PLOS ONE: Co-livraison de doxorubicine et SATB1 shRNA par thermosensible magnétique liposomes cationiques pour la thérapie du cancer gastrique

Résumé

Dans une étude précédente, nous avions mis au point un nouveau système de distribution magnétique thermosensible à base de liposomes. Cette étude visait à évaluer l'efficacité de ce système pour la co-délivrance de ces deux médicaments et des gènes à la même cellule et de ses effets anti-tumoraux sur le cancer gastrique. La doxorubicine (DOX) et SATB1 shRNA vecteur ont été chargés dans le système de co-délivrance, et DOX activité de libération thermosensible in vitro, le gène ciblé silencing l'efficacité, l'absorption cellulaire ciblée cytotoxicité in vitro, ainsi que l'activité in vivo anti-tumorale a été déterminée. Les résultats ont montré que ce système de co-livraison avait souhaitable l'efficacité de la livraison ciblée, DOX libération thermosensible et SATB1 gene silencing. En outre, la co-délivrance de la DOX et SATB1 shRNA exposa une activité accrue pour inhiber la croissance de cellules de cancer gastrique in vitro et in vivo, par rapport à la livraison unique. En conclusion, le système de drogue magnétique et le gène co-livraison thermosensible roman a une application prometteuse en chimiothérapie combinée et la thérapie génique pour le cancer gastrique

Citation:. Peng Z, Wang C, Fang E, Lu X, Wang G, Tong Q (2014) Co-livraison de doxorubicine et SATB1 shRNA par thermosensible magnétique liposomes cationiques pour la thérapie du cancer gastrique. PLoS ONE 9 (3): e92924. doi: 10.1371 /journal.pone.0092924

Editeur: Elena A. Rozhkova, Argonne National Laboratory, Etats-Unis d'Amérique

reçues: 4 Décembre, 2013; Accepté 26 Février 2014; Publié le 27 Mars, 2014

Droit d'auteur: © 2014 Peng et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Cette étude a été soutenu par la national science Foundation naturel de la Chine (n ° 81172186). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique est le quatrième cancer commun et la deuxième principale cause de décès par cancer dans le monde [1]. En 2008, il y avait environ 989 000 nouveaux cas de cancer de l'estomac et 738.000 décès dans le monde qui a eu lieu principalement dans l'Est, du Sud, et en Asie centrale; Europe centrale et orientale; et Amérique du Sud [2], [3]. En Chine, le cancer gastrique est le troisième cancer commun avec estimés 380.000 nouveaux cas et un taux de mortalité le plus élevé environ 26,3 pour 100.000 habitants chaque année [4], [5]. La résection chirurgicale est l'option curative commune, mais elle ne convient pas pour la plupart des patients qui sont à un stade avancé de cancer de l'estomac. D'autres traitements tels que la radiothérapie et la chimiothérapie présentent une certaine efficacité, mais ils sont souvent peu satisfaisants [4], [6]. En outre, l'administration systémique de la chimiothérapie provoque des effets indésirables [7], [8].

En raison du développement de la résistance aux médicaments à la chimiothérapie, la chimiothérapie traditionnelle efficacité anti-tumorale limitée a également montré [9]. Par conséquent, le système co-délivrance multi-agent a acquis une plus grande attention récemment, car il pourrait fournir différents types d'agents aux mêmes cellules tumorales qui présentent alors des effets antitumoraux synergiques. Par exemple, deux agents chimiques différents peuvent être combinés ou un agent chimique peut être combiné avec un petit ARN interférant (siARN) contre un oncogène. De plus, la livraison ciblée et contrôlée de médicaments peuvent améliorer encore les effets anti-tumoraux et réduire les effets indésirables.

Spécial AT-riche protéine de liaison (SATB1) est un organisateur de la chromatine globale qui régule l'expression génique et est impliquée dans la modulation des comportements biologiques malignes du cancer [10]. l'expression aberrante de SATB1 a été démontré que le cancer promu du sein, cancer du poumon et un lymphome [11] - [13]. Nos études antérieures ont montré que SATB1 joue un rôle important dans le cancer gastrique, et il peut être un marqueur de pronostic indépendant pour le cancer gastrique [14], [15]. La suppression de l'expression d'ARNsi SATB1 en fournissant ou en interférant plasmide codant pour l'ARN spécifique à court harpine (shRNA) contre SATB1 peut inhiber la prolifération et l'invasion, et favoriser l'apoptose des cellules tumorales [16], [17]. Ces résultats suggèrent que SATB1 est une cible thérapeutique potentielle pour le cancer gastrique.

