Importance du récepteur leurre 3 (DcR3) et externe signal régulé kinase 1/2 (ERK1 /2) dans l'estomac cancer

Importance du récepteur leurre 3 (DcR3) et externe signal régulé kinase 1/2 (ERK1 /2) dans le cancer gastrique Résumé

Arrière-plan de l'receptor Decoy 3 (DcR3), un membre du récepteur du facteur de nécrose tumorale (TNFR) superfamille, est associée à la suppression de l'immunité anti-tumorale. Il est fortement exprimé dans de nombreuses tumeurs, et son expression peut être régulée par la /MEK /ERK voie de signalisation MAPK. Le /MEK /ERK MAPK a été rapporté comme un régulateur en présence de la tumeur, le développement et l'expansion clonale. Résultats de signal externe kinase régulée (ERK) est un membre essentiel de cette voie.
L'expression de DcR3 et ERK1 /2 dans les tissus tumoraux de patients atteints de cancer gastrique était significativement plus élevé que le groupe non-cancéreuse (P
< 0,05). Il n'y avait pas de différence statistique entre les tissus tumoraux de patients atteints de différents âges ou le sexe, et même de la différenciation différente (P
> 0,05). Cependant, chez les patients de stade I cancer gastrique, le DcR3 et ERK1 /2 niveaux étaient significativement plus faible que les patients atteints de stades plus avancés
. Conclusions
DcR3 et ERK1 /2 jouent un rôle vital dans le développement du cancer gastrique, et ils peuvent être de nouveaux marqueurs pour indiquer l'efficacité du traitement du cancer gastrique dans l'avenir.
Contexte
récepteur Decoy 3 (DcR3) est un membre du récepteur du facteur de nécrose tumorale (TNFR) superfamille. Il a été démontré que le récepteur leurre pour Fas ligand (FasL), LIGHT et TL1A [1-3], également connu sous le nom TR6 [4]. DcR3 est principalement exprimé dans les cellules tumorales et inhibe de manière compétitive la signalisation du TNF. La surexpression de DcR3 dans les cellules tumorales les protège contre l'apoptose. DcR3 protège les cellules tumorales de la surveillance immunitaire, car elle contribue à la suppression de l'immunité hôte anti-tumorale.
DcR3 ARNm et la protéine sont amplifiés dans divers tissus malins, tels que le cancer du poumon, le cancer du côlon, le cancer gastrique, le cancer de l'oesophage, du pancréas le cancer et le mélanome malin [1, 5, 6]. Wu et al.
[7] ont rapporté que DcR3 n'a pu être détectée chez les patients non tumorales, mais n'a pu être détectée dans 98,8% (82/83) des patients atteints de cancers malins. Le plus Ce phénomène démontre que l'élévation l'expression de DcR3 est en corrélation significative avec la tumorigenèse et la progression tumorale. Wu et al.
[8] a rapporté que DcR3 a été fortement exprimé dans le cancer gastrique humain (GC), et positivement corrélée avec le développement et les métastases des lésions gastriques. patients atteints de cancer gastrique avec une forte expression DcR3 présenté une maladie pN2-3 plus avancées que celles avec une faible expression DcR3.
Le DcR3 pour FasL peut être impliqué dans la progression du cancer gastrique. Une évaluation plus poussée des rôles possibles de DcR3 et la régulation de l'expression DcR3 dans les cellules malignes est très important pour le développement de nouvelles stratégies pour contrôler la croissance des cellules malignes qui échappent à la surveillance immunitaire de l'hôte.
Au stade précoce, la MAPK /voie ERK est activée dans les tumeurs, ce qui est un signe notable pour de nombreux types de cancers chez l'homme. Récemment, plusieurs lignes de preuve suggèrent que ERK pourrait être un paramètre pour prédire le pronostic de certains cancers tels que le cancer du sein, le cancer du côlon, le cancer du pancréas et le cholangiocarcinome. Wang et al.
[9] ont rapporté que l'expression de ERK1 /2 était élevée dans cholangiocarcinome, qui en corrélation avec les stades TNM.
Kim et al.
[10] ont montré que le LPS induit DcR3 libération en les cellules humaines épithéliales intestinales (CEI), qui semblaient être via l'activation des kinases activées par les mitogènes protéines (MAPK), comme extracellulaire régulée par un signal kinase 1 et 2 (ERK1 /2) et de la protéine c-Jun NH2-terminale kinase ( JNK). Induite par le LPS DcR3 libération dans les cellules SW480 a été abolie par ERK1 /2 et les inhibiteurs de JNK. En outre, Yang et al.
[11] a rapporté que 3 g /ml DcR3 nettement induit la phosphorylation de la ERK et p38.
Conformément à ces rapports, nous proposons que DcR3 et ERK1 /2 sont étroitement liés. Les gènes DcR3 étroitement corrélés avec l'apparition et le développement de nombreux types de tumeurs. Dans cette étude, nous avons étudié le niveau d'expression et la localisation de DcR3 et ERK1 /2 chez les patients atteints de cancer gastrique de différents âges, le sexe, le stade et la différenciation, d'explorer la relation entre DcR3 /ERK1 /2 et gastrique apparition et le développement du cancer. En outre, nous fournissons des suggestions pour le diagnostic clinique des cancers gastriques.
Méthodes
échantillons cliniques
tumeurs ont été chez des patients atteints de cancer gastrique qui ont été subies biopsie endoscopique ou opérations curatives à l'hôpital Zhongshan affilié à Xiamen université. tissus tumoraux à partir de laquelle l'ADN et les protéines ont été isolées étaient de spécimen frais de la chirurgie de résection. Tous les échantillons ont été obtenus avec le consentement du patient et l'approbation du Comité d'éthique médicale de Zhongshan University Hospital Xiamen. Toutes les expériences de
souris ont été effectuées en utilisant 6-8 semaines des souris nude mâles achetés chez Model Research Center animale du Collège médical Université de Xiamen. Tous les animaux ont été logés dans des conditions pathogènes libres spécifiques avec un accès constant à l'eau et chow. Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées à la suite de l'approbation du soin et l'utilisation Comité des animaux de l'Université de Xiamen.
Culture cellulaire
La lignée cellulaire de cancer gastrique humain BGC823 a été maintenue dans notre laboratoire, qui a été cultivé dans des flacons avec de Dulbecco Eagle modifié milieu (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO2. Les réactifs

