Résumé
Contexte
Beclin 1 est un acteur principal de l'autophagie. L'expression de Beclin 1 et son rôle pronostique dans le cancer gastrique est largement inexploré. Le but de la présente étude est d'étudier l'expression de beclin 1 dans les cellules de cancer gastrique, de tissus et de sa relation avec le pronostic.
L'expression de Beclin 1 a été détecté dans 271 échantillons de ganglions lymphatiques de patients atteints de cancer gastrique positifs par immunohistochimie. La corrélation des Beclin 1 expression des caractéristiques clinico-pathologiques et la survie du cancer gastrique a été étudié. Beclin-1 expression dans des lignées cellulaires de cancer gastrique et les échantillons cliniques est également détectée en utilisant inverse blot transcription PCR et Western.
Beclin 1 est régulée à la hausse à la fois l'ARNm et des protéines dans six lignées cellulaires de cancer gastrique par rapport à ceux normalement une lignée cellulaire de la muqueuse gastrique (GES-1). L'expression de Beclin-1 dans les échantillons cliniques gastriques est également plus élevé que ceux dans les tissus non cancéreux adjacents. Parmi les 271 patients, 229 (84,5%) étaient Beclin 1 élevées tumeurs d'expression par immunohistochimie. Beclin 1 expression est étroitement associée à embolus intravasculaire. Kaplan-Meier analyse a montré haute beclin 1 expression était associée à une survie globale plus longue. Tant l'analyse univariée et analyse multivariée a révélé que Beclin 1 expression étaient des facteurs pronostiques indépendants chez les patients atteints de cancer gastrique ganglionnaire.
Nos résultats suggèrent fortement que Beclin 1 a un rôle potentiel dans tumorigenèse du cancer gastrique et pourrait être un biomarqueur prometteur pour prédire le pronostic des patients atteints de cancer gastrique lymphatique ganglionnaire. Il pourrait également servir de cible thérapeutique pour le traitement du cancer gastrique
Citation:. Geng Q-R, Xu D-Z, il L-J, Lu J-B, Zhou Z-W, Zhan Y-Q, et al. (2012) Beclin-1 Expression est un important prédicteur de la survie chez les patients atteints du ganglion-positive cancer gastrique. PLoS ONE 7 (9): e45968. doi: 10.1371 /journal.pone.0045968
Editeur: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Chili
Reçu: 4 Avril 2012; Accepté le 23 Août 2012; Publié le 27 Septembre, 2012 |
Droit d'auteur: © Geng et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités
Financement:. Ce travail a été soutenu par la Fondation des sciences médicales de la province du Guangdong (n ° 2010B031600071). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit
Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent
Introduction
le cancer gastrique reste un problème majeur de santé publique dans le monde entier, en particulier dans les pays d'Asie orientale, le taux d'incidence normalisé selon l'âge est > 20 pour 100 000 [1]. Pour le cancer gastrique avancé, le pronostic est encore faible, avec un taux de survie global estimé à 5 ans de 25% ou moins [2], [3]. métastase ganglionnaire est l'indicateur pronostique le plus puissant après résection curative [4] - [7]. Environ 75% des patients avancés ont un cancer gastrique ganglionnaire, dont le pronostic était significativement pire que pour ceux qui ont une maladie ganglionnaire [4].
Rapport ganglionnaire
Dans des études précédentes, nous avons trouvé positif est un organisme indépendant indicateur pronostique pour les patients atteints de cancer gastrique ganglionnaire et chimiothérapie intrapéritonéale peut être bénéfique [8], [9]. Cependant, une étape fondamentale vers l'amélioration de la survie des patients atteints de cancer gastrique ganglionnaire positif réside dans la compréhension accrue du comportement biologique de la tumeur et la recherche des cibles possibles pour la thérapie individuelle [10], [11]. Par exemple, le récepteur humain de croissance épidermique de facteur 2 (HER2) est devenu maintenant un nouveau marqueur du cancer gastrique suivant les principes fondés sur des preuves [12] .Adding trastuzumab à la chimiothérapie standard pourrait changer le faible taux de survie des patients atteints de cancer gastrique métastatique HER2-positif [13] - [15]
grande préoccupation récemment, le rôle de l'autophagie dans le développement du cancer et le traitement du cancer a été donné [16] - [18].. Beclin 1, un régulateur clé de la formation de l'autophagie, a été retrouvé surexpression dans une variété de cancers humains [19] - [22].
