Catécholamines up régule MMP-7 expression en activant AP-1 et STAT3 dans cancer

gastrique catécholamines up régule MMP-7 expression en activant AP-1 et STAT3 dans le cancer gastrique
Résumé de l'arrière-plan du stress, l'anxiété et la dépression peut causer physiologiques et neuroendocrines changements complexes, entraînant l'augmentation du niveau de stress lié aux hormones catécholamines, ce qui peut constituer un principal mécanisme par lequel le gène de l'impact des facteurs physiologiques expression dans les tumeurs. Dans la présente étude, nous avons étudié les effets de la stimulation des catécholamines sur MMP-7 expression dans les cellules de cancer gastrique et élucidé les mécanismes moléculaires de la régulation positive de la MMP-7 niveau par catécholamines par une voie de signalisation adrénergique
. Résultats
Augmentation de l'expression de MMP-7 a été identifié à la fois les niveaux d'ARNm et de protéines dans les cellules de cancer gastrique en réponse à la stimulation par l'isoprotérénol. β2-AR antigonist effectivement abrogée MMP-7 expression induite par l'isoprotérénol. L'activation de STAT3 et AP-1 a été en évidence induite par la stimulation de l'isoprotérénol et AP-1 affiche une plus grande efficacité que STAT3 dans MMP-7 expression induite par l'isoprotérénol. Mutagenèse de trois sites de liaison STAT3 dans MMP-7 promoteur n'a pas réussi à réprimer la transactivation de MMP-7 promoteur et faire taire l'expression STAT3 n'a pas été efficace dans la prévention de la MMP-7 expression induite par l'isoprotérénol. MMP-7 activités de promoteur Cependant, isoprotérénol induites ont été complètement disparu lorsque le site AP-1 a été muté. STAT3 et c-Jun pourraient interagir physiquement et se lier au site AP-1, ce qui implique que l'interaction des deux facteurs de transcription sur le site AP-1 est responsable de l'expression de MMP-7 isoprotérénol stimulée dans les cellules cancéreuses gastriques. L'expression de MMP-7 dans les tissus du cancer de l'estomac a été constaté que sur le site où β2-AR est surexprimé et les niveaux de MMP-7 et β2-AR étaient les plus élevés dans le locus métastatique du cancer de l'estomac.
Conclusions
Up-régulation de la MMP-7 expression par voie de signalisation β2-AR-médiation est impliqué dans l'invasion et les métastases du cancer gastrique.
Contexte
le cancer gastrique est la deuxième cause la plus fréquente de cancer lié la mort, avec environ 700 000 décès chaque année [1, 2]. Un des facteurs importants dans la pathogenèse du cancer de l'estomac est une infection chronique par Helicobacter pylori
[3]. Cependant, la majorité des personnes infectées ne développent pas de tumeur maligne et le résultat de l'infection dépend de l'hôte, et d'autres facteurs environnementaux [4]. Il existe des preuves de plus en plus soutenir le rôle du stress psychologique dans l'apparition du cancer gastrique et le développement [5]. Plusieurs études épidémiologiques ont démontré que des facteurs psychologiques ou comportementales au stress peuvent accélérer la progression du cancer gastrique [6, 7]. Cependant, le mécanisme précis par lequel le stress psychologique agit dans la progression du cancer de l'estomac est peu claire. De Stress initie une réponse de l'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (HPA), résultant du niveau de catécholamines augmenté [8, 9]. Plusieurs études ont montré que la stimulation de catécholamines interfère avec les bio-comportements des cellules tumorales directement, principalement par les récepteurs adrénergiques ß2 (β2-AR), la voie de signalisation médiée [10-14]. Des observations récentes montrant un mécanisme potentiel pour la progression de l'ovaire, les cancers du nasopharynx et du pancréas indiquent que la catecholamine peut moduler l'expression de la métalloprotéinase matricielle (MMP) -2 et MMP-9 par le stroma et les cellules tumorales [15-17]. Il soulève une question intéressante que le stress psychologique peut jouer un rôle dans le développement et la progression du cancer de l'estomac en modulant l'expression de MMP par β2-AR voie de signalisation médiée.
Lignes de preuves accumulées montrent que MMP-7 est impliqué dans la invasion et les métastases du cancer gastrique [18-24]. MMP-7 est le plus petit membre connu de la famille des MMP et possède la plus grande matrice extracellulaire (ECM) Activité -degradative contre une variété de composants de l'ECM, y compris l'élastine, la gélatine, le collagène de type IV, la fibronectine, la vitronectine, la laminine, l'entactine, l'aggrécane et de protéoglycanes , parmi les MMP [25, 26]. Il est également capable de déclencher l'activation d'une cascade de MMP [27]. Une caractéristique unique de la MMP-7 est l'expression restreinte principalement dans les cellules épithéliales du tissu glandulaire, y compris mammaire normale, du foie, du pancréas, de la prostate et des glandes péribronchiques [28].
