PLOS ONE: Dans la caractérisation in vitro de la cytotoxicité rapide de Anticancer Peptide PRPS-A2 à membrane Destruction et le Mécanisme intracellulaires contre Cancer Cell gastrique Lines

Résumé

Dans cette étude, PRPS-A2, synthétique 15-mer des peptides cationiques avec tous les acides aminés D, inhibe efficacement la survie des lignées de cellules gastriques d'une façon dépendante de la dose. les cellules tumorales gastriques tuer par PRPS-A2 implique un effondrement rapide de l'intégrité de la membrane et des voies intracellulaires. L'iodure de propidium (PI) et la lactate déshydrogénase (LDH) des essais ont démontré que le traitement d'une heure avec HPRP-A2 conduit à des changements de perméabilité de la membrane des cellules BGC-823 d'une manière dépendante de la dose. En outre, HPRP-A2 l'apoptose induite par BGC-823 cellules implique une augmentation marquée de la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), caspase-3, -8 et -9 activation, une diminution du potentiel de membrane mitochondriale (MMP) et du cycle cellulaire arrestation en phase G1. En plus de sa cytotoxicité inhérente, PRPS-A2 en synergie forte avec la doxorubicine (DOX) afin d'améliorer l'efficacité de tuer les cellules tumorales gastriques i n vitro
. Nous croyons que PRPS-A2 avec tous les acides aminés D pourrait être un candidat puissant de la thérapeutique anticancéreux, en particulier dans la thérapie de combinaison

Citation:. Zhao J, Hao X, Liu D, Huang Y, Chen Y (2015 ) In vitro
Caractérisation de la cytotoxicité rapide de Anticancer Peptide PRPS-A2 à membrane destruction et intracellulaires Mécanisme contre des lignées cellulaires de cancer gastrique. PLoS ONE 10 (9): e0139578. doi: 10.1371 /journal.pone.0139578

Editeur: Aamir Ahmad, École Wayne State University of Medicine, ETATS-UNIS

reçues: 2 Juillet 2015; Accepté 15 Septembre 2015; Publié: 30 Septembre 2015

Droit d'auteur: © 2015 Zhao et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le papier

financement:. Cette étude a été soutenue par le national Natural science Foundation de Chine (n ° 81373445, YXC et n ° 21442001, YBH) et la Fondation des sciences naturelles de la province du Jilin (n ° 20150101189JC , YC et n ° 20140101042JC, YBH). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

au cours des dernières décennies, bien que des avancées ont été réalisées dans le développement de traitements contre le cancer, la résistance et la toxicité non spécifique des médicaments conventionnels sont encore des questions bouteille cou pour les pratiques cliniques potentielles [1-3]. Par conséquent, il est urgent de mettre au point de nouveaux médicaments avec différents modes d'action qui peut surmonter les inconvénients de nombreux médicaments disponibles.

Actuellement, les applications potentielles des peptides anti-cancéreux (ACP) en tant qu'agents thérapeutiques pour le traitement du cancer progression attirer plus d'attention que la chimiothérapie conventionnelle principalement en raison des propriétés suivantes: (1) une spécificité élevée. Les peptides chargés positivement ciblent sélectivement les cellules cancéreuses qui portent des charges négatives et qui ont différents constituants de la membrane des cellules normales [4, 5], (2) nouveau mode d'action. Il pourrait éviter d'établir des mécanismes multirésistance [5-7]; (3) synergique effet anticancéreux avec des agents chimiothérapeutiques. Il a été rapporté que certains PVA peuvent produire une activité anticancéreuse synergique lorsqu'elle est combinée utilisation avec différents médicaments anticancéreux conventionnels [8-10].

Le mécanisme général de la mort cellulaire induite par le peptide est rupture de la membrane cytoplasmique par l'intermédiaire de micellisation ou d'une formation de pores , bien que certains des pays ACP sont signalés pour déclencher l'apoptose par voie du récepteur de mort et /ou voie mitochondriale [8, 11]. En outre, la formation de pores dans la membrane cellulaire et la variation de la perméabilité de la membrane peut fournir un meilleur canal pour l'entrée d'autres médicaments anticancéreux dans les cellules et améliorer leur activité anti-cancéreux [8, 12].

