PLOS ONE: hypoxia-inducible Factor 1α Détermine le cancer gastrique Chimiosensibilité via Modulation de p53 et NF-kB

chimiosensibilité

Résumé

Contexte

Réduction des cellules cancéreuses solides constitue un obstacle essentiel dans l'oncologie clinique. Par conséquent, la caractérisation moléculaire des voies de régulation chimiosensibilité est un préalable essentiel pour améliorer le traitement du cancer. Le facteur HIF-1α inductible par l'hypoxie a été liée à la chimiosensibilité tandis que les mécanismes moléculaires sous-jacents restent largement insaisissable. Par conséquent, nous avons analysé en détail le rôle de HIF-1α dans la détermination de la chimiosensibilité mettant l'accent sur les voies moléculaires responsables.

Méthodologie et Principaux résultats

interférence ARN a été appliqué pour inactiver HIF-1α ou p53 dans le cancer gastrique humain des lignées de cellules AGS et MKN28. Les agents chimiothérapeutiques 5-fluorouracile et cisplatine ont été utilisées et la chimiosensibilité a été évaluée par des analyses de prolifération cellulaire ainsi que la détermination de la répartition du cycle cellulaire et l'apoptose. L'expression des protéines p53 et p53 cible a été analysée par Western Blot. l'activité de NF-kB a été caractérisée par des moyens de dosage de décalage de mobilité électrophorétique. L'inactivation de HIF-1α dans les cellules de cancer gastrique conduit à l'élévation robuste de chimiosensibilité. Par conséquent, les cellules HIF-1alpha-compétentes ont montré une réduction significative de la sénescence et l'apoptose induite par la chimiothérapie. Remarquablement, ce phénotype était complètement absent dans cellules mutantes de p53 alors que l'inactivation de p53 en soi
n'a pas affecté la chimiosensibilité. HIF-1α supprimée de manière marquée l'activation induite par la chimiothérapie de p53 et p21 ainsi que la protéine de rétinoblastome, qui résulte en un arrêt du cycle cellulaire. formation réduite des espèces réactives de l'oxygène dans les cellules de HIF-1α-compétentes a été identifié comme étant le mécanisme moléculaire de l'inhibition de HIF-1α à médiation par la p53. En outre, la perte de HIF-1α abrogée, d'une manière p53-dépendante, liaison à l'ADN de NF-kB et l'expression de gènes anti-apoptotiques cibles de NF-kB induite par la chimiothérapie. En conséquence, la reconstitution de la sous-unité p65 de NF-kB a renversé la chimiosensibilité accrue des cellules HIF-1alpha-déficient.

Conclusion et signification

En résumé, nous avons identifié HIF-1α comme un puissant régulateur de p53 et NF-kB activité dans des conditions de stress génotoxique. Nous concluons que p53
mutations dans les tumeurs humaines détiennent le potentiel pour confondre l'efficacité de HIF-1 inhibiteurs dans le traitement du cancer

Citation:. Rohwer N, Dame C, Haugstetter A, B Wiedenmann , Detjen K, Schmitt CA, et al. (2010) hypoxia-inducible facteur 1α détermine le cancer gastrique Chimiosensibilité via la modulation de p53 et NF-kB. PLoS ONE 5 (8): e12038. doi: 10.1371 /journal.pone.0012038

Editeur: Deb Fox, L'Institut de recherche pour les enfants à l'hôpital New Orleans pour enfants, États-Unis d'Amérique

Reçu le 28 Avril 2010; Accepté le 19 Juillet 2010; Publié 10 Août, 2010

Droit d'auteur: © 2010 Rohwer et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Cette étude a été soutenue par des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de) à TC (CR 133 /2-1, 133 /2-2 et 133 /2-3), et NR (Graduiertenkolleg 276/4 - "Signalerkennung und -umsetzung»). TC a également été soutenue par une subvention de la Berliner Krebsgesellschaft e.V. (Http://www.berliner-krebsgesellschaft.de, CRFF200804). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

de la résistance aux médicaments intrinsèque et acquis sont les principales causes de l'efficacité limitée de la chimiothérapie dans la majorité des cancers gastro-intestinaux, y compris le cancer gastrique [1], [2]. La résistance aux médicaments représente un phénomène complexe et multifactorielle liée à microenvironnement de la tumeur, par exemple l'hypoxie, l'acidose et l'inflammation ainsi que la cellule néoplasique lui-même [3]. la résistance cellulaire peut être inhérente à l'arrière-plan génétique spécifique de la cellule tumorale ou résulter de mutations et de modifications épigénétiques après un traitement anti-prolifératif [4], [5].

