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PLOS ONE: microARN-10a est régulée à la baisse par méthylation de l'ADN et les fonctions comme un suppresseur de tumeur dans le cancer gastrique Cells

Résumé

Contexte

Les microARN agissent comme régulateurs post-transcriptionnels de l'expression des gènes dans de nombreux les processus biologiques. Leurs dérégulations se produisent fréquemment dans le cancer gastrique (GC). Bien que méthylation de l'ADN constitue un mécanisme important pour microRNA déréglementation dans le cancer, ce domaine reste largement inexploré.

Méthodologie /Principales constatations

L'ARN total a été extrait des tissus de 100 patients avec GC et quatre gastrique des lignées cellulaires de cancer. Les niveaux d'expression de miR-10a ont été déterminés par PCR en temps réel avec des sondes TaqMan spécifiques. En outre, une analyse fonctionnelle de miR-10a dans la régulation de la prolifération cellulaire, la migration et l'invasion a été réalisée. Par la suite, la méthylation spécifique PCR quantitative (QMSP) a été utilisé pour détecter l'état de méthylation d'ADN dans les îlots CpG amont de miR-10a
. Dans cette étude, nous avons constaté que l'expression de miR-10a dans les cellules de GC était plus faible que dans les cellules normales, ce qui était dû à l'hyperméthylation des îlots CpG amont de miR-10a
. Nous avons également validé l'expression légèrement plus faible de miR-10a dans les tissus du GC que leurs tissus non néoplasiques adjacents dans 100 patients du GC et confirmé l'hyperméthylation des îlots CpG en amont de miR-10a
chez certains patients. De plus, la réintroduction de miR-10a dans des cellules GC est capable d'inhiber la prolifération cellulaire, la migration et l'invasion. Bioinformatique et analyse immunoblot ont indiqué que les rôles suppresseurs de tumeur de miR-10a dans les cellules du GC étaient peut-être par le ciblage HOXA1.

Conclusions /Importance

Nos données indiquent que miR-10a agit comme un suppresseur de tumeur dans les cellules de GC et est partiellement réduit au silence par l'ADN hypermethylation en GC, ce qui suggère que miR-10a peut servir comme cible diagnostique ou thérapeutique potentiel du GC

Citation:. Jia H, Zhang Z, Zou D, Wang B, Yan Y, M Luo et al. (2014) microARN-10a est régulée à la baisse par méthylation de l'ADN et les fonctions comme un suppresseur de tumeur dans les cellules du cancer gastrique. PLoS ONE 9 (1): e88057. doi: 10.1371 /journal.pone.0088057

Editeur: Jorg Tost, CEA - Institut de Génomique, France

Reçu le 26 Janvier 2013; Accepté 4 Janvier 2014; Publié le 31 Janvier, 2014

Droit d'auteur: © 2014 Jia et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenue par des subventions de la national science Foundation naturel de la Chine (2011, 91.129.716, à JY), la municipalité de Beijing science & Commission de la technologie (2010B071, à J.Y.), Institut des sciences médicales de base, l'Académie chinoise des sciences médicales (2009RC03, à J.Y .; 2010PYB06, à J.Y .; 2012G04, à J.Y.). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique (GC) est la deuxième cause la plus fréquente de décès par cancer dans le monde [1]. Jusqu'à présent, peu de gènes suppresseurs de tumeur et des gènes liés à la tumeur ont été rapportés dans GC. Bien que des études approfondies ont été réalisées pour identifier les voies et les mécanismes impliqués dans le développement du cancer génétique, quelques améliorations sur le diagnostic précoce du cancer ont été faites. Les microARN (miARN) sont de petits ARN endogènes non codantes qui ont été identifiés en tant que régulateurs post-transcriptionnels de l'expression des gènes. Des études antérieures ont indiqué que les miARN exercent leurs fonctions à travers imparfait appariement de bases avec la région 3 'non traduite (3'UTR) des ARNm cibles [2] et miARN ont été largement étudiés dans le cadre de la régulation du cycle cellulaire, la différenciation, le développement et l'apoptose [3], [4]. la preuve accumulée indique que miARN sont déréglementés dans diverses maladies, en particulier dans le cancer. Par exemple, miR-216b est nettement régulée à la baisse dans le carcinome du nasopharynx [4]; miR-340 est dérégulée dans le cancer du sein et peut inhiber la migration des cellules du sein cancéreuses et l'invasion [5]; et miR-31 a été identifié comme un oncogène dans l'œsophage épithélioma spinocellulaire [6]. Pris ensemble, les miARN ont été identifiés comme candidats potentiels pour des biomarqueurs diagnostiques nouveaux ou cibles thérapeutiques du cancer.

