miRNA signature associée à devenir des patients atteints de cancer gastrique après une chimiothérapie

miRNA signature associée à devenir des patients atteints de cancer gastrique après une chimiothérapie
Résumé de l'arrière-plan
identification des patients qui sera probablement ou ne bénéficieront pas de la chimiothérapie cytotoxique par l'utilisation de biomarqueurs pourrait grandement améliorer la prise en charge clinique en définissant mieux le traitement approprié options pour les patients. microARN peuvent être des biomarqueurs potentiellement utiles qui aident à guider le traitement individualisé du cancer parce que l'expression de microARN est dérégulé dans le cancer. Afin d'identifier les signatures miRNA pour le cancer gastrique et pour prédire la résistance clinique au cisplatine /fluorouracile (CF) chimiothérapie, une analyse complète miRNA microarray a été réalisée en utilisant des échantillons de biopsie endoscopiques
. Les échantillons de biopsie de méthodes ont été recueillies avant la chimiothérapie de 90 patients atteints de cancer gastrique traités avec CF et de 34 volontaires en bonne santé. Au moment de la progression de la maladie, des échantillons post-traitement ont en outre été recueillies à partir de 8 répondeurs cliniques. expression miRNA a été déterminée en utilisant un Agilent microarray conçu sur mesure. Afin d'identifier une signature miARN pour la résistance à la chimiothérapie, nous corrélée niveaux d'expression de miARN avec le temps jusqu'à progression (TTP) de la maladie après un traitement CF.: Résultats
Une signature miARN distinguer le cancer gastrique de l'épithélium gastrique normale a été identifié. 30 miARN ont été significativement inversement corrélée à TTP alors que 28 miARN étaient significativement corrélées positivement avec TTP de 82 patients atteints de cancer (P
< 0,05). Au premier rang des miARN surexprimés associés à chimiosensibilité étaient miARN connus pour réguler l'apoptose, y compris let-7g, miR-342, miR-16, miR-181, miR-1, et miR-34. Lorsque ce prédicteur 58-miARN a été appliqué à un ensemble distinct d'échantillons de tumeurs pré et post-traitement des 8 intervenants cliniques, tous les échantillons 8 pré-traitement ont été correctement prédit comme étant à faible risque, alors que les échantillons du post-traitement les tumeurs qui se sont développées chimiorésistance ont été prévus pour être dans la catégorie à haut risque par le 58 miRNA signature, ce qui suggère que la sélection pour l'expression de ces miARN eu lieu comme la chimiorésistance née de. Conclusions
Nous avons identifié 1) une signature d'expression de miARN qui distingue le cancer gastrique de l'épithélium gastrique normale chez des volontaires sains, et 2) une miRNA signature d'expression chemoreresistance qui est en corrélation avec TTP après la thérapie CF. La signature chimiorésistance miARN d'expression comprend plusieurs miARN précédemment indiqués pour réguler l'apoptose in vitro
et garantit une validation supplémentaire.
Contexte
miARN sont courtes (~ 22 nucléotides), ARNs non codants qui régulent l'expression des gènes principalement par répression traductionnelle ou de la dégradation de la transcription [1]. miARN ont un grand potentiel en tant que biomarqueurs du cancer en raison de leur expression tissu-spécifique et de leur expression aberrante dans les cellules cancéreuses [2]. En outre, les miARN ont des fonctions importantes dans la régulation et l'apoptose du cycle cellulaire. L'expression des miRNAs peut être dérégulé dans le cancer par une variété de mécanismes, y compris régulation de la transcription, l'amplification, la suppression, la mutation et le silençage épigénétique [3]. Ainsi, les microARN peut être des biomarqueurs potentiellement utiles qui aident guider le traitement individualisé.
Identifier les patients qui sera probablement ou ne bénéficieront pas de la chimiothérapie cytotoxique par l'utilisation de biomarqueurs pourrait grandement améliorer la prise en charge clinique en définissant mieux les options de traitement appropriées pour les patients. La plupart des études précédentes qui tentent d'identifier les prédicteurs miRNA de chimiorésistance dans le cancer ont examiné seulement miARN individuels [4]. Jusqu'à présent, un seul publié à haut débit l'analyse des microréseaux a évalué miRNA signatures d'expression comme facteurs prédictifs de résistance à la chimiothérapie chez les patients atteints de tumeurs solides métastatiques [5]. Dans cette étude de microarray miRNA des cancers de l'ovaire de stade III-IV, laissez-7i expression a été jugée significativement réduite chez les patients 27 résistantes à la chimiothérapie par rapport à 42 répondeurs complets, bien qu'il n'y ait pas de cohorte de validation indépendante [5].
nous présentons ici les résultats d'une étude prospective en utilisant une analyse miRNA microarray à haut débit dans lequel une signature d'expression miRNA a été identifié qui distingue le cancer gastrique de l'épithélium gastrique normal. En outre, nous avons identifié une deuxième signature qui est en corrélation avec le temps jusqu'à progression (TTP) pour les patients atteints de cancer gastrique traités avec le cisplatine et fluorouracile (CF), un régime de chimiothérapie de référence pour le cancer gastrique. Ces signatures miARN peuvent être utiles en tant que biomarqueurs potentiels pour aider dans le diagnostic du cancer gastrique dans les cas difficiles et pour prédire la réponse des patients atteints de cancer de l'estomac à CF thérapie.: Résultats
Identification d'un cancer de l'estomac miRNA signature
Ninety des échantillons de tissus de cancer gastrique de prétraitement étaient disponibles pour cette analyse et leurs caractéristiques clinico sont décrites dans le tableau 1. Tous les patients avaient une maladie métastatique au moment de l'inscription et après des échantillons de tissus de biopsie endoscopique ont été recueillies, les patients ont été traités avec le cisplatine et fluorouracile (ou capécitabine ) combinaison chimiothérapie. Toutes les données de puces à ADN a été déposé à GEO et est disponible lors de la publication. Accès Auteur: http://​www.​ncbi.​nlm.​nih.​gov/​geo/​query/​acc.​cgi?​token=​ftixhsoiemwgyfi&​acc=​GSE30070Table Caractéristiques 1 clinico-pathologiques des patients