Notre étude précédente a démontré que HPRP-A2 peut induire la mort cellulaire et en même temps une meilleure DOX /épirubicine (EPI), l'apoptose induite dans les lignées cellulaires HeLa et HepG2 [12]. En outre, en raison de la composition D-amino-acide, HPRP-A2 est résistant au clivage protéolytique et conserve les activités anticancéreuses équivalentes à ses énantiomères L. [6, 12]. Sur la base des études précédentes, nous visons à atteindre deux objectifs dans cette étude: pour délimiter le mécanisme anticancéreux sous-jacent de PRPS-A2 et pour étudier l'effet anticancéreux synergique sur BGC-823 et les cellules SGC-7901 en combinaison PRPS-A2 avec DOX.

Matériel et méthodes

les lignées cellulaires et la culture cellulaire

lignées cellulaires de cancer gastrique humaines BGC-823 et SGC-7901 ont été obtenues auprès de l'American type culture Collection qui authentifie la cellule les lignes en testant l'ADN de répétition courte tandem, ont été utilisés dans les 6 mois de réanimation et ont été cultivées dans du DMEM avec du sérum fœtal bovin (FBS, 10% v /v), de pénicilline (100 U /ml) et de la streptomycine (100 U /ml) dans une atmosphère humide à 37 ° C avec 5% de CO _2.

synthèse de peptides et purification

le peptide a été synthétisé par synthèse peptidique en phase solide en utilisant Fmoc (9-fluorényl ) chimies carbonyl -methoxycar comme décrit précédemment [13]. Une caractérisation plus poussée a été détecté par spectrométrie de masse et analyse des acides aminés. DOX · HCl a été acheté chez Meilun Biology Technology Co., Ltd (Dalian, Chine).

analyses de la viabilité cellulaire

BGC-823 et les cellules SGC-7901 (5 × 10 ^{3) ont été étalées en triple exemplaire dans des plaques de microtitrage à 96 puits. Le milieu complet a été remplacé après 24 h avec 100 pi de milieu frais contenant différentes concentrations de médicaments. Après 24 h, les cellules ont été incubées avec de la 3- (4,5-diméthyl-2-thiazolyl) -2,5-diphényl-2H-tétrazolium (MTT) à 37 ° C pendant 4 h. Par la suite, le diméthylsulfoxyde (DMSO) a été ajouté pour dissoudre les cristaux de formazan et l'absorbance à 492 nm a été mesurée avec un lecteur de microplaques (GF-M3000; Gaomi Caihong Analytical Instruments Co., Shandong, Chine). La formule de Jin a été utilisée pour quantifier davantage l'effet synergique de la combinaison de traitement de HPRP-A2 et de la DOX. La formule est la suivante: Q = Ea + b /(Ea + Eb-Ea × Eb), où Q est l'indice de combinaison; Ea + b représente le taux d'inhibition de la prolifération cellulaire du médicament combiné; Ea et Eb sont des signes du taux d'inhibition de la prolifération cellulaire de chaque médicament. Après le calcul:. Q < 0,85, Q > 1,15 et 0,85 < Q < 1,15 indiquent un antagonisme, synergie et un effet additif, respectivement [14]
analyse}

activité hémolyse test

L'activité de l'hémolyse était effectuées comme décrit précédemment [13]. Pour obtenir des globules rouges du sang, du sang humain frais stabilisé avec EDTAK a été centrifugée à 1000 rpm pendant 5 min, lavées deux fois avec du PBS et on le dilue à une concentration finale de 2% dans le PBS. 70 ul de 2% d'érythrocytes humains ont été ajoutés à une plaque à 96 puits à fond rond, puis 70 ul de différentes concentrations de HPRP-A2. Après incubation à 37 ° C pendant 1 heure, la plaque a été ensuite centrifugé à 3000 tpm pendant 10 minutes et 90 ul de surnageant a été transféré dans une plaque à 96 puits à fond plat. La libération de l'hémoglobine a été déterminée en mesurant l'absorbance du surnageant à 540 nm. Érythrocytes dans du PBS et de l'eau distillée (dH _{2O) ont été utilisés comme témoins négatifs et positifs, respectivement. L'activité hémolytique a été calculé comme le pourcentage de groupe expérimental et contrôle positif, après soustraction du contrôle négatif, respectivement. Les données sont la moyenne ± écart-type de trois expériences indépendantes.}