Nous pensons que la combinaison de la thérapie génique et de chimiothérapie pourrait améliorer significativement l'efficacité thérapeutique contre le cancer gastrique. Dans notre étude précédente, nous avons développé un système de co-livraison thermosensible ciblée à base de liposomes cationiques magnétiques thermosensibles (TSMCL). Par calcéine essai de libération, nous avions optimisé la formulation liposomale thermosensible, puis mesuré les propriétés magnétiques et la livraison de gènes efficacité de TSMCL. Dans cette étude, nous avons chargé doxorubicine et SATB1-shRNA vecteur dans ce système pour la combinaison de la thérapie génique et de chimiothérapie, et évalué leur effet anti-tumoral synergique contre le cancer gastrique in vitro et in vivo.

Matériels et méthodes

Matériaux de cholestérol, le 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DPPC), et 3β- [N- (N ', N'-diméthylaminoéthane) carbamoyl] cholestérol (DC-Chol) ont été achetés chez Avanti Polar Lipids (USA). le bromure de diméthyldioctadécylammonium (Doab) ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich (USA). Magnetic Fluid Fe _{3O 4 a été synthétisé par Galaxy Nanotech (Chine). FAM marqué siRNA et le plasmide pGFP-SATB1 shRNA ont été fournis par GenePharma (Shanghai, Chine). Doxorubicine a été acheté chez Hisun Pharmaceutical (Zhejiang Chine). sérum fœtal bovin (FBS), les milieux de culture, de la pénicilline /streptomycine (PEST) et de la trypsine ont été fournies par Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). SATB1 anticorps monoclonal de lapin provenait Epitomics (Abcam, UK). Tous les autres produits chimiques étaient de qualité analytique commerciale et utilisés sans autre purification.}

Préparation du système de co-livraison

Ce système de co-livraison a été basé sur des liposomes cationiques thermosensibles, qui ont été préparés avec un thermosensible formulation cationique de DPPC, DC-cholestérol, et le cholestérol Doab à un rapport molaire de 80:5:5:10 optimisé dans nos expériences préliminaires. Liposomes (TSCL) ont été préparés par la méthode film d'hydratation fine, suivie par extrusion [18]. Le procédé à gradient de sulfate d'ammonium a été utilisé pour charger la DOX dans TSCL (TSCL-DOX). Pour préparer des liposomes magnétiques (TSMCL), un fluide magnétique Fe _{3 O 4 a été utilisé en tant que noyau et coencapsulé avec un tampon de sulfate d'ammonium dans les liposomes. Après la formation du film mince dans le ballon à fond rond, un millilitre d'une suspension de fer et de sulfate d'ammonium a été ajoutée pour hydrater le film, puis extrudé à travers des filtres de polycarbonate et chargé avec DOX (TSMCL-DOX) par le procédé de gradient de sulfate d'ammonium . Enfin, les produits de la filtration sur gel ont été centrifugés à 1000 g pendant 15 min pour éliminer encapsulé Fe 3O 4.}

pGFP-SATB1-shRNA (shSATB1) vecteur a été incubé avec différents liposomes dans sérum médias libres à la température ambiante pendant 30 minutes, pour préparer TSCL-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1, TSMCL-shSATB1 et TSMCL-DOX-shSATB1, respectivement.

Détermination du potentiel zêta, la taille des particules, et la polydispersité

la taille moyenne des particules et la polydispersité de la distribution granulométrique des liposomes ont été déterminées à 25 ° C par diffusion dynamique de la lumière en utilisant un instrument ZetaPALS particules encollage (Brookhaven Instruments Corporation, États-Unis). Le potentiel zêta de la dispersion de liposomes a été mesurée en utilisant le même instrument à 25 ° C par la mobilité électrophorétique.

Détermination de l'efficacité Doxorubicine chargé

la concentration de DOX dans les liposomes a été mesurée par un fluorimètre ( Perkin Elmer, USA) avec 485 nm excitation et 590 filtres d'émission nm avec une série de dilution de libre DOX comme la norme. DOX efficacité chargée a été calculée en se basant sur la concentration de DOX.

calorimétrie différentielle à balayage (DSC)

DSC a été réalisée pour évaluer la thermosensibilité de liposomes en déterminant la température de transition de phase (Tf). Tm a été évaluée en utilisant un DSC nano (TA Instruments, États-Unis) à une vitesse de chauffage de 20 ° C /h avec 20 mg /ml de phospholipides.