patients atteints de cancer gastrique
volontaires sains

formation
fixé
preuve de principe
Test set
(répondeur)

Nombre
82
8
34
Age - an
gamme
56
56
48
interquartile de médian (44-63)
(44-58)
( 43-57)
Sex - no. (%)
64 (78,0%) de Male
7 (87,5%)
23 (67,6%)
18 (22,0%) de Femme
1 (12,5% )
11 (32,4%) statut
Performance (PS) - no. (%)
ECOG1 PS 0 ou 1
73 (89,0%)
8 (100%)
ECOG PS 2 ou 3
9 (11,0%)
0
Le type histologique - pas. (%)
Intestinal Lauren 34 (41,5%)
3 (37,5%)
48 (58,5%) de la diffuse de Lauren
5 (62,5%)
Lieu lésion primaire - non. (%)
Upper 1/3
11 (13,4%)
1 (12,5%)
Moyen 1/3
18 (22,0%)
5 (62,5%)
Lower 1/3
43 (52,4%)
1 (12,5%) 10 (12,2%)
estomac entier
1 (12,5%)
chimiothérapie - pas . (%)
Cisplatine /fluorouracile
80 (97,6%)
8 (100%)
2 (2,4%) de cisplatine /capécitabine
0
* intensité de dose relative gamme%
Median
81,2
76,6
interquartile
(75,3 à 87,3)
(64,7 à 84,9)
Nombre de cycles de chimiothérapie
médian
4 - gamme
10
interquartile (2-5)
(7-11)
réponse à la chimiothérapie (critères OMS) -no (%)
PR2
16 (24,6% )
6 (100%)
SD3
25 (38,5%)
PD4
24 (36,9%)