Il a été constaté que la MMP-7 est surexprimée dans la invasifs cancers des organes digestifs, tels que l'œsophage [29], gastrique [30], du pancréas [31, 32], du colon [33-35], le foie [36] et d'autres organes. Le niveau de l'expression de MMP-7 est significativement associée à la transformation des cellules tumorales, les phénotypes des cancers agressifs et le stade de progression tumorale [37], en particulier dans les tumeurs du tractus gastro-intestinal. La surexpression de MMP-7 est fréquemment identifié dans les lésions gastriques précancéreuses et des carcinomes gastriques les plus [18-21, 24, 38]. Une corrélation positive de MMP-7 au niveau de l'invasion tumorale de la paroi gastrique, métastases ganglionnaires, la diffusion péritonéale et la survie des patients atteints de cancer gastrique a été documentée dans plusieurs études [23]. MMP-7 a été reconnue comme un médiateur important de la progression du cancer et considéré comme un marqueur pronostique indépendant pour le cancer gastrique primaire. Cependant, les mécanismes moléculaires possibles de MMP-7 surexpression dans le cancer gastrique sont encore largement inexploré.
Dans la présente étude, nous avons étudié les effets de la stimulation des catécholamines sur MMP-7 expression dans des lignées cellulaires de cancer gastrique et élucidé les mécanismes moléculaires de la régulation positive de la MMP-7 par niveau de catécholamines par une voie de signalisation adrénergique.: Résultats
isoprotérénol stimulation up-régule l'expression de MMP-7
Il a été montré que l'expression de MMP-9 dans l'ovaire le cancer était significativement augmentée dans les macrophages associés à une tumeur chez les patients présentant des symptômes dépressifs élevés [15] et les catécholamines potentialisé l'expression induite par le LPS des MMP dans les monocytes humains [39]. Afin de déterminer si les catécholamines associés à l'expression de MMP-7 dans les cellules de cancer de l'estomac, nous avons d'abord inspecté les effets de la β-AR agoniste isoprotérénol sur la transcription de MMP-7 gène dans des lignées cellulaires de cancer gastrique HGC-27 et MGC-803 . Les doses de catécholamines utilisées dans cette étude ont été choisis pour refléter les conditions physiologiques de cette hormone dans les tumeurs [40, 41]. PCR semi-quantitative en temps réel et des analyses ont montré que l'expression de MMP-7 au niveau de la transcription était faible dans les lignées cellulaires de cancer gastrique. Lorsque les cellules ont été exposées à 10 uM d'isoprotérénol dans le milieu exempt de sérum pendant 12 h, la MMP-7, les niveaux d'ARNm ont été remarquablement augmenté dans les deux lignées cellulaires (Fig. 1A et 1B). Pour déterminer si le niveau accru de MMP-7 ARNm conduit à une augmentation similaire dans la production de protéines, MMP-7 expression dans HGC-27 et MGC-803 cellules ont été analysées par Western blot. Comme on le voit sur la Fig. 1C, la stimulation de l'isoprotérénol a entraîné une régulation à la hausse significative de la MMP-7 expression dans HGC-27 et MGC-803 cellules. β2-AR, qui médie la plupart des effets des catécholamines, a été identifié dans le sein et cellules cancéreuses d'ovaire [11, 13]. Afin de clarifier le rôle de la signalisation β2-AR-médiation dans MMP-7 expression, nous avons utilisé un antagoniste propranolol β-AR et antagoniste sélectif β2-AR ICI-118,551 pour tester si l'effet de l'isoprotérénol sur MMP-7 expression peut être inhibée. Nos données montrent que le traitement par le propranolol et le ICI-118551 efficacement bloqué par l'isoprotérénol stimulée par l'expression de MMP-7 (Fig. 1D, panneau supérieur). Nous avons ensuite examiné si la β2-AR est exprimée dans les cellules cancéreuses gastriques. Les données montrent que l'expression de la β2-AR a été détecté dans les trois lignées cellulaires du cancer de l'estomac, y compris HGC-27, MGC-803 et MKN-45 (Fig. 1D, panneau inférieur). Ces données indiquent que l'isoprotérénol a stimulé la production de MMP-7 dans des lignées cellulaires de cancer gastrique et la régulation positive de l'expression de MMP-7 a été déclenchée par l'isoprotérénol principalement par la signalisation médiée β2-AR. Figure stimulation 1 isoprotérénol up-régule l'expression de MMP-7. A et B, HGC-27 et MGC-803 cellules ont été mises en incubation pendant une nuit dans un milieu sans sérum et ensuite traitées avec 2 ou 10 uM d'isoprotérénol, respectivement. L'expression de MMP-7 ARNm a été analysée par RT-PCR (A) et de PCR en temps réel (B). C HGC-27, les cellules ont été stimulées avec des cellules 0, 1 ou 2 pM isoprotérénol et MGC-803 avec 0, 5 et 10 uM d'isoprotérénol après privation de sérum. L'expression de MMP-7 protéines ont été analysées par Western Blot. D, MGC-803 cellules ont été traitées avec 10 pM de propranolol ou 1 pM ICI-118551 pendant 1 h et ensuite avec 10 uM d'isoprotérénol. MMP-7 expression a été analysée par Western blot (panneau supérieur); l'expression de la β2-AR dans le MGC-803, MKN-45 et HGC-27 des cellules a été détectée par Western Blot (panneau inférieur).