in vitro thermosensibles DOX libération dosage

20 pi DOX liposomes chargés ont été incubées dans 1 ml de PBS et du PBS avec du sérum de 50% de fœtus bovin (FBS) qui imite l'environnement in vivo séparément dans des tubes Eppendorf. Les échantillons ont été chauffés dans un bain d'eau à 37 ° C et 42 ° C pendant 1 h, respectivement. Ensuite, l'intensité de fluorescence de la DOX a été mesurée dans un fluorimètre (Perkin Elmer, USA) en utilisant une excitation à 485 nm et 590 nm filtres d'émission. Pour la libération de 100%, les échantillons ont été incubés dans 1 ml de PBS avec 1% de Triton X-100 pendant 1 min. Les rejets de DOX pourcentages ont été calculés comme suit: où F _{s est la fluorescence d'échantillons après chauffage, F 0 a été la fluorescence initiale des échantillons avant le chauffage, et F 100 a été la fluorescence d'échantillons traités avec Triton X-100.}

culture
Cell

adénocarcinome gastrique MKN-28 lignée cellulaire humaine a été acheté chez keygen Biotech (Nanjing, Chine) et cultivées en DMEM riche en glucose additionné de 10% de FBS, 100 U /ml de pénicilline et 100 pg /ml de streptomycine dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO _{2 à 37 ° C.}

In vitro transfection cellulaire

MKN-28 cellules ont été ensemencées dans des plaques à 12 puits à une densité de 4 x 10 ^{5 cellules /puits et cultivées pendant une nuit à environ 80% de confluence. Le jour suivant, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS préchauffé, puis TSCL-shSATB1 et TSMCL-shSATB1 ont été ajoutés dans chaque puits et mis en incubation pendant 6 h. Les cellules incubées avec TSMCL-shSATB1 ont été placés sur la plaque de 12 puits magnétique pendant les 30 premières minutes pour offrir un champ magnétique. Ensuite, le milieu d'incubation a été remplacé par du DMEM supplémenté avec 10% de FBS et les cellules ont été incubées pendant 24 h. le niveau d'expression de la GFP a été évaluée sous microscope à fluorescence (Nikon 80i) et cytomètre de flux (BD FACS Canto II).}

en temps réel polymérase quantitative réaction en chaîne (RT-qPCR)

L'ARN total a été extrait de MKN-28 cellules en utilisant TRIzol régente (Invitrogen, Carlsbad, CA) suivant les instructions du fabricant, et l'ADNc a été synthétisé en utilisant PrimeScript RT master Mix (Takara, Dalian). PCR a été réalisée en utilisant SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Dalian) sur un système de PCR en temps réel StepOne Plus (Applied Biosystems, USA). Les séquences des amorces étaient les suivantes: sens 5'-SATB1 ACAGAACCCTGTGGGAGAAC-3 'et anti-sens 5'-GCGTTGCTCTCCTGTTCATA-3' 5'-GADPH sens ACAGAACCCTGTGGGAGAAC-3 'et anti-sens 5'-GCGTTGCTCTCCTGTTCATA-3'. niveau SATB1 ARNm a été normalisée à celle de GAPDH.

Analyse par Western blot

MKN-28 cellules ont été récoltées et lysées dans un tampon RIPA. On a recueilli les surnageants après centrifugation à 10 000 g pendant 10 min. La concentration en protéines du surnageant a été déterminée en utilisant un kit BCA Protein Assay. Ensuite, 40 pg d'échantillons ont été analysés sur SDS-PAGE à 15% et les protéines ont été transférées sur des membranes PVDF. Ensuite, les membranes ont été incubées dans 5% de lait écrémé pendant 1 h pour bloquer la liaison non spécifique et ensuite mis en incubation pendant une nuit à 4 ° C avec un anticorps ou SATB1 β-actine (1:500 dilution). Les membranes ont ensuite été sondées avec de chèvre HRP-conjugué anticorps secondaire anti-lapin pendant 30 minutes. Enfin, les membranes ont été visualisées avec un système de chimioluminescence amélioré (ECL, Pierce) et exposés à un film radiographique.

Evaluation in vitro de l'absorption cellulaire

Pour évaluer la localisation intracellulaire de rendu DOX et pGFP-SATB1 shRNA et la pénétration accrue des liposomes dans les cellules de cancer gastrique par magnétique ciblé, un FAM marqué ARNsi (fluorescence verte) a été utilisé pour imiter pGFP-SATB1 shRNA et de la DOX par lui-même possède une fluorescence rouge instinct pour surveiller l'absorption cellulaire . MKN-28 cellules ont été ensemencées dans une plaque de 12 puits à 4 × 10 ^{5 cellules /puits et cultivées pendant une nuit. Ensuite, les cellules ont été incubées avec siRNA libre, TSCL-siRNA, TSMCL-siRNA, TSCL-DOX, TSMCL-DOX, TSCL-DOX-siRNA ou TSMCL-DOX-siRNA pendant 6 h. Pour les liposomes magnétiques, les plaques ont été placées sur une plaque magnétique de 12 puits au cours de la première heure d'incubation. Les cellules ont été visualisées sous un microscope à fluorescence pour localiser les marqueurs fluorescents de DOX et siRNA. Les noyaux ont été colorés avec DAPI (fluorescence bleue).}