16 Non mesurable 2
unevaluable
1
chimiothérapie de deuxième ligne
55 (67,1%)
6 (75,0%)
suivi médian pour les survivants
35,5 mois
- La survie globale - . mo
médian
8.2
16
interquartile
(6/8 à 10/5)
(11,3 à 26,7)
temps jusqu'à progression - mo.
médian
3.1
8.2
intervalle interquartile
(02.05 à 03.09)
(4,3 à 21,2)
1Eastern Cooperative Oncology Group, la réponse 2partial, maladie 3stable, maladie 4progressive
* intensité de dose relative
* moyenne des intensités de dose relatives de cisplatine et fluorouracile. l'intensité de la dose est définie comme la quantité de médicament administrée par unité de temps, exprimée en milligrammes par mètre carré et par semaine. l'intensité de la dose relative est définie comme l'intensité de la dose réelle par rapport à l'intensité de la dose prévue de chaque médicament.
Nous avons d'abord comparé les profils de miARN provenant des 90 échantillons de pré-traitement obtenus à partir de patients atteints d'un cancer gastrique avec les données d'expression de miARN provenant de 34 échantillons de biopsie de la muqueuse gastrique normale obtenu auprès de volontaires en bonne santé (figure 1). Pour estimer la puissance prédictive des profils de miARN spécifiques du cancer, la prédiction de classe analyses ont également été réalisées en divisant de façon aléatoire l'ensemble de l'échantillon en deux (formation et de test) sous-ensembles à un rapport 1-to-1. La randomisation a été réalisée en utilisant le logiciel NQUERY Advisor (version 7.0, Solutions statistiques, Saugus, MA). Puis étiquette de classe de chaque échantillon dans l'ensemble de test a été prédit pour chacune des 100 formations aléatoire pour tester les partitions selon composé prédicteur covariable (PCC), diagonal analyse discriminante linéaire (LDA), 1- et 3 plus proches voisins (NN), le plus proche Machine barycentre (NC), et le soutien vecteur (SVM). Lors d'une sélection de caractéristiques P
< 0,05, la précision de la prédiction médiane dans les ensembles de test était > 90% dans tous les classificateurs (91,9%, 90,3%, 90,3%, 93,5%, 93,5% et 91,9%, par CCP, LDA, 1-NN, 3-NN, Caroline du Nord, et SVM, respectivement), dans 100 partitions aléatoires de formation à l'essai. Figure schéma 1 de l'étude afin d'identifier et de tester miARN prédictive de la résistance aux FC
tableau 2 énumère les miARN qui sont exprimés de manière différentielle entre les 90 tumeurs de cancer gastrique et les 34 échantillons normaux à une sélection de caractéristique de P
< 0,005. De nombreux miARN qui sont surexprimés dans le groupe de cancers gastriques font partie des miR-106b-17-92 et 25 grappes, comme indiqué précédemment [6, 7]. En temps réel, la réaction en chaîne de la polymérase après transcription inverse quantitative (Q-RT-PCR) a confirmé les analyses de l'expression différentielle de certaines de ces miARN dans des échantillons de cancer de l'estomac (figure 2). Bien que miR-25 est significativement régulée à la hausse par l'analyse de la matrice dans les tumeurs, cela n'a pas atteint une signification statistique par Q-PCR, peut-être en raison du nombre limité d'échantillons qui étaient disponibles pour l'analyse. Bien qu'une étude précédente a rapporté que miR-486 est downregulated dans le cancer gastrique, nous avons trouvé l'expression de miR-486 à être élevée dans notre série de patients atteints de cancer gastrique tant par microarray et Q-PCR (fichier supplémentaire 1: Figure S1) .Table 2 miARN exprimés de manière différentielle dans le cancer gastrique et de l'épithélium gastrique normal.
surexprimé dans le cancer gastrique
p
FDR
Ratio
hsa-miR-25
< 1E-07
< 1E-07
1,64
hsa-miR-106b
< 1E-07
< 1E-07
1,85
hsa-miR-93
< 1E-07
< 1E-07
1,49
hsa-miR-503
< 1E-07
< 1E-07
2.17
hsa-miR-18a
< 1E-07
< 1e-07
2.27
hsa-miR-224
1.00E-07
2.59E-06
3.85
hsa-miR-451
1.00E-07
2.59E-06
3.23
hsa-miR-18b
2.00E-07
4.60E-06
2.17
hsa-miR-17-5p
2.00E-06
3.60E-05
1.61
hsa-miR-486-5p
3.00E-06
5.18E-05
2.22
hsa-miR-144
9.60E-06
0.000159
5.56
hsa-miR-552
1.03E-05
0.000164
2.38
hsa-miR-425-5p
1.32E-05
0.000195
1.35
hsa-miR-92
1.88E-05
0.000268
1.39
hsa-miR-106a
2.61E-05
0.000347
1.52
hsa-miR-223
2.68E-05
0.000347
2.13
hsa-miR-205
2.98E-05
0.000363
4.76
hsa-miR-196b
4.42E-05
0.000508
1.67
hsa-miR-19a
0.0001836
0.00181
1.69
hsa-miR-191
0.0003112
0.0028
1.27
hsa-let-7i
0.0004468
0.00385
1.20
hsa-miR-185
0.0004764
0.00394
1.32
hsa-miR-769-5p
0.0006683
0.00532
1.37
hsa-miR-196a
0.0008274
0.00646
1.45
hsa-miR-301
0.0009715
0.00745
1.82
hsa-miR-21
0.0012598
0.00948
1.49
hsa-miR-130b
0.0015411
0.0112
1.30
hsa-miR-19b
0.0015959
0.0114
1.39
hsa-miR-424
0.0019249
0.0135
1.52
hsa-miR-484
0.0020451
0.0139
1.33
hsa-miR-767-5p
0.0048511
0.03
1.64
hsa-miR-183
0.0050428
0.0305
1.52
hsa-miR-210
0.0053848
0.0318
1.35
hsa-miR-302c*
0.006328
0.0364
1.41
hsa-miR-520g
0.0070896
0.0402
2.13
hsa-miR-324-5p
0.0095742
0.0497
1.23
hsa-miR-103
0.0095861
0.0497
1.16
hsa-miR-376b
