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PLOS ONE: resvératrol inhibe la croissance du cancer gastrique par Induire G1 Phase Arrestation et sénescence dans un Sirt1 dépendant Manner

Résumé

resvératrol, un composé polyphénolique d'origine naturelle, a été signalé à exercer une activité anticancéreuse en affectant cibles moléculaires diverses. Dans cette étude, nous avons examiné les effets et les mécanismes sous-jacents du resvératrol sur le cancer gastrique. Nous avons trouvé que le resvératrol a inhibé la prolifération des cellules du cancer de l'estomac d'une manière dépendante de la dose. A la concentration de 25 et 50 uM, le resvératrol a inhibé la viabilité des cellules et diminue le potentiel clonogénique des cellules cancéreuses gastriques. traitement resvératrol arrêté des cellules de cancer gastrique dans la phase G1 et a conduit à la sénescence à la place de l'apoptose. Les régulateurs du cycle cellulaire et les voies de sénescence, y compris la cycline D1, la kinase dépendante de la cycline (CDK4 et 6), p21 et p16 ont été dérégulée par traitement resvératrol. Les effets inhibiteurs du resvératrol sur le cancer gastrique ont également été vérifiés in vivo
en utilisant un modèle de xénogreffe de souris nude. Resvératrol (40 mg /kg /j) exerce une activité inhibitrice sur le développement du cancer gastrique et une diminution significative des fractions de cellules Ki67-positives dans les échantillons tumoraux des souris nude. Après traitement resveratrol, l'induction de la sénescence et les changements dans l'expression des régulateurs impliqués dans les voies du cycle cellulaire et de la sénescence étaient semblables à ce que nous avons observé in vitro
. Toutefois, l'épuisement des Sirtuin (Sirt) 1 a renversé les effets décrits ci-dessus du resvératrol à la fois in vitro
et in vivo
. Nos données suggèrent que le resvératrol inhibe le cancer gastrique de manière Sirt1-dépendante et de fournir des preuves détaillées de la possibilité d'appliquer le resvératrol dans la prévention du cancer de l'estomac et de la thérapie

Citation:. Yang Q, Wang B, Zang W, Wang X Liu Z, Li W, et al. (2013) resvératrol inhibe la croissance du cancer gastrique par Induire G1 Phase Arrestation et sénescence d'une manière Sirt1-dépendante. PLoS ONE 8 (11): e70627. doi: 10.1371 /journal.pone.0070627

Editeur: Dominique Heymann, Faculté de médecine de Nantes, France

Reçu 20 Mars 2013; Accepté le 19 Juin 2013; Publié: 21 Novembre 2013 |

Droit d'auteur: © 2013 Yang et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenu par la national science Foundation naturel de la Chine (n ° 81101869, 81100103, 81171536 et 81000868), le Programme de recherche de base nationale de Chine (Programme 973, No. 2012CB911202) et Fondation de l'innovation indépendante de l'Université du Shandong (2012TS108) .La les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

intérêts concurrents:.. les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

introduction

le cancer gastrique (GC) est le quatrième cancer le plus fréquent et la deuxième cause de mortalité liée au cancer dans le monde. Selon une estimation globale, un total de 989,600 nouveaux cas de GC ont été diagnostiqués et un minimum de 738.000 patients sont morts de cette maladie en 2008, représentant 10% du total des décès par cancer [1]. Bien que l'incidence de la GC a diminué au niveau mondial, il reste élevé dans les pays en développement, en particulier en Chine [1], [2]. Des études antérieures ont révélé la relation intime entre la gastrite chronique causée par l'infection de Helicobacter pylori et le développement du GC [3]. De plus, les facteurs génétiques, environnementaux, alimentaires et d'autres hôtes ont été impliqués dans le processus oncogénique gastrique [1]. Comme il est encore difficile de faire un diagnostic précoce pour GC, la plupart des patients sont diagnostiqués à un stade avancé. Malgré l'amélioration des thérapies conventionnelles pour GC avancées, y compris la chirurgie, la chimiothérapie et la radiothérapie, la longueur ou la qualité de vie des patients atteints de GC avancée est encore faible [2], [4]. Par conséquent, l'exploration de nouveaux médicaments préventifs ou des cibles thérapeutiques de GC est urgent.

