PLOS ONE: galectine-3 Facilite motilité cellulaire dans le cancer gastrique par Up régulation Protease-Activated Receptor-1 (PAR-1) et Matrix métalloprotéinase-1 (MMP-1)

Résumé

Historique

galectine-3 est connue pour réguler les métastases du cancer. Cependant, le mécanisme sous-jacent n'a pas été défini. A travers les études de puces à ADN après la galectine-3 silençage, nous avons démontré ici que la galectine-3 joue un rôle clé dans la mise à la régulation de l'expression de la protease-activated receptor-1 (PAR-1) et de la matrice métalloprotéinase-1 (MMP-1) PAR-1 favorisant ainsi les métastases du cancer gastrique.

Méthodologie /principales constatations

Nous avons examiné les niveaux de galectine-3, PAR-1 et MMP-1 expression dans le cancer des tissus de patients gastriques et aussi les effets de la faire taire ces protéines avec des ARNsi spécifiques et de leur surexpression en utilisant des constructions lenti-virales spécifiques. Nous avons également utilisé le modèle d'embryon de poisson zèbre pour l'analyse de la in vivo
gastrique invasion des cellules cancéreuses. Ces études ont montré que: a) la galectine-3 silençage diminue l'expression de PAR-1. b) galectine-3 surexpression augmente la migration cellulaire et l'invasion et cette augmentation peut être inversée par PAR-1 silencieux, ce qui indique que la galectine-3 augmente la migration cellulaire et l'invasion par l'intermédiaire de PAR-1-régulation. c) galectine-3 interagit directement avec AP-1 facteur de transcription, et ce complexe se lie à PAR-1 promoteur et conduit PAR-1 transcription. d) galectine-3 amplifie aussi phospho-paxillin, une cible en aval PAR-1, en augmentant la MMP-1 expression. MMP-1 blocs silencieux invasion de phospho-paxillin amplification et cellulaire provoquée par la galectine-3 sur-expression. e) Silencing soit galectine-3, PAR-1 ou MMP-1 migration cellulaire significativement réduite dans les vaisseaux dans le modèle d'embryon de poisson zèbre. f) galectine-3, PAR-1 et MMP-1 sont fortement exprimés et co-localisées dans les tissus malins de patients atteints de cancer de l'estomac.

Conclusions /Importance

galectine-3 joue la clé le rôle de l'activation des récepteurs de surface cellulaire par la production de la protéase et augmente les métastases du cancer gastrique. Galectine-3 a le potentiel de servir de cible pharmacologique utile pour la prévention des métastases du cancer gastrique

Citation:. Kim S-J, Shin J-Y, Lee K-D, Bae Y-K, Choi I-J, Parc SH, et al. (2011) galectine-3 Facilite motilité cellulaire dans le cancer gastrique par Up régulation Protease-Activated Receptor-1 (PAR-1) et Matrix métalloprotéinase-1 (MMP-1). PLoS ONE 6 (9): e25103. doi: 10.1371 /journal.pone.0025103

Editeur: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, France

Reçu: 18 mai 2011; Accepté le 23 Août 2011; Publié le 22 Septembre, 2011

Droit d'auteur: © 2011 Kim et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Cette étude a été soutenue par le Centre national du cancer (CCN) de la République de Corée subvention (NCC-0910150 et NCC-0810060), Institut de recherche innovant pour la thérapie cellulaire, République de Corée (A062260) et cette recherche a été soutenue par le Programme de recherche Basic442 sciences à travers le national Research Foundation (NRF), financé par le Ministère de l'éducation, de la science et de la technologie (1031790-1), République de Corée. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

les cancers qui se propagent (métastaser) à partir de leur site d'origine vers une autre partie du corps, sont appelés cancers métastatiques. cancers métastatiques ont un mauvais pronostic et une mortalité élevée [1]. Une pleine compréhension du mécanisme biologique (s) impliqué dans les métastases et des approches rationnelles à prévenir ou contrôler les métastases peut conduire à des approches pratiques pour améliorer le taux de patients atteints de cancers métastatiques de survie. Dans des études antérieures, nous avons constaté que la galectine-3 augmente la motilité gastrique des cellules cancéreuses en régulant à la hausse fascin-1, une protéine du cytosquelette d'actine groupement [2]. Galectine-3 est un 31 kDa protéine d'hydrate de carbone de reconnaissance, impliqué dans la tumorigenèse, la croissance des cellules cancéreuses et les métastases [3], [4], [5] et de son expression élevée dans plusieurs cancers humains a été trouvé en corrélation avec le mauvais pronostic des cancers métastatiques.