Cependant, il existe encore relativement peu d'études qui ont étudié l'association entre 1 et Beclin cancer de l'estomac. En particulier, aucune donnée concernant leurs effets sur le pronostic dans le cancer gastrique, ont encore été signalés.
La présente étude a porté sur Beclin 1 expression dans les cellules de cancer gastrique, de tissus et de son importance clinicopathologique chez les patients avec gastrique ganglionnaire positif cancer. En outre, nous avons analysé les relations entre l'expression Beclin 1 avec le pronostic pour déterminer si Beclin 1 peut prédire les résultats cliniques.
Les lignées cellulaires et conditions de culture
des lignées de cellules de cancer gastriques humaines HGC-27, MKN803, MGC-803, SGC-7901, MKN-28, BGC-823 étaient des cadeaux de l'école d'oncologie Université de Pékin (Beijing, Chine.) [23], [24]. La ligne normale gastrique cellulaire de la muqueuse, GES-1, dérivé d'une muqueuse gastrique foetal épithélium humain, a été obtenu à partir du premier hôpital affilié Sun Yat-Sen University [25]. Ces lignées cellulaires ont été maintenues dans du milieu RPMI 1640 (Invitrogen) supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (Hyclone), de la pénicilline (100 unités /ml) et de la streptomycine (100 unités /ml) à 37 ° C et 5% de CO2 dans un incubateur humidifié .
Inverser
transcription PCR
L'ARN total a été extrait en utilisant la méthode Trizol. L'ARN a été prétraité avec de la DNase et utilisé pour la synthèse d'ADNc avec des hexamères aléatoires. Le mélange (25 pi au total) pour la PCR est composée de 0,5 ADNc ul, 0,5 U d'ADN Taq polymérase, 2,5 pi de tampon 10 x PCR, 2,5 mM mélange dNTP, et 50 sens pM et antisens amorces chacun. Beclin 1 ont été analysés par les amorces suivantes: Beclin 1 5'CGTGGAATGGAATGAGAT3 '
amorce inverse 5' GTAAGGAACAAGTCGGTAT3 ';
Actine: 5'AGCCATGTACGTAGCCATCC3'
et 5 'GTGGTGGTGAAGCTGTAGC 3 ».
analyse par Western blot
les cellules ont été lysées dans un tampon de lyse et la concentration en protéine a été déterminée par la méthode de colorant de Bradford (Bio-Rad Laboratories). Des quantités égales d'extraits cellulaires ont été soumis à SDS-PAGE et transférées sur une membrane PVDF (Bio-Rad). Expression de Beclin 1 a été déterminée avec un anticorps monoclonal de lapin (1:1000, Novus Biologicals, NB500-249) selon les protocoles suggérés par le fabricant.
L'étude consistait en 271 gastrique patients atteints de cancer qui ont subi une résection radicale pour histologiquement confirmé carcinome gastrique de Cancer Center de l'Université Sun Yat-sen entre Janvier 1998 et Décembre 2006. Nous avons obtenu le consentement éclairé de tous les participants impliqués dans cette étude. L'approbation éthique a été obtenu à partir de comité d'éthique de la recherche Sun Yat-sen University Cancer Center. Les critères d'éligibilité inclus histologiquement confirmé résection R0, qui a été définie comme aucune tumeur résiduelle macroscopique et microscopique et postopératoire temps de survie ≥6 mois. Les patients atteints de métastases à distance ou un traitement préopératoire ou ganglionnaire lymphatique ont été exclus de l'étude. La classification 7thTNM par le American Joint Committee on Cancer et de l'Union internationale contre les critères de cancer a été utilisé pour la mise en scène pathologique [26]
Tous les patients avaient suivi après la chirurgie de 6 à 12 mois d'intervalle. Median période de suivi était de 38 (gamme 10-145) mois pour tous les patients. La survie globale a été définie comme a été défini comme la période entre le moment de la chirurgie et de la mort ou a été censuré au dernier suivi.