0.0096083
0.0497
1.85
hsa-miR-151
0.0100422
0.0513
1.20
hsa-miR-596
0.011231
0.0556
1.61
hsa-miR-545
0.011422
0.0556
1.69
hsa-miR-221
0.0129139
0.0608
1.27
hsa-miR-20a
0.0133176
0.0619
1.35
hsa-miR-181b
0.0148487
0.0655
1.28
hsa-miR-181d
0.0154891
0.0668
1.16
hsa-miR-623
0.0189476
0.0809
1.43
hsa-miR-519d
0.0220958
0.0915
1.59
hsa-miR-563
0.0229302
0.094
1.37
hsa-miR-505
0.0241657
0.097
1.25
hsa-miR-107
0.0242694
0.097
1.11
hsa-miR-320
0.0282982
0.111
1.20
hsa-miR-96
0.0285699
0.111
1.39
hsa-miR-339
0.0312524
0.12
1.32
hsa-miR-181a
0.0318141
0.121
1.20
hsa-miR-345
0.0322275
0.121
1.19
hsa-miR-20b
0.0325811
0.122
1.28
hsa-miR-33b
0.0339343
0.125
1.64
hsa-miR-135b
0.0352682
0.129
1.59
hsa-miR-431
0.0374687
0.134
1.41
hsa-miR-193a
0.0377098
0.134
1.35
hsa-miR-550
0.0380645
0.134
1.30
hsa-miR-565
0.0446875
0.15
1.20
Sous-exprimés dans le cancer gastrique
p
Ratio
hsa-miR-146a
<FDR; 1E-07
< 1E-07
0,39
hsa-miR-133a
< 1E-07
< 1E-07
0,34
hsa-miR-625
< 1E-07
< 1E-07
0,56
hsa-miR-375
< 1E-07
< 1E-07
0,27
hsa-miR-133b
< 1E-07
< 1E-07
0,32
hsa-miR-195
< 1E-07
< 1E-07
0,47
hsa-miR-148a
< 1E-07
< 1E-07
0,47
hsa-miR-1
< 1E-07
< 1E-07
0,27
hsa-miR-26a
< 1E-07
< 1e-07
0.67
hsa-miR-204
2.00E-07
4.60E-06
0.26
hsa-let-7c
7.00E-07
1.53E-05
0.74
hsa-let-7a
9.00E-07
1.86E-05
0.72
hsa-let-7g
1.10E-06
2.17E-05
0.71
hsa-miR-497
1.70E-06
3.20E-05
0.56
hsa-miR-26b
1.28E-05
0.000195
0.58
hsa-miR-145
2.04E-05
0.000282
0.65
hsa-miR-34a
2.89E-05
0.000363
0.75
hsa-miR-143
4.28E-05
0.000506
0.63
hsa-miR-650
9.15E-05
0.00101
0.57
hsa-miR-150
9.25E-05
0.00101
0.49
hsa-miR-768-5p
0.0001037
0.0011
0.65
hsa-let-7d
0.0001302
0.00132
0.76
hsa-miR-203
0.0001311
0.00132
0.52
hsa-miR-29c
0.0002112
0.00203
0.52
hsa-let-7f
0.0002446
0.0023
0.69
hsa-miR-30d
0.0002592
0.00238
0.78
hsa-miR-642
0.0004345
0.00383
0.62
hsa-miR-30c
0.0004556
0.00385
0.75
hsa-miR-155
0.0004998
0.00406
0.66
hsa-miR-34b
0.0013651
0.0101
0.64
hsa-miR-551b
0.0019808
0.0137
0.53
hsa-miR-28
0.0027537
0.0184
0.85
hsa-let-7e
0.0034793
0.0227
0.84
hsa-let-7b
0.0035019
0.0227
0.85
hsa-miR-212
0.0039061
0.0249
0.76
hsa-miR-564
0.0047906
0.03
0.72
hsa-miR-770-5p
0.0050814
0.0305
0.71
hsa-miR-30b
0.0060842
0.0355
0.76
hsa-miR-30a-5p
0.0077597
0.0434
0.80
hsa-miR-199b
0.0083572
0.0461
0.67
hsa-miR-125a
0.0085563
0.0466
0.77
hsa-miR-621
0.0093423
0.0497
0.69
hsa-miR-31
0.0106862
0.054
0.66
hsa-miR-365
0.0113404
0.0556
0.78
hsa-miR-381
0.0123061
0.0592
0.70
hsa-miR-626
0.0128738
0.0608
0.78
hsa-miR-127
0.0138033
0.0635
0.69
hsa-miR-660
0.0142991
0.0651
0.75
hsa-miR-342
0.0146193
0.0655
0.75
hsa-miR-146b
0.0148729
0.0655
0.77
hsa-miR-361
0.0152056
0.0663
0.86
hsa-miR-489
0.0191692
0.081
0.71
hsa-miR-29a
0.0204334
0.0854
0.79
hsa-miR-95
0.0243644
0.097
0.54
hsa-miR-567
0.0265025
0.104
0.54
hsa-miR-152
0.0376121
0.134
0.78
hsa-miR-429
0.0378151
0.134
0.65
hsa-miR-200b
0.0396617
0.138
0.75
hsa-miR-504
0.0412648
0.142
0.63
hsa-miR-668
0.041717
0.143
0.77
hsa-miR-186
0.0437991
0.149
0.83
hsa-miR-135a
0.0468793
0.157
0.58
hsa-miR-485-5p
0.047683
0.158
0.82
Figure 2 Validation de l'expression de miR en temps réel quantitative à inverser la réaction en chaîne par polymérase (Q-RT-PCR). Q-RT-PCR analyse de miR-18a, miR-25, miR-1, et laissez-7g en 4 normale (montré en blanc
) et 4 échantillons de cancer (en noir
), confirmant sur- l'expression de miR-18a et miR-25 et la sous-expression de miR-1 et laissez-7g comme observé dans les données de puces à ADN des échantillons de cancer. Le test t P
valeur de l'élève entre 4 normal et 4 échantillons de cancer est indiquée pour chaque miARN. Pliez le changement (FC) de -1 indique une diminution de 50% dans l'expression de RNU6 normalisée d'une identification
miRNA. Donné une signature miARN pour la résistance à la thérapie CF
temps jusqu'à progression (TTP), pas de réponse radiographique, a été utilisé comme indicateur clinique de la réponse à la chimiothérapie, principalement parce que nous voulions inclure les patients qui ne disposent pas de la maladie quantifiable en utilisant les modalités d'imagerie standard. Pour définir un à partir de 82 échantillons que la formation prévue pour développer un prédicteur (Figure 1). Ces 82 échantillons de prétraitement ont été prélevés chez des patients qui ne subissent deuxièmes biopsies. Cinquante-huit miARN étaient significativement corrélées avec le TTP de ces 82 patients (sélection fonction P
valeur < 0,05) (tableau 3). La surexpression de 30 miARN a été associée à un retard TTP, tandis que la surexpression de 28 miARN a été associée à un tiers de confiance plus rapide. Six * miARN qui ont été associés à la chimiorésistance, y compris miR-518f *, miR-520a, miR-520d *, miR-519e *, miR-363 *, et miR-517 *, alors qu'aucun miARN * ont été associés à chemosensitivity.Table 3 miARN dont l'expression est associée à chimiosensibilité ou chimiorésistance.
miRNAa dont l'expression est associée à chimiorésistance
p
FDR

