Interleukine-8 est le seul gène les plus régulés à la hausse dans l'ensemble du profilage du génome de H. pylori exposé des cellules épithéliales gastriques

Interleukine-8 est les cellules épithéliales gastriques les plus régulés à la hausse gène dans l'ensemble du profilage du génome de H. pylori
exposés simples
Résumé
Contexte
L'association entre Helicobacter pylori
infection et la maladie gastro-intestinale supérieure est bien établie. Cependant, seule une petite fraction de H. pylori
transporteurs développent la maladie, et il existe de grandes différences géographiques dans pénétrance de la maladie. L'explication de cette énigme réside dans l'interaction entre la bactérie et l'hôte. Outer Membrane phospholipase de H. pylori (OMPLA) a été suggéré de jouer un rôle dans la virulence de cette bactérie. Le but de cette étude était de profil voies cellulaires et des processus biologiques affectés dans les cellules épithéliales gastriques pendant 24 h de l'exposition de H. pylori le plus important, et d'étudier la réponse inflammatoire à OMPLA + et OMPLA -. l'interleukine-8: Résultats de les variantes de H. pylori était le gène le plus significativement régulés à la hausse et semble jouer un rôle primordial dans la réponse des cellules épithéliales à H. pylori
infection et dans le les processus pathologiques conduisant à une maladie gastrique. voies cellulaires MAPK et NF-kappaB ont été puissamment activées, mais ne semblent pas expliquer l'impressionnante IL-8
réponse. Il a été marquée régulation à la hausse des TP53BP2
, dont la protéine correspondante ASPP2 peut interagir avec H. pylori
CagA et provoquer la suppression marquée p53 de l'apoptose. D'autres régulateurs de l'apoptose ont également montré la régulation aberrante. Nous avons également identifié la régulation de plusieurs oncogènes et la régulation des gènes suppresseurs de tumeur dès durant les 24 premières heures de l'infection. H. pylori
OMPLA variation de phase ne semble pas influencer la réponse des gènes des cellules épithéliales inflammatoires dans cette expérience.
Conclusion
Dans l'analyse du génome entier de la réponse épithéliale à l'exposition de H. pylori, IL- 8
démontré le plus marqué la régulation, et a été impliqué dans de nombreux processus de réponse cellulaire les plus importants à l'infection. Il y avait une dysrégulation de l'apoptose, des gènes et des oncogènes suppresseurs de tumeurs plus tôt que dans les 24 premières heures de l'infection de H. pylori, qui peut représenter des signes précoces de la tumorigenèse gastrique. OMPLA +/- n'a pas affecté la réponse inflammatoire aiguë à H. pylori
.
Fond
H. pylori
est bien établi que la cause primaire de la maladie de l'ulcère gastro-duodénal et l'initiateur de la cascade à plusieurs étapes menant à l'adénocarcinome gastrique. Bien que le cancer gastrique est le quatrième cancer le plus répandu dans le monde et le deuxième cancer du poumon dans l'apparition de décès liés au cancer [1], il existe des différences remarquables dans la distribution de cette maladie entre les pays occidentaux et orientaux. La diminution dans le cancer gastrique est parallèle à la prévalence de H. pylori dans le monde occidental, mais ce phénomène n'explique pas complètement les grandes différences géographiques dans la répartition du cancer gastrique. La raison pour laquelle seulement 1-2% de H. pylori de personnes infectées par le développement de tumeurs malignes gastriques reste inexpliquée, et comprend à la fois des différences dans les souches bactériennes, surtout cagA
état, génétique de l'hôte et les aspects environnementaux.