Le facteur de transcription hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1 ) constitue un régulateur de pivotement de l'adaptation cellulaire à l'hypoxie et a été impliqué dans la résistance aux médicaments [6] - [8]. La protéine HIF-1 est un hétérodimère constitué d'une sous-unité β-exprimé constitutivement (ARNT (translocateur aryle hydrocarbure récepteur nucléaire)) et d'une α-sous-unité hypoxia-inducible [9]. Dans des conditions normoxiques, une activité HIF-1α peut être induite par divers facteurs de croissance, les cytokines, les oncogenes activés ou la perte de fonction muté gènes suppresseurs de tumeurs [10]. HIF-1α joue un rôle central dans de nombreux aspects de la tumorigenèse, y compris la prolifération cellulaire tumorale, l'angiogenèse, la métastase, ainsi que la réponse à la chimiothérapie et à la radiothérapie [11]. HIF-1α est surexprimé dans un grand nombre de tumeurs solides, et l'expression tumorale HIF-1α est souvent associée à un mauvais pronostic [12] - [15]. une efficacité de plus, l'inhibition de HIF-1α au moyen d'interférence de l'ARN ou des composés pharmacologiques ont démontré antitumorale dans divers modèles de cancer de souris [16]. Une contribution de HIF-1α à la chimiorésistance des cellules néoplasiques a été observée dans une large gamme de tumeurs solides telles que le cancer gastrique [6] - [8], [17] - [20]. Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents ainsi que le rôle de HIF-1α pour la résistance aux médicaments dans des conditions normoxiques restent largement insaisissable [8], [18], [21]. Ici, nous identifions une suppression de p53 et de promotion du facteur nucléaire kB (NF-kB), l'activité des mécanismes centraux pour ce HIF-1α sensibilité de détermination de rôle contre la 5-fluorouracile (5-FU) et de cisplatine dans des cellules de cancer gastrique humain.
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HIF-1α de h2> Résultats détermine la sensibilité des cellules cancéreuses gastriques vers les agents chimiothérapeutiques 5-FU et cisplatine

inactivation fonctionnelle de HIF-1α a été obtenue par transduction lentivirale AGS et cellules MKN28 avec petits ARN interférents (siRNA) ciblant spécifiquement HIF-1α. Cette approche expérimentale a abouti à un effet de choc très efficace démontrée par une défaillance presque complète des cellules transduites pour induire la protéine HIF-1α en réponse à l'hypoxie tel que publié précédemment [22]. Pour évaluer l'importance de HIF-1α pour la sensibilité des cellules cancéreuses gastriques humaines vers des agents chimiothérapeutiques établis, nous avons comparé les effets du 5-FU et de cisplatine dans le HIF-1α-compétentes (brouillés "SCR"), et HIF-1α déficient (knockdown, "KD") cellules AGS. inactivation fonctionnelle de HIF-1α a déplacé la dépendance de la dose de l'inhibition de la croissance vers des concentrations de médicament plus faibles (figure 1A et la figure S1), ce qui suggère que HIF-1α est capable de réduire la sensibilité de la chimiothérapie des cellules cancéreuses gastriques dans des conditions normoxiques. Conformément aux rapports précédents [6] - [8], [17], [18], l'exposition à l'hypoxie augmente la résistance à la 5-FU dans les cellules AGS, mais l'inactivation de HIF-1α a entraîné l'élévation robuste de chimiosensibilité dans des conditions hypoxiques ( La figure S2). Dans une approche complémentaire, nous avons étudié les conséquences de la surexpression de HIF-1α (pcDNA HIF-1α) pour la chimiosensibilité des cellules AGS. les cellules AGS qui surexpriment HIF-1α étaient considérablement plus résistantes au traitement avec 5-FU (figure 1B). Stable expression de HIF-1α a été confirmée par l'EDH (hypoxie sensible élément) dosage rapporteur de la luciférase (figure 1C). Ces résultats suggèrent fortement que HIF-1α limite l'action cytotoxique du 5-FU et de cisplatine dans des cellules de cancer gastrique humain et que l'inactivation de HIF-1α peut avoir des effets bénéfiques sur la chimiosensibilité.

limites de HIF-1α induits par la chimiothérapie arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose via la suppression de p53