Isoprotérénol régule à la hausse de la MMP-7 activité de promoteur et active la STAT3 et AP-1
Pour explorer les mécanismes moléculaires par lesquels catécholamines up-réglemente MMP-7 expression, nous avons d'abord déterminé si la stimulation de l'isoprotérénol peut affecter directement la MMP-7 activité de promoteur. Nous avons construit un plasmide PMMP-7 contenant un gène rapporteur de la luciférase entraîné par un 340 pb MMP-7 fragment promoteur (-296 à 44) (figure 2A).. MGC-803 cellules ont été transfectées avec PMMP-7 et l'effet de l'isoprotérénol sur la MMP-7, l'activité du promoteur a été évaluée par des essais de luciférase. Comme on le voit sur la Fig. 2B, après stimulation isoprotérénol pendant 1 h, les activités luciférase a commencé à monter et peu à peu améliorée. À 6 heures après l'exposition, la MMP-7, les activités de promoteur ont montré une augmentation de plus de deux ordres par rapport aux cellules témoins non stimulées, ce qui suggère que la stimulation de l'isoprotérénol peut induire directement la transactivation du promoteur de MMP-7. Figure 2 isoprotérénol régule à la hausse MMP-7 activité de promoteur et active STAT3 et AP-1. Une représentation schématique du plasmide PMMP-7 contenant un gène rapporteur de la luciférase entraîné par un promoteur de MMP-7 fragment de 340 pb. SBE, le site STAT3; ABE, AP-1 site. B, MGC-803 cellules ont été co-transfectées avec PMMP-7 et pRL-TK. Après transfection pendant 48 h, les cellules ont été incubées dans un milieu sans sérum pendant 24 h, puis stimulées avec 10 uM d'isoprotérénol à 0, 1, 2, 3, 6 ou 9 heures, respectivement. MMP-7 activités de promoteur ont été évaluées par des essais de luciférase. C et D, MGC-803 cellules ont été traitées avec 10 pM de propranolol pendant 1 h et ensuite avec 10 uM d'isoprotérénol pour 0, 15, 30, 60, 120 ou 180 min, respectivement. La phosphorylation de STAT3 et c-Jun a été analysée par Western Blot avec un anticorps anti-substance fluorescente et STAT3 anticorps polyclonaux anti-substance fluorescente c-Jun lapin. ISO, isoprotérénol.