DMEM et SBF à la pénicilline-streptomycine ont été achetés de Hyclone Corporation (Utah, USA). Hématoxyline-et-éosine (H & E) kit de dosage ont été achetés auprès de Chemicon International, Inc (Temecula, CA, USA). ERK1 /2 et DcR3 Abs ont été achetés à la technologie Santa Cruz Bio. Réactifs RT-RCR ont été achetés auprès de Takara (Dalian, Chine). La séquence primaire a été synthétisé à partir de Sangon (Shanghai, Chine).
Dans les modèles de tumeurs animales in vivo
Tumeurs ont été générés chez la souris nude mâles par voie intramusculaire (im) injection de BGC823 cellules (1,0 x 105 cellules dans 100 ul PBS) en le flanc droit. Les mesures des tumeurs ont été converties en volume de tumeur (V) par la formule (L x W2 x 0,52), où L et W sont la longueur et la largeur, respectivement. Les mesures ont été faites avec un pied à coulisse à vernier. Toutes les souris porteuses de tumeur ont été divisés au hasard en groupes (2 souris /groupe).
RT-PCR et analyse de transfert de Western pour examiner l'expression de l'ARN total de DcR3 /ERK et de DcR3 ERK1 /2 a été extrait d'stimulée des cellules en utilisant du Trizol. Pour mesurer ERK /DcR3 nombre de copies de gènes, l'ADN à partir d'échantillons de tumeurs fraîches a été analysée avec RT-PCR. Les amorces en amont et en aval pour ERK1 ARNm étaient 5'-CCTGCTCATCAACACCACC-3 'et 5'-CGTAGCCACATACTCCGTCA-3', et pour l'ARNm de ERK2 étaient 5'-TCTTCC AGCCCTCCTTCCTG-3 'et 5'-CGTTTCTGCGCCGTTAGGT-3'. Les échantillons ont été dénaturés à 95 ° C pendant 4 min, puis 35 cycles d'amplification (95 ° C, 45 s; 55 ° C, 45 s; et 72 ° C, 60 secondes). Les produits étaient de 300 pb et des fragments de 400 pb, respectivement. Pour DcR3 ARNm, l'amorce amont était 5'GCAAAGCCAAGGATTCCCCCTG -3 'et l'amorce en aval était 5'-GGCACTGCTCTGAGCTGGAGCTG-3'. Les échantillons ont été dénaturés à 95 ° C pendant 4 min, puis 30 cycles d'amplification (95 ° C, 45 s; 55 ° C, 45 s; et 72 ° C, 60 secondes). Le produit était un fragment de 921 pb.
BGC823 cellules ont été récoltées et lysées dans un tampon de lyse cellulaire (1% (v /v) Nonidet P-40, 150 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl (pH 8), 1 mM de PMSF, 2 g /ml d'aprotinine, et 2 g /ml de leupeptine), qui pourrait libérer de DcR3 et de ERK1 /2 protéines. Vingt-cinq microgrammes de lysat total ont été fractionnés par SDS-PAGE et soumis à une analyse Western blot en utilisant l'anticorps anti-ERK ou anti-DcR3 anticorps monoclonal (clone 3 H5). Le plus buvardage de Western et analyse ELISA pour examiner l'expression de DcR3 /ERK après le traitement des inhibiteurs
BGC823 cellules surnageants de culture ont été prélevés à divers intervalles, et les niveaux de U0126, PD98059, APDC, MEK1 /2 et ERK1 /2 interférences ont été quantifiés en utilisant des kits ELISA commerciaux, selon les instructions du fournisseur. Les cellules traitées avec ERK1 /2 shRNA (5: 2, 6: 2), U0126 /PD98059 (0 pmol /L, 5 umol /L, 10 umol /L, 20 umol /L, 40 pmol /L) et CDAP (0 umol /L, 10 umol /L, 20 umol /L, 40 umol /L, 80 pmol /L), respectivement. Après une incubation de 5 ou 7 jours, les cellules ont été soumises à des cytokines comme indiqué dosage. Vingt-cinq microgrammes de lysat total ont été fractionnés par SDS-PAGE et soumis à une analyse Western blot en utilisant l'anticorps anti-ERK ou anti-DcR3 anticorps monoclonal (clone 3 H5).
Analyse immunohistochimique de l'expression de DcR3 et de ERK1 /2