Hazard Ratio

hsa-miR-526a
0.0000
0.0103
1.482
hsa-miR-122a
0.0002
0.0379
1.545
hsa-miR-518f*
0.0004
0.0537
1.298
hsa-miR-591
0.0007
0.0598
1.492
hsa-miR-524-3p
0.0010
0.0682
1.268
hsa-miR-320
0.0013
0.0701
1.865
hsa-miR-520a*
0.0014
0.0701
1.252
hsa-miR-183
0.0031
0.119
1.39
hsa-miR-516-5p
0.0034
0.119
1.306
hsa-miR-629
0.0036
0.119
1.42
hsa-miR-595
0.0043
0.119
1.858
hsa-miR-640
0.0054
0.132
1.3
hsa-miR-520d*
0.0063
0.143
1.326
hsa-miR-519e*
0.0091
0.164
1.24
hsa-miR-363*
0.0096
0.166
1.407
hsa-miR-513
0.0137
0.193
1.347
hsa-miR-328
0.0163
0.211
1.736
hsa-miR-519a
0.0170
0.211
1.118
hsa-miR-185
0.0189
0.217
1.697
hsa-miR-658
0.0200
0.223
1.532
hsa-miR-517*
0.0218
0.226
1.305
hsa-miR-515-5p
0.0349
0.301
1.145
hsa-miR-519c-5p
0.0368
0.304
1.157
hsa-miR-661
0.0392
0.315
1.437
hsa-miR-182
0.0416
0.315
1.408
hsa-miR-206
0.0417
0.315
1.606
hsa-miR-193b
0.0419
0.315
1.433
hsa-miR-601
0.0436
0.317
1.599
miARN dont l'expression est associée à chimiosensibilité
p
FDR
Hazard Ratio
hsa-miR-195
0.0007
0.0598
0.593
hsa-miR-146b
0.0016
0.0733
0.565
hsa-miR-26b
0.0037
0.119
0.686
hsa-miR-374
0.0042
0.119
0.84
hsa-miR-199b
0.0051
0.132
0.729
hsa-miR-132
0.0068
0.143
0.62
hsa-miR-140
0.0069
0.143
0.759
hsa-miR-487b
0.0088
0.164
0.679
hsa-let-7g
0.0091
0.164
0.539
hsa-miR-340
0.0103
0.171
0.82
hsa-miR-155
0.0109
0.174
0.704
hsa-miR-95
0.0115
0.176
0.856
hsa-miR-186
0.0137
0.193
0.662
hsa-miR-130a
0.0140
0.193
0.72
hsa-miR-342
0.0151
0.202
0.685
hsa-miR-577
0.0173
0.211
0.804
hsa-miR-128b
0.0184
0.217
0.701
hsa-miR-146a
0.0209
0.226
0.776
hsa-miR-16
0.0214
0.226
0.698
hsa-miR-503
0.0241
0.243
0.721
hsa-miR-224
0.0259
0.25
0.853
hsa-miR-223
0.0259
0.25
0.794
hsa-miR-128a
0.0294
0.276
0.704
hsa-miR-181b
0.0300
0.276
0.668
hsa-let-7f
0.0312
0.281
0.725
hsa-miR-1
0.0339
0.298
0.839
hsa-miR-421
0.0367
0.304
0.738
hsa-miR-127
0.0404
0.315
0.783
hsa-miR-34c
0.0435
0.317
0.74
hsa-miR-497
0.0493
0.351
0.769
La figure 3 représente une courbe de Kaplan-Meier pour les groupes à risque stratifiées par ces 58 miARN. Un niveau de signification de permutation pour la statistique log-rank de cross-validées courbes de Kaplan-Meier leave-one-out était de 0,021, ce qui suggère que l'association entre les données d'expression de miARN à TTP est statistiquement significative. Figure 3 courbes de Kaplan-Meier pour le temps de progression (TTP) de 2 groupes à risque stratifiés selon l'expression de 58 miARN en corrélation avec TTP à une sélection de caractéristiques P < 0,05. L'association des données d'expression de miARN à TTP était statistiquement significative (permutation P
valeur pour les statistiques du log-rank de courbes de Kaplan-Meier validation croisée = 0,021) de. Expression de la signature de la chimiorésistance est en corrélation avec l'évolution de la chimiorésistance dans tumeurs qui étaient auparavant chimiosensibilité
La signature 58 miRNA identifié ci-dessus est prédictive pour identifier les patients qui sont ou ne sont pas susceptibles de répondre favorablement à la thérapie des FC. Nous avons postulé que les patients qui ont d'abord démontré une signature d'expression 58 miRNA favorable se tourneraient vers une signature d'expression défavorable au moment où ils ont développé une résistance à la thérapie des FC. Afin de tester cette possibilité comme une preuve de principe, 8 paires d'échantillons d'ensemble de test (pré et post-traitement endoscopique obtenu) ont été recueillies à partir de 8 patients ayant initialement démontré une réponse clinique au traitement des FC, mais qui a finalement montré une maladie progressive au cours de laquelle une deuxième biopsie endoscopique a été prise. Comme le montre le tableau 4 tous les échantillons 8 de prétraitement des répondeurs cliniques ont été correctement prédit par le prédicteur 58-miARN d'être dans le groupe à faible risque (précision, 100%). Notamment, 6 des 8 paires ont été correctement identifiés pour chimiosensibilité (c.-à
., Les échantillons post-traitement ont été affectés d'un indice supérieur de prédiction de la réponse à la chimiothérapie de prétraitement des échantillons et, par conséquent, prévus pour être plus résistants à la thérapie) (précision, 75% ). Lorsque la même prédiction a été réalisée en utilisant la sélection de caractéristiques P
valeur de 0,01, le résultat de prédiction est resté le même (tableau 4) .Table 4 Prévision pour chimiorésistance dans la série la preuve de principe essai
sélection d'entité de l'échantillon ID
P < 0,05