Nous avons commencé une caractérisation de l'inhibition de la croissance observée en analysant les modèles de distribution du cycle cellulaire après la chimiothérapie. G _{1-synchronisé, les cellules AGS privées de sérum ont été libérés de G 0 /G 1 phase en plus des profils sériques et cycle cellulaire ont été déterminées après l'addition de 5-FU. cultures Sortie de AGS non traitées facilement progressé grâce à G 1 en S et G 2 /M phases [22], tandis que les cellules 5-FU-traités sont restés dans G 1 phase (non représenté). Fait intéressant, la rétention 5-FU-dépendante des cellules dans G 1 phase a été grandement augmentée en AGS KD par rapport aux cellules AGS SCR, compatibles avec G 1 arrêt du cycle cellulaire (figure 2A). Irréversible arrêt du cycle cellulaire a émergé comme un important mode d'action des agents anti-prolifératifs et est caractérisé par des caractéristiques cellulaires de sénescence [7], [23]. En conséquence, la fraction de cellules sénescentes a été déterminée. En effet, le traitement avec 5-FU a conduit à une induction robuste de la sénescence dans les cellules AGS. Cette réponse a été significativement augmentée dans les cellules avec une perte concomitante de HIF-1α (figure 2B). En outre, l'induction de l'apoptose a été suggérée par une augmentation 1 G dans la fraction pré histogrammes d'ADN de cellules AGS KD 5-FU traités (non représenté). Par conséquent, on obtient une analyse quantitative de la fraction de cellules apoptotiques sur la base de la détection de la caspase-3 (figure 2C). En accord avec les données sur la distribution du cycle cellulaire, la fraction apoptotique 5-FU induit était significativement augmentée dans les cellules AGS KD HIF-1α-deficient par rapport aux cellules de HIF-1alpha-compétente.}

sénescence induite par la chimiothérapie et apoptose deux ont été intimement lié au suppresseur de tumeur p53
. Par conséquent, nous avons émis l'hypothèse que p53 pourrait contribuer à la cytotoxicité augmentée de 5-FU en cas de perte de HIF-1α. Après le traitement 5-FU, la protéine p53 accumulé dans les cellules AGS progressivement, un effet qui a été remarquablement améliorée dans les cellules AGS HIF-1alpha-deficient (figure 2D). Cette stabilisation de p53 était associée à des niveaux accrus de la kinase cycline-dépendante (CDK), p21, un inhibiteur cible transcriptionnelle bien établie et effecteur en aval de p53 avec des fonctions dans l'arrêt du cycle cellulaire, une sénescence induction et l'apoptose (figure 2D). Encore une fois, les cellules AGS HIF-1alpha déficientes ont montré une augmentation nettement plus forte dans le p21 que les cellules AGS HIF-1alpha-compétent. Forte induction de p21 est prévu pour inhiber l'activité de G _{1 cycline /CDK complexes, ce qui entraîne hypophosphorylation de la protéine de rétinoblastome (pRb) et l'incapacité à induire S cyclines de phase, par exemple, cycline A. En effet, à la fois pRb hypophosphorylation et les niveaux A cycline réduits ont été confirmées dans les cellules AGS KD 5-FU-traités et - dans une moindre mesure - également dans les cellules AGS SCR (Figure 2D). Ces changements confirment le maintien G 1 phase observée dans histogrammes d'ADN et sont compatibles avec le G irréversible 1 arrestation observée dans la sénescence induite par la chimiothérapie. Ainsi, les différents résultats biologiques de traitement 5-FU dans les cellules AGS HIF-1α déficientes et -proficient proviennent de la régulation différentielle de p53 et de son aval p21 cible.}

L'inactivation de p53 émousse le rôle de HIF-1α pour chimiosensibilité

pour obtenir des données expérimentales pour le rôle proposé de p53 dans la régulation HIF-1α-médiée de chimiosensibilité dans les cellules AGS, nous p53 fonctionnellement inactivé par l'interférence d'ARN en utilisant la transfection transitoire d'anti-p53 siRNA (si p53) ou un contrôle brouillé siRNA (si scr). P53 a été efficacement renversé, comme il est indiqué par la défaillance des cellules transfectées pour induire la effecteurs p53 p21 et MDM2 en réponse à un traitement 5-FU (figure 3A). Fait intéressant, les cellules AGS KD transfectées avec si p53 étaient significativement moins sensibles à l'inhibition de la croissance par le 5-FU que les cellules AGS KD transfectées avec le siRNA contrôle (figure 3B). Conformément à ces résultats, G Rétention de cycle _{1 cellulaire et l'apoptose des cellules AGS KD 5-FU-traités ont été réduits par p53 knockdown par rapport aux cellules transfectées avec le siRNA contrôle (Figure 3D et 3E). Par contraste, la chimiosensibilité des cellules AGS HIF-1alpha-compétent n'a pas été influencée par l'inactivation de p53 (figure 3C).}