tissus tumoraux ont été fixés dans un milieu de formol et inclus dans de la paraffine. Les articles 6 mm d'épaisseur ont été montées sur des lames de verre prétraités avec 0,1% de poly-L-lysine. Ils ont ensuite été deparaffinaged en xy lène, déshydratés dans de l'éthanol gradué et trempées dans 3% de H 2 O 2 pendant 10 minutes pour éliminer l'activité de peroxydase endogène. Ensuite, les lames ont été immergées dans un tampon citrate (pH 6,0) et chauffée à l'ébullition 92-98 ° C dans un four à micro-ondes pendant 10 min. Par la suite, elles ont été rincées 3 fois avec du PBS pendant 10 minutes à chaque fois et bloqués avec 10% de sérum de chèvre normal dans du PBS pendant 1 h à température ambiante. Les lames ont ensuite été amenés à réagir avec le lapin purifié par affinité anti TR6 Ab (1,67 g /ml) à la température ambiante pendant 2 heures. Après lavage, les lames ont été incubées avec un anticorps de chèvre anti-lapin biotinylé pendant 10 min. le signal TR6 a été révélé par la streptavidine-peroxydase en utilisant DAB comme substrat selon les instructions du kit Histostain-Plus (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA). signaux DcR3 ont été révélés en brun. Enfin, les lames ont été contre l'hématoxyline et scellées avec des milieux aqueux de montage (Zymed).
Analyse statistique
données ont été présentées sous forme de moyenne ± écart-type. La signification de la différence entre les deux groupes a été évaluée par un test t à deux queues estudiantine. Valeur de probabilité inférieure à 0,05 a été considérée comme significative. Résultats Tous les moyens ont été calculés à partir d'au moins trois expériences indépendantes.
patients atteints de cancer ont des niveaux élevés DcR3
Pour étudier la corrélation entre DcR3 expression et la tumeur apparition et le développement, les tumeurs de 50 patients atteints de cancer gastrique ont été collectés et testés pour les taux de protéine DcR3 ARNm et. Comme on le voit sur la figure 1a, les bandes DcR3 921 pb ont été générés par RT-PCR à partir des tissus de tumeur de la plupart des patients (36/50), par rapport aux tissus non cancéreux (2/50) à partir des mêmes organes de ces patients. Ces résultats démontrent que les niveaux DcR3 ont augmenté significativement (huit échantillons cliniques choisis au hasard sont présentés sur la figure 1a). Pour confirmer davantage les résultats, les taux de protéine DcR3 ont été examinés par transfert de Western. Les résultats démontrent que la protéine DcR3 peut être détectée dans la plupart des patients cancéreux; la protéine DcR3 a été détectée dans 74% (37/50) des tissus tumoraux, mais seulement 6% (3/50) des tissus non cancéreux (tableau 1 et figure 1b, huit échantillons cliniques choisis au hasard sont représentés sur la figure 1b ). Figure 1 L'expression de DcR3 dans le cancer gastrique et les tissus non cancéreux analysés par RT-PCR (Figure1a) et transfert de Western (Figure1b). a: Lane M, marqueurs d'ADN; , des tissus tumoraux lanes1-7; piste 8, les tissus non cancéreux; DcR3 ARNm a été positive dans les tissus 36 de 50 tumorales (1-7) et négative dans les tissus non cancéreux (8). b: les tissus lanes1-7, la tumeur; piste 8, les tissus non cancéreux. protéine DcR3 a été positif dans 37 des 50 échantillons de tissu tumoral (1-7), dont seulement trois 50 dans les tissus non cancéreux (8).
Tableau 1 Analyse des patients atteints d'un cancer gastrique avec DcR3 et de ERK1 /2 expression dans les tissus tumoraux et normaux