Afin de clarifier le rôle de la galectine-3 dans les métastases du cancer, nous knocked-down son expression dans les cellules de cancer gastrique en utilisant son siRNA et examiné les résultats de l'expression génique par l'analyse des microréseaux d'ADN [6]. Parmi les résultats précédents, nous avons constaté une réduction significative du niveau de protease activated receptor 1 (PAR-1), membre de la famille des transmembrane G-récepteurs couplés aux protéines [7], et son activateur, la matrice métalloprotéase-1 ( MMP-1) (figure S1). Clivée PAR-1 est auto-phosphorylée et transduit par un signal extracellulaire (s) par diverses voies, et joue un rôle crucial dans les métastases tumorales [7], [8], [9]. Surexpression de PAR-1 a été rapporté dans plusieurs cancers, y compris les mélanomes, du sein et des cancers gastriques. MMP-1 est également régulée à la hausse dans une grande variété de cancers avancés, et une corrélation négative significative a été observée entre son expression et la survie des patients [10], [11], [12], [13]. En outre, plusieurs études ont démontré que la MMP-1 joue un rôle crucial dans les métastases du cancer du sein [14], le foie et les cancers du côlon [15] et les cancers gastriques [16], [17], entre autres. Il semble qu'une fois sécrété, la MMP-1 favorise l'invasion des cellules cancéreuses par la dégradation de la matrice extracellulaire et /ou des couches de sous-muqueuse de vaisseaux lymphatiques [10], [14]. De nombreuses études ont démontré que l'inhibition des MMP conduit à l'inhibition de l'invasion des cellules [18], [19].

constatations es nous ont conduit à l'hypothèse que la galectine-3, PAR-1 et MMP-1 peut être impliqué dans l'amélioration de la migration et l'invasion du cancer gastrique. Pour tester cette hypothèse, nous avons mené des études pour leur rôle dans les cellules cancéreuses gastriques. Dans les deux in vitro
et in vivo
études dans, nous avons utilisé le modèle d'embryon de poisson zèbre pour déterminer leurs effets sur la migration et l'invasion des cellules cancéreuses avec des organites vivant. Nous avons également déterminé les niveaux d'expression de la galectine-3, PAR-1 et MMP-1 dans les tissus malins de patients atteints de cancer gastrique des corrélations cliniques entre ces protéines dans des échantillons humains.

galectine Silencing

Résultats ou -3 PAR-1 réduit la migration et l'invasion des cellules cancéreuses gastriques humaines

les taux de galectine-3 et PAR-1 expression ont été élevés dans des lignées cellulaires de cancer gastrique plus. Nous taire galectine-3 et PAR-1 dans MKN-28 cellules utilisant les siRNA respectifs. Le traitement par la galectine-3 siRNA a diminué les niveaux des deux galectine-3 et PAR-1 expression, alors que PAR-1 traitement siRNA diminué que PAR-1 expression alors qu'aucune différence n'a été observée dans la galectine-3 (figure 1A). La transfection de cellules SNU-638, qui présentent initialement aucune expression de la galectine-3, avec la galectine-3 plasmide codant entraîné une augmentation de l'expression à la fois de PAR-1 et de la galectine-3 (figure 1B). Silencing soit galectine-3 ou PAR-1 réduit le nombre total de migration ( p
< 0,001) (figure 1C) et les cellules envahissant ( p
< 0,001) (figure 1D), presque de moitié. Ces données ont montré que la galectine-3 a augmenté PAR-1 expression et à la fois la galectine-3 et PAR-1 la migration des cellules de cancer gastrique modulé et invasion.

galectine-3 améliore la migration des cellules de cancer gastrique /invasion en augmentant PAR-1 expression

Nous avons examiné la relation entre l'augmentation de la galectine-3-induits dans la migration cellulaire et l'invasion d'une part et de PAR-1 expression d'autre part. Nous infectés SNU638 cellules avec un lentivirus contenant la cassette galectine-3 expression, et examiné les expressions de la galectine-3 et PAR-1, et la migration cellulaire mesurée. Nous avons constaté que la sur-expression de la galectine-3 a été accompagnée par une augmentation de PAR-1 ARNm et la protéine d'expressions (figure 2A), ainsi que la migration des cellules ( p
< 0,001) (figure 2B) et l'invasion des cellules ( p
< 0,001) activités (figure 2C). Ces augmentations ont été réduites de PAR-1 silencieux. Ces résultats suggèrent que la galectine-3 a favorisé la migration et l'invasion des cellules de cancer gastrique par une régulation de PAR-1.