test PI

BGC-823 cellules (1 x 106 cellules /puits) ont été ensemencées dans des plaques à six puits. Après incubation avec HPRP-A2 (5, 10, 15 pM) pendant 1 h, les cellules ont été recueillies et ensuite traitées avec 5 ug /ml de PI à 4 ° C pendant 10 minutes dans l'obscurité. Les cellules ont été lavées avec du PBS trois fois et ensuite détecter l'intensité de fluorescence du PI en utilisant la cytométrie de flux (FACSCalibur, Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA).

libération de LDH

libération de LDH l'activité a été mesurée par kit de dosage de la LDH (Jiancheng Bioengineering, Ltd., Chine) selon les instructions du fabricant. BGC-823 cellules ont été ensemencées à 5 x 10 ^{3 cellules /puits dans une plaque à 96 puits. Après incubation avec PRPS-A2 (5, 10, 15 uM) pendant 1 h, la libération de LDH dans le surnageant a été mesurée avec un lecteur de microplaques (GF-M3000; Gaomi Caihong Analytical Instruments Co., Ltd Shandong, Chine) au 450 nm. Des cellules sans traitement ou lysées avec du Triton X-100 ont été utilisés comme témoins négatifs et positifs, respectivement. Toutes les expériences ont été réalisées en triple exemplaire. activité de la LDH a été calculé comme le pourcentage de groupe expérimental et contrôle positif, après soustraction du contrôle négatif respectivement.}

ROS test

kit de dosage ROS (BestBio, Co. Shanghai, Chine) a été utilisé pour détecter la génération de ROS. Les cellules (1 x 106) ont été traités par HPRP-A2 (5, 10, 15 pM) pendant 1 heure. Les procédures suivantes ont été effectuées selon le protocole du fabricant. En bref, les cellules digérées par la trypsine ont été centrifugés à 1500 tpm pendant 3 minutes, lavées trois fois avec du PBS puis mises en suspension dans 500 ul de PBS. Après incubation avec la 2 ', 7'-diacétate dichlorofluorescin (DCFH-DA), sonde fluorescente pendant 20 min à 37 ° C, les cellules ont été lavées avec du PBS trois fois et ont détecté le vert intensité de fluorescence (en Moyenne géométrique) par cytométrie en flux. L'intensité de fluorescence verte est positivement corrélé avec le niveau de ROS.

Mesure de MMP de

MMP a été déterminée par le kit de dosage potentiel de membrane mitochondriale avec 5,5 ', 6,6'-tétrachloro -1,1 ', 3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodure (JC-1), qui est une sonde de l'activité mitochondriale (BestBio, Co., Shanghai, Chine). JC-1 est toujours utilisé pour détecter la dépolarisation mitochondriale se produisant dans les stades précoces de l'apoptose. Lorsque les cellules à haute MMP, JC-1 se sont réunis dans la matrice mitochondriale, formant agrégats J et de produire la fluorescence rouge. A l'inverse, les cellules contenant JC-1 monomère de monomère monomermonomer ont une faible MMP et montrent une fluorescence verte. dépolarisation mitochondriale a été déterminée par une diminution dans le rouge (590 nm, FL-2 canaux) /vert (530 nm, FL-1 canal) rapport d'intensité de fluorescence. En bref, après le traitement avec HPRP-A2 (5, 10, 15 pM) pendant 1 h, BGC-823 cellules ont été recueillies et mises en incubation avec la solution pendant 20 minutes 0,5 ml de JC-1 travaillant à 37 ° C, puis lavées deux fois avec du PBS, en suspension dans PBS, et analysées par cytométrie de flux (FACSCalibur, Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA).

activité Caspase test

Les cellules ont été traitées avec PRPS-A2 (10, 15 uM) pendant 24 h, puis les niveaux d'activités de caspase ont été mesurés à l'aide des kits de détection d'activité de la caspase correspondantes (BestBio, Co., Shanghai, Chine), selon les instructions du fabricant. Les données moyennes sont présentées comme la moyenne ± écart-type d'au moins trois expériences indépendantes.