Cases
nombre positif
taux positif (%)
50
ARNm de tumeur
Protein
+ /+
ARNm
Protein
+ /+
DcR3
36
37
28
72,0
74,0
56,0
ERK1
37
42
36
74,0
84,0
72,0
P
> 32
37
27
64,0
74,0
54,0
non-cancéreuses
50
DcR3 2
de 0,05
ERK2 3
0
4.0
6.0
0
ERK1
6
5 1
12,0
15,0
2.0
ERK2
9
10 3
18,0
20,0
6.0 de l'expression de ERK1 /2 dans des échantillons cliniques
pour identifier les molécules de signalisation liées à DcR3, les niveaux d'expression ERK1 /2, JNK et p38 ont été testés. Nous avons constaté que seulement ERK1 /2 pouvait être détectée dans des échantillons de tumeur (données non présentées pour les JNK et p38). ERK1 ARNm a été détecté dans 74% des échantillons (37/50) et ERK2 L'ARNm a été détecté dans 64% des échantillons (32/50; tableau 1 et figure 2a). Au niveau des protéines, ERK1 a été détectée dans 84% ​​(42/50) et ERK2 dans 74% (37/50) des tissus tumoraux (tableau 1 et figure 2b). Ces résultats indiquent que les patients atteints de tumeurs de cancer gastrique ont un ERK1 supérieur /événement 2-positif par rapport aux tissus non cancéreux (P
< 0,05). Il y avait une corrélation positive entre les taux d'ARNm et de protéine, comme dans 42 des 50 tumeurs des tissus ERK1 niveau de la protéine a été élevée, dont 36 cas étaient compatibles avec l'expression de l'ARNm. En revanche, ERK1 expression de la protéine a été détectée seulement dans cinq tissus normaux. Lors de l'examen ERK2, 37 des 50 cas de tissus tumoraux ont été positifs pour l'expression de la protéine ERK2, dont 27 cas étaient compatibles avec l'expression ERK2 ARNm, tandis que dix cas seulement ont montré l'expression de protéine positive dans les tissus normaux. Les huit échantillons choisis au hasard sont présentés dans la figure 2. Figure 2 L'expression de ERK1 /2 dans le cancer gastrique et les tissus non cancéreux analysés par RT-PCR (figure 2a) et un Western Blot (figure 2b). a: Lane M, marqueurs d'ADN; , des tissus tumoraux lanes1-7; piste 8, les tissus non cancéreux; ERK1 et ERK2 étaient positifs ARNm dans les tissus tumoraux. b. Localisation ERK1 et la protéine ERK2 étaient positifs dans les tissus tumoraux (1-8) de ERK1 /2 chez les patients atteints de cancer gastrique
Examiner ERK1 2 Répartition /, les tumeurs de 50 patients ont été testés par immunohistochimie. Les résultats montrent que ERK1 /2 ont été exprimés dans les tissus tumoraux de la plupart des patients. l'expression de ERK1 a été trouvée dans le cytoplasme. expression positive ERK2 a été trouvé dans certaines cellules tumorales (figure 3). Figure 3 La localisation de ERK1 /2 protéines dans les tissus de cancer gastrique analysés par immunohistochimie. A: contrôle, B: ERK1, C:. ERK2
DcR3 et ERK1 /2 niveaux en corrélation avec l'invasion tumorale, mais pas avec l'âge, le sexe ou la différenciation
L'incidence positive de DcR3 ARNm dans les tissus tumoraux de patients atteints de cancer gastrique a été 72,0% (36/50) et de la protéine DcR3 74,0% (37/50), ce qui était significativement plus élevé que dans les tissus non cancéreux présentant seulement 4% (2/50) et 6% (3/50), respectivement ( P