galectine-3 favorise PAR-1 la transcription par l'interaction avec AP-1 complexe

Nous avons ensuite tenté d'élucider la façon dont la galectine-3 régule PAR-1 expression. Parce qu'il a été rapporté que AP-1 l'activité transcriptionnelle est régulée par la galectine-3 [20], nous nous sommes concentrés sur le rôle de ce facteur de transcription à cet égard (figure 2D). Nous avons effectué des études d'immunoprécipitation et déterminé que la galectine-3 directement en interaction avec les deux Fra-1 et c-Jun dans le complexe d'AP-1, et que cette interaction était associée à une régulation à la hausse de l'AP-1 l'activité de transcription (figure 2E). Ensuite, nous avons examiné l'activité de liaison d'ADN de AP-1 avec et sans la galectine-3 par des essais ChIP (Figure 2F). Nous avons constaté que l'AP-1 complexe lié au promoteur de PAR-1, en présence de la galectine-3, mais pas en son absence. Nous avons également évalué l'activité transcriptionnelle de AP-1 par un dosage de la luciférase après la transfection d'un plasmide rapporteur contenant AP-1 séquence de liaison en face d'un promoteur minimal de luciférase d'entraînement en LacZ ou la galectine-3 surexprimant SNU-638 cellules ( p
< 0,001) (figure 2G). L'activité transcriptionnelle de AP-1 a augmenté de manière significative dans la galectine-3 cellules surexprimant, mais pas dans les cellules lacZ surexprimant. Ces résultats suggèrent que la galectine-3 a facilité la liaison du promoteur PAR-1 en interagissant avec AP-1 complexe, ce qui augmente PAR-1 expression par régulation de la transcription.

galectine-3 augmente l'expression de MMP-1 et l'activation de pAR-1 de signalisation

MMP-1 a été rapporté pour réguler pAR-1 activation par clivage de pAR-1 signalisation intracellulaire captif, et d'influer sur l'invasion des cellules [21]. Comme présenté dans la figure S1, nous avons montré que la galectine-3 régulé MMP-1 expression. Par conséquent, nous avons confirmé les interrelations de la galectine-3, MMP-1 et PAR-1. Nous avons analysé les niveaux de MMP-9, qui est une cible en aval de PAR-1 [8], l'expression de l'ARNm après silençage galectine-3, la MMP-1 et de PAR-1 individuellement (figure 3A). Alors que la galectine-3 silençage réduisait l'expression des trois molécules (MMP-1, PAR-1 et MMP-9), la MMP-1 silençage réduite que l'expression de MMP-9, et non ceux de la galectine-3 ou de PAR-1. Fait intéressant, PAR-1 silençage produit les mêmes effets que la MMP-1 silencieux. Nous avons également détecté la phosphorylation de la paxillin protéine du cytosquelette (pY181), une caractéristique de PAR-1 activation [22], [23]. Après silence galectine-3, MMP-1 et PAR-1 individuellement, le phosphorylaion de paxillin a diminué, ce qui suggère la galectine-3 a également réglementé PAR-1. Nous avons également vérifié la réduction de la MMP-9 activité après silence de la galectine-3, MMP-1 et PAR-1 individuellement (figure 3A).

niveaux d'expression galectine-3 sur-exprimant SNU638 cellules ont montré une augmentation de MMP -1 et PAR-1 des protéines ainsi que leurs ARNm, en plus de la paxilline phosphorylée (pY181). Dans ces cellules, la MMP-1 silençage réduit la phosphorylation de la paxilline, sans modifier l'expression de la galectine-3 ou de PAR-1 (figure 3B). En outre, la MMP-1 silençage réduit l'invasion de cellules, qui est déclenchée par la galectine-3 surexpression ( p
< 0,001) (figure 3C), ce qui implique que la galectine-3 a augmenté la MMP-1 expression conduisant à activation du pAR-1 signalisation.

Over-expression de MMP-1 dans les cellules cancéreuses augmente l'invasion cellulaire par l'activation de pAR-1 de signalisation

Nous avons confirmé que la régulation de la MMP-1 par la galectine-3 est importante pour l'activation de pAR-1 et une augmentation de la signalisation de l'invasion des cellules cancéreuses gastriques. Un lentivirus (pLECE3 Vector) contenant MMP-1 cassette d'expression régulée par le promoteur CMV a été préparé et infecté dans des cellules de cancer gastrique AGS (figure 4A-B). Comme prévu, la MMP-1 surexpression augmente le potentiel d'invasion des cellules cancéreuses gastriques, et PAR-1 silençage inversé de manière significative cette augmentation ( p
< 0,001) (figure 4B). Cela a également été confirmé par le fait que la surexpression de MMP-1 a augmenté la phosphorylation de la paxilline, et que le silençage supplémentaire de PAR-1 est bloqué comme la phosphorylation (figure 4A). Dans la MMP-1 des cellules surexprimant, la galectine-3 silençage réduisait l'expression de PAR-1, mais pas de MMP-1, ainsi que la phosphorylation de la paxilline et le potentiel invasif des cellules (figure 4A-B). Ces observations suggèrent que la surexpression de MMP-1 a augmenté l'invasivité des cellules cancéreuses par l'activation de PAR-1 signalisation. Pris ensemble, ces résultats suggèrent que la galectine-3 a augmenté l'expression à la fois de PAR-1 et MMP-1, et que l'augmentation de l'expression de MMP-1 activation de PAR-1 signalisation, ce qui, à son tour, facilite l'invasion des cellules cancéreuses. Ces événements sont schématiquement représentées sur la figure 4C.