HIF-1α ne parvient pas à affecter chimiosensibilité cellules mutantes
p53

pour confirmer la régulation HIF-1α-dépendante de 5-FU réactivité et de caractériser davantage la contribution de p53, nous avons examiné une seconde gastrique lignée cellulaire de cancer humain (MKN28), qui porte une mutation faux-sens dans TP53
au niveau du codon 251. Fait intéressant, la deletion de HIF-1α dans les cellules MKN28 n'a pas réussi à améliorer l'inhibition de la croissance après une exposition au 5-FU (figure 4A). De même, le 5-FU induit par G _{1 'accumulation et l'apoptose des cellules MKN28 n'a pas été affectée par la perte de HIF-1α (figure 4B et 4C). Conformément à ces résultats, les niveaux de p53 et pRb protéines sont restés inchangés dans les cellules MKN28 5-FU-traités tout au long de la période de 24 h, et p21 induction était absente (Figure 4D). Cependant, lorsque la fonction de p53 a été restaurée par un traitement préalable avec le composé chimique PRIMA-1 [24] HIF-1α knock-down traduite en un considérablement amélioré la cytotoxicité du 5-FU (figure S3). effets compatibles avec le rôle établi de p53 dans cytotoxique induite par la chimiothérapie /cytostatiques, traitement avec PRIMA-1 en soi
légèrement réduit la prolifération des cellules MKN28 et considérablement amélioré l'efficacité du 5-FU dans MKN28 cellules (Figure S3).}

NF-kB est un médiateur important du rôle de HIF-1α dans chimiosensibilité

l'activation de NF-kB est associée à une protection contre l'apoptose induite par la chimiothérapie et, à l'inverse, l'inhibition de NF -κB peut améliorer l'efficacité des agents anti-néoplasiques à la fois in vivo
et in vitro
[25] - [27]. Par conséquent, nous avons déterminé l'activité de NF-kB liaison à l'ADN dans les cellules AGS HIF-1α déficientes et -proficient après le traitement avec le 5-FU par essai de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA). Le traitement par 5-FU puissante activation de NF-kB liaison à l'ADN dans les cellules AGS SCR, avec des niveaux de crête se produisant 6 heures après l'exposition au 5-FU (figure 5A). Traitement avec TNFa pendant 4 h, a servi de témoin positif pour l'activation de NF-kB. En outre, un supershift a été induite par un anticorps anti-p65, ce qui confirme que les complexes NF-kB 5-FU induit contenait la sous-unité de 65 kDa (p65). La perte de HIF-1 a inhibé significativement l'activation de NF-kB en réponse au 5-FU et de TNFa (figure 5A). Conformément à cette observation, le 5-FU traitement a également échoué à induire les cibles des gènes NF-kB cIAP1 et A20 dans les cellules AGS KD, alors qu'ils étaient facilement induits dans les cellules AGS SCR (figure 5B)
.

Pour faire face à la signification fonctionnelle de NF-kB pour une inhibition de croissance de 5-FU induit, nous p65 surexprimé (pcDNA p65) dans les cellules AGS KD. La transfection de p65 pcDNA, mais pas le contrôle de vecteur vide, ont donné lieu à une induction significative de la protéine p65 et l'activité transcriptionnelle de NF-kB dans les cellules AGS KD (figure S4). Il faut noter que les cellules AGS KD HIF-1alpha-deficient surexprimant p65 étaient beaucoup plus résistantes au traitement 5-FU par comparaison aux cellules AGS KD transfectées avec le vecteur témoin (figure 5C), en accord avec un rôle essentiel de NF-kB dans la médiation de la chimiorésistance vers 5-FU dans les cellules cancéreuses gastriques. Pris ensemble, l'activation simultanée de la p53 et l'inhibition du NF-kB dans le 5-FU traitées, les cellules AGS HIF-1alpha déficiente a été observée. Pour clarifier, si les deux événements sont interdépendants, nous avons étudié le 5-FU induite par l'activation de NF-kB dans les cellules avec MKN28 mutant p53.
Deux 5-FU et de TNFa activé NF-kB liaison à l'ADN dans un Time- de façon dépendante, en indiquant les mécanismes de l'activation de NF-kB p53 indépendante par le 5-FU (figure 5D). Cependant, différente de la constatation dans les cellules AGS, cette activation de NF-kB dans le lignée cellulaire mutante p53 de n'a pas été émoussée par HIF-1α inactivation. Ainsi, HIF-1α peut soutenir l'activation de NF-kB induite par la chimiothérapie en contrecarrant mécanismes inhibiteurs p53-dépendante.