miR-10a a été rapporté à jouer un rôle important dans la genèse et le développement d'une variété de cancers humains. Par exemple, miR-10a est dérégulée dans la tête et du cou carcinomes épidermoïdes et également dans le carcinome hépatocellulaire [7], [8]. En outre, dans le cancer du col utérin humain, miR-10a sert un oncogène en régulant CHL1 [9]; la régulation de miR-10a dans la leucémie myéloïde chronique favorise CD34 + prolifération des cellules [10]. Cependant, la fonction de miR-10a et le mécanisme sous-jacent carcinogenèse gastrique restent floues. Dans cette étude, nous avons mesuré avec précision l'expression de miR-10a chez 100 patients atteints de cancer gastrique et étudié les rôles de miR-10a dans les cellules de cancer gastrique. Nous avons constaté que miR-10a a été régulée à la baisse dans les tissus du GC et appliquées expression de miR-10a réprimé la prolifération, la migration et l'invasion des cellules du GC
.

Les modifications épigénétiques dont hyperméthylation de l'ADN, la désacétylation des histones et la méthylation des histones sont étroitement associée à une inactivation du gène. Hyperméthylation de promoteur est considéré comme un mécanisme alternatif pour réguler à la baisse les gènes suppresseurs de tumeurs dans les cancers humains [11]. MiRNAs dont l'expression est réprimée par méthylation de l'ADN ont été rapportées dans quelques cancers humains [12] - [14]. Pour étudier plus avant si la régulation négative de miR-10a provient de l'hyperméthylation de la région génomique en amont de miR-10a
, nous avons analysé la méthylation de l'ADN de l'île de CpG dans la région promotrice du Mir- 10a
chez 55 patients du GC et a constaté que la régulation de miR-10a dans les tissus du GC pourrait être due à l'hyperméthylation des séquences CpG dans son promoteur.

Matériaux et méthodes

patients et Specimens

échantillons cliniques humains ont été recueillies à partir de prélèvements chirurgicaux de 100 patients atteints de GC à l'Institut du cancer et de l'hôpital, l'Académie chinoise des sciences médicales, Hôpital général de l'Armée de libération du peuple et de l'Hôpital Shanxi Cancer. Les tissus non néoplasiques adjacentes correspondantes de la marge tumorale macroscopique ont été isolés en même temps et utilisés comme témoins. Les tumeurs ont été organisées selon le TNM (2010) les critères de classification de l'Union internationale contre le cancer (UICC). Tous les échantillons ont été divisés en deux parties et ont été immédiatement congelés rapidement dans de l'azote liquide et stockés à -80 ° C jusqu'à l'extraction d'ARN. Quatre lignées cellulaires de cancer gastrique (HGC-27, MGC-803, CGS-7901 et MKN-45) ont tous été conservés dans notre laboratoire et entretenues dans du milieu DMEM ou 1640 avec 10% de FBS. Le Comité clinique éthique de la recherche de l'Institut des sciences médicales de base, l'Académie chinoise des sciences médicales a approuvé les protocoles de recherche et de consentement éclairé a été obtenu à partir des participants.

Extraction de l'ARN, l'ADNc Synthèse des ARNm et de miARN et Real- les dosages PCR temps

l'ARN total a été extrait des tissus et des cellules de cancer gastrique en utilisant Trizol réactif (Invitrogen, CA, USA) selon les instructions du fabricant. L'ARN a été quantifié par absorbance à 260 nm et l'ADNc a été synthétisé par M-transcriptase inverse de MLV (Invitrogen) à partir de 2 pg d'ARN total. Oligo (dT) 18 a été utilisé comme amorces de RT pour la transcription inverse de l'ARNm. Une tige-boucle RT amorce a été utilisée pour la transcription inverse de miARN. RT-PCR quantitative a été réalisée dans un Bio-Rad CFX96 en temps réel système de PCR (Bio-Rad, CA, USA) en utilisant kit SYBR Premix Ex Taq (Takara, Dalian, Chine) ou TaqMan sondes (Applied Biosystems, Foster City, CA , USA) selon les instructions du fabricant. Les conditions de PCR étaient les suivantes: 95 ° C pendant 30 s, suivie par 40 cycles de 95 ° C pendant 5 s et 60 ° C pendant 34 s. Pour les ARNm, les données ont été normalisées en utilisant le contrôle de GAPDH endogène. Pour miARN, U6 snRNA a été utilisé comme contrôle endogène. La quantité relative de miR-10a a été mesurée avec le 2 méthode -ΔΔCT. Les séquences des amorces sont présentées dans le tableau S1.

