l'extrémité 3 'UTR de l'ARNm cible, nous avons construit des vecteurs rapport luciférase contenant les sites à l'intérieur putatif 3' UTR de liaison miR-30b. Comme le montre la figure 4B, on a observé une réduction marquée de l'activité luciférase ( P
< 0,01) après contransfection de luciférase vecteurs de rapport et imite miR-30b. En revanche, aucun changement de la luciférase a été observée dans les cellules transfectées avec les constructions mutantes 3 'UTR. Ce résultat a ensuite été confirmée par des expériences GFP de répression. Comme on le voit sur la figure 4C et 4D, la fluorescence de la GFP a été significativement réduite dans les cellules transfectées avec des vecteurs de rapport de GFP contenant des sites de liaison et mimétiques miR-30b, alors qu'il n'y avait pas de changement de la fluorescence de la GFP dans les cellules transfectées avec le vecteur mutant et miR-30b mimétiques. En outre, la surexpression de miR-30b AGS et HGC-27, les cellules conduit à la régulation à la baisse des niveaux de PAI-1 (figure 4E) protéine. Pris dans leur ensemble, les données ci-dessus suggèrent que le PAI-1 est une cible potentielle de miR-30b et miR-30b peuvent réguler négativement la protéine cible.

corrélation inverse entre miR-30b et de PAI-1 dans l'expression gastrique les tissus cancéreux et des lignées cellulaires cancéreuses

Considérant que miR-30b est régulée à la baisse dans le cancer gastrique, et il a été rapporté que la protéine PAI-1 dans les tissus de cancer gastrique est beaucoup plus élevé que dans les tissus non tumoraux [ ,,,0],28], on a effectué l'analyse de corrélation entre miR-30b et de PAI-1 expression dans des lignées cellulaires de cancer de l'estomac et les tissus de cancer gastrique. Comme le montre la figure 5A supérieure, PAI-1 niveau de la protéine était le plus bas dans la cellule AGS parmi les cinq lignées de cellules gastriques. En revanche, le niveau miR-30b était le plus élevé AGS, par rapport à d'autres lignées cellulaires (5A de fond de la figure). Par la suite, nous avons examiné PAI-1 et miR-30b expression dans 21 ensembles de cancer de l'estomac et des tissus non tumoraux adjacents. Nous avons constaté que 81% (17/21) des cancers gastriques affiché plus élevés de PAI-1 ARNm par rapport aux tissus normaux. En revanche, miR-30b a été généralement régulée à la baisse dans 18 des 21 tumeurs. En utilisant l'analyse de corrélation de Pearson, nous avons observé une corrélation inverse significative entre miR-30b et PAI-1 ARNm (figure 5B, R
= -0,6475, P
= 0,0123). Au-dessus des résultats suggèrent que l'expression de miR-30b est inversement corrélée avec PAI-1 expression dans le cancer gastrique, et amélioré l'expression de PAI-1 dans le cancer gastrique pourrait être le résultat d'une expression réduite miR-30b.

PAI-1 est potentiellement impliqués dans miR-30b-apoptose induite par

Pour vérifier davantage si PAI-1 est impliqué dans l'apoptose miR-30b-promu, nous avons d'abord testé si le silence de PAI-1 expression peut avoir la même apoptose promotion effet que miR-30b surexpression. les cellules CGT-7901 ont été transfectées avec le PAI-1 ou d'ARN siRNA contrôle négatif (NC) pendant 48 h, comme le montre la figure 6A, les niveaux d'ARNm de PAI-1 peut être considérablement réduit par son ARNsi. Par la suite, PAI-1 siRNA affiché des augmentations évidentes du taux apoptotique dans les cellules SGC-7901 (Figure 6B, 6C), par rapport à miR-contrôle. Notamment, PAI-1 siRNA a pu phénocopies l'effet de miR-30b surexpression sur la régulation de l'apoptose des cellules cancéreuses (figure 6B, 6C). Un exemple représentatif de la parcelle dot a été montré à la figure 6D. Ensuite, nous avons également examiné si PAI-1 pourrait abroger l'effet de favoriser l'apoptose par miR-30b. cellules SGC-7901 ont été transfectées avec imite miR-contrôle ou miR-30b pendant 24 h, et suivies par transfection avec PAI-1 vecteur humain ADNc ORF Clone (indiqué comme PAI-1) ou un vecteur vide. Comme cela est représenté sur la figure 6E-G, la surexpression de PAI-1 a entraîné la suppression de l'effet évident de l'apoptose miR-30b-induite. Pris ensemble, nos résultats suggèrent que PAI-1 est potentiellement impliqué dans l'apoptose miR-30b-promu.