Cycle cellulaire analyse

BGC-823 cellules (1 x 10 ^{6) ont été ensemencées dans 6 puits les plaques pendant 24 h. Après induction avec PRPS-A2 (5, 10, 15 uM) pendant 24 h, la distribution du cycle cellulaire a été déterminée par un FACScan et le logiciel Cell Quest (FACS Calibur, Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA). Toutes les expériences ont été réalisées en triple.}

L'analyse statistique

Les données sont présentées comme moyen SD ± de trois déterminations indépendantes. La signification statistique des différences entre les groupes ont été analysés par t
-test, avec une signification acceptée à P
< 0,005 (*) et P
< 0,001 (**).

Résultats

Peptide et cytotoxicité

Comme le montre la figure 1, peptide PRPS-A2 est un 15 résidu α-hélicoïdale amphipathique membrane active un peptide constitué de tous les acides D-aminés. Comparer la toxicité sélective de HPRP-A2 en direction des cellules cancéreuses gastriques et des cellules normales (cellules rouges du sang humain), on peut aisément constater que la CI _{50 (la concentration de médicament à laquelle la viabilité cellulaire a été réduite de 50% par rapport aux non traités les valeurs des cellules) sont nettement inférieure à la concentration minimale hémolytiques (la concentration de médicament qui conduit à 20% d'hémolyse des cellules) de la HPRP-A2. Ces résultats indiquent que PRPS-A2 peut tuer sélectivement les cellules cancéreuses gastriques et épargner les cellules normales (figures 2 et 3). activités anticancéreuses similaires des deux lignées cellulaires (BGC-823 et SGC-7901) ont indiqué qu'il y avait un effet à large spectre dans l'action anticancéreuse du PRPS-A2. En raison de sa caractéristique de la membrane active, HPRP-A2 montre le potentiel thérapeutique anti-cancéreuse puisqu'il est plus sélectivement toxiques envers les cellules tumorales que les cellules normales.}

HPRP-A2 induit l'amélioration de la perméabilité membranaire

afin de vérifier la modification de la perméabilité de la membrane après incubation avec PRPS-A2, l'absorption cellulaire de PI et la libération extracellulaire de la LDH ont été étudiés avec cytométrie en flux et lecteur de microplaques vers BGC-823 cellules. Comme on le voit sur la figure 4, les graphes de cytométrie en flux de la PI se déplacent progressivement vers la direction d'une forte intensité de fluorescence d'une manière dépendante de la concentration, ainsi que la libération accrue de la LDH a également été observée dans les cellules incubées avec HPRP-A2. Autrement dit, PRPS-A2 pourrait causer des dommages de la membrane cellulaire et se traduire par l'amélioration de la perméabilité de la membrane cellulaire.

PRPS-A2 causé les dommages de la fonction mitochondriale

L'oxygène réactif intracellulaire espèces (ROS) la libération et le potentiel de la membrane mitochondriale (MMP) ont été détectés avec FACS pour refléter la fonction des mitochondries de BGC-823 cellules in vitro
. Comme cela est représenté sur la figure 5A, l'histogramme de cytométrie en flux des cellules incubées avec une concentration plus élevée de HPRP-A2 a révélé l'intensité de fluorescence plus élevée, après incubation pendant 1 h. La comparaison quantitative de cytométrie de flux correspondant de l'intensité de fluorescence dans ces différentes Moyenne géométrique des concentrations a montré une tendance similaire, à savoir que la libération accrue de ROS dans BGC-823 cellules en présence de PRPS-A2 était dépendante de la concentration. Similaire concentration-dépendante changement de tendance a également été observée sur la figure 5B, le rapport de FL2-H /FL1-H a diminué de façon marquée, ce qui indique une dépolarisation de la MMP.