Extraction de l'ADN, des tissus cancéreux méthylation spécifiques PCR (MSP) et quantitative méthylation spécifiques PCR (QMSP)

ADN de haut poids moléculaire génomique a été extrait gastrique en utilisant un kit d'extraction d'ADN (biomed, BJ, Chine) selon les instructions du fabricant. modification par le bisulfite a été réalisée en utilisant le kit de séquençage EpiTect bisulfite (Qiagen, Hilden, Allemagne) selon le protocole. Jusqu'à 2 ug d'ADN génomique a été utilisé comme matériau de départ. L'ADN des lymphocytes normale traitée avec CpG méthyltransférase (M.SssI) (NEB, MA, USA) a été utilisé comme témoin positif, et un système de réaction sans modèle a été utilisé comme un contrôle à blanc.

Le sodium bisulfate- ADN traité a été amplifié en utilisant le Bio-Rad CFX96 temps réel PCR System (Bio-Rad) à l'aide KAPA SYBR® Kits qPCR rapide (Kapa Biosystems) dans les conditions suivantes: 95 ° C pendant 5 minutes, suivi de 40 cycles de 95 ° C, pendant 30 s, 54 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 30 s et une extension finale à 72 ° C pendant 10 min. GAPDH a été utilisé comme témoin interne. Les réactions ont été réalisées QMSP en triple. Le niveau de méthylation dans un échantillon a été estimée comme Lu L et al. décrit [15]. Les séquences des amorces sont présentées dans le tableau S1.

5-aza-2'-deoxyazacytidine traitement

cellules cancéreuses gastriques ont été ensemencées dans boîtes de 10 cm (1 x 10 6 cellules par boîte) un jour avant le traitement médicamenteux. Les cellules ont été traitées avec 1 uM 5-aza-2'-deoxyazacytidine (5-AZA) (Sigma, MO, USA) toutes les 24 h pendant 3 jours.

Culture cellulaire et Oligonucleotides Transfection

Les lignées de cellules gastriques humaines HGC-27, SGC-7901 et MKN-45 ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640 (Gibco, BRL, Royaume-Uni) des milieux supplémentés avec du sérum de veau fœtal à 10%, et MGC-803 a été maintenue dans DMEM (Gibco, BRL , Royaume-Uni) complété avec du sérum bovin fœtal à 10%. Ces lignées cellulaires ont été maintenues à 37 ° C dans l'air humidifié contenant 5% de CO 2.

Le miR-10a mimique, siRNA la bousculade imiter, siHOXA1 siARN et scramble ont été synthétisés par GenePharma (Shanghai, Chine ) et transfectées dans les cellules à une concentration finale de 50 nmol /L en utilisant DharmaFECT1 réactif (Dharmacon, TX, USA).

prolifération cellulaire et la formation Colony Assay

les mimic- ou siRNA- les cellules transfectées ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits (5000 cellules /puits). Les cellules ont été incubées avec 10% de la CCK-8 (DOJINDO, Japon) à 37 ° C jusqu'à une conversion de couleur visuelle est produite. Les taux de prolifération ont été déterminées à 0, 12, 24, 48, 72, 96 heures après la transfection.

Les cellules transfectées synoptiques ont été trypsinisées et réensemencées à 200 cellules par puits dans des plaques 6 puits et maintenus en 1640 avec 10% de FBS. Les cellules ont été cultivées pendant 7 jours, fixées avec du methanol et colorées avec 0,1% de cristal violet dans 20% de methanol pendant 15 min.