immunohistochimie
Beclin 1 a été détectée avec un anticorps monoclonal de lapin ( 1:100, Novus Biologicals, NB500-249). Tous les échantillons de tumeur ont été obtenus à partir de cancers gastriques réséqués chirurgicalement avant traitement adjuvant. , des blocs de tissus en paraffine fixées au formol ont été stockés à température ambiante identifié par un numéro d'identification. Les procédures ont été effectuées de manière similaire à la méthode décrite précédemment [23]. Les sections immunocolorées ont été évalués et les tissus des adénocarcinomes de la prostate humains ont servi de contrôle positif. Toutes les lames ont été évaluées par deux observateurs indépendants en fonction de la proportion de cellules tumorales colorées positivement et l'intensité de la coloration. Selon les critères décrits récemment pour note Beclin 1 expression, l'intensité de la coloration de la membrane varie de faible à fort: 0 (pas de coloration), 1 (faible coloration), 2 (coloration modérée) et et 3 (coloration intense) [27]. Le pourcentage de cellules tumorales positives a été notée comme 0 (< 5%) 1 (6% à 25%), 2 (26% à 50%), 3 (51% à 70%) et 4 (> 70% ). indice de coloration a été calculé en additionnant le score d'intensité de la coloration et le pourcentage de score de cellules positives. Immunoréactive score égal ou supérieur à 4 a été utilisé pour classer les tumeurs avec une grande Beclin 1 expression, et un score de coloration ci-dessous 4 a été utilisé pour indiquer à faible Beclin 1 expression.
Toutes les analyses statistiques ont été effectuées en utilisant le logiciel SPSS (version 18 pour Windows, SPSS, Chicago, IL). Différences de P < .05 ont été considérées comme statistiquement significatives. L'association de Beclin-1 expression de diverses fonctionnalités clinicalopathologic a été analysée en utilisant le test du chi carré. Les courbes de survie ont été tracées par la méthode de Kaplan-Meier et comparées par le test du log-rank. Un modèle de risque proportionnel de Cox (en arrière, pas à pas) pour l'analyse multivariée a été appliquée pour les facteurs qui ont atteint une importance dans l'analyse univariée.
Résultats dans des lignées cellulaires de cancer gastrique
La surexpression de Beclin 1 a été rapportée dans de nombreux cancers. Son statut d'expression dans des lignées cellulaires de cancer gastrique, cependant, reste incertaine. Pour déterminer les niveaux de beclin-1 transcrits et des protéines, l'analyse de transcription-PCR semi-quantitative inverse et analyse par transfert de Western d'expression ont été réalisées séparément dans des cellules humaines normales gastriques épithéliaux (Ges-1) et de six lignées cellulaires de cancer gastrique (HGC-27, MKN803, MGC-803, SGC-7901, MKN-28, BGC-823). Nous avons constaté que Beclin 1 ARNm et la protéine niveau d'expression régulé à la hausse dans les six lignées cellulaires de cancer gastrique par rapport à la normale cellules épithéliales gastriques GES-1. (Fig. 1 A et B)
Beclin une expression dans des tissus de cancer gastrique
Pour déterminer beclin-1 ARNm et l'expression des protéines dans les tissus du cancer gastrique, 4 apparié tissus de cancer de l'estomac et des tissus non cancéreux adjacents le cancer des lésions ont été détectées par analyse par transcription inverse-PCR et analyse par transfert de western, séparément. On a constaté que Beclin-1 dans les quatre échantillons de tissu tumoral avait une expression significativement plus élevé au niveau des deux ARNm et la protéine de niveaux que ceux dans les tissus normaux adjacents aux tumeurs à partir des mêmes patients (fig. 1 C et D).
Beclin 1 expression dans le cancer gastrique
Pour étudier si beclin-1 pourrait cliniquement en corrélation avec la progression du cancer de l'estomac, l'expression et la localisation subcellulaire des protéines Beclin 1 a été détectée par immunohistochimie dans 271 tissus de cancer gastrique paraffine. 1 Beclin spécifique coloration n'a été trouvée principalement sur la membrane plasmatique et dans le cytoplasme des cellules cancéreuses, à l'occasion du noyau. La figure 2 montre des exemples représentatifs de Beclin 1 immunocoloration. Parmi les 271 patients, 229 (84,5%) étaient Beclin 1 tumeurs de haute expression.
Les patients atteints de Beclin 1 faible expression cancer gastrique a montré beaucoup plus courte de 5 ans le taux de survie globale (OS , p = 0,011;. la figure 3) et la survie sans maladie (DFS, p = 0,010; la figure 4) que ceux avec Beclin 1 ceux d'expression élevés.. L'expression de Beclin 1 est étroitement associée à embolus intravasculaire (P = 0,017). Cependant, il n'y avait pas de corrélation significative entre le niveau d'expression de Beclin 1 et de l'âge, le sexe, le site, la taille de la tumeur, T classification, N classification, ou stade pathologique des patients atteints de cancer gastrique (tableau 1). Beclin 1 expression, site, embolus intravasculaire, la classification des T histopathologique, la classification pathologique de N et le stade pathologique étaient des facteurs pronostiques indépendants dans l'analyse univariée (données non présentées) .En analyse multivariée, Beclin 1 expression, embolus intravasculaire, le site et le stade pathologique étaient significatives indépendante facteur pronostique pour le temps de survie (tableau 2).