Silencing de galecin-3, PAR-1 ou MMP-1 blocs gastrique migration des cellules cancéreuses in vivo
dans un modèle zebrafish

zebrafish Transgenic, Tg (kdrl: EGFP) ^{S843
[24], exprimer EGFP spécifiquement dans leur vascularisation. Les embryons de poisson zèbre correspondants sont transparents avec des navires fluorescents verts. Nous avons utilisé ces poissons pour mener in vivo
études sur la migration des cellules de cancer gastrique humain (figure 5A). Lorsque le rouge fluorescent marqué les cellules AGS ont été injectés dans le sac vitellin des embryons de poisson zèbre à 48 HPF (heures après la fécondation), la majorité des cellules AGS transplantées ont été situés dans le centre de la vésicule ombilicale des embryons de 4 heures après la transplantation ( hpt). Après 26 hpt, les deux cellules transfectées normales et scRNA migré dans la région du tronc, et résidaient dans la cuve du tronc et /ou la queue des embryons à 50 hpt. Cependant, le nombre de cellules AGS migrés, dans lequel chacun de la galectine-3, PAR-1 ou MMP-1 sont réduits au silence, a diminué de manière significative (figure 5B). Nous avons également compté le nombre d'embryons de poisson zèbre qui affichent cellules migrantes et les résultats sont affichés (Figure S2). Quatre-vingt 4-93 pour cent des embryons de poisson zèbre qui ont été transplantés avec des cellules de contrôle ou scRNA cellules traitées cellules affichées migrent dans leurs vaisseaux du tronc et de la queue à 50 hpt. Cependant, seulement 7 à 11% des embryons qui ont été transplantés avec des cellules dans lesquelles la galectine-3, PAR-1 ou MMP-1 ont été réduits au silence affiché des cellules en migration. Ces résultats suggèrent que d'abord, le modèle d'embryon de poisson zèbre peuvent être utilisés pour contrôler la migration des cellules du cancer de l'estomac comme un animal vivant, et, deuxièmement, que le silençage de chacun de la galectine-3, PAR-1 et MMP-1 a provoqué une réduction significative de la la migration des cellules de cancer gastrique in vivo
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expressions de galectine-3, PAR-1 et MMP-1 sont élevés, en parallèle, dans les tissus malins de patients atteints de cancer gastrique

Nous avons déterminé le taux de galectine-3 expression de l'ARNm de protéine et, PAR-1 et MMP-1 dans les tissus normaux et malins de 20 patients atteints d'un cancer de l'estomac, puis employées RT-PCR en utilisant une image J analyseur. Comme on le voit sur la figure 5C, et la figure S3, 73,7% des patients atteints de cancer ont montré des niveaux d'expression plus élevés de la galectine-3 et de 70% d'entre eux ont montré plus élevés de PAR-1 et MMP-1 niveaux dans les tissus malins que chez leurs homologues normaux. En outre, parmi galectine-3 patients positifs, 71,4% étaient également PAR-1 positif, tandis que 64,3% ont également MMP-1 positive (Figure 5D). Ces données indiquent qu'il y a une augmentation parallèle de l'expression de la galectine-3, ainsi que de PAR-1 et MMP-1 dans les tissus gastriques malignes. Nous avons également constaté que ces protéines co-localisées dans les zones malignes des tissus, et non dans les zones non malignes (figure 5C). Galectine-3 est présent à la fois dans le cytosol et le noyau, tandis que les PAR-1 et MMP-1 ont été observées en général dans le cytosol et de la membrane dans la même région (figure 5C). Ces résultats suggèrent que les deux expressions PAR-1 et MMP-1 significativement corrélées avec galctin-3 expression chez les patients atteints de cancer gastrique.