H . pylori de la carcinogenèse implique une action indirecte des bactéries par une inflammation chronique de la muqueuse gastrique corpus, ainsi que l'action directe de H. pylori
sur les cellules épithéliales. inflammation persistante est associée à une augmentation de la production de plusieurs cytokines pro-inflammatoires, comme l'IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-7 et l'IL-8 [2], ce qui augmente l'apoptose, la prolifération excessive et de la production d'oxygène réactif et de l'azote espèces causant des dommages de l'ADN et des mutations. En outre, l'action directe de H. pylori
sur les cellules épithéliales peut également favoriser la carcinogenèse. cagA
+
H. pylori
souches injectent des produits bactériens dans les cellules épithéliales à travers un processus d'injection de type IV sophistiqué, qui active la signalisation intracellulaires voies, en particulier la famille de la protéine kinase activée par un mitogene (MAPK) voie [3] et le facteur nucléaire kappa B (NF-kB), et peuvent faciliter la transition épithéliale-mésenchymateuse [4], qui peut contribuer à la transformation néoplasique. Par ailleurs, le développement des tumeurs est associée à la prolifération et l'apoptose inhibition [5, 6], tandis que l'apoptose excessive est supposée favoriser la formation d'ulcères gastriques. L'effet de H. pylori
sur l'apoptose épithéliale gastrique a montré des preuves contradictoires. Plusieurs études in vitro ont montré que H. pylori
stimuler l'apoptose [7, 8], alors que certaines études in vivo montrent une inhibition de l'apoptose [9, 10]. l'injection CagA dans les cellules épithéliales gastriques régule à la hausse de la protéine anti-apoptotique MCL [11] et interfère avec la protéine de stimulation de l'apoptose 2 de p53 (ASPP2) [12]. les causes d'inhibition ASPP2 dégradation accrue de p53, d'une manière similaire aux virus tumoraux à ADN, ce qui diminue l'activité apoptotique, ce qui peut expliquer le risque accru de GC associé à cagA
+
H. pylori infection
.
Tannæs et al. ont précédemment rapporté que le gène
l'pylori pldA H., codant pour la membrane externe bactérienne phospholipase A (OMPLA), affiche une variation de phase résultant en 'ON' (OMPLA +) et 'OFF' (OMPLA - ) la commutation de l'activité OMPLA en raison d'un glissement spontané chez un homopolymère (C) des voies du gène [13]. Le OMPLA + variante a été associée à une survie bactérienne accrue dans un environnement acide, l'adhésion, l'hémolyse et la libération de l'uréase et VacA par rapport à la OMPLA - variante [14]. OMPLA a également été impliquée dans la virulence d'autres agents pathogènes gastro-intestinaux [15], et un lien entre l'activité et OMPLA inflammation gastrique a été proposé dans une précédente étude [16].
Bien que la réponse des cellules de l'épithélium gastrique à H. pylori
l'exposition a été soumis à de nombreuses expériences depuis la découverte de la bactérie en 1984 [17], de la technologie des puces à ADN seules quelques études ont utilisé [18-29]. La quasi-totalité de ces expériences ont été réalisées sur les souches de H. pylori de l'Asie, et pas d'auteurs ont comparé la réponse des cellules épithéliales à OMPLA + contre OMPLA - bactéries. Le but de l'étude était d'étudier la réponse de l'expression génique temporelle des cellules épithéliales gastriques exposés à une souche
H. pylori obtenu cliniquement, et d'examiner la contribution de OMPLA sur la réponse inflammatoire. Résultats L'accent a été mis sur les réponses biologiques les plus importantes en utilisant Gene Ontology (GO) termes et les voies de signalisation cellulaires associés.
Pour étudier la morphologie cellulaire suivant H. pylori
infection à 3 et 6 h, non cellules -exposed et H. pylori
exposés ont été colorés et examinés par microscopie immunofluorescence (Figure 1). A la fois 3 et 6 h il n'y avait pas de différence significative dans la capacité entre le OMPLA + et OMPLA - H. pylori
à adhérer aux cellules AGS, et il n'y avait pas de différences significatives dans les changements morphologiques dans les cellules AGS en réponse à l'exposition aux deux variantes. Nous ne sommes pas en mesure d'identifier des différences statistiquement significatives dans l'expression des gènes entre les cellules exposées à OMPLA + et OMPLA - variantes à tout point de temps sur 24 h de co-culture (p
< 0,05). Nous avons donc conclu que l'analyse des résultats pourrait être réalisée sans tenir compte des différences dans la variation de phase. images Figure 1 immunofluorescence de cellules AGS exposés à H. pylori. les cellules AGS étaient non-exposés, ou exposés à OMPLA + et OMPLA- H. pylori
à une MOI de 300: 1 et co-cultivées pendant 3 et 6 h. Les bactéries ont été colorées avec un anticorps de lapin anti-Helicobacter. Les images ont été capturées par microscopie à fluorescence.