Dans notre étude précédente [42, 43], nous avons identifié un site de liaison AP-1 à la position -67 à -61 et trois STAT3 sites de liaison aux positions -137 à -122, -168 à -159 et -255 à -245 en MMP-7 promoteur (Fig. 2A). Nous avons également démontré que l'AP-1 et STAT3 liés à l'AP-1 et l'une des STAT3 (-137 à -122), les sites, la régulation positive de la MMP-7 transcription. Une étude récente a montré que catécholamines a le potentiel pour activer STAT3. Pour étudier si catécholamines stimule la MMP-7 transcription via l'activation de STAT3 et AP-1, nous avons analysé la phosphorylation de STAT3 et c-juin Figue. 2C a montré que l'isoprotérénol a provoqué la phosphorylation de STAT3 après 30 stimulation min, atteignant un pic à 2 h. Bien que l'activation de c-Jun a été lente, initiée à 60 min, une phosphorylation maximale a été obtenue à 2 h ainsi (Fig. 2D). Cela signifiait que la stimulation de l'isoprotérénol produit un signal β2-AR médiation qui a déclenché l'activation de STAT3 et AP-1. Elément
STAT3 dans la MMP-7 promoteur ne soit pas requis et STAT3 ne suffit pas pour la MMP-7 expression induite par l'isoprotérénol
afin de déterminer si les éléments de STAT3 sont fonctionnels dans MMP-7 transcription du gène induite par l'isoprotérénol, nous avons d'abord entrepris la mutagenèse de trois sites de STAT3 par mutation des core-séquences de sites de STAT3 basé sur PMMP-7 (Fig. 3A) et construit le plasmide PMMP-7MS. Le plasmide a été transfecté dans MGC-803 cellules. Après transfection pendant 48 h, les cellules ont été incubées dans un milieu exempt de sérum pendant une nuit, puis stimulées avec 10 uM d'isoprotérénol pendant 6 h. Nous avons constaté, de manière surprenante, que la mutation des trois sites de liaison STAT3 n'a eu aucun effet important sur la transactivation du promoteur de MMP-7. Comme on le voit sur la Fig. 3B, les activités luciférase ont été progressivement augmenté et ont approché un pic à 6 h après l'exposition. Le résultat était très similaire à celle observée dans les cellules transfectées avec le type sauvage MMP-7 promoteur. Pour identifier le rôle de STAT3 dans cet événement, HGC-27 et MGC-803 cellules ont été transfectées avec pGeneSuppressor exprimant shRNA ciblant STAT3 et HGC-27 /STAT3-sh et MGC-803 /cellules STAT3-sh établies. Figue. 3C montre que l'expression de STAT3 a été supprimée de manière efficace dans les cellules. Conformément aux données ci-dessus, MMP-7 activités de promoteur induite par l'isoprotérénol ne semblaient pas être altérée de manière significative dans MGC-803 /cellules STAT3-sh (Fig. 3D). En outre, la MMP-7 expression induite par l'isoprotérénol, tant au niveau de la protéine ARNm et n'a pas été important affecté par faire taire l'expression de STAT3 comme démontré par RT-PCR, PCR en temps réel et Western blot (Fig. 3E, F et 3G). Les résultats suggèrent que l'élément STAT3 dans la MMP-7 promoteur est pas nécessaire et STAT3 ne suffit pas pour la MMP-7 expression induite par l'isoprotérénol. La figure 3 STAT3 élément de MMP-7 promoteur ne soit pas nécessaire et STAT3 ne suffit pas pour la MMP-7 expression induite par l'isoprotérénol. Une représentation schématique du plasmide PMMP-7MS contenant trois sites mutés STAT3 au niveau des positions -255 à -245, -168 à -159 et -137 à -122. B, MGC-803 cellules ont été co-transfectées avec PMMP-7MS et pRL-TK, affamé, puis stimulées avec 10 uM d'isoprotérénol pour 0, 1, 2, 3, 6 ou 9 h, respectivement. MMP-7 activités de promoteur ont été évaluées par des essais de luciférase. cellules C, HGC-27 et MGC-803 ont été transfectées de façon stable avec pGeneSuppressor exprimant STAT3 shRNA. L'expression de STAT3 a été analysée par Western blot en HGC-27 /STAT3-sh et MGC-803 cellules /STAT3-sh. D, la MMP-7, les activités de promoteur ont été testés dans MGC-803 cellules /STAT3-sh après stimulation avec 10 uM d'isoprotérénol à 0, 1, 2, 3, 6 ou 9 heures, respectivement. E à G, HGC-27 /STAT3-sh et cellules /STAT3-sh-803 MGC ont été stimulées avec 2 uM ou 10 uM d'isoprotérénol, respectivement. L'expression de MMP-7 a été analysée par RT-PCR (E), PCR en temps réel (F) et par Western blot (G).