test MTT

MKN-28 cellules ont été ensemencées à une densité de 2 x 10 ^{4 cellules /puits dans des plaques à 96 puits et cultivées pendant une nuit. Les cellules ont ensuite été incubées avec les différents liposomes à 37 ° C pendant 2 h en CO _{2 incubateur. Pour les liposomes magnétiques, les plaques ont été placés sous une plaque magnétique 96 puits pendant les premières 1 h d'incubation. Ensuite, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et incubées pendant 46 h dans du milieu frais. Par la suite, la viabilité cellulaire a été mesurée par un test MTT. Le milieu dans chaque puits a été remplacée par une solution de MTT 20 ul (Sigma-Aldrich, USA) et on fait incuber pendant 4 h à 37 ° C, puis les surnageants ont été éliminés et les cristaux de formazan ont été dissous avec 200 pi de DMSO. Les plaques ont été mesurées à 490 nm dans un lecteur de microplaques et la viabilité cellulaire a été calculée selon la formule suivante:}}

cytométrie en flux

L'apoptose a été détectée en utilisant un kit Annexin V-FITC Apoptosis Detection (eBioscience, États-Unis). MKN-28 cellules ont été ensemencées dans des plaques à 12 puits et traitées comme décrit ci-dessus. Après 24 h, les cellules ont été recueillies, lavées deux fois avec du PBS et mises en suspension dans 500 pi de tampon de liaison. Ensuite, les cellules ont été colorées avec deux Annexin V-FITC et l'iodure de propidium (PI). Les cellules en stade précoce de l'apoptose colorées avec l'annexine V-FITC mais pas tachée de PI ont été quantifiées par cytometery d'écoulement.

modèle de xénogreffe de souris

vieux Cinq à six semaines mâles Balb /c des souris nues ont été fourni par le Centre d'expérimentation animale de Tongji Medical College. Chaque souris a été inoculé par voie sous cutanée dans le flanc droit avec 5 x 10 ^{6 MKN-28 cellules. Plusieurs semaines après l'inoculation de la tumeur, les souris porteuses de tumeurs 36 ont été répartis aléatoirement en six groupes (n = 6). Les souris ont été injectés par la veine caudale avec DOX libre, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1, TSMCL-DOX-shSATB1 ou une solution saline normale comme témoin. La dose de DOX était de 2,5 mg /kg et celle de pGFP-SATB1 shRNA était de 10 ug par souris. Le traitement a été administré une fois tous les 3 jours et taille de la tumeur a été mesurée par un compassage puis le volume de la tumeur a pu être calculée par la formule suivante: volume = (D _{Min) 2 × D Max /2, où D Max était le diamètre de la tumeur la plus longue et D Min était la plus courte. Pour TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1 et TSMCL-DOX-shSATB1, le ciblage magnétique a été réalisé en utilisant un champ magnétique externe continue de 5000 Gauss pendant 30 minutes en se concentrant sur la tumeur après l'administration du médicament. Toutes les expériences ont été approuvées par le Comité d'éthique de Tongji Medical College et tous les animaux ont été traités avec humanité conformément aux directives institutionnelles de protection des animaux et l'utilisation du Comité.}}

Analyse statistique

Les données ont été exprimées comme la moyenne ± écart-type (DAKOTA DU SUD). La signification statistique entre les différents groupes a été évaluée avec le test t de Student et l'analyse d'un facteur de la variance (ANOVA) à tester. Pour le temps de survie des animaux, les courbes de Kaplan-Meier de chaque groupe ont été établis et log rank test a été effectué pour comparer les taux de survie. p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative

Résultats

Caractérisation des liposomes

Comme le montre le tableau 1, le diamètre de TSCL était de 83,6 ± 5,7 nm, tandis que celle de TSCL. DOX a été porté à 118,5 ± 7,9 nm en raison de l'encapsulation de DOX. Pendant ce temps, les diamètres des TSCL-shSATB1 et TSCL-DOX-shSATB1 ont augmenté de manière significative à 161,1 ± 11,8 nm et 238,1 ± 20,6 nm, respectivement, en raison de l'adhérence et la fusion de l'ADN plasmidique à des liposomes. Pour les liposomes magnétiques, les tailles de particules de TSMCL, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1 et TSMCL-DOX-shSATB1 étaient 135,0 ± 11,6 nm, 157,2 ± 14,3 nm, 221,3 ± 15,7 nm et 319,4 ± 20,1 nm, respectivement, sensiblement supérieure à celle de TSCL, TSCL-DOX, TSCL-shSATB1 et TSCL-DOX-shSATB1 en raison de l'emprisonnement des nanoparticules magnétiques. En outre, la taille des TSMCL-shSATB1 et TSMCL-DOX-shSATB1 était significativement plus grande que des TSMCL et TSMCL-DOX, respectivement (p < 0,05). Tous les liposomes avaient distribution de taille étroite parce que leurs polydispersions ne sont plus que 0,3.