Le profil d'ADNc de H. pylori
exposé les cellules AGS ont été comparées aux cellules témoins non infectées à six points de temps séparés dans les 24 h. 7498 sondes de puces correspondant à 6237 gènes humains ont montré une expression différentielle dans les cellules infectées par rapport aux cellules témoins à pas moins de 1 point de temps (p
< 0. 05) (fichier supplémentaire 1: Tableau S1). Le nombre de gènes fortement exprimés de manière différentielle à chaque point de temps par rapport à la non-infecté les cellules AGS et comment elles se chevauchent à différents points de temps sont illustrés dans le Tableau 1 et la Figure 1 2.Table Nombre de gènes régulés de manière différentielle
Time

0.5

1

3

6

12

24

Up-régulé
0 2
91
123
1679
2997
Bas-réglementée
0 1
26
65
2034
2492
total
0 3
117
188
3713
5489
Nombre de gènes significativement différentiellement régulés (p <
0,05) à chacun des instants d'échantillonnage après une période de co-incubation de H. pylori dans les cellules AGS

figure 2 diagrammes de Venn des gènes régulés de manière significative. diagrammes de Venn des gènes exprimés de manière différentielle de pylori
infectés par les cellules AGS H. par rapport aux cellules témoins (p
< 0,05). Les cercles indiquent sécantes qui se chevauchent des gènes au niveau des points de temps indiqués. AGS = contrôle non infecté les cellules AGS.
Il n'y avait pas beaucoup exprimé gènes à 0,5 h, une augmentation modérée du nombre de gènes de 1 à 6 h, et une augmentation de 20 fois 6-24 h. D'un point de prélèvement à l'autre, la plupart des gènes se chevauchent, mais un nombre considérable de gènes uniques ont également été régulés différemment à chaque point de temps (Figure 2). Environ 47% du nombre total de gènes exprimés de façon significative ont été régulée à la hausse, et 53% ont montré une régulation par rapport au témoin. Parmi les plus de 6000 gènes exprimés de façon significative, l'IL-8
était le seul gène le plus exprimé de manière différentielle (Figure 3). Figure 3 Hiarchical regroupement des gènes les plus significativement différentiellement régulés. regroupement Hiarchical de gènes significativement différentiellement régulés (log2FC > 1,5, p
< 0,05). La flèche pointe à l'IL-8
.
La liste de tous les gènes importants a été analysé pour associés Encyclopédie de Kyoto des gènes et génomes (KEGG) voies de signalisation par Pathway Express, à chaque point de temps. Significativement touchés voies et correspondant Facteur d'impact (IF) sont présentés dans le tableau 2. Les premières voies de signalisation de réponse qui ont été affectées de manière significative inclus la signalisation dans H. pylori
voie d'infection, l'interaction du récepteur de cytokine-cytokine, récepteur Toll-like cellules épithéliales ( TLR) voies, ainsi que de nombreuses voies liés au cancer et les voies de signalisation immunologiques. A 1 h, IL-8
a été impliqué dans la plupart des voies de signalisation affectées. A 3 et 6 h, la plupart des voies les mieux classés ont eu plusieurs gènes en commun, tels que NFKB1, NFKB2, NFKBIA, NFKBIE, BIRC2, BIRC3, JUND, CCND1
et AKT3
. Le système de signalisation phosphatidylinositol est attribué un haut IF à 6 h en raison de l'importance d'un seul gène, PIK3C2B
, qui est régulée à la baisse par un journal 2FC de -0.58 et joue un rôle clé dans cette voie. Au bout de 12 h, les voies cellulaires les plus touchées sont le leucocyte de migration trans-endothéliale, les molécules d'adhésion cellulaire, la voie de la réplication de l'ADN, la voie de signalisation de p53, ainsi que plusieurs voies liées au cancer. résultats relativement similaires sont observés à 24 h, cependant certaines des voies liées au cancer sont représentés plus bas dans la liste (données non présentées uniquement top 10 montré dans le tableau 2) .Table cours 2 Temps: KEGG voies cellulaires et gène ontologie