formation ROS Altered est responsable de la modification HIF-1α induite par l'activité de p53

Pour clarifier le mécanisme moléculaire sous-jacent superinduction p53 dans le 5-FU les cellules traitées par HIF-1α-déficientes, nous avons caractérisé le rôle des espèces réactives de l'oxygène (ROS). ROS constituent un lien de candidat (i) ROS sont des activateurs puissants de la fonction de p53 et les facteurs clés pris en compte dans l'induction de p53 par divers agents chimiothérapeutiques [28], et (ii) HIF-1α peut supprimer la génération de ROS en diminuant l'activité mitochondriale et biogenèse [22], [29], [30]. En conséquence, les cellules AGS KD ont été prétraités avec le chlorure de ROS inhibiteurs diphénylèneiodonium (DPI) ou apocynine. Les inhibiteurs de conférer une protection significative contre l'inhibition de la croissance de 5-FU induit dans les cellules AGS KD (Figure 6A et 6B). En outre, le DPI et apocynine presque complètement empêché l'induction de p53 et de p21 en aval de sa cible en 5-FU cellules traitées (figure 6C et 6D). Ces résultats suggèrent une intersection de signalisation HIF-1α avec la réponse médiée par p53 au 5-FU au niveau de la production de radicaux libres. Pour établir le rôle causal de HIF-1α du potentiel d'oxydo-réduction de cellules AGS après le traitement 5-FU, les taux de ROS intracellulaire ont été déterminés dans les cellules AGS KD et SCR par cytométrie en flux. Nous avons constaté que les niveaux de superoxyde intracellulaire dans les cellules AGS KD 5-FU traités étaient 2,5 fois plus élevés que ceux dans les cellules AGS SCR 5-FU-traités (figure S5), ce qui indique que l'inactivation fonctionnelle de HIF-1α dans les cellules AGS a donné lieu à élévation significative et fonctionnelle du stress oxydatif intracellulaire même sous traitement chimiothérapeutique

Discussion

Le facteur de transcription HIF-1α a été établi comme médiateur important de la chimiorésistance hypoxie médiée [6] - [8]. , [17], [18], [20]. Ici, nous identifions HIF-1α comme un puissant déterminant de la chimiosensibilité dans les cellules de cancer gastrique dans des conditions normoxiques. En appliquant un système de siRNA à base de lentivirus-nous montrons considérablement amélioré 5-FU et cisplatine toxicité dans les cellules cancéreuses gastriques HIF-1alpha-déficient. Les données disponibles sur le rôle de HIF-1α pour la chimiosensibilité des cellules cancéreuses dans des conditions normoxiques sont contradictoires. Alors que les cellules de fibrosarcome HIF-1alpha-déficient (HT1080) affiché significativement amélioré la sensibilité envers l'étoposide dans l'air ambiant, le cancer du côlon (HCT116) et hépatome (Hepa-1) cellules ont échoué à le faire [6]. Unruh et al.
Rapporté une meilleure sensibilité des fibroblastes embryonnaires murins HIF-1alpha-déficient à carboplatine ou étoposide sous normoxique ainsi que des conditions hypoxiques [8]. En ce qui concerne le cancer gastrique, une efficacité accrue de 5-FU et la vincristine a été démontrée sous normoxie in vitro
[18]. Eh bien en ligne avec nos résultats, les deux études ont conclu un rôle central pour HIF-1α dans la médiation de la chimiorésistance dans des conditions normoxiques. Fait intéressant, une étude récente du Japon a montré une efficacité inférieure de la chimiothérapie à base de 5-FU dans HIF-1α exprimant des adénocarcinomes gastriques humaines, le renforcement de la perception de HIF-1 en tant que facteur essentiel dans la détermination de la chimiorésistance du cancer gastrique [31].

le contrôle de la progression du cancer par chimiothérapie repose au moins en partie sur l'induction de la sénescence cellulaire. Récemment, la perte de HIF-1α a été montré pour provoquer la sénescence précoce des fibroblastes embryonnaires de souris immortalisées dans des conditions normoxiques [32]. Nos données actuelles suggèrent que HIF-1α garde similaire cellules de cancer gastrique contre la sénescence induite par la chimiothérapie dans des conditions normoxiques. Ceci constitue le premier rapport de la sénescence élevée induite par la chimiothérapie par inactivation fonctionnelle de HIF-1α dans une lignée cellulaire de cancer humain établi. Dans les cellules de HIF-1alpha-déficientes, nous avons également observé une induction de l'apoptose amélioré en réponse à la 5-FU. Des études antérieures ont signalé une réactivation du facteur pro-apoptotique Bid [6], ou un changement dans l'équilibre des membres famille Bcl-2 pro- et anti-apoptotiques pour tenir compte de l'augmentation des taux d'apoptose suivants inactivation de HIF-1α dans les cellules cancéreuses gastriques traités avec le médicament [ ,,,0],. 18]