Discussion

Bien que la déréglementation des miARN a été observé dans les tissus de cancer gastrique et des lignées cellulaires, la mécanisme moléculaire exact par lequel miARN modulent le processus de tumorigenèse est pas encore totalement élucidé. À ce jour, une série de miARN a été rapporté à fonctionner comme oncogène dans le développement du cancer gastrique [29], [30], cependant miARN agissant comme des gènes suppresseurs de tumeur doivent encore être étudiées.

Ici, nous a montré miR-30b a été régulée à la baisse dans les cellules de cancer gastrique et les tissus tumoraux. Nos données indiquent également que overxepression de miR-30b pourrait améliorer l'apoptose des cellules de cancer gastrique in vitro et in vivo, et miR-30b a pu inhiber la croissance tumorale du cancer gastrique in vivo. Nous avons caractérisé en outre PAI-1 comme une cible potentielle de miR-30b et de l'expression de miR-30b était inversement corrélée avec l'expression du PAI-1 dans le cancer gastrique. En outre, PAI-1 est potentiellement impliqué dans l'apoptose miR-30b-induite. les résultats ci-dessus suggèrent miR-30b peut agir comme un suppresseur de tumeur roman de régulation de l'apoptose des cellules cancéreuses dans le cancer gastrique.

miR-30b est l'un des miR-30 famille qui est associée au développement de plusieurs types des cancers. Cependant, le rôle de miR-30b dans la tumorigenèse est controversée. miR-30b a été signalé à être régulé à la baisse dans le cancer de la prostate [31], de la vessie tumeur invasive [32], le cancer de la thyroïde anaplasique [33], cancer de l'œsophage [34], et le cancer du poumon [35], alors que l'expression accrue de Mir- 30b a été identifié dans le médulloblastome [36] et le mésothéliome malin [37]. En outre, miR-30b a été identifié comme l'un des facteurs prédictifs indépendants de survies sans récidive de carcinome hépatocellulaire [38]. Depuis miR-30b était soit régulée à la hausse ou réduite dans différents cancers, nous pourrions tirer une conclusion que miR-30b peut jouer des rôles différents comme un oncogène ou un gène suppresseur de tumeur dans divers cancers.

Dans la présente étude nous avons constaté que l'expression de miR-30b a été significativement réduite dans les tissus du cancer de l'estomac et des lignées cellulaires par rapport aux tissus gastriques normaux. Conformément à notre constatation, miR-30b a été trouvé à la baisse exprimée par tableau microRNA de 184 cancers gastriques et 169 non-tumeur muqueuse [39], et Qiao et al ont trouvé que miR-30b a été vers le bas-exprimé dans le tissu de cancer de l'estomac et des lignées cellulaires de cancer de l'estomac, des cellules AGS et BGC-823 [40]. Par conséquent, la perte d'expression de miR-30b peut être associé à la pathogenèse et la progression du cancer de l'estomac.