Temps
KEGG nom de voie cellulaire
IF
GO gènes régulés à la hausse

GO gènes régulés à la baisse
0,5
Aucun gènes importants
Aucun gènes importants
Aucun gènes importants 1
épithéliale signalisation cellulaire dans l'infection par Helicobacter pylori
16,6
Aucune GO significative
Aucun gènes importants
cytokine-cytokine interaction récepteur
8.1
cancer de la vessie
7.5
récepteur voie de signalisation de type Toll
6.6
base excision réparation
6.0
immunodéficience primaire
5,9
Pathways dans le cancer
5.4 3
épithéliale signalisation cellulaire dans l'infection à Helicobacter pylori
17,8
anti-apoptose
Pas de GO significative
Pathways dans le cancer
16,9
régulation de génome rétroviral
petit cancer du poumon de cellule
14.2
réplication
MAPK voie de signalisation
14,2
T -helper 1 différenciation des cellules
12,5
régulation négative de l'apoptose de la voie de signalisation médiée LPS
adipocytokine voie de signalisation
12.3 régulation
négatif de la migration des cellules musculaires lisses
cancer de la prostate
11.4
régulation de la MAP kinase chimiotaxie d'activité
Toll-like récepteur voie de signalisation
11,1
protéine acide aminé déphosphorylation
T cell receptor voie de signalisation
activation 10.5
de neutrophiles
récepteur de cellules B voie de signalisation
9.9
entraînement de l'horloge circadienne
6
phosphatidylinositol système de signalisation
32,2
anti-apoptose
Aucune GO significative
signalisation cellulaire épithéliale dans l'infection par Helicobacter pylori
15.5
régulation de génome rétroviral
petit cancer du poumon de cellule
14.2
réplication
Pathways dans le cancer
12,4
T-helper 1 différenciation cellulaire
l'activation de 11,6
de polynucléaires neutrophiles apoptose
adipocytokine voie de signalisation
10.1 régulation
négatif du récepteur de la voie de signalisation de type Toll I-kappaB
8.9
kinase /NF -kb cascade
MAPK voie de signalisation
8,7
induction de chimiotaxie positifs
cancer de la vessie
8,5
récepteur cellulaire myéloïde différenciation des cellules B
dendritique voie de signalisation
8.3
12
leucocytaire transendothéliale migration
309,7
arrêt du cycle cellulaire
réponse à la protéine dépliée
molécules d'adhésion cellulaire (CAMs)
75,4
amino transport des acides
S-adénosylméthionine processus biosynthétique
réplication de l'ADN
25,0 régulation
positif de la transcription
cycle cellulaire
20,0
réponse au stress
Pathways dans le cancer
19,4
régulation de MAP kinase activité
signalisation p53 voie
17,0
traitement Antigène et la présentation
15,7
MAPK voie de signalisation
13,2
Petit cancer du poumon
12,2
rythme circadien
11,9
24
migration leucocytaire
80,3
kératinocytes différenciation
processus de biosynthèse du cholestérol
du cycle cellulaire
24,4
amino transport des acides
réponse à la protéine dépliée
voie de signalisation p53
20,9
kératinisation
processus biosynthétique isoprénoïde
circadien rythme
18,6
angiogenèse
processus de biosynthèse de la créatine
de réplication de l'ADN
18,0
apoptose
réponse au stress oxydatif
jonctions adhérentes
16,1
réponse au stress
Pathways dans le cancer
arrêt du cycle 14,9
cellulaire Nucleotide excision de réparation de
14,3
pyrimidine nucléotide métabolique
Ubiquitin protéolyse médiée
14,2
processus
phosphatidylinositol système de signalisation
13,7
induction de chimiotaxie positifs
significativement impacté les voies cellulaires KEGG et enrichi termes Gene Ontology ( processus biologiques seulement) (p <