sélection d'entité P < 0,01


Predictive
Index
Percentile1

Prediction
For
Pretreatment
Sample2

Overall
Prediction3


Predictive
Index
Percentile

Prediction
for
Pretreatment
Sample

Overall
Prediction

1 pré
39%
bas
incorrect
35%
faible
incorrect
1 message
22%
24%
2 pré
48%
bas
corriger
49%
bas
correct
2 après
79% 77% de
3 pré
55%
faible
corriger
46%
bas
correct
3 après
73%
77%
4 pré
13%
bas
correcte
24%
faible
correcte
4 après
72%
73%
5 pré
31%
bas
correcte
33%
faible
correcte 5 après
48%
46%
6 pré
13%
bas
corriger
27%
bas
correct
6 après
16%
66%
7 pré
7%
bas
corriger
12%
faible
correct
7 après
66%
57%
8 pré
52%
bas
incorrect
50%
faible
incorrect
8 après
17% de 24%
indice prédictif 1Le a été calculé pour chaque échantillon par cette méthode supervisée en composante principale, où une valeur élevée de l'indice prédictif correspond à une progression rapide après la chimiothérapie (ie
., court TTP). Si l'indice de prédiction d'un échantillon dans l'ensemble de test correspond à l'indice prédictif médian de l'ensemble de la formation, l'échantillon a été attribué un indice de prédiction de 50%. Le plus risque 2Le a été prédit faible, voire percentile de l'indice de prédiction de l'échantillon de prétraitement était moins de 67%
prévision 3Le a été considérée comme correcte si les échantillons post-traitement ont été assignés un indice prédictif plus élevé que les échantillons de pré-traitement.
Discussion
Cette étude a utilisé une approche prospective pour identifier une signature miARN pour gastrique le cancer par rapport à l'épithélium de l'estomac normal et une signature miARN qui prédit la réponse au traitement standard des FC.
depuis techniques histopathologiques de routine ne parfois pas conduire à un diagnostic définitif de cancer de l'estomac, l'ajout d'une signature miARN de ces échantillons de patients peut améliorer la l'exactitude d'un diagnostic de cancer gastrique. Dans les études précédentes miRNA microarray de cancer gastrique, les tissus de contrôle ont été obtenus à partir des régions de l'estomac des cancers gastriques patients qui étaient déterminés à être histologiquement normale et non à partir de tissus de l'estomac des volontaires sains [6, 7]. Etant donné que les anomalies moléculaires sont souvent trouvés dans histologiquement normal apparaissant tissu adjacent au tissu tumoral, on a choisi d'obtenir des tissus témoins provenant d'échantillons de biopsie endoscopique à partir de volontaires normaux, sans cancer. La plupart des miARN exprimés différentiellement signalés pour être caractéristique du cancer gastrique dans les études de microréseaux précédentes [6, 7] ont également été identifiés au sein de la signature de cancer gastrique dans nos analyses actuelles. Cependant, en plus de ceux-ci préalablement miARN dans le cancer gastrique signalé, nous avons en outre identifié potentiels miARN suppresseurs de tumeur (au P
< 0,05 [6] et P
< 0,01 [7], y compris miR-1 [8 , 9] et laissez-7 [10] que nous avons trouvé pour être sous-exprimés dans le cancer gastrique (à P
< 0,001). (tableau 2) Fait intéressant, Oh et al ont trouvé l'expression de miR-486 à être réduite dans de nombreux . cancers gastriques, dans certains cas, associée à une perte génomique de la région [11] Nous avons trouvé que miR-486 pour être surexprimé dans notre cohorte de cancer gastrique à la fois par puces à ADN et une analyse PCR Taqman (fichier additionnel 1: la figure S1). Il est possible que cette différence dans les résultats est due à très différentes populations de patients étudiés.
dans cette étude, nous présentons pour la première fois à notre connaissance, un prédicteur miRNA pour réponse à la CF thérapie. le 58 miRNA signature qui fournit un index pour évaluer la réponse potentielle à la thérapie CF peut être utile pour stratifier les patients dans un groupe qui devraient recevoir un traitement standard et un groupe qui ne sera probablement pas bénéficier d'un tel traitement et doit être placé sur un essai thérapeutique différent. Plusieurs des 58 miARN que nous avons identifiés dans le tableau 2 qui sont associés à TTP sont compatibles avec les rapports publiés se rapportant à leur expression chimiorésistance et la biologie tumorale. Au premier rang des miARN régulés à la hausse associées à un TTP prolongée (définie par un rapport <risques; 1) étaient miARN qui ont été montré pour induire l'apoptose dans les cellules cancéreuses gastriques et d'autres, tels que miR-16, laissez-7g, miR-181, miR-342, miR-1 et miR-34 [8, 12-18]. miR-16 augmente induction de l'apoptose par nutlin et génistéine [12], et modulant multirésistance des cellules cancéreuses gastriques humaines [13]