Notre étude identifie un nouveau mécanisme, par lequel HIF-1α contrecarre la fois la sénescence et l'apoptose induite par la chimiothérapie: Nous présentons une preuve concluante pour la capacité de HIF-1α pour supprimer l'induction de la tumeur p53 suppresseur en réponse à la 5-FU dans des conditions normoxiques. P53 est le destin des cellules pivot déterminant en raison de son rôle dans la régulation de progression du cycle cellulaire et l'apoptose en réponse à un stress cellulaire et constitue le gène le plus fréquemment muté dans les cancers humains [33]. Une grande variété d'agents chimiothérapeutiques ont été montrés pour stabiliser p53 et, inversement, la perte de p53 constitue un mécanisme principal de résistance du cancer vers la chimiothérapie [33], [34]. L'interaction de p53 et HIF-1α a fait l'objet de débats de longue date que les deux rapports positifs et négatifs ont été publiées [35]. travaux Toutefois, l'ensemble précédemment publié concentré sur p53-HIF-1alpha-interactions sous hypoxique (ou même anoxique) conditions. Au meilleur de nos connaissances, nos expériences pour la première fois fournissent des preuves pour la suppression de l'activité de p53 par HIF-1α dans des conditions normoxiques. Comme conséquence de la régulation à la hausse de p53 dans les cellules de HIF-1alpha-déficientes, on a observé des changements dans les effecteurs en aval qui sont liés à l'irréversible arrêt du cycle cellulaire caractéristique de la sénescence, par exemple la stabilisation de p21 et hypophosphorylation de pRb. Différent de notre observation, les travaux récents sur la chimiorésistance vers étoposide dans les fibroblastes embryonnaires murines immortalisées HIF-1α déficientes n'a pas observé une induction de p21 [36]. Aussi, HIF-1α stabilisé p21 et p27, ainsi que conduit à hypophosphorylation de pRb pendant la croissance induite par l'arrestation de l'hypoxie des fibroblastes embryonnaires murines immortalisées et les lymphocytes B spléniques primaires [37]. Ces résultats contrastés sont très probablement expliqués par les types cellulaires étudiés: Alors que Goda et al
. caractérisé par une réponse physiologique à l'hypoxie dans des types de cellules non transformées, nous avons analysé la réponse à de graves dommages à l'ADN dans des lignées de cellules cancéreuses établies.

Alors que p53 a été montré de façon répétée pour neutraliser la fonction NF-kB [38], [39 ], nos données actuelles indiquent un rôle pour le suppresseur de tumeur dans la régulation de l'activation de NF-kB HIF-1α-dépendante. En dehors de p53, NF-kB a émergé comme un second, déterminant central de la résistance à des agents chimiothérapeutiques [40]. Plusieurs études différentes ont établi des liens fonctionnels entre NF-kB et HIF-1α, mais ils placent variablement HIF-1α soit en amont de la NF-kB ou vice versa. Par exemple, la stabilisation induite par l'hypoxie de HIF-1α dans les cellules musculaires lisses est sous le contrôle de transcription de NF-kB [41]. De même, les résultats obtenus à partir de souris knock-out IKK-ß conditionnelles a confirmé le rôle central de NF-kB dans le contrôle de la base et l'expression induite par l'hypoxie de HIF-1α in vivo
[42]. A l'inverse, l'expression du gène de la sous-unité p65 de NF-kB a été démontrée être contrôlée par HIF-1α dans le contexte de l'apoptose par l'hypoxie suppression des neutrophiles [43]. Notre constatation d'une diminution marquée de l'activité de NF-kB dans les cellules HIF-1alpha-déficient lors d'un traitement avec le 5-FU est donc bien en ligne avec ce dernier rapport. Fait intéressant, nous avons également observé significativement réduit la liaison de sous-unités NF-kB dans les cellules HIF-1α déficientes après stimulation par TNFa, un inducteur bien établi de l'activité de NF-kB [44] ADN. Cela soulève la question pertinente dans quelles conditions physiologiques et physiopathologiques HIF-1α est capable de réguler l'activation de NF-kB. HIF-1α et NF-kB partagent une importance cruciale pour divers procédés tels que l'inflammation, la destruction microbienne et la tumorigenèse. La nature moléculaire exacte ainsi que la hiérarchie de leur interaction est le plus probable et Cell-dépendante du contexte et ne peut être généralisée.