potentiels Zeta de TSCL, TSCL-DOX, TSCL-shSATB1 et TSCL-DOX-shSATB1 étaient 52,0 ± 7,3 mV, 50,1 ± 7,7 mV, 31,3 ± 5,2 mV et 26,7 ± 4,5 mV, respectivement. Après incubation avec pGFP-SATB1- shRNA, les charges de surface a diminué de manière significative (p < 0,05), en raison de l'interaction électrostatique entre les lipides cationiques et l'ADN du plasmide. Cependant, le piégeage de nanoparticules magnétiques n'a pas abouti à une diminution significative du potentiel Zeta dans des liposomes magnétiques.

Pour DOX efficacité chargé, le taux d'encapsulation DOX était de 89 ± 3% et 78 ± 8% (n = 3) pour TSCL-DOX et de la DOX-TSMCL, respectivement, et était de 85 ± 7% et 73 ± 9% (n = 3) pour TSCL-DOX-shSATB1 et TSMCL-DOX-shSATB1, respectivement. Ces données indiquent que l'interaction entre les liposomes et le plasmide n'a pas donné lieu à une fuite DOX.

La thermosensibilité des liposomes

calorimétrie différentielle à balayage a été effectuée pour déterminer la température de transition de phase de TSCL. Comme on le voit sur la Fig. 1, TSCL composée de DPPC, DC-cholestérol, et le cholestérol Doab à un rapport molaire de 80:5:5:10 avait un Tf de 40,8 ° C avec un pic de transition relativement large qui peut être le pic de transition de fusion de la DPPC et Doab .

In vitro thermosensible DOX libération des liposomes

Comme le montre la Fig. 2, DOX taux de TSCL-DOX et TSMCL-DOX libération était de seulement 12% et 16% après une incubation avec du PBS à 37 ° C, et une augmentation de 20% et 19% après incubation avec 50% de FBS, respectivement. Pour TSCL-DOX-shSATB1 et TSMCL-DOX-shSATB1, DOX vitesse de libération était de 12% et 15% après une incubation avec du PBS à 37 ° C et est à la fois 16% après une incubation avec 50% de FBS, ce qui indique que l'incorporation du plasmide avait aucun effet significatif sur la stabilité des liposomes (p > 0,05).

DOX taux de TSCL-DOX et TSMCL-DOX libération a été porté à 37% après une incubation avec du PBS à 42 ° C, et a augmenté à 45% et 49% après une incubation avec 50% de SBF, respectivement. Pour TSCL-DOX-shSATB1 et TSMCL-DOX-shSATB1, DOX taux de libération était de 35% et 43% après une incubation avec du PBS et FBS à 42 ° C, respectivement, à la fois significativement plus élevée que celle à 37 ° C (p < 0,05). Ces résultats indiquent que TSCL-DOX, TSMCL-DOX, TSCL-DOX-shSATB1 et TSMCL-DOX-shSATB1 ont thermosensibilité souhaitable, et pourraient être utilisés pour hyperthermie déclenché une libération contrôlée de la DOX.

Silencing d'expression SATB1 dans MKN-28 cellules transfectées avec des liposomes

Ensuite nous avons évalué l'efficacité des liposomes pour délivrer vecteur shSATB1 dans MNK-28 cellules. des images de fluorescence typiques des cellules transfectées avec TSCL-shSATB1 et TSMCL-shSATB1 ont été représentés sur la Fig. 3A. Cytométrie de flux a montré que l'efficacité de transfection de TSCL-shSATB1 était seulement de 15,4 ± 0,15%. Cependant, après l'application de l'orientation du champ magnétique, l'efficacité de transfection de TSMCL-shSATB1 était de 34,3 ± 0,93%, nettement supérieur à celui des TSCL-shSATB1 (Fig. 3B).

Pour déterminer si le vecteur shSATB1 livré pourrait servir de médiateur au silence de l'expression SATB1 dans MKN-28 cellules, nous avons effectué en temps réel PCR quantitative et analyse par Western blot. Les résultats ont montré que les taux d'ARNm et de protéine SATB1 diminué dans des cellules transfectées avec TSCL-shSATB1 et TSMCL-shSATB1, par rapport aux cellules témoins. En outre, TSMCL-shSATB1 avec l'aide d'un champ magnétique était plus puissant que TSCL-shSATB1 pour inhiber l'expression SATB1 dans MKN-28 cellules (Fig. 3C, D).