0,05) à différents points de temps après la co-culture de H. pylori hôtels et les cellules AGS. Top 10 voies /ontologies inclus où le nombre est supérieur à 10. SI = Facteur d'impact
Parce que l'analyse GO associe simplement des gènes exprimés de manière différentielle avec les ontologies, il n'y a aucune tentative de classement de la véritable signification biologique des gènes ou des ontologies individuels. Par conséquent, nous avons inclus seulement des gènes avec un journal 2FC > 1,5 dans l'analyse de GO, à l'exclusion des gènes exprimés de façon significative moins qui étaient susceptibles d'entraîner erronée classement de GO. Seuls les termes classés dans les processus biologiques sont inclus (tableau 2), car ceux-ci ont fait l'objet de l'étude. Aucun des termes GO ont été enrichis à 0,5 ou 1 points h de temps. Parmi les gènes régulés à la hausse à 3-6 h, les GO® les plus fréquemment associés étaient anti-apoptose, et plusieurs processus inflammatoires et anti-microbiennes telles que la régulation de la réplication du génome rétroviral, T-helper 1 cellule différenciation, la chimiotaxie, l'activation des neutrophiles et activation du système immunitaire. A 12-24 h, les gènes régulés à la hausse enrichi ontologies comme l'arrêt du cycle cellulaire, l'apoptose, la réponse au stress, le transport des acides aminés, l'angiogenèse et la kératinisation, alors que certains processus biosynthétiques sont parmi les termes régulés à la baisse.
Classification hiérarchique du 245 gènes avec un journal 2FC > 1,5 5 formé des groupes distincts (A-E), à une distance seuil de 0,54 (figure 3). Chaque groupe a été examiné pour GO et les associations de la voie de signal cellulaire (tableau 3). GO analyse a fourni les termes importants pour tous les groupes (p
< 0,05). Le tableau 3 montre les 10 significativement touchés voies de signalisation cellulaire au sein de chaque groupe, classés selon IF. Cluster A contenait 9 gènes, et a démontré des niveaux stables à 6-12 h avant de montrer un déclin. Trois gènes ont été impliqués dans les processus anti-apoptotiques et deux gènes ont été impliqués dans la signalisation MAPK. Seuls 3 gènes ont été assignés à regrouper B, où il y avait une augmentation rapide et puissante dans l'expression au cours de la 3 premières heures, suivie d'une baisse. Sur les 3 gènes dans le groupe, l'IL-8
et CXCL2
semblaient dicter la plupart des processus inflammatoires aigus comme la chimiotaxie, la réponse immunitaire et neutrophiles activation.Table 3 Cluster profilage: KEGG voies cellulaires et Gene Ontology
profil temporel plus de 24 h
Cellular Pathway
impact Factor

GO numéro

GO nom
MAPK voie de signalisation
7.3
GO: 0006916
anti-apoptose
apoptose
7.1
GO: 0045063
T- helper 1 différenciation cellulaire
GO: 0031665
régulation négative de la voie de signalisation LPS-médiée
GO: 0014912
régulation négative de la migration des cellules musculaires lisses
GO: 0043405
régulation de MAP kinase activité
signalisation cellulaire épithéliale chez H. pylori
infection
12,4
GO: 0006935
chimiotaxie
d'interaction du récepteur de cytokine-cytokine
10.2
GO: 0006954
réponse inflammatoire
cancer de la vessie
6,8
GO: 0006955
réponse immunitaire
récepteur voie de signalisation de type Toll
5.9
GO: 0045091
réglementation des rétroviral la réplication du génome
Pathways dans le cancer
4.8
GO: 0042119
l'activation des neutrophiles
GO: 0050930
induction de chimiotaxie positifs
GO: 0030593
chimiotaxie des neutrophiles
signalisation 0006915
apoptose
MAPK: GO: 0030155
régulation de l'adhésion cellulaire
GO: 0019722
calcium médiée signalisation
rythme circadien
20,0
GO voie
10.7