Dans la présente étude, nous avons pu identifier les ROS comme un point de HIF d'intersection 1a avec l'cellulaire réponse au stress p53 induite par la chimiothérapie. ROS intracellulaire sont connus comme de puissants inducteurs de p53 et de participer à l'activation de p53 par des médicaments chimiothérapeutiques [45]. Les mitochondries représentent la principale source de intracellulaire ROS [46], et HIF-1α contrecarre probablement la production de ROS au niveau mitochondrial via de multiples mécanismes, y compris l'inhibition de la biogenèse mitochondriale et du pyruvate navette dans les mitochondries, la réduction de l'activité mitochondriale due à l'utilisation accrue de la glycolyse et l'activation de la mitochondrie autophagy [29], [30], [47], [48]. Précédemment, nous avons établi un lien fonctionnel entre la réduction de HIF-1α contrôlée de ROS et de l'indépendance d'ancrage de cellules de cancer gastrique [22], ce qui implique HIF-1α dans la pathogenèse du cancer gastrique en l'absence d'hypoxie. Nous avons trouvé maintenant que le capacitiy de HIF-1α pour limiter la production d'ERO des cellules cancéreuses gastriques confère également une résistance aux agents chimiothérapeutiques qui agissent via l'activation de p53 (figure 6E). Fait intéressant, les effets sur la résistance à l'augmentation de la thérapie par modulation de p53 et de ROS ont également été rapportés pour HIF-2α [49]. Les isoformes HIF-alpha 1 et 2 montrent un large chevauchement des cibles de HIF putatifs et se lier à des éléments de réponse hypoxiques et la répartition précise des effets induits par l'hypoxie à une ou l'autre isoforme est pas toujours réalisable [50]. Bertout et al.
A démontré que l'inhibition de HIF-2α augmente l'apoptose induite par un rayonnement par une accumulation de ROS et une augmentation subséquente de l'activité de p53 [49]. En outre, Roberts et al.
A montré que la résistance contre la chimiothérapie est partiellement médiatisée par la suppression de HIF-2α à médiation par la p53 dans des cellules de carcinome à cellules rénales [51]. Par conséquent, les observations rapportées ce pli justifient des enquêtes sur le rôle potentiel de HIF-2α, une tâche qui est actuellement en cours dans notre laboratoire.

Compte tenu de la nécessité clinique pour identifier les facteurs prédictifs de réponse pour les options de traitement disponibles, notre les résultats pourraient décisions thérapeutiques potentiellement directs: d'une part, la connaissance de HIF-1α surexpression pourrait diriger un choix de médicaments qui agissent en grande partie d'une manière indépendante de p53. D'autre part, un avantage particulier peut résulter d'une combinaison de HIF-1 inhibiteurs et des agents endommageant l'ADN (par exemple, 5-FU) dans les cancers de la p53 fonctionnelle. Inversement, une diminution de l'efficacité de HIF-1 inhibiteurs pourrait être prévu pour le traitement de tumeurs p53 défectueux, un aspect qui peut constituer un facteur de confusion dans les essais cliniques de HIF-1α inhibant les régimes.

Matériel et méthodes de traitement

culture cellulaire et les produits chimiques

AGS (CRL-1739, ATCC, Rockville, Maryland, États-Unis) et MKN28 (JCRB cellulaire Banque, Tokyo, Japon) ont été cultivées comme cultures monocouches en milieu standard . Génération de cellules AGS et MKN28 exprimant de manière stable soit siRNA ciblant spécifiquement HIF-1α (knockdown, "KD") ou le contrôle non spécifique siRNA (brouillés, «SCR») a été publié précédemment [22]. 5-fluorouracile (5-FU), le cis-Diammineplatinum (II), le dichlorure de (cisplatine) et le chlorure superoxyde anions inhibiteurs de diphénylèneiodonium (DPI) et apocynine ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (Allemagne) et on les dissout dans du DMSO. PRIMA-1 (pour la réactivation de p53 et d'induction de l'apoptose massive) a été obtenue auprès Tocris Biosciences (Ellisville, Missouri, Etats-Unis) et on le dissout dans de l'eau stérile. le contrôle du véhicule des solvants a été inclus dans toutes les expériences.