< 0,05; tableau 1). L'occurrence positive de l'expression de ERK1 /2 de l'ARNm était de 74,0% (37/50) et 64,0% (32/50) et l'expression des protéines 84,0% (42/50) et 74,0% (37/50). Tous deux étaient significativement plus élevés que les tissus non cancéreux, montrant 12,0% (6/50) et 18,0% (9/50), et 10,0% (5/50) et 20,0% (10/50), respectivement (tableau 1). Ces résultats suggèrent que les niveaux DcR3 et de ERK1 /2 expression en corrélation avec l'apparition et le développement tumoral.
Comme cela est représenté dans les tableaux 2, 3 et 4, il n'y avait pas de différence significative entre les tissus tumoraux provenant de différents âges, des groupes de genre et les patients présentant une différenciation différente stades du cancer gastrique (P
> 0,05). Cependant, les niveaux de DcR3 et de ERK1 /2 expression étaient significativement plus élevés dans le stade TNM II-IV (tableau 5). Ainsi, les expressions de DcR3 et ERK1 /2 en corrélation avec l'invasion de la tumeur et le stade TNM, mais pas avec l'âge, le sexe ou differentiation.Table 2 Corrélation d'expression de DcR3 et ERK1 /2 avec l'âge chez les patients atteints de cancer gastrique de
Cas
nombre positif
taux positif (%)
≥50
32
ARNm
Protein
+ /+
ARNm
Protein
+ /+
DcR3
25
28
21
78,1
87,5
65,6
ERK1
28
31
26
87,5
96,9
81,2
P
> 20
22
16
62,5
68,8
50,0
<de 0,05 de
ERK2; 50
18
11
DcR3 9
5
61,1
50,0
27,8
13
11
5
72,2
61,1
27,8
ERK2 de ERK1
12
15
6
66,7
83,3
33,3
Tableau 3 corrélation d'expression de DcR3 et ERK1 /2 avec le sexe dans
cas des patients atteints de cancer gastrique
nombre positif
taux positif (%)
39
ARNm
Protein Homme
+ /+
ARNm
Protein
+ /+
29
29
24
74,4
74,4
61,5
ERK1
32
DcR3 35
28
82,1
89,7
71,8
P
> 11
DcR3 de 0,05
26
30
23
66,7
76,9
59,0
Femme
ERK2
7
8
5
63,6
72,7
45,6
ERK1
9
7
6
81,8
63,6
54,5
ERK2
6
7 4
54,6
63,6
36,4
Tableau 4 corrélation d'expression de DcR3 et ERK1 /2 avec la différenciation de la tumeur dans
cas des patients atteints de cancer gastrique
nombre positif
taux positif (%)
bien
9
ARNm
Protein
+ /+
ARNm
Protein
+ /+
DcR3
7
7
5
77,8
77,8
55,6
ERK1
7
9
6
77,8
100,0
66,7
P
> 0.05
ERK2
6
7
5
66,7
77,8
55,6
Modérément
28
DcR3
21
23
20
75,0
82,1
71,4
24
24
22
85,7
85,7
78,6
ERK2
ERK1 13
DcR3 de 19
24
17
67,9
85,7
60,7
Low 8
7
5
61,5
53,9
38,5
10
9 8
76,9
69,2
61,5
ERK2
7
6
ERK1 5
53,9
46,2
38,5
Tableau 5 corrélation d'expression de DcR3 et ERK1 /2 avec des stades pathologiques de la tumeur dans le stade TNM de patients atteints de cancer gastrique
cas
numéro
taux positif
positif (%)
I
6
ARNm
Protein
+ /+
ARNm
Protein
+ /+
DcR3 1
1 1
16,7
16,7
16,7
ERK1 2
2
1
33,3
33,3
16,7
P
> 0.05
ERK2 1
1
0
16,7
16,7
0.0
II
17
DcR3
12
13
10
70,6
76,5
58,8
14
14
11
82,4
82,4
64,7
P
ERK1 > 0.05
10
12
9
58,8
70,6
52,9
III
ERK2
25
DcR3
21
21
21
84,0
84,0
84,0
23
24
22
92,0
96,0
88,0
P
ERK1 > 0.05
ERK2
20
23
18
80,0
92,0
72,0
IV 2
DcR3 2
2
2
100,0 100,0