Essai de l'apoptose des cellules

dosages d'apoptose ont été réalisées dans HGC-27, et lignées de cellules MGC-803 en utilisant le kit Annexin V-FITC Apoptosis Detection I (BD Biosciences) selon le protocole du fabricant, puis analysé par Calibur cytomètre de flux (BECTON DICKINSON).

migration cellulaire et Invasion Assays

Un essai de cicatrisation a été réalisée pour évaluer la migration cellulaire. Une plaie artificielle a été créée sur une monocouche de cellules confluentes sans FBS en utilisant une pointe de pipette 200 pi 24 heures après la transfection. Pour visualiser les cellules et la cicatrisation des plaies de la migration, les images ont été prises à 0, 12, 24, 36, 48, 60 heures.

Pour les essais d'invasion Transwell, HGC-27 et les cellules MGC-803 en suspension dans 0,2 ml de RPMI 1640 ou DMEM sans FBS ont été placés sur la chambre supérieure de chaque insert (Millipore, MA, USA) prérevêtue avec 40 pi de 1 mg /ml matrigel. La chambre inférieure a été remplie avec 600 pi de RPMI 1640 ou DMEM avec 10% de FBS comme l'attractant nutritionnel. 24 heures plus tard, les cellules d'invasion attachées à la surface inférieure ont été fixées avec 20% de methanol et colorées au May-Gruwald-Giemsa (MGG). Les membranes ont ensuite été découpés et intégrés dans des lamelles. Les cellules des trois champs visuels différents ont été comptés, et tous les essais ont été effectués en triple.

Western blotting

Analyse par transfert de Western a été réalisée selon des procédés classiques. Les protéines ont été séparées par 10% de SDS-PAGE puis transférés sur des membranes de PVDF (Amersham, Buckinghamshire, UK). Les membranes ont été bloquées pendant une nuit avec du lait en poudre de 5% non gras et incubées pendant 2 h avec un anticorps anti-HOXA1 (Bioworld, MN, USA) à 1:500 dilutions ou anticorps anti-GAPDH (Proteintech, Chicago, États-Unis) à 1: 50.000 dilutions. Après lavage avec du TBST (Tris 10 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, et 0,1% de Tween 20), les membranes ont été incubées pendant 2 h avec un anticorps secondaire (zsgb-bio, Beijing, Chine).

Statistiques

Chaque expérience a été répétée au moins trois fois. test t de l'étudiant (bilatéral) et x Test 2 ont été réalisées, et la signification statistique a été défini comme α = 0,05 (deux côtés). Les moyens ± SD sont affichés dans les figures.

Résultats

miR-10a est régulée à la baisse dans les cellules cancéreuses gastriques

Nous avons examiné l'expression de maturité miR-10a quatre lignées humaines gastriques de cellules cancéreuses (HGC-27, MGC-803, SGC-7901 et MKN-45) et une lignée de cellules de l'épithélium gastrique humaine (GES). Le niveau de miR-10a SGE expression était significativement plus élevée que les niveaux dans les deux lignées cellulaires de cancer gastrique (HGC-27 et MGC-803) et n'a pas été significativement mais visiblement supérieur à celui des niveaux dans les deux autres lignées cellulaires de cancer gastrique (MKN-45 et SGC-7901) (Fig. 1a). Ces données suggèrent que la régulation négative de miR-10a pourrait être pertinent à la genèse et le développement de GC.

L'expression de miR-10a chez les patients du GC clinique et leur corrélation avec les caractéristiques clinicopathologiques

Pour étudier davantage la relation entre miR-10a et GC genèse, nous avons détecté l'expression de miR-10a dans 100 patients cliniques par TaqMan sonde dérivée PCR en temps réel, comme décrit ci-dessus. Sur 100 paires d'échantillons de GC, l'expression de miR-10a a été régulée à la baisse dans 58 cas (58/100, 58%) par rapport aux tissus adjacents correspondants (Fig. 1b). Dans l'ensemble, l'expression de miR-10a a été régulée à la baisse dans les tissus du GC par rapport aux tissus adjacents, bien que la régulation à la baisse n'a pas été statistiquement significative (p = 0,148, test t apparié, deux-tailed) (fig. 1c).

pour évaluer la corrélation entre l'expression de miR-10a et les caractéristiques clinicopathologiques, les patients ont été divisés en deux groupes en fonction de l'expression relative de miR-10a dans les tissus cancéreux selon un document publié précédemment [16] . Comme on le voit dans le tableau S2, une association statistiquement significative n'a été observée entre les deux groupes TNM. Il y a plus de patients qui sont dans I + stade II dans le groupe avec une plus faible expression de miR-10a dans leurs tissus GC. Cette relation a indiqué que miR-10a peut être plus important au début de la carcinogenèse du cancer. Cependant, nos données ont démontré que le niveau de miR-10a expression avait pas de corrélation avec l'âge, le sexe, le type histologique, le pourcentage de la tumeur, l'invasion veineuse, l'invasion du nerf, la position, Borrmann dactylographie, stade pT, le stade pN ou le stade pM.