Discussion

Cette étude a démontré que la galectine-3 amélioré la migration des cellules de cancer de l'estomac et l'invasion. Mécanistique, cette liée galectine-3 à la régulation du récepteur de surface de PAR-1 sur les cellules et l'activité de MMP-1 protéase. Ceci est en accord avec des rapports démontrant une corrélation entre l'expression de PAR-1 et de l'invasion tumorale et les métastases dans l'estomac et d'autres cancers [25], [26], [27]. Cette étude est la première à démontrer une interaction directe de la galectine-3 et AP-1 composants complexes, c-Jun et Fra-1, et la régulation de PAR-1 expression par AP-1 facteur de transcription. Comme il a été déjà démontré par d'autres qui surexpression de Fra-1 favorise l'invasion des cellules cancéreuses et les métastases [28], la régulation positive de PAR-1 par c-Jun et Fra-1 semble être un mécanisme possible pour expliquer le lien d'induit une régulation positive du récepteur de surface cellulaire PAR-1 et l'activité de MMP-1 protéase galectine-3. Cette possibilité est prise en charge par notre constatation d'expressions parallèles et co-localisé de la galectine-3 et PAR-1 dans les tissus malins de patients atteints de cancer de l'estomac.

Il est une nouvelle observation que l'augmentation de la galectine-3 MMP-1 expression . Il est clair que la surexpression de MMP-1 peut augmenter l'activité d'invasion de cellules de cancer de l'estomac en bloquant une cellule à cellule et à des interactions de la matrice par la dégradation de l'ECM. Par conséquent, une augmentation de la MMP-1 expression promue par la galectine-3 pourrait avoir des effets doubles, à savoir, PAR-1 activation et de la dégradation de l'ECM, et les deux sont critiques pour les métastases du cancer gastrique. Cependant, comment la galectine-3 régule la MMP-1 expression est encore difficile, parce que l'expression de MMP-1 est régulée par une série d'événements complexes, y compris la diaphonie entre plusieurs facteurs de transcription, tels que AP-1, le transducteur de signal et activateur de transcription-3, MAP kinase et hypoxia-inducible factor-1 en hypoxie [29], [30], [31].

Mise en place du poisson-zèbre ( Danio rerio
) modèle d'embryon l'étude de la migration et l'invasion des cellules cancéreuses gastriques est une réalisation particulière de cette étude, car les modèles animaux appropriés ne sont pas disponibles pour l'étude des métastases du cancer gastrique humain jusqu'à présent. Le modèle de poisson zèbre pour étudier les cancers génétiquement modifiés et /ou des xénogreffes de tumeur, présente de nombreux avantages, y compris la faisabilité d'avant et arrière des analyses génétiques, la transparence des embryons [32], et l'aptitude à l'étiquetage de la GFP des navires [32], [33], [34]. Cette étude a montré que les cellules de cancer gastrique RFP marqué ont envahi les vaisseaux sanguins tandis que la galectine-3, MMP-1 ou PAR-1 réduit au silence les cellules de cancer gastrique ne pouvait pas. Ainsi, l'embryon de poisson zèbre semble être un modèle prometteur pour l'étude de l'invasion et la métastase des cellules cancéreuses, bien que d'autres études sont clairement nécessaires pour confirmer cette constatation.

En conclusion, nos études ont démontré que la galectine-3 a accéléré le cancer gastrique motilité cellulaire par up-régulation de pAR-1 et MMP-1. D'autres études sont clairement nécessaires pour établir le rôle de la galectine-3 dans les métastases du cancer et de son aptitude à servir de cible thérapeutique pour certains cancers.

Matériels et méthodes

Tissues

Paires de 2 mm de taille des échantillons de biopsie ont été obtenus à partir de tissus d'adénocarcinome gastrique de 20 patients subissant une endoscopie diagnostique et endoscopique dissection sous-muqueuse, au centre de cancérologie national en Corée, après avoir obtenu par écrit leur consentement éclairé. Les échantillons de tissus ont été congelés dans de l'azote liquide à -70 ° C immédiatement après la biopsie jusqu'à son utilisation. Certains des échantillons de tissus ont été paraffindized pour les études immunohistochimiques, au besoin. Ces études ont été approuvées par le Conseil d'examen institutionnel du Centre national du cancer (# NCCNSH 03-024).

Culture cellulaire et transfections de siRNA

lignées de cellules d'adénocarcinome modérément différenciées humaines gastriques, AGS, MKN- 28 et SNU-638 ont été obtenues à partir de la cellule Banque Korea Line et maintenu comme décrit précédemment [35]. ARNsi utilisés dans les transfections ont tous été fourni par Invitrogen (Carlsbad, CA). Leurs séquences sont galectine-3 (LGAL3) siRNA; AUAUGAAGCACUGGUGAGGUCUAUG 5'-3 ', PAR-1 ARNsi; CCCAUCUGUGUACACCGGAGUGUUU 5'-3 ', et MMP-1 ARNsi; GGAGAAAUAGUGGCCCAGUGGUUGA 5'-3 '. Les transfections ont été effectuées en utilisant le réactif Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) suivant les instructions du fabricant. Induction de transitoire galectine-3 surexpression dans SNU-638 cellules a été réalisée en utilisant pcDNA3.1 /NT-galectine-3 avec pcDNA3.1 /NT-GFP. Pour le traitement de commande de normalisation, les lignées cellulaires de cancer gastrique ont été traités avec 1 pg par des réactifs LTX (Invitrogen).