100,0
ERK1 2
2 2
100,0
100,0 100,0

P
> 0.05
ERK2 1
1 1
50,0
50,0 50,0
de niveaux de DcR3 et ERK1 /2 expression sont amplifiés dans les modèles
animaux Comme le montre dans le tableau 6, après l'injection BGC823 cellules dans le flanc droit de souris nues, les tumeurs ont augmenté chaque jour. La RT-PCR a été utilisée pour tester les niveaux d'ARNm DcR3 et ERK1 /2 dans les tumeurs et l'analyse par transfert de Western a été utilisée pour examiner les niveaux de protéine. Dans les modèles animaux de cancer gastrique, DcR3, ERK1 et ERK2 ont été détectés à 921 pb, 300 pb et 400 pb, respectivement. Dans ces tissus tumoraux DcR3 ARNm a été détecté au jour six, a atteint un pic le jour 10, et est resté détecté le jour 12. DcR3 a également été détectée à partir du jour de six à 12 jours dans le foie, alors qu'il n'a été détecté que le jour 12 dans le cœur et les poumons ( La figure 4a). les expressions ERK1 /2 d'ARNm ont été détectés au jour quatre dans les tissus tumoraux, et l'ARNm de ERK1 atteint son maximum le jour 10 (figure 4a et tableau 7) .Tableau 6 Poids de la tumeur chez BGC823 souris nude (x ± s, n = 6)
Groupe
Δ poids /mg
2 d
4d 6d

8d
10 d
12 d
normal
- -
-
- -
- Modèle
0. 47 ± 0. 17 △
0. 77 ± 0. 28 △
1. 01 ± 0. 39 △
1. 43 ± 0. 79 △
1. 65 ± 0. 68 △
1. 46 ± 0. 66 △
Note: △ P
< 0,01 vs
normale; ** P
< 0,01 par rapport au modèle.
Tableau 7 Expression de DcR3 et de ERK1 /2 ARNm dans les tissus tumoraux de modèles animaux analysés par RT-PCR