miR-10a inhibe la prolifération cellulaire in vitro

Pour explorer le rôle de miR-10a dans la carcinogenèse gastrique, nous avons transfecté miR-10a imiter dans les lignées de cellules GC HGC-27 et MGC-803, tous deux présenté une haute efficacité de transfection (Fig. 2a). Comme cela est démontré par la CCK-8 essais de croissance 0, 1, 2, 3 et 4 jours après la transfection mimétique, la surexpression de miR-10a réduit la prolifération cellulaire dans les deux lignées cellulaires, alors que l'imitateur d'embrouillage n'a eu aucun effet sur la prolifération cellulaire par rapport aux cellules non traitées, (Fig. 2b). Par la suite, des dosages de formation de colonies ont été effectués pour évaluer la capacité proliférative des cellules HGC-27 et MGC-803 transfectées mimiques et a révélé que la surexpression de miR-10a HGC-27, les cellules réduit la formation de colonies (Fig. 2c). Cependant, aucune des cellules MGC-803 formés colonies, ce qui pourrait être due à relativement faible adhésion des cellules. Pour traiter davantage l'effet de miR-10a sur l'apoptose cellulaire dans les deux lignées cellulaires GC, l'apoptose précoce des MGC-803 et HGC-27 des cellules a été examinée par coloration à l'annexine V après la transfection mimétique miR-10a. Comme prévu, quelques cellules au début apoptotiques (20,8% en HGC-27 et 22,9% en MGC-803) ont été détectés dans les cellules synoptiques traités scramble, alors que le traitement imite miR-10a a augmenté le pourcentage de cellules apoptotiques précoces (28,4% en HGC -27 et 27,7% en MGC-803) (Fig. 2d). Collectivement, nous avons conclu que miR-10a pourrait supprimer la survie cellulaire dans les cellules du GC en induisant l'apoptose des cellules.

miR-10a inhibe la migration cellulaire et Invasion in vitro

Nous avons en outre a évalué les effets de miR-10a sur la migration et l'invasion cellulaire, qui étaient les principaux déterminants de la progression maligne et les métastases. La capacité de migration a été démontrée par un essai cicatrisation de la plaie /scratch en HGC-27 et MGC-803 cellules. Les deux lignées de cellules traitées avec miR-10a mimique étaient typiquement moins migratoire que ceux traités avec le contrôle de brouillage ou de cellules non traitées à 12, 24, et 36 heures après grattage (Fig. 3a). En outre, nous avons effectué une analyse de l'invasion des cellules Matrigel et coloré les cellules envahies pour mesurer les capacités d'invasion directionnelles des cellules après avoir exprimé ectopique miR-10a dans les deux lignées cellulaires. Le invasivité des cellules transfectées avec miR-10a mimique a considérablement diminué par rapport à la commande de brouillage et de cellules non traitées (figure. 3b). Ces résultats ont démontré que miR-10a a joué un rôle important dans la régulation de la migration cellulaire et l'invasivité en GC et a suggéré que la régulation négative de miR-10a pourrait contribuer à la métastase de la tumeur dans la carcinogenèse gastrique.