AP-1 joue un rôle essentiel dans l'expression de MMP-7 induite par l'isoprotérénol
Les données ci-dessus était inattendue, puisque STAT3 pourrait être activé par la stimulation de l'isoprotérénol. De plus, dans notre précédente étude [42, 43], nous avons démontré que STAT3 et AP-1 ont participé à la régulation de la signalisation à médiation Her2 MMP-7 expression dans les cellules cancéreuses du sein. Nous avons ensuite cherché à déterminer si l'AP-1 influences isoprotérénol induite par MMP-7 expression. MGC-803 cellules ont été transfectées avec le plasmide PMMP-7 mA contenant un mutant le site AP-1 à la position -67 à -61 dans les activités de MMP-7 et le promoteur luciférase mesurée (Fig. 4A). Étonnamment, MMP-7 activités de promoteur induite par l'isoprotérénol ont été complètement disparu à tous les points de temps (Fig. 4B), ce qui suggère que le site AP-1 a été crucial dans la MMP-7 expression induite par l'isoprotérénol. Figure 4 AP-1 joue un rôle crucial dans la MMP-7 expression induite par l'isoprotérénol. Une représentation schématique du plasmide PMMP-7 mA contenant un mutant le site AP-1 à la position -67 à -61. B, MGC-803 cellules ont été co-transfectées avec PMMP-7mA et pRL-TK, affamé, puis stimulées avec 10 uM d'isoprotérénol pour 0, 1, 2, 3, 6 ou 9 h, respectivement. MMP-7 activités de promoteur ont été évaluées par des essais de luciférase. C, MGC-803 cellules co-transfectées avec TAM67, PMMP-7 et pRL-TK ont été induites avec 10 uM d'isoprotérénol. MMP-7 activités de promoteur ont été analysées par des analyses de luciférase. D, MGC-803 cellules exprimant de manière stable shRNA ciblant c-Jun (MGC-803 /c-Jun-sh) ont été mis en place et l'expression de c-Jun a été analysé par Western blot. E, MMP-7, les activités de promoteur ont été testés dans MGC-803 cellules /c-Jun-sh après stimulation avec 10 uM d'isoprotérénol à 0, 1, 2, 3, 6 ou 9 heures, respectivement. F, MMP-7 expression a été analysée dans MGC-803 cellules /c-Jun-sh après stimulation avec 0, 2 ou 10 uM d'isoprotérénol, respectivement. G, les plasmides exprimant c-Jun et STAT3C ont été transfectées dans MGC-803 cellules /c-Jun-sh, respectivement. MMP-7 activités de promoteur ont été analysées par des tests luciférase.
Pour confirmer MMP-7 expression induite par l'isoprotérénol est contrôlée par AP-1, nous avons ensuite examiné si la transactivation de MMP-7 promoteur induite par l'isoprotérénol peut être inhibée par une dominante négatif mutant c-Jun TAM67, qui n'a pas le c-Jun domaine 5'-transactivation, mais possède un c-Jun leucine zipper fonctionnelle et le domaine de liaison à l'ADN. Après transfection transitoire avec TAM67 dans MGC-803 cellules, transactivation induite par l'isoprotérénol de MMP-7 promoteur a été analysée par des dosages luciférase. Comme on le voit sur la Fig. 4C, l'expression de la dominante négative c-Jun a présenté un effet modérateur remarquable sur les activités MMP-7 promoteur. Pour vérifier davantage le rôle critique de l'AP-1, nous avons testé si le blocage endogène exprimé c-Jun peut inhiber l'expression de MMP-7. Les MGC-803 cellules /c-Jun-sh ont été établies (Fig. 4D) et MMP-7 activités de promoteur analysées par des essais luciférase. Les données sur la Fig. 4E a montré que les activités de MMP-7 promoteur ont été étonnamment réduits par knock-down de l'expression c-juin L'analyse Western blot a également démontré que la MMP-7 expression induite isoprotereol-a nettement diminué dans MGC-803 cellules /c-Jun-SH, alors qu'une sensiblement grande quantité de MMP-7 protéine a été détectée dans les cellules parentales après la stimulation d'isoprotérénol (Fig. 4F). Notamment, la surexpression de exogène c-Jun considérablement restauré MMP-7 activités de promoteur en 803 MGC cellules /c-Jun-sh, mais constitutivement activé STAT3 STAT3C mutant que très peu activé MMP-7 promoteur lorsque l'expression c-Jun a été réduit au silence (Fig . 4G). Ces données ont prouvé que AP-1 dominé MMP-7 expression induite par l'isoprotérénol.
C-Jun et STAT3 régulent synergétique MMP-7 expression en réponse à la stimulation de l'isoprotérénol
coopération de Stat3 et c-Jun dans la régulation d'une variété de la transcription des gènes ont été rapportés. Notre précédente étude démontre que l'activation de la MMP-9 promoteur dépend de l'interaction de Stat3 et AP-1 [44]. Comme mentionné plus haut, la stimulation induite par l'isoprotérénol l'activation de STAT3 et AP-1 en même temps. Nous avons spéculé que Stat3 et AP-1 peuvent synergétique participer à la régulation de la MMP-7 expression isoprotérénol stimulée. Il a été indiqué que l'AP-1 coopère avec STAT3 dans l'interleukine 6 transactivation induite de l'élément de réponse de l'IL-6 en l'absence de l'AP-1 de l'ADN de liaison directe [45]. Il nous a incités à tester la liaison éventuelle coopération de l'AP-1 /STAT3 sur le site AP-1.