GO: 0006950
réponse au stress
mTOR voie de signalisation
7.5
GO: 0007050
arrêt du cycle cellulaire
jonction Tight
7.0
GO: 0030216 différenciation
kératinocytes
voie de signalisation JAK-STAT
6.7
GO: 0006865
amino transport des acides
interaction récepteur de cytokine-cytokine
6.5
GO: 0031424
kératinisation
règlement de l'autophagie
6.4
GO: 0008652
amino processus de biosynthèse des acides
voie de signalisation p53
5.6
GO: 0006220
pyrimidine nucléotide métabolique processus
règlement de 5,2
TGF-bêta de la voie de signalisation de cytosquelette d'actine
cellule 5.2
tueur naturel médiée cytotoxicité
4,7
mélanogénèse
8.3
GO: 0030146
diurèse
GnRH voie de signalisation
7.6
GO: 0030147
natriurèse
ErbB voie de signalisation
6.7
GO: 0048661
régulation positive de la lisse muscle prolifération cellulaire
Pathways dans le cancer
6.4
GO: 0002268
la différenciation des cellules dendritiques folliculaires
signalisation des cellules épithéliales chez H. pylori
infection
5,7
GO: 0031583
activation de l'activité de la phospholipase D par couplés aux protéines G protéine récepteur de signalisation
GO: 0014826
veine contraction des muscles lisses
GO: 0002467
formation centre germinatif
GO: 0030578
PML organisation du corps
GO: 0030195
régulation négative de la coagulation du sang
GO: 0043507
régulation positive de l'activité kinase juin
traitement et présentation Antigène
13,7
GO : 0006695 processus de biosynthèse du cholestérol

MAPK voie de signalisation
9.7
GO: 0006986
réponse à la protéine dépliée
cancer de la vessie
6.2
GO: 0006916
anti- -apoptosis
Pathways dans le cancer
6.1
GO: 0006139
nucléobases, -side, -tide et le processus métabolique de l'acide nucléique
règlement du cytosquelette d'actine
6.1
GO: 0008299
processus biosynthétique isoprénoïde
GO: 0006601 processus de biosynthèse
créatine
GO: 0009416
réponse à la lumière stimulus
GO: 0043154
régulation négative de l'activité caspase
GO: 0007566
embryon implantation
profils temporels de 5 principaux groupes identifiés par le regroupement hiarchical des 245 plus exprimés de manière différentielle des gènes (p
< 0,05) et associés ontologies de gènes (processus biologiques seulement) et KEGG voies de signalisation cellulaire dans chaque grappe chez H. pylori
exposé des cellules AGS. Les points de données sont à 0,5, 1, 3, 6, 12 et 24 heures de co-incubation. Les barres d'erreur représentent ± écart-type d'expression au sein du cluster. Top 10 des ontologies cotées où le nombre dépasse 10
Cluster C composent le plus grand groupe, et contenaient 150 gènes qui ne présentaient aucun changement qu'après 6-12 h. Les gènes de la réponse GO termes apoptose, arrêt et le stress du cycle cellulaire ont été nettement enrichis, et beaucoup de ces gènes tels que juin, Gadd45a, DDIT3, MKNK2, DUSP1, RPS6KA5, FLNC
et RASGRP
ont également été impliqués dans MAPK signalisation. En outre, CSF2RA
, IL24
, IL20R
et PIM1 oncogène
ont été impliqués dans JAK-STAT signalisation et la signalisation cytokine-cytokine Cluster D de. A montré une augmentation modérée culminant à 12 h, suivie d'une baisse vers 24 h. 13 gènes ont été assignés à ce groupe, y compris EDN1
, l'une des isoformes de la vasoconstricteur endothéline puissante, qui a enrichi la quasi-totalité des GO® énumérés.
NFKB2, l'un des deux sous-unités NF-kB, HBEGF
et ETS1
ont également été inclus dans ce groupe.
Cluster E a démontré 71 gènes qui ont montré la régulation après 6-12 h et inclus FGFR3
et plusieurs gènes de protéines de choc thermique qui ont été impliqués dans la voie de signalisation MAPK et l'inhibition de l'apoptose. En outre, plusieurs GO processus biosynthétiques ont été enrichies.