isolement de l'ARN et RT-PCR analyse

ARN total a été isolé à partir de cellules cancéreuses gastriques humaines et des échantillons de tissu d'un patient, en utilisant le réactif Trizol (Invitrogen) selon les instructions du fabricant. transcriptase inverse PCR a été réalisée en utilisant un système de transcription inverse (Promega Corp. USA), en suivant les instructions du fabricant. Les amorces ont été utilisées: 5'-ATGGCAGACAATTTTTCGCTCC-3 '(sens) et 5'-ATGTCACCAGAAATTCCCAGTT-3' (anti-sens) pour LGAL3 humain génétique (galectine-3); 5'-CCAAAACTGAGCATAAGTCC-3 '(sens) et 5'-AGGATGGAGCAAATGTAGTG-3' (anti-sens) pour F2R humaine (PAR-1) gène; ACAGCTTCCCAGCGACTCTA 5'-3 '(sens) et 5'-CAGGGTTTCAGCATCTGGTT-3' (antisens) pour le gène de MMP-1 humaine; CTCGAACTTTGACAGCGACA 5'-3 '(sens) et 5'-GCCATTCACGTCGTCCTTAT-3' (antisens) pour le gène de MMP-9 humaine; AGCCTCGCCTTTGCCGA 5'-3 '(sens) et 5'-CTGGTGCCTGGGGCG-3' (anti-sens) pour le gène de la β-actine humaine; GGCTGCTTTTAACTCTGGTA 5'-3 '(sens) et 5'-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3' (anti-sens) pour la glycéraldéhyde humaine 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH). La PCR a été réalisée dans un volume de 20 pi en utilisant une Ex Taq (Takara). Le cycle d'amplification (dénaturation à 95 ° C pendant 1 min, annelage à 60 ° C pendant 1 min et extension de l'étape à 72 ° C pendant 2 min) a été répétée 32 fois suivie d'une extension finale pendant 10 min à 72 ° C.

Construction de la galectine-3 exprimant vecteur et infection lenti-virale

la pleine longueur galectine-3 humain exprimant la construction pcDNA3.1-NT-GFP-GAL3, le vecteur pcDNA3.1-NT-GFP et le vecteur lenti-viral à plus-express LacZ, galectine-3 (1-250) dans pLL3.7 ont été décrites précédemment [2]. F2R humain a été cloné dans pLECE3 dans des sites d'enzymes de restriction BamH1 et Not1, la création de la pLECE3-F2R (PAR-1) construire. cDNA pleine longueur de F2R, MMP-1, et le contrôle mRFP ont été utilisées pour l'amplification par PCR, avec les amorces énumérées dans les données S1, et des fragments de PCR résultants ont été clones dans le vecteur pLECE3 utilisant des sites d'enzymes de restriction PAC1 et HPA1, la création de la pLECE3 -MMP-1 construit. En outre, le site mRFP du vecteur pGEM-T-Easy a été transféré au vecteur pLL3.7 remplaçant la région de la GFP en utilisant Âge1 et EcoR1 sites d'enzymes de restriction, de faire pLL3.7-mRFP. la production de vecteurs Lenti-viral a été décrit précédemment [2]

Analyse par Western blot

extractions cellulaires de lysat ont été préparées avec du tampon RIPA (1% de NP-40;. 0,1% de dodécylsulfate de sodium; 0,5 désoxycholate%; NaCl 150 mM, Tris 50 mM, pH 7,5) et de la protéase inhibiteur cocktail. 20 ug de protéine totale de chaque lysat a été résolu dans 8 à 12% de gels de SDS PAGE et électro-transférées sur une membrane PVDF, puis bloqué dans 5% de lait écrémé dans 0,05% de Tween-20 avec 1 x PBS (PBST). les anticorps primaires polyclonaux, anti-galectine-3, anti-ThrombinR (PAR-1), anti-c-Jun, anti-Fra-1 et anti-β-actine (Santa Cruz), anti-MMP1 (Calbiochem), anti- Paxillin et anti-phospho paxillin (pY181) (Epitomics) ont été incubées avec blots à 1:1000 dilution dans des volumes minimaux de 5% de BSA (sérum-albumine bovine) dans un tampon PBST pour la température ambiante 1 heure ou plus de nuits à 4 ° C. Anticorps secondaires chèvre conjugué à la HRP anti-souris ou anti-lapin (GE Healthcare UK Limited) ont été mises en incubation à 1:5000 dilution de 5% de BSA dans un tampon PBST pendant 1,5 heure à température ambiante. Les protéines d'intérêt ont été détectés par chimioluminescence amplifiée (ECL) (Amersham Corp, Arlington Heights, IL, USA).