Pour déterminer si cette STAT3 et AP-1 peuvent être recrutés sur le site AP-1 dans MMP-7 promoteur in vivo , MGC-803 cellules ont été stimulées avec 10 uM d'isoprotérénol pour 0, 2,5 ou 4 h, respectivement. L'ADN de la chromatine /complexes de protéines nucléaires ont été préparés et liaison de STAT3 et c-Jun au site AP-1 a été analysée par des analyses ChIP. Le produit de PCR pour l'amplification sélectionnée étend de la région de -76 à 165 hébergeant le site AP-1 dans MMP-7 promoteur. L'immunoprécipitation avec un anticorps anti-STAT3 et anti-c-Jun anticorps suivie d'une PCR a donné une bande de 241 pb attendue des précipitants après stimulation par l'isoprotérénol pendant 2,5 h. Les intensités de ces bandes ont été affaiblies après 4 h. En revanche, dans les cellules témoins non stimulées aucune liaison de STAT3 à ce site a été observé et la liaison de c-Jun à peine détectable. Aucune bande a été amplifié par immunoprécipitation à l'aide d'IgG de lapin (Fig. 5A). Les données ont été confirmées par PCR en temps réel (Fig. 5B). Ces données ont démontré que l'association de STAT3 et c-Jun avec la MMP-7 in vivo
promoteur est spécifique et que la stimulation induite par l'isoprotérénol liaison de STAT3 /c-Jun à l'élément AP-1. Figure 5 c-Jun et STAT3 régulent synergétique MMP-7 expression. A et B, MGC-803 cellules ont été stimulées avec 10 uM d'isoprotérénol à 0, 2,5 ou 4 h, respectivement. L'ADN de la chromatine /complexes de protéines nucléaires ont été préparés. La liaison de STAT3 et c-Jun au site AP-1 a été analysée par immunoprécipitation avec des anticorps anti-STAT3 et anti-AP-1 par PCR suivie d'anticorps (A) et PCR en temps réel (B). C, MGC-803 cellules ont été traitées avec 10 uM d'isoprotérénol 0 ou 2,5 heures, respectivement. L'extrait nucléaire a été préparé avec un kit nucléaire-cytosol Extraction. β-tubuline et AP-2α ont été analysés par Western blot pour examiner la séparation des protéines cytoplasmiques et nucléaires. C, les protéines cytosoliques; N, des protéines nucléaires. D, 200 pg d'extraits nucléaires a été incubée à 4 ° C pendant 4 h avec les oligonucléotides biotinylés contenant AP-1 séquence consensus précédemment couplé à des Dynabeads M-280 en présence ou en l'absence d'un, cinq ou 15 fois la quantité de la double concurrents d'oligonucléotides -stranded. L'incubation des protéines nucléaires avec les oligonucléotides double brin contenant une mutation AP-1 place (Mout Oligo), ou les oligonucléotides double brin non spécifique (NS) Oligo a été utilisé comme témoin. Les complexes ADN /protéine ont été séparées par un aimant Dynal, et soumis à une SDS-PAGE. STAT3 et c-Jun ont été détectées par Western blot avec des anticorps anti-STAT3 et des anticorps anti-c-Jun. E et F, MGC-803 cellules ont été cotransfectées avec les plasmides PMMP-7mA et pCDNA3.1 /c-Jun ou les activités de luciférase et STAT3C ont été dosées.
Pour caractériser davantage les interactions de STAT3 /c-Jun avec le AP-1 site, nous avons effectué un test d'affinité de précipitation de l'ADN. Après MGC-803 cellules ont été traitées avec isoproterenol pendant 2,5 heures, l'extrait nucléaire a été préparée et sa qualité a été évaluée (Fig. 5C). Les oligonucléotides biotinylés qui correspondent à -74 à -52 région de promoteur de MMP-7 ont été incubées avec 200 pg d'extraits nucléaires pour les essais de pull-down. Les billes magnétiques revêtues de streptavidine ont été utilisés pour précipiter des oligonucléotides double brin marqués à la biotine et des protéines de liaison d'ADN associées. La liaison des protéines nucléaires aux oligonucléotides biotinylés a été analysée en présence d'un, cinq ou 15 fois la quantité de concurrents oligonucléotide double brin contenant de l'AP-1 séquences de consensus. L'incubation des protéines nucléaires avec les oligonucléotides double brin contenant un site de AP-1 muté ou oligonucléotides double brin non spécifique a été utilisé comme témoin. Les complexes de protéines-ADN résultants ont été résolus par SDS-PAGE, suivi par Western Blot avec un anticorps anti-c-Jun et des anticorps anti-STAT3. L'association de ces deux facteurs de transcription avec des oligonucléotides contenant AP-1 séquences consensus pouvait être clairement détectée dans les extraits nucléaires provenant de cellules stimulées par l'isoprotérénol, mais pas à partir de cellules non stimulées. La concurrence avec quinze fois le montant des concurrents totalement aboli la formation des complexes ADN /protéine biotinylé (Fig. 5D). Aucune liaison de c-Jun et STAT3 soit les oligonucléotides contenant un muté AP-1 place ou d'oligonucléotides non spécifiques a été détecté (Fig. 5D). Cette expérience fournit en évidence in vitro pour confirmer que STAT3 et c-Jun, sous stimulation catecholamine peuvent interagir physiquement et se lier au site AP-1 pour obtenir la transactivation de la MMP-7 gènes dans des cellules de cancer gastrique.