Magnétique ciblée in vitro l'absorption cellulaire

Pour comparer les pénétrations dans les cellules entre les liposomes non magnétiques et magnétiques avec l'application de guidage ciblé magnétique, ainsi que la localisation intracellulaire de la DOX et délivrée shSATB1, un ARNsi FAM-marqué a été utilisé comme indicateur. L'absence de fluorescence verte dans les cellules traitées avec l'ARNsi libre a indiqué qu'il ne pouvait pas pénétrer dans les cellules (données non montrées). Nous avons observé que plus les cellules traitées avec TSMCL-siRNA présentaient une fluorescence verte que les cellules traitées avec TSCL-siRNA (Fig. 4A). En outre, plus les cellules traitées avec TSMCL-DOX ont montré une fluorescence rouge que les cellules traitées avec TSCL-DOX (Fig. 4B). Dans les cellules traitées avec TSMCL-DOX-siRNA, l'intensité de fluorescence élevée a été observée, et les cellules semblait rose en raison de la fusion de bleu, rouge et vert de couleur (Fig. 4C). Ces observations suggèrent que TSMCL est plus efficace dans la fourniture de siARN et DOX dans les cellules que TSCL, après l'application du champ magnétique.

En outre, nous avons examiné la localisation intracellulaire de la DOX et délivrée ARNsi. la fluorescence rouge a été observée dans les deux noyaux et le cytoplasme, ce qui indique celui délivré DOX était située dans les noyaux et le cytoplasme. En revanche, la fluorescence verte est apparue en premier lieu dans le cytoplasme, ce qui suggère que les ARNsi ont été délivrés dans le cytoplasme (Fig. 4D). La fusion de rouge et vert apparut jaune dans le cytoplasme, et la fusion de bleu et de rouge est apparue la lavande dans les noyaux. Pris ensemble, ces données indiquent que les deux TSCL et TSMCL peuvent pénétrer dans les cellules cancéreuses gastriques et délivrer leur contenu dans le cytoplasme (DOX et siARN) et les noyaux (DOX).

in vitro des effets anti-tumoraux de la liposomes

Nous avons évalué les effets in vitro anti-tumorales de ce système de co-livraison par cytotoxicité et l'apoptose activité d'induction. La cytotoxicité des liposomes a été évaluée par un test MTT. Pour déterminer les effets de la concentration de DOX et de plasmide sur la cytotoxicité des liposomes, nous avons examiné les liposomes chargés avec différentes concentrations de la DOX et de différentes quantités de SATB1 shRNA. Avec l'augmentation de la concentration de DOX, la cytotoxicité des liposomes a été augmentée (Fig. 5A). Cependant, l'addition de la concentration SATB1 shRNA n'a pas entraîné une augmentation de la cytotoxicité, et il y avait seulement légèrement augmenter la cytotoxicité lorsque la concentration SATB1 shRNA est d'environ 4 ug (fig. 5B). Ainsi, nous avons utilisé 25 uM DOX et 4 pg SATB1 shRNA pour comparer la cytotoxicité entre DOX gratuit, shRNA gratuit, TSCL, TSMCL, TSCL-DOX, TSMCL-DOX, TSCL-shSATB1, TSMCL-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1 et TSMCL- DOX-shSATB1.

Comme le montre la Fig. 5C, libre shRNA, TSCL et TSMCL avaient peu de cytotoxicité. La viabilité cellulaire était de 40,3 ± 3,4%, 73,6 ± 3,5% et 51,3 ± 4,5% pour les droits DOX, TSCL-DOX et TSMCL-DOX, respectivement, ce qui indique que la cytotoxicité des TSMCL-DOX était supérieure à celle TSCL-DOX, mais inférieur libre DOX . La viabilité des cellules était de 79,2 ± 6,9% et 71,6 ± 4,7% pour TSCL-shSATB1 et TSMCL-shSATB1, respectivement, montrant aucune signification statistique (p > 0,05). Pour les médicaments et de gènes co-délivrance, la viabilité cellulaire était seulement de 35,0 ± 3,2% et 22,3 ± 3,4% pour TSCL-DOX-shRNA et TSMCL-DOX-shRNA respectivement sensiblement inférieur à celui de la DOX libre, TSCL-DOX, TSMCL- DOX et SATB1shRNA liposomes chargés (p < 0,05). En outre, la viabilité des cellules de TSMCL-DOX-shRNA était significativement inférieure à celle des TSCL-DOX-shRNA (p < 0,05). Ces résultats suggèrent que l'effet synergique de cytotoxicité est réalisé par co-DOX et délivrant SATB1 shRNA. En outre, avec l'application de magnétique ciblée, une cytotoxicité encore améliorée peut être obtenue.