Immunoprécipitation

extraits de cellules de lysat ont été préparés avec un tampon IP + (Hepes 20 mM, 1 % de Triton X-100, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM mM, NaF 100, pyrophosphate de sodium 10 mM, orthovanadate de sodium 1 mM, 0,2 mM de PMSF, 10 ug /ml inhibiteur de protéase cocktail) dans de la glace pendant 30 min. Après l'enlèvement des débris par centrifugation (13200 rpm à 4 ° C pendant 20 minutes), les surnageants ont été soumis à une étape de précontrôle avec de la protéine A /G Agarose billes à 4 ° C pendant 30 min dans rotateur. Surnageants obtenus après une brève centrifugation (2000 tours par minute à 4 ° C pendant 4 min) ont été soumis à une immunoprécipitation en utilisant un anticorps anti-galectine-3 et IgG de souris normale (témoin négatif). Les immunoprécipités ont été lavés deux fois dans du tampon IP (20 mM Hepes, 1% de Triton X-100, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NaF 100 mM, du pyrophosphate de sodium 10 mM). Au bout de 30 pi de 2 x tampon d'addition d'échantillon SDS, suivie d'ébullition à 95 ° C pendant 5 min. Après avoir surnageants obtenus après une brève centrifugation, leurs niveaux d'expression de protéines ont été déterminées par l'analyse Western blot réalisée.

immunohistochimie

Pour la galectine-3 et PAR-1 immunohistochimie, déparaffinées coupes de tissus de patients atteints de cancer gastrique ont été laissées dans un four micro-ondes pendant 15 min dans un tampon citrate (laboratoires Vector), puis mis en incubation avec 3% de H _{2 O 2 pendant 15 minutes pour bloquer la peroxydase endogène, suivi d'une incubation avec 10% de sérum de chèvre normal (Vector laboratoires) dans du PBS pendant 1 × 10 min. Les anticorps primaires ont été utilisés un anti-galectine-3 (1:200) anti-MMP1 (Epitomics) et anti-PAR-1 (1:200) anticorps (Santa cruz), et l'étape suivante a été effectuée conformément aux instructions du Vectastain®ABC kit (laboratoires Vector). Les produits ont été visualisés par diaminobenzidine (DAB) kits (laboratoires de vecteur).}

Gélatine zymographie

Les milieux conditionnés ont été obtenus à partir de cultures de MKN-28 lignées cellulaires de cancer gastrique et concentrées en utilisant Vivaspin 6 (Sartorius ). Les surnageants sont concentrés dans un tampon 6 x Foz ont été séparés sur des gels de SDS 10% contenant 1 mg /ml de gélatine. Chacun a été mis en incubation dans 100 ml de tampon de réaction zymographie et colorées avec Coomassie Bio-safe ™, G-250 (Bio-Rad Laboratories). Après décoloration, des bandes transparentes nettes indiquant une activité gélatinolytique ont été visualisées sur un fond bleu.

migration Transfilter et invasion des essais

Pour la migration de transfilter et le dosage de l'invasion, nous avons utilisé MKN-28 et SNU-638 cellules. Les cellules ont été transfectées avec des ARNsi pour 1 jour, isolé et ajouté aux chambres supérieures des pores inserts Transwell avec du collagène de type l (BD Bioscience) filtres enduits dans les tests de migration, et matrigel (BD Bioscience) filtres enduits, pour des essais d'invasion. Du RPMI 1640 avec 10% de FBS et 1% d'antibiotiques (Gibco) a été ajouté à la chambre inférieure suivie d'une incubation pendant 20 heures. cellules Migration et d'invasion ont été quantifiées après H & E coloration. Chaque expérience a été réalisée en triple et les données présentées comme des valeurs moyennes.

chromatine analyses d'immunoprécipitation

chromatine immunoprécipitation (ChIP) les analyses ont été effectuées en utilisant un kit de dosage de ChIP (Millipore). Les échantillons ont été appliqués sur la vaisselle après la galectine-3 siRNA traitement et les dosages ont été effectués en suivant les instructions du fabricant. L'anti-galectine-3, anti-c-Jun, anti-Fra-1 et normal /souris IgG de lapin ont été utilisés pour immunoprécipiter des complexes d'ADN contenant. Avant la PCR, des amorces ont été préparées pour l'AP-1 avec des sites de liaison à PAR-1 promoteur -666 (5'-CACTGT CGACGTCTCCACAT-3 ') et PAR-1 site promoteur -307 (5'-GGGCCTAGAAGTCCAA ATGA-3'). PCR a été réalisée avec un taq Ex (Takara).