Nous avons montré que l'isoprotérénol induite par MMP-7 activation du promoteur n'a pas été perturbé par la mutagenèse de l'âme des séquences de tous les trois sites de STAT3, ce qui suggère que les éléments de STAT3 ne peuvent pas agir en MMP-7 transcription génique induite par l'isoproterenol dans des cellules de cancer gastrique. Pour vérifier davantage le rôle de l'AP-1 élément, le plasmide PMMP-7mA a été co-transfectés dans MGC-803 cellules avec soit pCDNA3.1 /c-Jun ou STAT3C, respectivement. Chose intéressante, la mutation de l'AP-1 site de liaison complètement bloqué l'activation de la MMP-7 promoteur dans les cellules transfectées surexprimant soit c-Jun ou STAT3C (Fig. 5E et 5F), ce qui indique que le site AP-1 est un élément régulateur important et la régulation synergique induite par l'isoprotérénol MMP-7 par l'expression STAT3 et AP-1 repose sur cet élément.
β2-AR et MMP-7 ont été colocalisés dans les tissus du cancer de l'estomac
la surexpression de MMP-7 est fréquemment à l'avant invasive du cancer gastrique humain et directement associée à un pronostic chez les patients atteints de cancer gastrique. Afin d'étudier la corrélation entre le niveau β2-AR avec la MMP-7 expression dans le cancer gastrique humain, nous avons prélevé cinq échantillons de tissu du cancer gastrique et analysé l'expression de la β2-AR et MMP-7 par un marquage immunohistochimique. Fait intéressant, la forte expression de la β2-AR et MMP-7 est apparue dans la même région des tissus de tumeur (Fig. 6A), ce qui suggère une relation étroite entre la MMP-7 et β2-AR. Pour étudier davantage le rôle de la MMP-7 et β2-AR dans la métastase du cancer gastrique, nous avons analysé l'expression de MMP-7 et ß-ARs dans les tissus cancéreux, péri-cancéreuses et métastatiques d'un patient avec un cancer gastrique. Comme on le voit sur la Fig. 6B, l'expression de β1-AR, β2-AR et MMP-7 au niveau de la protéine est plus élevée dans les tissus cancéreux que dans le tissu péri-cancéreux. Cependant, la plus haute expression d'entre eux a été trouvé dans le tissu métastatique. En outre, l'ARNm de la MMP-7 a également été surexprimé dans les tissus métastatiques (Fig. 6C). Ces données impliquent fortement un lien étroit entre les MMP-7, β2-AR et les métastases du cancer gastrique. La figure 6 β2-AR et MMP-7 ont été surexprimés dans les tissus du cancer de l'estomac. A cinq échantillons de tissus de cancer gastrique ont été recueillies. L'expression de la β2-AR et MMP-7 a été analysée par immunohistochimie. B, l'expression de MMP-7, β1-AR et β2-AR dans les tissus cancéreux, péri-cancéreuses et métastatiques a été analysée par Western blot. C, le niveau de MMP-7 ARNm dans les tissus cancéreux, péri-cancéreuses et métastatiques a été analysé par temps réel Rapport
La présente étude PCR. De se fondait sur l'hypothèse que le stress psychosocial peut être un facteur prédisposant dans le cancer gastrique. Le stress, l'anxiété et la dépression peuvent provoquer physiologiques et neuroendocrines changements complexes qui influent sur plusieurs systèmes, y compris le système digestif. Les patients atteints de cancer éprouvent souvent une détresse émotionnelle importante. L'association de stress physiologique avec une élévation de la sécrétion d'acide gastrique et stomachache a longtemps été remarqué [46, 47]. Il a été rapporté que le stress chronique peut aggraver les ulcères d'estomac. Dans un récent sondage basée sur la population inscrite de 2014 sujets, le stress a été considéré comme facteur de risque le plus puissant dans le cancer gastrique [48]. Les résultats des études expérimentales suggèrent que l'activité accrue du système nerveux sympathique peut constituer un principal mécanisme par lequel le gène de l'impact des facteurs physiologiques expression dans les tumeurs [49]. À ce jour, la plupart des études portant sur les mécanismes reliant le stress et le cancer progression a été liée à des effets indirects à travers l'immunosuppression [8]. Dans plusieurs études récentes, ont été directement liés à la modification du comportement des cellules malignes [10-17] liées au stress des protéines et des voies. Cependant, il y a un manque de données délimitant les mécanismes moléculaires impliqués.