Pour déterminer le mécanisme anti-tumorale supplémentaire en plus de la cytotoxicité du système de co-livraison, nous avons examiné le taux de MKN-28 apoptose les cellules traitées avec DOX gratuit, TSCL-DOX, TSMCL-DOX, TSCL-shSATB1, TSMCL-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1 et TSMCL-DOX-shSATB1 par cytométrie en flux. Comme le montre la figure. 5D, le taux d'apoptose était de 22,3% dans les cellules traitées avec DOX gratuit, a été de 8,9% dans les cellules traitées avec TSCL-DOX, mais a augmenté à 13,4% dans les cellules traitées avec TSMCL-DOX et le champ magnétique. De même, le taux d'apoptose a été de 9,4% dans les cellules traitées avec TSCL-shSATB1, mais a augmenté à 17,4% dans les cellules traitées avec TSMCL-shSATB1 et le champ magnétique. En revanche, les taux d'apoptose était de 27,7% dans les cellules traitées avec TSCL-DOX-shSATB1, supérieure à celle dans les cellules traitées avec TSCL chargées de la DOX ou shSATB1 seul. Le taux d'apoptose était de 32,4% dans les cellules traitées avec TSMCL-DOX-shSATB1, le plus élevé parmi tous les groupes. Ces résultats démontrent que la DOX co-distribution et SATB1 shRNA conduit à des effets combinés de l'induction de l'apoptose. En un mot, ce système de co-livraison présente des effets puissants anti-tumorales in vitro.

In vivo l'activité anti-tumorale des liposomes

Afin de déterminer l'activité in vivo anti-tumorale du système de co-livraison, nous avons établi MKN-28 modèles de xénogreffes de souris et injecté DOX libre, TSMCL-DOX, TSCML-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1 ou TSMCL-DOX-shSATB1 dans les souris par la veine caudale. Le traitement a été administré une fois tous les 3 jours, et les tumeurs ont été disséquées (Fig. 6A). Au jour 15, le volume de la tumeur était de 0,44 ± 0,05 cm ^{3 chez des souris traitées avec TSMCL-DOX-shSATB1, significativement inférieure à celle dans le groupe de solution saline (2,14 ± 0,23 cm 3), le groupe DOX libre (1,08 ± 0,13 cm 3), le groupe TSMCL-DOX (0,68 ± 0,10 cm 3), le groupe TSCML-shSATB1 (1,43 ± 0,21 cm 3), et de groupe TSCL-DOX-shSATB1 (0,77 ± 0,12 cm 3) (Fig. 6B).}

en outre, comme représenté sur la Fig. 6 (C), le temps médian pour le volume de la tumeur pour atteindre 2 cm ^{3 était de 30 jours dans le groupe TSMCL-DOX-shSATB1, plus longue que celle dans le groupe de solution saline, groupe DOX libre, groupe TSMCL-DOX, groupe TSCML-shSATB1 et le groupe TSCL-DOX-shSATB1 (Fig. 6C). Pris ensemble, ces résultats indiquent que la co-distribution DOX et shSATB1 par TSMCL présente un effet anti-tumoral synergique in vivo.}

Discussion

Malgré le développement récent de la chirurgie, la radiothérapie et cibler la thérapie, la chimiothérapie est toujours l'une des approches importantes pour le traitement du cancer gastrique. Cependant, les effets thérapeutiques de la chimiothérapie sont souvent insatisfaits et ne pouvaient pas améliorer significativement le pronostic des patients atteints de cancer [19]. Une des principales raisons est la tumorigenèse et la progression du cancer gastrique implique une variété de mécanismes différents; le mécanisme anti-tumoral unitaire de la chimiothérapie traditionnelle est limitée, leurs effets thérapeutiques ainsi l'association de la chimiothérapie avec une thérapie génique peut améliorer les effets antitumoraux. Un autre obstacle de la chimiothérapie est que l'administration systémique du médicament conduit à la concentration de médicament limitée dans les sites tumoraux tout en provoquant de nombreux effets indésirables [8]. La clé pour résoudre ces problèmes repose sur de nouvelles manières de délivrance de médicaments, par conséquent, le développement multi-agents système délivrant qui peuvent être directement guidés vers le site de la tumeur avec libération contrôlée peut surmonter ces problèmes et améliorer les effets thérapeutiques ciblés [20] - [25] .