La consommation de fruits et légumes frais contribue à une diminution de l'incidence du cancer, y compris GC [2], [5]. Les applications cliniques suggèrent également que certaines molécules alimentaires bioactifs ont la capacité d'inhiber de multiples étapes oncogènes [5] - [7]. Resveratrol (Res, 3,5,4'-trihydroxystilbène) est un phénomène naturel composé polyphénolique présente dans près de 70 espèces de plantes, y compris la peau des raisins rouges, les arachides, les baies et les autres [6] - [8]. Res a été signalée pour exercer des activités antitumorales en 1997 [8]. Des rapports ultérieurs ont montré que Res confère des effets inhibiteurs sur plusieurs types de cancers, comme le cancer du côlon, le cancer du sein et de lymphomes, et affecte les cibles moléculaires différentes [9] - [11]. Sirtuin 1 (Sirt1), une classe III nicotinamide adénine nucléotide (NAD +) - dépendante désacétylase histone /protéine, a été signalé comme étant un objectif clé de la résolution dans plusieurs modèles tumoraux [9], [10]. Toutefois, certaines données montrent des résultats contraires suggérant que Res exerce des effets chimioprotectrices indépendante de Sirt1 [11]. Les effets inhibiteurs de Res sur GC et le mécanisme sous-jacent ne sont pas bien étudiés.

Dans la présente étude, nous avons montré que Res inhibé la prolifération des cellules GC in vitro
. traitement Res arrêt du cycle cellulaire induite à la phase G1 et a conduit à la sénescence cellulaire. Ces effets de Res ont été rétablis par l'épuisement des Sirt1. Les activités de SIRT1 dépendant inhibitrices de Res sur les cellules du GC ont également été vérifiés in vivo
. Pris ensemble, nos résultats indiquent que Res exerce des effets inhibiteurs SIRT1-dépendante sur GC et suggère un rôle thérapeutique pour Res en GC.

Matériel et méthodes de

Déclaration
éthique

Tous études sur les animaux ont été approuvés par le comité d'éthique de la Faculté de médecine (n ° 001 en 2011 pour l'approbation éthique animale) Université de Shandong et tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance.

lignées cellulaires, conditions de culture et de traitement Res

lignées cellulaires de GC Human AGS (obtenus à partir de cellules Resource Center, Institut de Shanghai de biochimie et de biologie cellulaire à l'Académie chinoise des sciences), BGC-823 et SGC-7901 (acheté auprès de Centre chinois de type Culture Collection, Wuhan, Chine) ont été utilisés dans cette étude. Les cellules ont été cultivées dans du F12 (AGS) ou le RPMI 1640 (BGC-823 et CGS-7901) contenant 10% de FCS, 100 unités /ml de pénicilline et de 2 mmol /L de L-glutamine à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% CO 2. Haute pureté Res a été acheté chez Sigma (St. Louis, MO, USA), dissous dans du DMSO et a ajouté dans le milieu de culture à la concentration indiquée. Toutes les expériences ont été réalisées 24 h après Res supplémentation, sauf indication contraire.

Petit interférence ARN Transfection

Chimiquement modifiés petits ARN interférents (siRNA) ciblant SIRT1 et de contrôle siRNA ont été achetés à GenePharma (Shanghai , Chine). La séquence de l'ARNsi a été sirt1 CCAUCUCUCUGUCACAAAUTT 5'-3 '. Les cellules ont été incubées pendant une nuit, puis transfectées avec le siRNA en utilisant Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) selon le protocole du fabricant. Quarante-huit heures après transfection de siRNA, les cellules ont été traitées avec 50 uM Res pendant 24 h avant d'une étude plus approfondie.

La prolifération a été évaluée en utilisant le titre Cell 96 ® AQueous One Solution
Viabilité cellulaire Assay prolifération cellulaire Assay (Promega, Madison, WI, USA). En bref, 2 x 10 3 cellules ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits et on a laissé croître pendant 24 h. Vingt-quatre heures plus tard, 20 pi de MTS (3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxy-méthoxyphényl) -2- (4-sulfophényl) -2H-tétrazolium) a été ajouté à chaque bien. Après une incubation de 3 h à 37 ° C, l'absorbance à 490 nm a été enregistrée sur un Varioskan flash Multiplate Reader (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). La viabilité cellulaire a été calculée par la formule suivante: la viabilité cellulaire relative = (absorbance moyenne de groupe traité - absorbance moyenne de blanc) /(absorbance moyenne de l'absorbance moyenne de contrôle de blanc). Les dosages ont été effectués en triple et répétées trois fois.