L'apoptose est un processus de mort cellulaire qui se produit commandé dans des conditions physiologiques et pathologiques. Une perturbation de cet équilibre délicat peut conduire à l'apparition du cancer [27]. Maintenant, on sait peu sur l'effet de miR-30b sur l'apoptose dans le cancer. L'expression controversée de miR-30b suggère la complexité de la fonction de miR-30b. Récemment, Li et al [41] ont trouvé que miR-30b a été significativement réduite en réponse à la stimulation par le stress oxydatif, et miR-30b peut inhiber l'apoptose mitochondriale et la fission consécutive. Au contraire, il a été démontré que miR-30 peut inhiber l'auto-renouvellement et d'induire l'apoptose des cellules initiatrices de tumeurs mammaires (BT-CI) en réduisant au silence et Ubc9 ITGB3 [42]. évidences ci-dessus montrent que miR-30 est un gène multifonction qui peut inhiber ou induire l'apoptose. Dans le rapport, nous avons constaté l'expression ectopique de miR-30b pourrait induire l'apoptose des cellules de cancer gastrique in vitro, et la surexpression de miR-30b pourraient inhiber de manière significative la croissance tumorale in nude modèle de xénogreffe de souris en induisant l'apoptose des cellules de cancer gastrique in vivo. Au-dessus de résultats suggèrent que miR-30b peut jouer le rôle potentiel dans le développement du cancer de l'estomac en favorisant l'apoptose du cancer.

Pour explorer le mécanisme moléculaire sous-jacente fonction miR-30b, il est important d'identifier son gène cible. Récemment, plusieurs nouvelles cibles de miR-30b ont été confirmés, y compris p53 [43], Delta-like 4 [44], et Snail1 [45]. Dans notre étude, PAI-1was identifié comme un gène cible de miR-30b dans le cancer gastrique. PAI-1 est l'inhibiteur principal de tPA et uPA, du PAI-1 et les blocs peuvent l'activation du plasminogène. Il a été bien établi que l'expression de PAI-1 est plus élevée dans le cancer de l'estomac que dans les tissus de contrôle et de PAI-1 peut servir en tant que nouveau facteur de pronostic dans le cancer gastrique, prédisant une survie plus courte [28], [46], [47 ]. Fait intéressant, des données récentes montre l'activité protumorigenic de PAI-1 peut être par le biais d'une fonction anti-apoptotique [22]. Notre étude a montré que l'expression de miR-30b était inversement corrélée avec le PAI-1 expression dans des lignées cellulaires de cancer de l'estomac et des tissus tumoraux, PAI-1 surexpression pourrait contrecarrer l'effet de favoriser l'apoptose par miR-30b et l'expression ectopique de miR-30b eu semblable effet promoteur-apoptose par rapport à taire PAI-1 expression. Cela suggère que l'axe miR-30b-PAI-1 peut être impliqué dans le développement du cancer gastrique. Cependant la voie aval est nécessaire pour être étudiée plus.

Le développement du cancer gastrique est caractérisée par le multi-factorielle et procédé en plusieurs étapes, et H. pylori
a été démontré que la principale cause de cancer de l'estomac. Des rapports récents de nos recherches et d'autres études ont mis en évidence le rôle régulateur des miARN dans H. pylori
infection et les maladies associées. miARN est un pont potentiel de H. pylori de l'infection à une gastrite chronique et le cancer gastrique [16], [48], [49]. Pour ce qui est de miR-30b, elle peut avoir plusieurs fonctions en H. pylori de l'infection et H. pylori
maladies -Associated. Notre précédent rapport trouvé miR-30b était capable de réguler le processus d'autophagie en ciblant ATG12 et BECN1 pendant H. pylori
persistent infection [19].

• PLOS ONE: Cellules intratumorale IL-17-Positive Mast sont la principale source de l'IL-17 C'est prédictif de la survie dans le cancer gastrique Patients
• PLOS ONE: Helicobacter pylori Favorise épithéliale-mésenchymateuses Transition dans le cancer gastrique par régulation négative de Programmed Protein Cell Décès 4 (PDCD4)