La prolifération cellulaire test

Pour la détermination de la croissance des cellules, 3 × 10 ^{4 cellules ont été ensemencées en triple dans des plaques à 24 puits, laissées se fixer pendant 16 h et ensuite traitées comme il est indiqué sous normoxique ou dans des conditions hypoxiques. Après le traitement, les cellules ont été trypsinisées et les cellules viables ont été comptées en utilisant un hémocytomètre.}

Détermination de la distribution du cycle cellulaire et l'apoptose par cytométrie en flux

distribution du cycle cellulaire, y compris le pré-G _{1 fraction a été déterminée à partir des histogrammes d'ADN comme décrit [52]. Apoptose a également été quantifiée de la détection des actifs, clivé caspase-3 par cytométrie en flux en utilisant un anticorps 488 conjugué Alexa Fluor (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, États-Unis).}

Quantification de sénescence

L'activité β-galactosidase sénescence associée a été évaluée dans les préparations cytocentrifugation comme décrit [53].

analyse immunoblot

lysats de cellules entières ont été préparés comme décrit précédemment [52], puis résolu sur un 10% de sodium sur gel de polyacrylamide-dodécylsulfate et transférés sur de la nitrocellulose (Amersham Biosciences, Freiburg, Allemagne). Les transferts ont été sondés avec des anticorps contre p53 et CDK2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Californie, USA), p21 (Oncogene Research Products, Bad Soden, Allemagne), la cycline A (Upstate, Temecula, Californie, USA), pRb (BD Pharmingen , Heidelberg, Allemagne), MDM2 (Calbiochem, San Diego, Californie, USA), p65 (Cell Signaling Technology) et de l'actine (Sigma-Aldrich). Les anticorps secondaires ont été conjugués à la peroxydase de raifort (Dianova, Hambourg, Allemagne) et l'activité de la peroxydase a été visualisée en utilisant le Western foudre chimiluminescence Réactif Plus (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, Massachusetts, États-Unis).

PCR quantitative en temps réel analyse

Pour une analyse PCR en temps réel, l'ARN cellulaire total a été extrait avec le réactif Trizol (Invitrogen, Karlsruhe, Allemagne). L'ADNc du premier brin a été synthétisé avec une amorce oligo (dT) et un système SuperScript ™ First Strand Synthesis (Invitrogen). L'analyse quantitative PCR en temps réel a été réalisée en utilisant TaqMan PCR Universal Mastermix (pour β-actine) ou SYBR GREEN PCR Master Mix (pour A20 et cIAP1; Applied Biosystems, Darmstadt, Allemagne). Les séquences des amorces sont fournies dans le tableau S1. Pour normaliser la quantité d'ARN d'entrée, les réactions PCR ont été effectuées avec la sonde et des amorces pour β-actine.

transfection transitoire et rapporteur de la luciférase test

transfections transitoires de cellules AGS ont été effectuées en utilisant Effectene Transfection le réactif (Qiagen, Hilden, Allemagne) selon le protocole du fabricant. Pour les études de surexpression, les cellules ont été ensemencées à 3 x 10 ^{4 cellules /24 puits et transfectées avec 100 ng de pcDNA HIF-1α (aimablement fourni par Wanja Bernhardt, Universitätsklinikum Erlangen, Erlangen, Allemagne) ou pcDNA p65 (aimablement fourni Hiroyasu par Nakano, Université Jutendo, Tokyo, Japon), respectivement. Pour EDH ou NF-kB dosage de la luciférase, 3 × 10 4 cellules /24 puits ont été co-transfectées avec 100 ng de Phré-Luc (un cadeau de Randall S. Johnson, UCSD, San Diego, Californie, USA) ou IgκB-Luc (un cadeau de Florian R. Greten, Technische Universität München, München, Allemagne), et 30 ng de phRL-null (Promega, Mannheim, Allemagne). L'activité luciférase a été mesurée avec le système à double luciférase Reporter Assay (Promega), comme décrit [54]. Pour parvenir à la suppression de p53 transitoire, les cellules AGS ont été transfectées à 30% de confluence avec 75 ou 150 nmol /L si p53, ( Silencer
Sélectionnez siRNA, Applied Biosystems) et analysé 48 h après la transfection. A siRNA non spécifique (si scr, Eurogentec, Seraing, Belgique) a été utilisé comme témoin.}

électrophorétique essai de décalage de mobilité (EMSA)

extraits de protéines nucléaires ont été préparés comme décrit [54]. EMSA a été réalisée comme décrit précédemment [55] en utilisant 8 pg de protéine nucléaire et 100 fmol /L du 22 pb double brin NF-kB consensus oligonucelotide (volet d'extrémité avant radiomarqué: 5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C- 3 '; E3292, Promega). Des échantillons ont été résolus par électrophorèse sur un gel à 5% de Polyacrylamide non dénaturant.

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