Pour confirmer les résultats de puces à ADN, nous avons choisi de vérifier l'IL-8
, comme cela a été le seul gène le plus différentiellement réglementé dans l'étude. ARNm et la protéine ont été échantillonnés aux mêmes points de temps et ont étudié par RT-PCR et le test ELISA (figures 4 et 5). Il y avait une augmentation de l'IL-8
ARNm visible après 1 h et un pic à environ 3 h. La réponse
IL-8 ARNm puis a chuté à 6 et 12 h. À 24 h il y avait une deuxième augmentation, mais avec une variance notable entre les deux expériences. A 0,5 et 1 h de co-culture, l'IL-8 niveaux de protéines étaient faibles et ne montrent aucun changement. Entre 3 et 6 h de co-culture, il y avait une importante augmentation de l'IL-8, qui n'a montré aucune augmentation supplémentaire après 6 heures. La figure 4 décours temporel de l'IL-8 L'expression d'ARNm dans les cellules AGS de co-cultivées avec H. pylori. L'analyse quantitative PCR de l'expression de l'IL-8 à H. pylori
cellules AGS infectées par six points différents d'échantillonnage de plus de 24 h. Les points de données sont les valeurs de trois culture cellulaire réplique à partir de deux expériences indépendantes, A et B. Les lignes représentent la moyenne calculée dans chacune des expériences.
Figure 5 Time-cours de l'IL-8 expression de la protéine dans les cellules AGS co-culture par H. pylori. Analyse ELISA de l'IL-8 expression de la protéine dans les cellules infectées par le pylori
AGS H. six points différents d'échantillonnage pendant 24 h. Les points de données sont les valeurs de trois culture cellulaire réplique à partir de deux expériences indépendantes, A et B. Les lignes représentent la moyenne calculée dans chacune des expériences.
Enfin, nous avons voulu vérifier que le MOI choisi était stable à l'égard de gène AGS expression. Nous avons utilisé l'IL-8
réponse comme un indicateur de l'expression génique, les cellules AGS et ont été co-incubées avec H.pylori
pendant 3 heures à différentes MOI dans deux expériences distinctes (figure 6). Il y avait un modeste IL-8
réponse à une MOI 15: 1 et 150: 1, avec une augmentation remarquable à une MOI de 300: 1. Il y avait alors des changements négligeables dans l'expression de l'IL-8 au-dessus de 300: 1, ce qui suggère que l'inoculum initial de 300: 1 était suffisante pour provoquer une réponse biologique, sans surcharger le système de culture cellulaire. La figure 6 dose-réponse de l'IL-8 L'expression d'ARNm dans les cellules AGS de co-cultivées avec H. pylori. L'analyse quantitative par PCR de l'expression de l'IL-8 chez H. pylori
cellules AGS infectées par le co-incubées pendant 3 h. Discussion de
points de données sont les valeurs de trois culture cellulaire réplique à partir de deux expériences indépendantes, A et B. Les lignes représentent la moyenne calculée dans chacune des expériences. Dans cette étude, nous démontrons une importante réponse immédiate de cellules AGS à l'exposition à une souche de H. pylori obtenu à partir d'un contexte clinique. Plus de 6000 gènes humains ont montré une régulation différentielle statistiquement significative au cours des 24 premières heures de co-incubation.