miR-10a Cibles HOXA1 en GC

MiRNAs remplissent des fonctions biologiques en régulant négativement leurs gènes cibles. Il a été rapporté que l'oncogène est HOXA1 une cible directe de miR-10a mégacaryocytopoïèse et le cancer du pancréas humain [17] - [19]. Comme prédit par PicTar, il y avait une séquence complémentaire entre l'a-miR-10a et HOXA1 3'UTR (Fig. 4a). Cependant, on ignore si miR-10a régule la prolifération cellulaire, la migration et l'invasion en GC en ciblant HOXA1. Pour clarifier leur relation réglementaire, nous avons d'abord détecté la protéine et les taux d'ARNm de HOXA1 dans les cellules transfectées miment miR-10a HGC-27 et MGC-803 en utilisant western blot et RT-PCR. Nous avons observé une diminution évidente du niveau de la protéine en présence d'HOXA1 mimétiques miR-10a par rapport au témoin de brouillage dans les deux cellules (Fig. 4b). Le niveau de HOXA1 d'ARNm a également été régulée à la baisse dans HGC-27 cellules, ce qui suggère que miR-10a inhibe l'expression de HOXA1 en dégradant l'ARNm de HOXA1 dans HGC-27 cellules. Cependant, il y avait peu de changement dans le niveau d'ARNm de HOXA1 dans MGC-803 cellules, ce qui suggère que miR-10a peut réguler à la baisse l'expression de HOXA1 par la répression de la traduction, mais pas clivage de l'ARNm dans MGC-803 cellules (fig. 4c). En outre, nous avons analysé les niveaux de HOXA1 de protéines chez 24 patients du GC. Parmi ces échantillons, il y avait 12 patients chez lesquels miR-10a a été régulée à la baisse dans leurs tissus GC et 12 patients chez lesquels miR-10a a été régulée à la hausse dans leurs tissus GC (figure 4d.). HOXA1 a été régulée à la hausse dans la plupart des patients chez lesquels miR-10a a été régulée à la baisse dans leurs tissus GC. De même, HOXA1 a été régulée à la baisse dans la plupart des patients chez lesquels miR-10a a été régulée à la hausse dans leurs tissus GC. Une comparaison des niveaux miR-10a et les niveaux de HOXA1 en GC de protéines a révélé une corrélation inverse entre miR-10a et HOXA1 (r 2 = 0,1839, P = 0,0366) (Fig. 4E). Collectivement, ces résultats fournissent des preuves solides que HOXA1 est une cible directe de miR-10a en GC. Nous avons également détecté le niveau de HOXA1 chez ces patients d'ARNm et observé que le niveau de HOXA1 chez plusieurs patients de l'ARNm était pas compatible avec le niveau de protéine qui a indiqué que miR-10a régule l'expression de sa cible, HOXA1, par la répression de la traduction, mais pas l'ARNm clivage chez ces patients (figure. S1).

knock-down de Cell HOXA1 Supprimée cancer gastrique croissance et migration in vitro

ensuite, nous avons demandé si HOXA1 joué importante rôles dans les cellules du cancer gastrique. Pour examiner le rôle de HOXA1 en GC, nous avons frappé le bas HOXA1 endogène dans HGC-27 et des lignées de cellules MGC-803 pour détecter l'effet sur la prolifération cellulaire et la migration cellulaire. Nous avons observé que la répression HOXA1 a inhibé la prolifération cellulaire et la migration des HGC-27 et MGC-803 cellules, respectivement (fig. 5a et 5b). Ces résultats suggèrent que les fonctions miR-10a comme suppresseur de tumeur dans les cellules du GC en supprimant l'expression de HOXA1.

miR-10a est épigénétique Silenced en GC lignées cellulaires

Pour élucider si la faible expression de Mir- 10a dans le tissu GC est le résultat de modifications épigénétiques, nous avons traité HGC-27, MGC-803, CGS-7901 et MKN-45 des cellules avec un inhibiteur de méthylation de l'ADN 5-aza. L'expression de miR-10a a été régulée à la hausse dans HGC-27, SGC-7901 et MKN-45 cellules quand ils ont été traités par AZA, ce qui suggère que l'expression de miR-10a peut être réprimée dans ces cellules par méthylation de l'ADN (figure. 6a).

pour étudier la régulation de miR-10a par méthylation de l'ADN, nous avons cherché la base de données du génome humain pour la présence d'îlots CpG autour de miR-10a en utilisant le logiciel "CpG île Searcher» et identifié un îlot CpG situé 1638 pb en amont de miR-10a
(Fig. 6b). De plus, nous avons détecté l'état de méthylation d'ADN à l'aide QMSP et MSP dans les quatre lignées de cellules GC. L'île CpG a été hyperméthylés dans les quatre lignées cellulaires GC, ce qui était conforme à la faible expression de miR-10a dans ces lignées de cellules GC. Lorsque les lignées cellulaires du GC ont été traités avec 5-aza-CdR, le niveau de méthylation a été diminué par rapport au groupe de DMSO (. Figure 6c).