Discussion
L'autophagie est un mécanisme d'auto-dégradation et associée à la progression de la tumeur. Beclin 1, un orthologue mammifère de la levure Atg6, joue un rôle crucial dans le processus de nucléation vésiculaire de l'autophagie [28]. Il est un gène indispensable pour les premières phases de l'autophagie [29] - [30].
L'étude actuelle a, pour la première fois, a montré Beclin 1 est régulée à la hausse à la fois les taux d'ARNm et de protéines dans six des lignées cellulaires de cancer de l'estomac par rapport à ceux dans des conditions normales cellules épithéliales gastriques GES-1. Nous avons également révélé Beclin 1 expression est élevée dans les tumeurs gastriques primaires par rapport aux quatre échantillons de cancer gastrique appariées adjacentes à des tumeurs des mêmes patients par transcription inverse-PCR et Western blot. Les résultats diffèrent de ceux rapportés dans les cellules de cancer du foie et des cellules de cancer du col, ce qui montre Beclin une expression significativement plus faible par rapport aux tissus normaux correspondants [31], [32]. L'explication possible est que l'expression beclin-1 dans les cancers gastriques contribuent à l'induction de la mort cellulaire autophagique, produisant ainsi une pression sélective pour remplacer la mort cellulaire au cours du développement du cancer [27], [33].
Dans cette étude , nous avons observé que 229 (84,5%) patients avaient une expression élevée Beclin 1 à 271 patients atteints de cancer gastrique, en ligne avec la conclusion de l'étude précédente par des données Ahn et al.Their montré aucune ou très faible expression de Beclin1 dans les cellules muqueuses normales de estomac par immunohistochimie [27]. Cependant, ils n'explorent l'expression beclin-1 au niveau de l'ARNm dans des lignées cellulaires, ni enquêter sur son rôle dans le pronostic.
Nous avons ensuite analysé la relation entre l'expression de beclin-1 et les caractéristiques cliniques des patients . Il n'y avait pas de corrélation significative entre l'expression de beclin-1 et de l'âge, le sexe, la classification T, N classification, ou le stade de patients atteints de cancer gastrique. Intéressant, dans notre étude, il y avait une relation significative entre l'expression de beclin-1 et embolus intravasculaire. Ce qui suggère que beclin-1 pourrait être utilisé comme marqueur emboles intravasculaires chez les patients atteints d'un cancer gastrique ganglionnaire. Ces observations mettent en évidence le rôle important des beclin-1 dans le développement du cancer de l'estomac.
De plus, nous avons trouvé faible beclin-1 expression était fortement associée à une diminution de la survie chez les patients atteints de cancer gastrique ( P À notre connaissance, l'étude est le premier rapport que Beclin 1 avait un l'expression significativement plus élevé dans les cellules du cancer de l'estomac et des tissus à la fois de l'ARNm et des protéines par rapport à leurs contreparties normales. De plus, nous avons trouvé haute beclin 1 expression était associée à une survie globale plus longue. Tant l'analyse univariée et analyse multivariée a montré Beclin 1 expression, site, embolus intravasculaire et le stade pathologique étaient des facteurs pronostiques indépendants. Les résultats suggèrent fortement que Beclin 1 a un rôle potentiel dans la tumorigenèse du cancer gastrique. Il pourrait être un biomarqueur prometteur et une nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de cancer gastrique lymphatique ganglionnaire. D'autres études sont également nécessaires pour clarifier le mécanisme par lequel l'autophagie acteur Beclin 1 est impliqué dans le développement et la progression du cancer gastrique.
= 0,011) et le sous-ensemble embole intravasculaire ( P
= 0,017). En analyse multivariée, Beclin-1 expression a conservé son indépendance en tant que facteur pronostique ( P
= 0,044). Ces résultats suggèrent une utilité potentiellement prometteuse de beclin-1 comme un indicateur pronostique et la survie. Le mécanisme est toujours pas clair. L'explication en est peut-être que l'expression beclin-1 dans les cancers gastriques limites instabilité chromosomique et diminue la fréquence de mutation supplémentaire [34].
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