H. pylori de l'infection a été associée à la stimulation et de l'inhibition de l'apoptose. Des expériences de culture de cellules montrent une régulation positive des gènes associés à l'apoptose [7, 8], alors que d'autres études in vivo démontrent l'inhibition la prolifération et l'apoptose [9, 10]. Il a été démontré la toxine VacA pour provoquer l'apoptose dans plusieurs études [30-33], alors que le rôle de CagA sont contradictoires. CagA a été associée à la stimulation et de l'inhibition de l'apoptose [11, 12, 34]. cellules biliaires exposés à cagA
+
H. pylori
à une très faible inoculum (MOI 1: 1) a démontré une croissance accrue des cellules, tandis qu'à MOI de 200: 1, l'apoptose a été stimulée [35 ]. CagA peut même contrarier directement l'effet pro-apoptotique de VacA, comme on le voit dans les cellules AGS [31]. Apoptose se produit après un certain nombre d'événements cellulaires, conduisant à l'activation de la caspase-3, qui est pensé pour constituer l'effecteur de base de l'apoptose. Dans la présente étude, les deux gènes inhibiteurs et stimulateurs ont montré une expression différentielle importante, ce qui démontre la complexité de l'influence de H. pylori
sur l'apoptose: les inhibiteurs de caspases HSPA5
et DHCR24
a montré la fin de la régulation similaire à la chaleur HSPA1B gènes de choc, HSPB1
, qui sont également associées à la stimulation de l'apoptose (groupe E, tableau 3). D'autre part, TNFAIP3, BIRC2, BIRC3
et SERPINB2
, également associé à l'inhibition de l'apoptose, a démontré précoce et la régulation persistante regroupés dans le cluster A. Cependant, les régulateurs positifs de l'apoptose PTPRH, TNFRSF12A, IL24, Gadd45a, TRIB3, DDIT4, PHLDA4, PP1R15A
et SQSTM1
étaient tous régulés à la hausse dans le modèle similaire après 6-12 h (groupe C). MCL1
, un gène anti-apoptotique exprimé en réponse à l'injection CagA [11], ont démontré l'augmentation régulation à la hausse au cours de l'étude. Il n'y avait aucun changement significatif dans BCL-2
et très peu d'augmentation de BAX de l'expression dans notre étude, deux gènes importants qui déterminent la sensibilité des cellules à d'autres stimuli apoptotiques [36-39]. Il convient de noter, il a été marquée régulation à la hausse du TP53BP2
, un important gène suppresseur de tumeur (TSG) dans le cancer humain, stimulant principalement la promotion de la p53 de gènes de l'apoptose. D'autre part, TP53BP2
est codant pour la protéine ASPP2, qui a également été montré pour stimuler l'apoptose indépendamment de p53 [40-42]. Cependant, Buti et al. a récemment démontré que CagA injecté dans les cellules epitheliales gastriques ciblées protéine ASPP2 pour inhiber l'apoptose à médiation par p53 [12]. L'expression TP53BP2
a augmenté vu dans notre étude, pourrait donc potentialiser cet effet en augmentant l'interaction CagA-ASPP2 pour provoquer une inhibition accrue de l'apoptose médiée par p53. En fait, l'étude a montré que les gènes cibles de p53 impliqués dans l'apoptose [43] telles que FAS
, DR4
, TNFRSF10B
(aussi appelé DR5 /KILLER
), DCR1
, DCR2
, P53AIP1
, CASP6
, APAF1
et BNIP3L
n'a pas montré d'augmentation significative, et BNIP3L
, CASP6
et APAF1
, BID
et BAX
ne montrait que peu d'augmentation. gènes cibles de p53 de régulation des processus cellulaires non-apoptotiques dont MDM2
, Gadd45a
, CDKN1A
(également connu sous le nom P21 WAF1 /CIP1
), EGFR
, CCND1
, CCNG2
et TGFA
démontré modéré à marqué une régulation. Cette expression différentielle des gènes identifiés parmi les gènes cibles de p53 dans cette étude, peut indiquer l'inhibition sélective de l'apoptose p53 médiée due à une interaction accrue CagA-ASPP2, compatible avec les constatations de Buti.
Néanmoins, cette étude n'a pas été conçue pour évaluer si la la somme totale des signaux inhibiteurs et stimulateurs facilite l'apoptose ou de la prolifération des cellules épithéliales. Les résultats actuels montrent la complexité de la régulation de l'apoptose dans les cellules epitheliales en réponse à l'exposition de H. pylori, et l'analyse de cluster suggère qu'il existe une certaine coordination biologique de l'expression du gène régulant l'apoptose. Cela peut expliquer en partie le mécanisme cancérogène complexe de H. pylori
dans adénocarcinome gastrique. Il existe une forte association entre H. pylori
infecton, en particulier le cagA
+ génotype [44], et adénocarcinome gastrique [45, 46], ainsi que d'autres cancers ont été suggérées pour abriter un rôle à jouer H. pylori
[47, 48]. 0,05.

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