. surexpression de laisser-7c ou-7g laissez a été montré pour diminuer l'expression de Bcl-xL dans des lignées de cellules Huh7 et HepG2 [14]. Laissez-7g et miR-181b sont positivement corrélés avec la réactivité clinique du cancer du côlon à S-1, un fluorouracil par voie orale [4]. miR-181a et miR-181b se sont avérés fonctionner comme suppresseurs de tumeur qui provoquent une inhibition de croissance, d'induire l'apoptose et inhiber l'invasion de cellules de gliome [15]. La reconstitution de la SAH-miR-342 dans la lignée colorectale des cellules cancéreuses HT-29 induit l'apoptose [16]. miR-1 sensibilise les cellules cancéreuses du poumon à l'apoptose induite par la doxorubicine [8]. Ectopique miR-34 expression induit l'apoptose, arrêt du cycle cellulaire ou la sénescence dans les cellules normales et tumorales [17]. Ainsi, la surexpression de ces miARN pro-apoptotiques dans les tumeurs primaires semble être une caractéristique très cohérente des patients qui profitent de mucoviscidose
intéressant, nous avons identifié six * miARN qui ont été associés à la chimiorésistance, y compris miR-518f *, Mir- 520a, miR-520d *, miR-519e *, miR-363 *, et miR-517 *, alors qu'aucun miARN ont été associés à la chimiosensibilité. Un seul miR, miR-302 *, a été identifié dans le cancer gastrique miR signature. miR * s sont considérés comme des brins de passagers qui sont censés normalement être dégradé de la pré-miR qui conduit à la maturité 22 nt brin qui pénètre dans le complexe RISC. Les fonctions de * miARN restent floues, mais il est possible qu'elles résultent de facultés affaiblies traitement des pré-miARN (Tchernitsa et al J of Pathology, 2010) ou peut jouer un rôle dans le ciblage traduction de l'ARNm (Gu et Lu, Plos One 2010 Analyse de).
Nous avons également observé que, bien que 21 miARN ont été trouvés en commun entre les GC et chimiorésistance signatures miRNA, 37 miARN étaient uniques à la signature de chimiosensibilité. de l'échantillon paires pré et post-traitement de 8 patients qui a d'abord répondu à un traitement CF mais plus tard est devenu résistant à la thérapie servi comme une preuve de principe pour démontrer que l'indice prédictif du 58 miRNA signature serait passer d'un indice favorable (à l'étape de pré-traitement) à un indice défavorable ( post-traitement lorsque la résistance développée). Malheureusement, il n'a pas été possible d'obtenir des paires supplémentaires assorties d'échantillons provenant de patients similaires pour fournir une analyse statistique plus robuste. Néanmoins, les résultats sont cohérents avec un modèle de sélection clonale de cellules tumorales résistantes préexistantes résidant à l'intérieur de la tumeur primaire.
Selon le modèle de sélection clonale classique pour le développement de la résistance acquise à la résistance à la chimiothérapie, de la résistance des tumeurs initialement réactives développe en raison de l'excroissance sélective de clones chimiorésistantes qui existent déjà au sein de la tumeur [18]. Étant donné qu'un TTP rapide indique spécifiquement une résistance intrinsèque à la chimiothérapie [19], les 58 miRNA dont les niveaux d'expression sont corrélés avec une courte TTP peut représenter miARN liée chimiorésistance-déjà présents dans la majorité des cellules tumorales dans la tumeur primaire. Cependant, les tumeurs primaires qui ne semblent pas exprimer cette signature miARN de résistance, d'abord répondre à la thérapie jusqu'à préexistante, les cellules résistantes se développent de manière sélective malgré un traitement CF. Au moment où un échantillon est obtenue lorsque la résistance est observée, la plus grande partie de la tumeur exprime l'défavorable, chimiorésistance signature miARN. Étant donné que la résistance dans la plupart de ces patients se développe sur une période relativement courte de temps (mois, pas des années), il semble peu probable que les résultats de la résistance de l'accumulation de multiples changements génétiques individuels.
Les résultats de cette étude fournira de nouvelles données importantes et les signatures miRNA, surtout prédire la réponse au traitement CF et concernant l'émergence de la résistance de la tumeur. Cependant, des études plus importantes doivent être menées à l'avenir pour valider davantage ces résultats et déterminer si elles peuvent être appliquées dans un contexte clinique.
Conclusions
Bien que limitée par la petite taille de l'ensemble de validation de l'échantillon, cette étude identifie miARN qui peuvent comprendre une signature cliniquement pertinente pour la résistance intrinsèque du cancer gastrique au CF et suggère que ces miARN ont été sélectionnés pour le développement au cours de la chimiorésistance acquise. Depuis ce prédicteur miRNA peut éventuellement fournir un guide utile pour la chimiothérapie personnalisée à l'avenir, elle justifie une enquête plus approfondie et de validation dans les grandes études prospectives.
Méthodes
Le recrutement des patients et le traitement
Des échantillons de tissus ont été prélevés à l'hôpital de Cancer Center Korean national par endoscopie 2001-2006 en vertu d'un protocole approuvé par le Conseil d'examen institutionnel (IRB) de l'Hôpital national Cancer Center à Goyang, en Corée. Tous les patients et les volontaires ont signé des formulaires de consentement éclairé CISR approuvés. L'admissibilité à l'enrôlement dans l'étude comprenait les paramètres suivants: 1) l'âge ≥ 18 ans; 2) histologiquement confirmé adénocarcinome gastrique; 3) documenté métastases à distance; 4) pas malignes antérieurs ou concomitants autres que le cancer gastrique; 5) aucune chimiothérapie antérieure, soit adjuvant ou palliatif; et 6) une fonction adéquate de tous les organes principaux. 34 volontaires en bonne santé ont subi une gastroscopie pour le dépistage systématique du cancer gastrique et avait muqueuse gastrique normale par histologie. Il n'y avait pas de gastrite parmi les 34 volontaires en bonne santé.