Formation Test de colonies

cellules ont été ensemencées dans des plaques 6 puits (300 ou 500 cellules par puits) et on incube pendant 10 jours jusqu'à ce que les colonies étaient assez grand pour être clairement discernées. Les cellules ont été fixées avec du methanol et colorées avec du cristal violet et le nombre de colonies avec plus de 50 cellules ont été comptées manuellement. Des expériences ont été réalisées en triple et répétées trois fois.

Analyse de Cycle cellulaire

Les cellules ont été récoltées, fixées avec pré-refroidi 70% d'éthanol à 4 ° C pendant la nuit puis colorées avec l'iodure de propidium (Beyotime , Jiangsu, Chine) contenant RNase A à 37 ° C pendant 30 minutes dans l'obscurité. La distribution du cycle cellulaire a été déterminée en utilisant un cytomètre de flux (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) et les données ont été analysées avec le logiciel Multicycle (Flow Systems Phoenix, San Diego, CA, USA). Des expériences ont été réalisées indépendamment trois fois.

Apoptose Assay

Détection et quantification de l'apoptose ont été réalisées par l'étiquetage des cassures de brins d'ADN en utilisant un In Situ cellulaire kit de détection de la mort, TMR rouge (Roche Applied Science, Bâle, Suisse). Des cellules ou des coupes en paraffine de xénogreffes ont été marquées avec TUNEL selon les instructions du fabricant. Pour les cellules, le traitement avec 0,2 mM H 2O 2 pour 12 h servi comme témoin positif. Pour les sections de paraffine, les contrôles positifs ont été achetés chez Millipore (Billerica, MA, USA). Les noyaux ont été contre-colorées avec du DAPI (Beyotime) et les lames ou les sections ont été imagées par microscopie à fluorescence (Olympus, Tokyo, Japon) en utilisant un logiciel cellSens dimension. Des expériences ont été réalisées indépendamment trois fois.

β-galactosidase

sénescence a été évaluée à l'aide d'une sénescence β-galactosidase Kit (Beyotime). En bref, des cellules ou des coupes congelées de xénogreffes ont été fixées et ensuite incubées avec fraîchement préparée β-galactosidase (β-Gal) une solution de coloration à 37 ° C pendant une nuit. Des expériences ont été réalisées indépendamment trois fois.

Stable Hairpin ARN (shRNA) Cellules GC de lentiviraux courte

vecteurs lentiviraux contenant le contrôle ou Sirt1 shRNA ont été construits par GenePharma et utilisés pour transfecter BGC-823 cellules. knockdown efficace de Sirt1 a été vérifiée par western blot. Pour la transduction stable, le contrôle-lentivirus infecté ou Sirt1 shRNA-lentivirus infectés BGC-823 cellules ont été cultivées dans un milieu complet fourni avec 2 pg /ml de puromycine pendant quatre semaines et considéré comme LV-C et LV-S, respectivement.

Femme athymiques BALB /c souris nude
souris Nude modèle de xénogreffe (6~8 semaines) ont été achetés à l'Université de Pékin (Beijing, Chine) et ont été maintenues dans des conditions exemptes d'organismes pathogènes spécifiques à la clé Laboratoire de cardiologie Remodeling et fonction de recherche, l'hôpital Qilu, l'Université du Shandong. Les souris ont été divisées au hasard en quatre groupes (8 souris par groupe): le groupe I et II, BGC-823 cellules (1 x 10 6 cellules par injection dans 0,1 ml de PBS) ont été injection sous-cutanée dans la région du flanc du souris nude; groupe III, LV-C (BGC-823 cellules) a été injectée; et le groupe IV, LV-S (BGC-823 cellules) a été injecté. Après l'implantation, les souris nude des groupes II, III et IV ont été traités avec Res (40 mg kg -1 dans 0,1 ml d'huile végétale, administrée par gavage, une fois par jour). La taille de la tumeur sous-cutanée a été mesurée avec un pied à coulisse et les volumes tumoraux ont été calculés par la formule (longueur) x (largeur 2) /2. Les souris ont été sacrifiées quatre semaines plus tard. Les tumeurs ont été récoltées et traitées pour des études de transfert Western et immunochimiques.

Temps réel par PCR quantitative (RT-QPCR)

ARN total dans les cellules a été isolé en utilisant le réactif Trizol (Invitrogen) et transformés en ADNc en utilisant la trousse de réactifs PrimeScript RT ™ (Takara, Tokyo, Japon). RT-QPCR a été réalisée pour les gènes, y compris la cycline D1, la kinase cycline-dépendante 4 (CDK4), p21 et β-actine comme décrit précédemment [12]. Les séquences des amorces d'amplification sont énumérées dans le tableau S1. L'expression de l'ARNm de la cycline D1, de la CDK4 et p21 a été étalonnée par rapport à la ß-actine par rapport au témoin en utilisant le 2 -ΔΔCt méthode. Chaque expérience a été répétée en triple.