2d

4d

6d

8d

10d

12d

DcR3
—
—
+
+
++
++
ERK1
—
+
+
+
++
++
ERK2
—
+
+
+
+
+
Figure 4 L'expression de DcR3 et de ERK1 /2 dans les modèles de souris analysées par RT-PCR (figure 4a) et Western blot (figure 4b). a: Lane M, marqueur d'ADN; lanes1-6, coeur, le foie, la rate, les poumons, les reins et les tissus tumoraux de modèles de souris sur le quatrième jour; lanes7-12, qui le huitième jour; lanes13-18, le douzième jour; ERK1 ARNm a été positive dans lane2,8,9,12,14,15,18, ERK2 ARNm a été positive dans lane1,2,6,9,10,12,13,14,15,17,18. ARNm DcR3 a été détectée dans lane8, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. b: voie 1, coeur; lane2, le foie; lane3, de la rate; Lane4, du poumon; lane5, les reins; , des tissus tumoraux lane6; L'expression de la protéine ERK1 accrue dans les tissus tumoraux que le temps passait, dans le cœur, le foie et le rein a persisté pendant 12 jours, l'expression de ERK2 a pu être détectée dans la rate et de la tumeur à partir du deuxième jour, ce qui est positif dans les tissus tumoraux jusqu'à ce que le quatrième jour et tous les cinq organes au douzième jour. L'expression de la protéine DcR3 a été positive dans les tissus tumoraux et le foie sur le sixième jour et dans la rate, le dixième jour, ce qui était négatif dans le cœur, les poumons, les reins jusqu'au douzième jour.
Protéine DcR3 a été détectée sur six jours dans la tumeur les tissus et le foie, et l'expression sont restés jusqu'au jour 12. protéine DcR3 a été détectée au jour 10 dans la rate et le jour 12 dans le cœur, les reins et les poumons. protéine ERK1 a été détectée sur quatre jours dans les tissus tumoraux, et a continué d'augmenter chaque jour. protéine ERK1 est resté à un niveau stable dans le cœur, le foie et les reins, mais elle a diminué dans les poumons et la rate au jour 10, après avoir atteint le sommet. ERK2 a été détectée sur deux jours dans les tissus de la rate et de la tumeur. De quatre jours, la protéine ERK2 a été détectée dans les six échantillons, et a continué d'augmenter jusqu'au jour 12. Ces résultats suggèrent que ERK1 et ERK2 pourraient avoir des effets différents sur la présence de la tumeur, le développement et l'expansion clonale.
Expression DcR3 a diminué après l'inhibition de la l'expression ou la phosphorylation de ERK1 /2 dans les cellules BGC823
Pour étudier l'effet de l'expression 2 ERK1 /et de la phosphorylation sur l'expression de DcR3, BGC823 cellules ont été traitées avec des ERK1 /2 shRNA ou avec des inhibiteurs qui régulent spécifiquement la voie ERK. L'analyse Western blot a confirmé que les inhibiteurs de la phosphorylation efficacement bloqué des molécules de la voie MEK /ERK, et que le shRNA réduit de manière significative l'expression de ERK1 /2 (figure 5). Comme on le voit sur la figure 5A, lorsque BGC823 cellules ont été traitées avec des ERK1 /2 shRNA, ERK1 /2 et P-ERK1 /2 niveaux ont diminué par rapport au groupe témoin. Figure 5 L'expression de ERK1 /2 et P-ERK1 /2 dans la lignée cellulaire BGC823 interférence avec le plasmide et l'inhibiteur détecté par transfert Western. a: Les niveaux de ERK1 /2 et P-ERK1 /2 expression ont diminué par rapport au groupe témoin. 1) groupe de contrôle; 2) 5: 2 (plasmide: réactif); 3) 6: 2 (plasmide: réactif). b: ERK1 /2 phosphorylation a progressivement diminué les concentrations de l'U0126 inhibiteur, PD98059 a augmenté, mais totale ERK1 /2 expression de la protéine à peine changé. 1) 0 umol /L; 2) 5 umol /L; 3) 10 pmoles /L; 4) 20 umol /L; 5) 40 pmol /L. c: ERK1 /2 phosphorylation a progressivement diminué les concentrations de l'inhibiteur APDC. 1) 0 umol /L; 2) 10 pmoles /L; 3) 20 pmoles /L; 4) 40 umol /L; 5) 80 pmol /L. d: PD98059 peut évidemment empêcher le niveau de phosphorylation de MEK1 /2, mais il n'a pas modifier les niveaux d'expression MEK1 /2 ou NF-kB. 1) 0 umol /L; 2) 5 umol /L; 3) 10 pmoles /L; 4) 20 umol /L; 5) 40 pmol /L.