Cette étude de miARN a été réalisée comme une étude parallèle à une étude d'analyse de l'expression de l'ARNm [20] visant à identifier les facteurs prédictifs d'ARNm de la chimiorésistance. Quatre-vingt dix échantillons de biopsie pré-traitement recueillies de 2001 à 2006 ont été analysés dans cette étude miARN. Après une biopsie endoscopique initiale, tous les 90 patients ont été traités avec le cisplatine (60 mg /m 2, D1) en combinaison avec soit fluorouracile (1 g /m 2 pendant 5 jours; n = 88) ou capécitabine (Xeloda, Roche; 1,250 mg /m 2 fois par jour pendant 2 semaines; n = 2) toutes les 3 semaines. On a demandé aux intervenants cliniques de subir la deuxième endoscopie à la maladie progressive du temps (PD) a été observée selon l'Organisation mondiale de la santé (OMS) critères. Les deux critères suivants ont été utilisés pour définir les intervenants cliniques: 1) les patients dont les tumeurs démontré une baisse de plus de 50% de la somme des produits des deux plus grands diamètres perpendiculaires de lésions mesurables pendant au moins 4 semaines; ou 2) les patients qui n'ont pas une maladie mesurable lors de la présentation et ont eu une diminution spectaculaire de l'épanchement pleural /ascite pendant au moins 4 semaines [21]. Post-traitement miRNA données de biopuces peuvent être obtenues à partir d'échantillons prélevés lors de la chimiorésistance développé (PD) en 8 répondeurs cliniques. échantillons post-traitement ont été recueillies au moins 2 semaines après la dernière dose de fluorouracile, et avant la chimiothérapie de deuxième ligne a été lancé, afin d'éviter les effets de la drogue aigus sur influencer le profil d'expression. Pour ces 8 répondeurs cliniques, des échantillons avant et après le traitement (qui ont été recueillies au moment de la progression de la maladie) représentent les tumeurs chimiosensibles et chimiorésistantes, respectivement. échantillons de prétraitement des 82 patients restants ont été utilisés pour identifier un prédicteur miRNA pour la réponse à la chimiothérapie. Ce prédicteur a été appliqué à 8 paires d'échantillons prélevés dans les mêmes patients pré- et post-traitement. La prédiction a été considérée comme correcte si les échantillons post-traitement ont été assignés un indice prédictif plus élevé pour chimiorésistance que les échantillons de pré-traitement. des échantillons de biopsie ont été prélevés de manière similaire à partir de 34 volontaires sains. Des échantillons de tissus
cellules tumorales contenant au moins 50% ont été traités pour l'ARN comme décrit précédemment [22]. Les ARN extraits ont été analysés en utilisant le Bioanalyzer 6000 L'ARN total et dosage du spectrophotomètre Nanodrop suivant les protocoles du fabricant. 500 ng d'ARN total a été soumis à un usage miARN microréseau. Un mélange d'ARN total isolé à partir de trois lignées cellulaires de cancer gastrique (SNU-601, SNU-638, et AGS) a été utilisé comme l'ARN de référence pour l'hybridation compétitive. Expérience
Microarray
miRNA conception de puces à ADN
Le Laboratoire moléculaire technologie (LMT) _miRNA_v2 microarray a été conçu en utilisant la base de données Sanger miR9.0 (http:... //microARN sanger ac uk) et fabriqué comme une synthèse sur mesure 8 x 15 K microarrays (Agilent Technologies, San José, CA). Il y a un total de 4,361 entrées miARN dans la base de données miR9.0. Certains des miARN ont des séquences exactes de différentes espèces. Nous écroulés la base de données de 1667 uniques séquences miRNA matures à travers toutes les espèces, y compris l'homme, la souris, le rat, etc. Les séquences de miARN matures ont été incorporés dans les sondes 60-mères oligonucléotides longs avec une séquence de liaison sur l'extrémité 3 'de séparer les séquences de miARN l'écart de la surface de la lame de verre. La séquence de liaison est une séquence exclusive d'Agilent qui présente une homologie minimale avec une séquence quelconque dans la GenBank. Chaque échéance miARN est représenté par + et - (complément inverse) des séquences de brins. Ceci permet à la puce à ADN à utiliser avec les protocoles de marquage différents. Selon le protocole, l'une des sondes peut également servir de témoin négatif. Chaque sonde dispose de 4 répétitions dans chaque microarray, fournissant répétitions techniques pour mesurer la cohérence et les performances de la puce. En résumé, chaque miARN matures unique est représenté par 8 sondes (4 + brin et 4 - brin). Un total de 3,556 ID uniques seq LMT (miARN, les contrôles positifs et négatifs, +/- brin) étaient sur la puce, chacune avec 4 répétitions. http://​www.​ncbi.​nlm.​nih.​gov/​geo/​query/​acc.​cgi?​token=​ftixhsoiemwgyfi&​acc=​GSE30070

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