Western Blot

protéine totale à partir des cellules ou des échantillons de tumeur a été extraite avec du tampon RIPA Lyse (Beyotime), comme décrit [12]. La concentration en protéine a été déterminée en utilisant le kit Protein Assay BCA (Pierce, Rockford, IL, USA). La membrane a été sondée avec des anticorps contre Sirt1 (Abcam, Cambridge, MA, USA), bcl-2, bax, caspase-3, la cycline D1, CDK4 et 6 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), p16 et p21 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). L'anticorps secondaire utilisé était une peroxydase de raifort (HRP) conjugué à anti-lapin ou un anticorps de souris. Les bandes de protéines ont été visualisées en utilisant un système ECL (Pierce). β-actine (Cell Signaling) a servi de témoin de chargement.

immunohistochimie

Les échantillons de tumeurs des souris nues ont été déparaffinées, réhydratés et de l'antigène récupérés. Les sections ont été incubées avec un anticorps dirigé contre Ki67 (1:500, Abcam) pendant une nuit à 4 ° C. HRP-conjugué IgG de lapin anti-et DAB coloration ont été utilisées pour visualiser l'anticorps Ki67. Les lames ont été finalement de contraste avec l'hématoxyline. Les lames ont été imagées par un microscope optique Olympus (Tokyo, Japon) en utilisant le logiciel cellSens Dimension. Les cellules Ki67-positives ont été comptées manuellement et Ki67 pour cent des cellules positives ont été évaluées par champs. Cinq champs distincts ont été comptés pour chaque section.

Analyses statistiques

Les données ont été exprimées comme la moyenne ± écart-type. Les analyses statistiques ont été effectuées en utilisant le paquet statistique pour les sciences sociales (SPSS, la version 16.0, Chicago, IL, USA) par une voie ANOVA avec post-hoc test de Tukey. P-valeurs inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.

Res Empêche la viabilité des cellules de GC dans un Manner
SIRT1 dépendant

Trois lignées de cellules GC (AGS

Résultats, BGC-823 et SGC-7901) ont été examinés dans nos expériences. Cultiver les cellules dans le véhicule (DMSO à 0,1%) n'a pas affecté la viabilité des cellules (données non montrées). Cependant, lorsqu'ils sont traités avec différentes concentrations de Res pendant 24 heures, la prolifération des cellules a été inhibée selon la dose à 25, 50, 100 et 200 pm Res (figure 1A). Il faut noter que la prolifération de l'AGS est évidemment inhibé lorsqu'elles sont traitées avec 10 uM Res, qui n'a pas été observé dans les deux autres lignées cellulaires (figure 1A). Dans toutes les trois lignées cellulaires, la présence de 100 uM Res était suffisante pour induire une inhibition de plus de 50% de croissance (56,78% d'AGS, 54,87% pour le BGC-823 et de 52,16% pour la CGT-7901, respectivement). Par conséquent, 25 et 50 um Res ont été utilisées pour les expériences ultérieures. Pour déterminer le rôle fonctionnel de Sirt1 dans le traitement Res, nous avons frappé vers le bas l'expression Sirt1 utilisant un siRNA spécifique. L'inhibition de l'expression efficace sirt1 a été vérifiée par Western Blot (figure 1B). Les résultats du test au MTS a montré que dans les cellules déplétées sirt1 Res n'a pas inhibé la prolifération cellulaire (figure 1C). Ces données indiquent que Res est capable d'inhiber la prolifération des cellules de GC et que l'effet inhibiteur peut être sauvé par Sirt1 épuisement.

Res Diminue le potentiel clonogénique des cellules GC d'une manière Sirt1 dépendant

pour les cellules tumorales, la formation de colonies a été trouvé être un paramètre plus sensible que la viabilité d'évaluer l'effet d'un médicament. Ainsi, les efforts ont ensuite été entreprises pour déterminer l'effet de la résolution sur le potentiel clonogénique des cellules GC. Res, à la concentration de 25 pM, a conduit à une réduction significative du nombre foyers ainsi que les tailles des cellules GC. Après un traitement avec 50 uM Res, le potentiel clonogénique diminué davantage. Cependant, knockdown de Sirt1 avant le traitement Res a augmenté le nombre de foyers à un niveau comparable à celui du groupe de véhicules (Figure 2).