Le Down-régulation de miR-10a en GC patients était due à l'hyperméthylation de

de ses îlots CpG Nous avons étudié davantage le statut de méthylation de l'îlot CpG dans le tissu GC et le tissu normal adjacent de 55 cas sélectionnés au hasard par le biais QMSP. Le niveau de méthylation dans les tissus GC 55 était plus élevé que dans les tissus adjacents non cancéreuses (p < 0,01), ce qui est cohérent avec la faible expression de miR-10a dans les tissus GC (figure 6d.). En outre, nous avons choisi au hasard deux paires d'échantillons sur lesquels analyser le niveau de méthylation de l'ADN par séquençage bisulfate PCR (BSP) pour valider l'exactitude du MSP. Les résultats de la BSP étaient en accord avec celui de la QMSP et ont été complétées comme la Fig. S2. En outre, le taux de méthylation de miR-10a (M /M + U) chez ces patients atteints de GC a montré une corrélation inverse entre l'expression de miR-10a (r 2 = 0,1956, P = 0,0006) (Fig. 6e). Nous avons également détecté le niveau de méthylation de miR-10a dans les cellules gastriques normales et des lignées cellulaires de cancer gastrique. Les résultats de QMSP ont révélé que l'île CpG a été partiellement méthylé dans les cellules GES mais extrêmement hyperméthylé dans les deux lignées cellulaires de cancer gastrique HGC-27 et MGC-803, qui a également suggéré que l'île CpG en amont de miR-10a
a été hyperméthylé dans les cellules de GC (figure. de 6f). Collectivement, ces résultats fournissent des preuves solides que l'expression de miR-10a a été régulée par méthylation de l'ADN chez ces patients du GC. La régulation à la baisse de miR-10a chez les patients du GC était due à l'hyperméthylation de ses îlots CpG.

Discussion

Dans cette étude, nous avons déterminé que miR-10a a été régulée à la baisse chez les humains cancer de l'estomac en partie en raison de son hyperméthylation de promoteur d'ADN. D'autres études ont démontré que la surexpression de miR-10a supprime la prolifération cellulaire, la migration et l'invasivité dans les lignées cellulaires GC HGC-27 et MGC-803, éventuellement en ciblant le HOXA1 oncogène.

MiRNAs ont été rapportés pour réguler diverses développementale et les processus cellulaires, et sont impliqués dans de nombreuses maladies humaines, en particulier dans le cancer. MiRNAs suppriment l'expression des gènes en ciblant les ARNm en se liant à leurs 'UTR 3. Ces miARN présentent des rôles régulateurs dans la pathogenèse du cancer et sont impliqués dans la prolifération cellulaire, la différenciation, l'apoptose, les métastases et la résistance [4], [20]. MiR-10a joue un rôle important dans plusieurs cancers, dont le cancer hépatocellulaire [9], le cancer du pancréas [17], la leucémie myéloïde aiguë [21] et de la leucémie myéloïde chronique [10]. L'expression anormale de miR-10a est susceptible de jouer un rôle crucial dans la transformation maligne et est relative à spécificité tissulaire. Sa dérégulation peut contribuer au développement de la néoplasie de l'estomac.

La validation de l'expression de miR-10a dans des échantillons cliniques ont démontré que miR-10a a été régulée à la baisse dans 58 (58/100, 58%) tissus GC par rapport aux tissus adjacents. Cependant, Weidong Chen et al.
Étudié l'expression de miR-10a dans 33 cas de GC et a observé que l'expression de miR-10a était plus élevée dans les tissus du GC que dans les tissus adjacents [22]. Le manque d'uniformité peut être le résultat des différentes quantités d'échantillons cliniques et de la variation indistincte de miR-10a dans les tissus GC. Nos données devraient être plus biologiquement Representive à cause des grands nombres d'échantillons cliniques. Seule une partie supérieure, mais pas tous les patients atteints de GC ont une régulation à la baisse miR-10a dans leurs tissus GC Bien que les fonctions miR-10a comme un suppresseur de tumeur dans des cellules cancéreuses gastriques. Cela peut être à cause du mécanisme distinct de la genèse de GC chez différents individus. Il pourrait y avoir d'autres gènes importants ou les facteurs responsables de la tumorigenèse chez les patients du GC dans les tissus dont GC miR-10a était inchangée ou régulés à la hausse. En outre, l'expression de miR-10a ne présente aucune corrélation avec les caractéristiques clinico sauf pour le stade TNM, indiquant que miR-10a pourrait jouer un rôle partiel dans la tumorigenèse en particulier dans les premiers stades.