activation des caspases et l'analyse du cycle cellulaire

l'activation de la caspase-3, -8 et -9 dans les cellules HPRP-A2 induites a été mesurée en utilisant un avec un lecteur de microplaque à 405 nm. Comme on le voit sur la figure 5C, la caspase-3, -8 et -9 ont tous augmenté après le traitement avec HPRP-A2 pendant 24 h BGC-823 cellules, ce qui suggère que l'induction de l'apoptose par le HPRP-A2 peut être dépendante de la caspase- . Comme le montre la figure 6, BGC-823 cellules traitées avec les différentes concentrations de PRPS-A2 (5, 10, 15 uM) pendant 24 h ont donné lieu à l'augmentation de la sous-G1 arrestation et G1 arrestation. Ces résultats ont également renforcé l'augmentation de l'activité caspase-3 après le traitement du PRPS-A2.

augmentation PRPS-A2-induite dans DOX cytotoxicité

BGC-823 et les cellules SGC-7901 ont été sélectionnés pour étudier l'effet anticancéreux synergique de PRPS-A2 et médicament chimiothérapeutique DOX. Les cellules ont été traitées avec HPRP-A2 (6 M) et /ou Dox (1,6 pg /ml) pendant 4, 24 h et 48 h. des dosages de MTT ont été utilisés pour évaluer les effets anti-cancéreux combinatoires sur les cellules. Les concentrations médicamenteuses choisies dans cette étude ont été basés sur le circuit intégré _{50 valeurs de chaque médicament seul. Il n'y avait pas de cytotoxicité ou de la croissance réduction évidente lorsque chaque médicament a été utilisé seul. En revanche, lorsqu'ils sont utilisés dans les peptides /combinaisons de médicaments (HPRP-A2 /DOX) aux mêmes doses étant utilisée seule, la combinaison présentait une cytotoxicité significative (figure 7). Il est également clair que l'activité anticancéreuse du PRPS-A2 n'a pas été très affecté par le temps d'incubation; En revanche, avec l'augmentation du temps d'incubation de 48 h, DOX montre une plus grande activité anti-cancéreuse que celle de 4 h, ce qui indique de façon spectaculaire les différents mécanismes d'action entre l'ACP et un médicament chimiothérapeutique. Selon la formule de Jin, tous les Q (indice de combinaison) les valeurs étaient supérieures à 1,15, ce qui indique qu'il y avait des effets synergiques importants entre le peptide α-hélicoïdale PRPS-A2 et le médicament anticancéreux classique DOX dans BGC-823 et les cellules SGC-7901 .}

Discussion

peptides Anticancer (ACP) ont récemment reçu de grandes attentions comme agents prometteurs chimiothérapeutiques qui évitent les inconvénients des médicaments actuels. De nombreuses études ont permis de vérifier que certains peptides cationiques naturels et synthétiques possèdent un spectre large et rapide de l'activité anti-cancéreuse contre les cellules tumorales plutôt que les cellules normales, telles que les globules rouges humains [4, 15]. En outre, les pays ACP ont également été vérifiées pour avoir la capacité de surmonter le mécanisme multirésistance, et des effets synergiques dans le traitement combiné [11].