Res Induit l'accumulation de cellules de GC dans la phase G1 de manière Sirt1 dépendante

Pour examiner l'effet inhibiteur de Res sur les cellules GC, nous avons effectué une analyse du cycle cellulaire. Nous avons observé que 25 et 50 uM Res ont augmenté la proportion de cellules dans la phase G1 à la fois BGC-823 et les cellules SGC-7901 (figures 3A et 3B). L'induction de l'arrestation de phase G1 par Res a également été dose-dépendante. Res à une concentration de 50 uM ont montré un effet plus fort qu'il ne l'a fait à 25 uM. L'augmentation du nombre de cellules dans la phase G1 est accompagnée d'une diminution des populations de cellules principalement dans les phases S. L'épuisement des sirt1 avant le traitement Res diminue l'induction de la phase G1 du Res (figures 3A et 3B). Pour corroborer les résultats ci-dessus, nous avons examiné l'expression des régulateurs du cycle cellulaire de la phase G1, y compris la cycline D1, CDK4, CDK6, p21 et p16 dans BGC-823 cellules. Comme cela est représenté sur la figure 3C, dans Res cellules traitées BGC-823, les taux d'activateurs de la transition G1 /S protéines (cycline D1, de la CDK4 et de la CDK6) a diminué, alors que les teneurs en protéines des inhibiteurs des CDK (CDKI) (p21 et p16) a augmenté. En revanche, ces changements ne sont pas trouvés dans Sirt1 appauvries BGC-823 cellules quand ils ont été traités avec 50 uM Res. Des résultats similaires ont été obtenus à partir de la RT-QPCR de la cycline D1, de la CDK4 et p21 (figure 3D).

L'absence de cellules sub-G1 indique que le traitement Res n'a pas déclenché l'apoptose dans les cellules GC (figure 3A) , ce qui était conforme aux résultats des expériences de marquage TUNEL de BGC-823 cellules (Figure S1A). Les teneurs en protéines des molécules apparentées à l'apoptose, tels que bcl-2, Bax et de la caspase-3, à partir de chaque groupe étaient comparables (figure S1B). Pris ensemble, nos résultats montrent que Res induit G1 arrestation de phase dans les cellules GC de manière Sirt1-dépendante et ne pas induire l'apoptose.

Res Induit sénescence des cellules GC d'une manière Sirt1 dépendante

dans nos mains, Res se traduit par une croissance arrestation plutôt qu'une augmentation de l'apoptose. Par conséquent, nous avons fait des efforts supplémentaires pour explorer si Res pourraient induire la sénescence dans les cellules du GC. ß-gal coloration, un marqueur spécifique des cellules sénescentes de mammifère, a été utilisé. Après traitement Res, nous avons trouvé des fractions accrue des cellules ont été colorées avec du β-Gal. Cependant, le pré-traitement avec l'ARNsi sirt1 bloqué et la sénescence cellulaire induite par Res (figure 4). Des résultats similaires ont été obtenus à la fois BGC-823 et les cellules SGC-7901, ce qui suggère que charge Res sur Sirt1 pour induire la sénescence cellulaire dans les cellules du GC.