De nombreux miARN ont été signalés en corrélation avec tumorigenèse, cependant, le mécanisme moléculaire sous-jacent reste incertain. Dans notre rapport, une analyse fonctionnelle de miR-10a, y compris la prolifération cellulaire, la migration et l'invasion des essais, nous a permis de mieux comprendre la contribution de miR-10a à carcinogenèse gastrique. La transfection de miR-10a miment la prolifération cellulaire inhibée de façon significative, la migration et l'invasivité des cellules GC, ce qui indique que la répression de miR-10a pourrait favoriser la progression de la tumeur dans la carcinogenèse gastrique. Les futures études sont nécessaires pour élucider ce mécanisme.

Dans le génome humain, miR-10a
est situé en amont de HOXB4
. miR-10b
, un autre membre de la famille miR-10, est situé en amont de HOXD4
. Ces deux éléments sont différents les uns des autres dans une seule base et présentent une séquence de semences identiques, ce qui suggère des fonctions similaires. Kwoneel Kim [12] a rapporté que miR-10b joue un rôle dans GC comme un suppresseur de tumeur. Dans notre étude, nous avons démontré que la surexpression de miR-10a inhibé la prolifération tumorale, la migration et l'invasivité, qui était similaire à la fonction de miR-10b GC. Les gènes Hox sont hautement conservés des facteurs de transcription qui sont déterminants pour la formation de motifs antéro-postérieur correcte de l'axe du corps [23]. HOXA1 a été validé comme une cible directe de miR-10a dans le cancer du pancréas humain [17] et mégacaryocytopoïèse [18]. Nous avons également observé que la surexpression de miR-10a a diminué les taux de protéine HOXA1 dans deux lignées cellulaires GC, ce qui suggère que HOXA1 est une cible directe de miR-10a dans le cancer gastrique.

Les modifications épigénétiques se sont révélés être des médiateurs clés qui sous-tend la régulation négative de l'expression des miARN et présentent une corrélation étroite avec la cancérogenèse [12], [13], [24]. Nos données démontrent que le hyperméthylation de l'ilôt CpG en amont de miR-10a
conduit à la régulation à la baisse miR-10a dans des lignées cellulaires de patients atteints de GC et GC. De plus, le traitement a augmenté l'AZA miR-10a dans les lignées cellulaires du GC. D'après nos constatations, le statut de méthylation de miR-10a peut être utilisé comme un biomarqueur potentiel dans GC.

En résumé, cette étude rapporte que les actes miR-10a comme un suppresseur de tumeur dans les cellules de GC et est en partie vers le bas régulés par l'ADN hyperméthylation. L'expression forcée de miR-10a supprime la prolifération cellulaire, la migration et l'invasivité in vitro
. L'état de méthylation et le niveau d'expression de miR-10a peut servir en tant que biomarqueurs potentiels de CPG et miR-10a peuvent avoir une valeur thérapeutique potentielle dans le traitement du cancer. D'autres études sur la régulation épigénétique de l'expression des miARN sont nécessaires, et la régulation de l'expression des miARN par des médicaments épigénétiques peuvent fournir une nouvelle stratégie thérapeutique pour les cancers humains gastriques et autres.

Informations complémentaires
Figure S1.
Le niveau d'ARNm de HOXA1 dans les 24 patients du GC a été détectée par qRT-PCR
doi:. 10.1371 /journal.pone.0088057.s001
(TIF)
Figure S2. Analyse
BSP de l'état de méthylation chez deux patients du GC. Rempli et les cercles ouverts représentent méthylés et des sites CpG non méthylés respectivement
doi:. 10.1371 /journal.pone.0088057.s002
(TIF)
Tableau S1.
Les amorces sont utilisées dans cet article
doi:. 10.1371 /journal.pone.0088057.s003
(XLSX)
Tableau S2.
association entre l'expression de miR-10a avec des caractéristiques clinico chez les patients atteints de cancer gastrique
doi:. 10.1371 /journal.pone.0088057.s004
(XLSX)

Remerciements

Les auteurs remercient Hualu Zhao IBMS (Institut des sciences médicales de base), PUMC (Peking Union Medical College) pour l'assistance technique et le Dr Zhang Hongkai de l'hôpital Jiuxianqiao pour son aide en immunohistochimie.

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