Parmi les divers systèmes d'administration de médicaments, les liposomes sont les plus prometteurs pour de bonnes biocompatibilities qui causent peu ou pas antigénique allergique et des réactions toxiques et faciles à se biodégrader. Comme les deux supports de médicaments et de gènes, les liposomes ne peuvent pas protéger l'hôte contre les effets indésirables du médicament encapsulé, mais empêchent également le contenu d'une inactivation prématurée piégées par le milieu physiologique [26]. En outre, un liposome est un système de délivrance de médicaments potentiellement ciblée, si elle est réalisée par un renforcement de la perméabilité et de rétention (EPR) effet (passif ciblé), ou par magnétique d'orientation sur le terrain et la connexion immunitaire (active ciblée) [27]. En outre, certains liposomes possèdent contrôlées déclenchées drogue caractéristiques de libération, tels que thermo sensibilité, la sensibilité du pH et de la sensibilité des micro-ondes.

Récemment, nous avons mis au point un nouveau système magnétique ciblé thermosensible de médicaments et de gènes co-livraison (TSMCL). Basé sur une formulation thermosensible électroneutre (DPPC:Cholesterol = 80:20), nous avons ajouté différents composants cationiques et optimisé la thermosensibilité des liposomes par calcéine essai de libération. Les résultats ont indiqué que nous pourrions obtenir un thermosensibilité souhaitable en remplaçant 10 parties en moles de cholestérol de 5 parties molaires DC-cholestérol et 5 parties molaires Doab (DPPC:DC-Cholesterol:DOAB:Cholesterol = 80:5:5:10), et calcéine la libération à partir des liposomes serait inférieure à 37 ° C, mais significative, supérieur à 42 ° C dans cette formulation. Ensuite, le fluide magnétique Fe _{3O 4 a été utilisé comme le noyau et a fonctionné comme le ciblage magnétique et source de TSMCL de chauffage. Vibrant magnétomètre de l'échantillon (VSM) mesure avait indiqué que le fluide magnétique Fe 3O 4 avait été superparamagnétique, ainsi TSMCL aurait de bons effets ciblés magnétiques. Pendant ce temps, la courbe de chauffage en fonction du temps a montré également que les deux fluides magnétiques Fe 3 O 4 et TSMCL peut être chauffée de 25 ° C à 42 ° C en 20 min. Avec l'aide d'un fluide magnétique Fe 3O 4, le ciblage magnétique et la température a déclenché la libération du médicament de TSMCL pourrait être réalisé. Enfin, à la fois TSCL et TSMCL avaient exposé morphologies liposomales typiques et de bonnes distributions sous TEM. Sur la base de la construction réussie de TSMCL, dans cette étude, nous avons chargé DOX et SATB1 shRNA vecteur dans TSMCL pour faire TSMCL-DOX-shSATB1 et évalué les effets anti-tumoraux contre les cellules de cancer gastrique in vitro et in vivo.}

DOX est un médicament couramment utilisé en chimiothérapie avec une grande efficacité pour inhiber la prolifération des cellules tumorales et induisent l'apoptose des cellules tumorales, mais ses effets thérapeutiques sont limitées en raison de la cardiotoxicité sévère et myélosuppression lorsque administré par voie systémique [28]. Bien que les liposomes DOX ont partiellement amélioré la situation, l'absence de délivrance ciblée Límites encore leur utilisation [29]. SATB1 est un organisateur de la chromatine globale qui régule directement l'expression de ERRB2, MMP2, ABL1 et E-cadhérine à agir comme un régulateur clé du développement du cancer [30]. SATB1 dans surexpression de différentes tumeurs a été associée à des comportements malignes biologiques tels que l'invasion, la prolifération et les métastases [10] - [13]. Silencing expression SATB1 par petits ARN interférents (siRNA) ou plasmide codant court ARN harpin (shRNA) pourrait inhiber la prolifération, l'invasion et les métastases, et induire l'apoptose de différentes cellules tumorales [16], [17]. Par conséquent, SATB1 devient une cible potentielle pour le traitement du cancer [30]. Cependant, les vecteurs de livraison appropriés pour siRNA ou shRNA sont importantes pour la thérapie génique du cancer SATB1 ciblé.

Dans cette étude, en utilisant le système TSMCL-DOX-shSATB1, tant DOX et SATB1 shRNA vecteur pourraient être dirigés vers le site de la tumeur sous magnétique déposé des conseils et DOX a été libéré dans une hyperthermie déclenchée manière. Hyperthermie déclenché la libération dépend de liposomes thermosensibles qui sont principalement composées de Dipalmitoyphosphocholine (DPPC) qui subit un gel liquide transition de phase cristalline (Tm) qui devient très leaky aux petites molécules solubles dans l'eau à 41 ° C [31]. Liposomes composé de DPPC différents et les lipides ont Tm distincts et thermosensibilité [32]. analyse DSC a montré que la Tm de notre système de distribution était de 40,8 ° C, et DOX essai de libération a indiqué qu'il était stable à 37 ° C tandis que DOX a été libéré lorsque la température est portée à 42 ° C.

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