Res Inhibe la croissance tumorale in vivo d'une manière Sirt1 dépendante

ensuite, d'autres études ont été réalisées pour déterminer les effets de Res sur BGC-823 xénogreffes croissance chez la souris nude. Pour le in vivo
étude, transduites lentiviral-shRNA BGC-823 cellules stables ont été utilisés. Parmi les quatre SIRT1 shRNA-lentivirus, LV-1 et LV-4 exerce des effets évidents silencieux sur l'expression Sirt1 (Figure S2). Après quatre semaines de dépistage, l'expression de Sirt1 a été maintenue à la diminution des niveaux dans l'écurie lentiviral-shRNA BGC-823 cellules (Figure S2). Stable LV-1 lentiviral-shRNA BGC-823 cellules ont été utilisées dans les xénogreffes études ultérieures en raison des effets inhibiteurs plus forts sur l'expression Sirt1 par rapport à la LV-4. Tous les animaux ont survécu jusqu'à la fin de nos expériences, et aucune différence évidente n'a été trouvée dans leur poids corporel (données non présentées). Quatre semaines après l'implantation, les mesures de volumes de la tumeur ont indiqué que le traitement Res réduit significativement la croissance de BGC-823 xénogreffes (Res vs contrôle: 0.5728 ± 0,2276 cm 3 vs 1.4288 ± 0,1741 cm 3, P < 0,001) . transduction stable du contrôle shRNA-lentivirus n'a pas affecté de façon significative le volume tumoral (Res vs Res + Ci: 0.5728 ± 0,2276 cm 3 vs 0,68 ± 0,0672 cm 3, P = 0,603). Cependant, dans les xénogreffes Sirt1 appauvries, les effets inhibiteurs de Res sur la croissance de la tumeur ont été sauvées (Res + Si vs Res + Ci: 1.2313 ± 0,1777 cm 3 vs 0,68 ± 0,0672 cm 3, P < 0,001, Res + Si vs contrôle: 1.2313 ± 0,1777 cm 3 vs 1.4288 ± 0,1741 cm 3, P = 0,123) (figure 5A). Dans les xénogreffes Res-traités, le marqueur de prolifération, Ki67, a diminué de manière significative (figure 5B) (% des Ki67-positives cellules, Res vs contrôle: 3 ± 1,8 vs 44,67 ± 3,79, P < 0,001). Sénescence a été observée dans les xénogreffes de souris traitées Res indiquées par une coloration β-Gal (figure 5B). Cependant, aucune apoptose a été induite par évidente dans les xénogreffes Res (figure S1D) et aucun changement n'a été observé dans les régulateurs de l'apoptose, tels que bcl-2, Bax et de la caspase-3 (figure S1C). Ces résultats concordent avec les in vitro
expériences. En outre, les changements dans l'expression des régulateurs du cycle cellulaire, y compris la cycline D1, CDK4, CDK6, p21 et p16 étaient semblables à ce que nous avons observé in vitro
(figure 5C). Tous les changements observés dans Ki67, β-Gal et les régulateurs du cycle cellulaire ont été inversés par Sirt1 déplétion (Figures 5B et C) (% des cellules Ki67-positives, Res + Si vs Res + Ci: 46,32 ± 6,03 vs 2,65 ± 1,53, P < 0,001, Res + Si vs contrôle: 46,32 ± 6,03 vs 44,67 ± 3,79, P = 0,946)

Discussion

Res, un polyphénol naturel, est actuellement en cours d'évaluation comme anticancéreux prometteurs. agent. Bien qu'il ait été prouvé pour conférer des effets anti-prolifératifs contre plusieurs types de cancer à la fois dans la culture cellulaire et des modèles de xénogreffe [9] - [11], ses effets de chimioprévention sur GC et le mécanisme sous-jacent ont pas été bien étudiée. Dans cette étude, nous avons démontré que Res inhibé la prolifération de lignées de cellules de GC (AGS, BGC-823 et SGC-7901). L'activité anti-croissance n'a été observée après que les cellules ont été traitées avec 25 uM Res pendant 24 h, et l'effet inhibiteur est dose-dépendante. A une concentration de 50 uM Res, les taux d'inhibition de ces trois lignées cellulaires ont été de 41%, 34% et 32%, respectivement. Lorsque la concentration de la résolution augmente encore, les effets inhibiteurs ont été renforcées. Les deux 100 et 200 pm Res a inhibé la croissance de plus de 50% par rapport au groupe du véhicule. En outre, la dose plus élevée de Res est trop grande pour atteindre in vivo
et donc n'a pas de sens dans un contexte clinique [13], [14]. Par conséquent, les deux concentrations efficaces inférieures de 25 et 50 pm Res ont été utilisés dans les études ultérieures. L'activité d'inhibition de la croissance de la Res semble être spécifique à la cellule, comme l'IC50 est différente selon le type de cellule et varie de 27 pM à 180 pM de [9], [10], [15], [16]. Certaines de ces études ont également montré que Res exerce les effets inhibiteurs d'une manière dépendante du temps [15], [16]. La concentration et la durée du traitement Res utilisées dans notre étude sont cohérentes avec la majorité des rapports provenant d'autres groupes [8], [9], [16]. Pour le in vivo
étude, le procédé d'administration, nous avons utilisé est le gavage parce que cela est la méthode couramment utilisée dans les souris comme alternative à l'injection intra-péritonéale [15], [17]. En outre, des études sur des souris ont révélé que Res est absorbée efficacement après administration par voie orale et peut être trouvé dans le corps [17], [18]. Lorsqu'il est utilisé in vivo
, Res diminué de manière significative la prolifération des cellules comme caractérisé par l'expression de Ki67, ce qui est cohérent avec les résultats de nos in vitro
expériences.