essais de luciférase

Un AP-1 plasmide rapporteur luciférase a été obtenu du Dr Sung-Pil Yoon du centre du cancer national en Corée et les études des effets de la galectine-3 sur AP-1 activité transcriptionnelle dans lacZ et galectine-3 sur des cellules exprimant ont été réalisées conformément à un rapport précédent [2]. Au bout de 48 heures, les cellules ont été récoltées et l'activité luciférase a été mesurée en utilisant un système d'analyse de luciférase (Promega) selon les instructions du fabricant. Chaque expérience a été réalisée en triple et les données présentées comme des valeurs moyennes

test de migration cellulaire en utilisant le modèle zebrafish

La ligne zebrafish transgénique Tg (de kdrl: EGFP). ^{S843
[24], dans lequel EGFP est spécifiquement exprimée dans la vascularisation, a été maintenue conformément aux procédures d'utilisation standard [36] approuvé par le soin et l'utilisation des animaux au Comité institutionnel national Cancer Center en Corée; numéro de permis: NCC 11-116. Nous avons obtenu des embryons zèbre poissons du centre national du cancer d'aqua-room zebrafish. la transplantation des cellules cancéreuses a été réalisée selon Nicoli et al [37] avec de légères modifications. En bref, des embryons dechorionated ont été anesthésiés avec de tricaïne (Sigma) et les cellules cancéreuses ont été injectées (150 à 200 par embryon) dans les centres des sacs vitellins embryonnaires à 48 HPF (heures après la fécondation) à l'aide d'un micromanipulateur (Narishige) et un pneumatique Picopump (WPI ) équipé d'une aiguille de verre de borosilicate. Les embryons ont été maintenus après procédures de transplantation et ont été examinées pour la migration des cellules cancéreuses par microscopie à fluorescence. Pour l'imagerie, les embryons et les larves ont été traités avec de la N-phénylthiourée (Sigma) à partir de 12 HPF pour prévenir la pigmentation et examinées avec un microscope à fluorescence inversé (Carl Zeiss) sous une optique à épifluorescence. images fluorescentes ont été capturées avec une caméra CCD (Carl Zeiss). Stable fluorescents gastriques lignées cellulaires AGS (RDRF) ont été générés par l'infection lenti-virus avec pLL3.7-mRFP suivi par tri FACS.}

Microarray analyse des données

Microarray a été réalisée chez AGS, le cancer gastrique lignée cellulaire après silençage de la galectine-3 comme décrit précédemment [6]. les résultats de biopuces ont été téléchargés sur le GEO (GSE29630).

Statistiques d'analyse

Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± écart-type à partir d'au moins 5-10 images obtenues à partir de trois expériences indépendantes utilisant un microscope (100 ×, × 200), à moins d'indication contraire. L'analyse statistique a été effectuée par une voie test ANOVA en utilisant le logiciel Prism. Les données ont été considéré comme significatif si p
<. 0.05

Informations complémentaires
Figure S1.
Silencieux galectine-3 avec un ARNsi dans des cellules cancéreuses gastriques ont donné lieu à des changements dans l'expression des gènes liés à la motilité cellulaire. A, Parmi l'analyse des puces à ADN, nous avons choisi la motilité cellulaire gène lié MMP-1, MMP-3, FSCN1 (Fascin-1), F2R (PAR-1), TIMP-2, SERPINE1 (PAI-1) et a montré le rapport de facteur de changement . B La détection de l'expression d'ARNm de la MMP-1, MMP-3, FSCN1 (Fascin-1), F2R (PAR-1), TIMP-2, SERPINE1 (PAI-1) en utilisant par PCR. β-actine a été utilisée comme témoin de normalisation
doi:. 10.1371 /journal.pone.0025103.s001
(TIF)
Figure S2.
Le nombre d'embryons de poisson zèbre avec un rapport de cellules migrées. La détection de cellules de cancer gastrique AGS (RFP) numéros après transplantation d'AGS (DP) dans l'embryon de poisson zèbre avec un traitement spécifique siARN (galectine-3, MMP-1 et PAR-1) avec contrôle négatif scRNA (figure 5A-B). Elle a montré nombre de cellules migré par embyos a été compté et indiquées en pourcentage
doi:. 10.1371 /journal.pone.0025103.s002
(TIF)
Figure S3.
analyse par RT-PCR du niveau de l'ARNm de galectine-3, la MMP-1 et de PAR-1 chez les patients atteints de cancer gastrique.

• PLOS ONE: La tumeur Log Les chances de Envahissement ganglionnaire-Métastases Staging System, un système de stadification Nouveau prometteur pour le cancer gastrique après D2 Résection en Chine
• PLOS ONE: Honokiol Induit calpaïne-Mediated Glucose-Regulated Protein-94 Clivage et Apoptose dans les cellules humaines du cancer gastrique et réduit la croissance tumorale