Dans la présente étude, nous avons identifié augmenté MMP-7 expression dans les lignées cellulaires de cancer gastrique en réponse à la stimulation de l'hormone catécholamines liée au stress. On estime que la concentration des catecholamines peut être plus de 100 fois plus élevé dans le microenvironnement tumoral que dans les tissus normaux et le plasma circulant. MMP-7 est unique dans son expression restreinte dans les cellules tumorales, ce qui indique que l'expression de MMP-7 est d'une manière associée à une tumeur. Nous avons remarqué que la stimulation de l'isoprotérénol significativement régulée à la hausse MMP-7 expression à la fois les niveaux de protéines dans les cellules de cancer gastrique ARNm et. β2-AR antigonist effectivement abrogée MMP-7 expression induite par l'isoprotérénol régulation à la hausse, ce qui suggère que la voie β2-AR-médiation est impliqué dans le processus.
MMP-7 expression est étroitement contrôlée au niveau de la transcription. Notre étude précédente a démontré que l'héréguline-β induite par MMP-7 expression était régulée par STAT3 médiée HER2 et AP-1 activation dans des lignées cellulaires de cancer du sein humain [42, 43]. Nous avons également identifié les sites de liaison fonctionnels AP-1 et STAT3 dans les 350 premières pb du site de départ de la transcription chez l'homme MMP-7 promoteur [42, 43]. Une autre étude a montré que le FGF-2 peut directement réguler positivement la MMP-7 expression génique dans des lignées de cellules tumorales humaines et des cellules endothéliales de la veine ombilicale par AP-1 et STAT3 [50]. Accumuler des preuves soutient fermement que STAT3 sert de noeud central réglementaire sur lequel plusieurs voies de signalisation oncogénique convergent [51]. activation aberrante de STAT3 a été prouvé à jouer un rôle crucial dans le développement du cancer gastrique [52, 53]. Une étude récente et nos données ont découvert l'association des catacholamine avec l'activation de STAT3 dans les cellules de cancer de l'ovaire et du sein [12, 13]. Dans la présente étude, nous avons démontré que la stimulation de l'isoprotérénol évidence induit l'activation de STAT3 dans les cellules de cancer gastrique, ce qui implique que les catécholamines peuvent accélérer la progression maligne du cancer gastrique. Nos données non publiées ont également prouvé que l'isoprotérénol a stimulé l'expression de MMP-2 et MMP-9 dans des cellules de cancer de l'estomac principalement par l'activation de STAT3. Toutefois, dans cette étude, nous avons constaté que AP-1 affiche une plus grande efficacité que STAT3 dans MMP-7 transcription du gène induite par l'isoprotérénol et les éléments de STAT3 étaient non fonctionnels, comme faire taire l'expression de STAT3 n'a pas été efficace dans la prévention de MMP induite par l'isoprotérénol 7 expression et la mutagenèse de trois sites de liaison STAT3 a échoué à réprimer la transactivation de MMP-7 promoteur en réponse à l'isoprotérénol induction. En revanche, le site AP-1 et c-Jun gouvernées ce processus. Il est intéressant de STAT3 et c-Jun ont été trouvés se lier à la seule AP-1 site dans la MMP-7 promoteur simultanément, ce qui implique que l'interaction des deux facteurs de transcription à un site de liaison est responsable de la MMP-7, l'expression d'isoprotérénol stimulée dans le cancer gastrique cellules. No.

Sequences

P1
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACC-3'
P2
5'-CCCAAGCTTTGCCGTCCAGAGACAATTG-3'
P3
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACCTATGAGAGCAGTCATTTGACGCTGGCAAAA-3'
P4
5'-CATTGTGTGCTCCCTGCCACTAACGATGTAATACTT-3'
P5
5'-TTGTCTTTCAAAGGATT-3'
P6
5'-TACTTCCTCGTCCTAGCCAATGCAAAATAACACATAC-3'
P7
5' 3'
P8
5'-GAAAACACTCAAACGAGTGACCTATTTCCACAT-3'
P9
5'-TTTCTTTTTAGAGTCTACAG-3'
P10
5'-GAGTGCCAGATGTTGCAGAA-3'
P11
5'-GTGAGCATCTCCTCCGAGAC-3'
P12
5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'
P13
5'-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'
P14
5'-ACACATACTTTCAAAGTTCTGTAGACTCT-3'
P15
5'-ACGGTGAGTCGCATAGCT-3'

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