Res peut ralentir la prolifération des cellules cancéreuses grâce à des mécanismes divers, parmi lesquels, la régulation du cycle cellulaire est importante [9], [15], [19]. Notre in vitro
données a démontré que le traitement des cellules GC avec Res induit G1 arrêt de phase. La phase G1 est la première des quatre phases du cycle cellulaire qui a lieu dans la division des cellules eucaryotes. G1 est une phase du cycle cellulaire particulièrement important car il est le point auquel une cellule engage à une ronde de division. La progression dans la phase G1 nécessite la formation et de l'action de la cycline D-CDK4 ou -CDK6 complexes. Ces complexes puis phosphorylent rétinoblastome, ce qui conduit à la libération des facteurs de transcription E2F et la transcription du gène en aval impliquée dans la progression de la phase S. Les activités des complexes D-CDK cycline sont réglementés par des inhibiteurs en amont, y compris les membres de la INK (p15, p16 et p18) et les familles CIP (p21, p27 et p57) [20], [21]. Dans la même ligne, accompagné de l'arrestation de phase G1, nous avons observé la régulation négative de la cycline D1, CDK4 et CDK6 et la surexpression de p21 et p16 dans les cellules GC Res-traitées. Notre in vivo
résultats des niveaux de ces régulateurs du cycle cellulaire dans les échantillons de tumeur d'expression sont compatibles avec les in vitro
résultats. Nos résultats sont également conformes à ceux des études précédentes [15], bien que certains autres ont rapporté que la phase S arrestation est induite par Res [9], [19]. Persistance d'arrêt de la croissance peut conduire à l'apoptose ou la sénescence dans les cellules. Parce que les deux voies de signalisation de p21 et p16 participent à la progression de la sénescence à médiation par les différents types de stress [22], [23], nous avons effectué une coloration β-Gal. Res traitement a augmenté de manière significative la fréquence des cellules sénescentes GC d'une manière dépendante de la dose. Le programme de la sénescence cellulaire représente une barrière importante contre l'initiation du cancer et le développement [24], [25]. Bien que les études précédentes montrent que, grâce à l'atténuation du stress oxydatif et l'amélioration du métabolisme, Res exerce des effets anti-âge à la fois in vitro
et in vivo
[26] - [28], les effets opposés ont été représentés dans le cancer. Res a été trouvé pour induire l'inhibition de la croissance sénescence comme dans plusieurs types de cancers [29], [30]. Le double rôle de Res dans la sénescence cellulaire, ce qui retarde le vieillissement dans les tissus normaux et l'accélération de la sénescence dans les tumeurs, en fait un candidat idéal pour la prévention et le traitement du cancer.

L'apoptose est un autre effet commun qui est habituellement observé dans Res-traité les cellules cancéreuses [9], [11], [15], [16]. Des expériences montrent que l'apoptose peut être médiée par plusieurs voies différentes et de nombreuses molécules régulatrices. Parmi ces régulateurs, les protéines comprenant la famille Bcl-2 sont importants. Il y a deux protéines anti-apoptotiques (bcl-2, bcl-xl) et des protéines pro-apoptotiques (bax, mauvais, bak et Bcl-xs) dans cette famille. Une augmentation de la bcl-2 rapport Bax proapoptotique /anti-apoptotique favorise la perméabilité de la membrane mitochondriale, provoque la libération de cytochrome c par les mitochondries à cytosol et, à son tour, entraîne l'activation de la caspase-9 et en aval cibler la caspase-3 [31]. En dépit de cette voie apoptotique intrinsèque, les ligands pro-apoptotiques, tels que FasL, en se liant à leurs récepteurs, provoquent l'activation de la caspase-8 et les effecteurs en aval, tels que la caspase-3. L'activation des caspases effectrices induit le clivage de nombreux substrats cellulaires et provoque directement l'apoptose [31] - [33]. Bien que de nombreux rapports précédents ont indiqué que l'apoptose était responsable de l'inhibition de la croissance Res-induite, on n'a pas observé l'apoptose évidente dans les cellules GC Res-traitées. Cette absence de l'apoptose peut être due à la concentration et la durée du traitement Res adapté dans notre expérience, car les études de différents groupes montrent que Res exerce des effets et la durée de dosage-dépendante [34], [35]. En outre, comme les effets de Res sont également spécifiques à la cellule [36] - [38], les cellules GC utilisées dans notre étude peuvent être résistantes à l'apoptose induite par Res