PRPS-A2 possède un spectre rapide et large de l'activité anticancéreuse, cependant, quelques différences se produisent également dans la sensibilité de la HPRP-A2 à différentes lignées cellulaires. Sur la base des différents IC _{50 valeurs pour PRPS-A2 à BGC-823 (8,65 ± 0,38 uM), SGC-7901 (10,42 ± 0,30 uM), PC3 (21,38 ± 0,56 uM) et B16 (19,16 ± 0,38 uM ), nous avons choisi BGC-823 et les cellules SGC-7901 en tant que cibles de recherche. En outre, les activités anticancéreuses de PRPS-A2 à d'autres lignées de cellules cancéreuses telles que HeLa et HepG2 ont été publiés dans notre précédent article [12]. Les deux BGC-823 et les cellules SGC-7901 appartiennent à des lignées de cellules gastriques, par conséquent, nous avons choisi BGC-823, par exemple, pour étudier le mécanisme anticancéreux du PRPS-A2 in vitro
.}

dans cette étude, nous avons montré que HPRP-A2 est un peptide α-hélicoïdale amphipathique ayant une activité anticancéreuse significative au BGC-823 et des lignées cellulaires CGT-7901. Nos études ont montré que HPRP-A2 a montré une toxicité du cancer sélectif, principalement parce que les cellules cancéreuses sont composées de plusieurs phospholipides anioniques et contiennent mucine O-glycosylée, ce qui augmente la charge négative à la surface des cellules cancéreuses [16, 17]. En outre, plus microvillosités sur les cellules cancéreuses peuvent augmenter la concentration du peptide de liaison en augmentant la surface de la membrane et présentent ainsi une cytotoxicité plus forte contre les membranes cellulaires du cancer [11, 18].

PVA sont capables de perturber la membrane cellulaire, ce qui peut provoquer des changements de perméabilité de la membrane cellulaire. Dans cette étude, le changement de la membrane cellulaire BGC-823 a été observée en détectant PI-perméabilisation et la libération de LDH. Les augmentations progressives de PI perméabilisation et la libération de LDH sont dans les mœurs de concentration-dépendante après le traitement avec PRPS-A2. la mort cellulaire en outre, HPRP-A2-induite est associée à la génération d'espèces réactives de l'oxygène, la dépolarisation de la MMP, l'activation de l'activité de la caspase et le bloc dans la phase G1 du cycle cellulaire.

En plus de la cytotoxicité de PRPS-A2, nous avons prouvé que cela pourrait augmenter l'efficacité de la DOX contre BGC-823 et les cellules SGC-7901, ce qui est conforme à notre étude précédente. Dans notre étude précédente, nous avons exploré la thérapie anticancéreuse combinatoire utilisant des peptides α-hélicoïdales PRPS-A1 et PRPS-A2 avec les médicaments chimiques DOX et du PEV dans les lignées cellulaires HeLa et HepG2 [12]. La synergie représentée permet l'utilisation de concentrations relativement faibles de peptides et de médicaments pour obtenir des effets anticancéreux significatifs in vitro et

in vivo. Cette réduction de dose réduit au minimum les effets secondaires des médicaments sur les cellules normales et permet un effet anti-cancéreux de l'apoptose à médiation efficace. Notre étude présente a des implications dans ce PRPS-A2 peut devenir un agent thérapeutique anticancéreux prometteur avec sélectivité anticancéreux haut et fort effet synergique dans la thérapie de combinaison. Nos études illustrent principalement le mécanisme de mort cellulaire PRPS-A2-induite et peuvent être utiles dans la conception de chimiothérapeutiques contre des lignées de cellules gastriques.

Conclusions

PRPS-A2 montre une activité anticancéreuse forte pour BGC- 823 et SGC-7901 de lignées cellulaires et une faible toxicité contre des cellules de globules rouges humains. HPRP-A2 cancer induit la mort cellulaire à la fois un effet direct sur membrane destructive et mécanismes intracellulaires, y compris une augmentation spectaculaire de la caspase-3, -8 et -9 activation, une diminution du potentiel de membrane mitochondriale (MMP), et la génération de ROS et l'arrêt du cycle cellulaire en phase G1. D'ailleurs, PRPS-A2 en synergie fortement avec DOX pour améliorer l'efficacité de tuer les cellules tumorales gastriques in vitro
. Nos résultats soulignent le potentiel anticancéreux large du PRPS-A2 et élucider son mécanisme d'action. Nous croyons que doter les pays ACP ayant des propriétés plus efficaces et tumorales de ciblage va ouvrir de nouvelles façons de lutter contre le cancer avec succès.

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