Res a plusieurs objectifs. parmi lesquels, le NAD classe III + - dépendante déacétylase Sirt1 est la plus fréquemment étudiée. Bien qu'une étude biochimique a indiqué que Res était pas un activateur direct de Sirt1 [39], Res a toujours été considéré comme un agoniste classique de Sirt1. De nombreuses études montrent que Res exerce divers effets dans différents modèles d'une manière de Sirt1 dépendant [40], [41]. Dans notre expérience, Sirt1-déplétion inversé l'inhibition de la croissance de Res Les deux in vitro
et in vivo
. L'arrestation de phase G1 et de la sénescence induite par le traitement Res ont été secourus par Sirt1-épuisement. Ces résultats indiquent que les effets d'inhibition des Res sur GC dépendent de sirt1. Selon les études précédentes, Sirt1 peut réguler l'expression des gènes par le biais de deux mécanismes différents. Tout d'abord, directement sirt1 médie directement la désacétylation d'une protéine et accroît sa ubiquitination et la dégradation subséquente du protéasome de l'ubiquitine [42]. D'autre part, indirectement, sirt1 exerce une activité déacétylase influençant la confirmation de la chromatine ou de réprimer l'activité des facteurs de transcription et régule la transcription de gènes [43] - [45]. Comme les molécules (cycline D1, CDK4, CDK6, p21 et p16) détectés dans nos expériences ont pas été signalés comme les cibles directes de Sirt1, nous avons supposé que Sirt1 pourrait réguler l'expression de ces gènes principalement par le biais du mécanisme indirectement. Les résultats de RT-QPCR soutiennent également cette hypothèse.

Dans l'ensemble, nos résultats suggèrent que Res inhibe à la fois la prolifération des cellules du GC in vitro
et la croissance de xénogreffes in vivo
. traitement Res induit G1 arrestation de phase dans les cellules du GC et conduit à la sénescence à la place de l'apoptose. Sirt1-déplétion sauve les effets décrits ci-dessus Res fois in vitro
et in vivo
. Notre travail indique que Res inhibe GC de manière Sirt1-dépendante et fournit des preuves détaillées de la possibilité d'appliquer Res dans la prévention et la thérapie GC.

Informations complémentaires
Figure S1.
Res exerce aucun effet sur l'apoptose des BGC-823 cellules. (A) L'apoptose a été indiqué par le marquage TUNEL (rouge) et BGC-823 cellules ont été DAPI (bleu). Le traitement avec H 2O 2 a servi de contrôle positif. grossissement d'origine: × 200. Les barres d'échelle, 50 pm. (B) des régulateurs de l'apoptose dans les cellules BGC-823, dont Bcl-2, Bax et de la caspase-3 ont été analysées par Western Blot. (C) Les régulateurs de l'apoptose dans les xénogreffes, notamment Bcl-2, Bax et de la caspase-3 ont été analysées par Western Blot. Pour la détection de caspase-3, BGC-823 cellules traitées avec H 2O 2 a servi de contrôle positif (montré dans le panneau de droite). (D) L'apoptose dans des xénogreffes a été détectée par marquage TUNEL (rouge) et les sections ont été DAPI (bleu). Sections de rongeurs femelles glande mammaire obtenus 3~5 après le sevrage des bébés rats (Millipore) ont servi de contrôle positif. grossissement d'origine: × 200. Les barres d'échelle, 50 pm. 'R' représente le resvératrol, 'Ci' représente le contrôle siRNA, et 'Si' représente le Sirt1 siRNA
doi:. 10.1371 /journal.pone.0070627.s001
(TIF)
Figure S2.
Knockdown de Sirt1 par shRNA-lentivirus. (A) BGC-823 cellules ont été transfectées avec contrôle ou shRNA-lentivirus Sirt1 spécifiques. L'efficacité de la transfection a été évaluée à l'aide d'un microscope à fluorescence. À une multiplicité d'infection (MOI) de 50, plus de 90% des cellules ont été transfectées avec des shRNA lentivirus. Après quatre semaines de dépistage avec la puromycine, toutes les cellules vivantes ont été transduites. Grossissement: x 100, bar pour 200 um. (B) Les cellules ont été récoltées 4 jours après l'infection et 28 jours après la sélection à la puromycine. L'efficacité de silençage de Sirt1 a été vérifiée par western blot
doi:. 10.1371 /journal.pone.0070627.s002
(TIF)
Tableau S1.
Amorces pour les expériences de RT-QPCR effectuées dans cette étude
doi: 10.1371. /journal.pone.0070627.s003
(DOC)

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