U0126 est un inhibiteur de MEK très efficace, ce qui entraîne l'inhibition de la phosphorylation de ERK, comme le fait le PD98059. La phosphorylation de ERK a progressivement diminué les concentrations de médicaments ont augmenté, bien que l'expression totale ERK1 /2 de la protéine n'a pratiquement pas changé (figure 5B).
APDC peut inhiber l'activation des cellules de NF-kB dans une variété de cellules. Par la dégradation de IkB, CDAP peut diminuer la translocation de NF-kB, empêchant ainsi l'activation du NF-kB. Comme on le voit sur la figure 5 C, sous différentes concentrations de CDAP, en changeant le degré d'inhibition du NF-kB peut atténuer significativement ERK1 /2 niveaux de phosphorylation. Cependant, le mécanisme spécifique nécessite une enquête plus approfondie.
Pour examiner l'effet de ces inhibiteurs et shRNA sur l'expression DcR3, nous avons utilisé l'analyse ELISA, qui ont démontré que sécrétée DcR3 dans le surnageant a diminué après les différents traitements (figure 6). L'analyse statistique a montré que les niveaux de sécrétion DcR3 étaient significativement différents entre les groupes expérimentaux et des groupes témoins (P
< 0,05). Comme on le voit sur la figure 6, l'interférence avec ERK1 /2 dans les cellules BGC823 conduit à une diminution expression de la protéine DcR3 par rapport au groupe témoin. La tendance correspond au niveau d'expression de ERK dans la figure 5 et prouve que les deux sont corrélées positivement. En outre, les niveaux d'expression de DcR3 et P-ERK a diminué lorsque les cellules ont été traitées avec différentes concentrations de U0126, PD98059 et CDAP. Ces données indiquent que la sécrétion de DcR3 corrélation positive avec P-ERK1 /2 des niveaux d'expression dans les cellules gastriques BGC823. Il est intéressant de noter que dans le groupe U0126, les niveaux de sécrétion de DcR3 a augmenté lorsque la concentration de médicament a atteint 40 umol /L; cependant, le mécanisme spécifique nécessite une enquête plus approfondie. Dans le groupe APDC, les niveaux DcR3 n'a pas changé de manière significative à des concentrations supérieures à 20 pmol /L. Figure 6 L'expression de la protéine DcR3 avec l'interférence de plasmide et de l'inhibiteur par l'analyse ELISA. a: les niveaux d'expression de DcR3 dans BGC823 la culture surnageante a diminué lorsque les cellules ont été traitées avec interférence ERK1 plasmide. b: les niveaux d'expression de DcR3 a diminué lorsque les cellules ont été traitées avec une interférence ERK2 plasmide. c: les niveaux d'expression DcR3 a diminué lorsque les cellules ont été traitées avec différentes concentrations de U0126, PD98059 et APDC umol /L

Discussion Il a été démontré que le gène DcR3 est exprimé à un niveau bas dans l'embryon humain, du poumon. cerveau, le foie, la rate, l'estomac, du côlon, les ganglions lymphatiques et la moelle épinière, alors qu'il a été exprimé à un niveau élevé dans les cancers tels que le cancer gastro-intestinal, le carcinome hépatocellulaire et le cancer du pancréas [1, 12].
Wu et al.
[8] ont rapporté que l'expression de DcR3 chez les patients atteints de cancer gastrique était significativement plus élevé que la normale. expression DcR3 dans le cancer de l'estomac bien différencié était significativement plus faible que celui des spécimens différenciés mal (P
< 0,05).
Le niveau d'expression DcR3 était significativement associée à la métastase ganglionnaire et le stade pathologique, mais ne sont pas corrélés avec la taille de la tumeur, l'état métastatique, le ou les types histologiques. Lorsque les patients ont été suivis pendant 63 mois, DcR3 surexpression a été trouvé à être associée à un taux significativement raccourci de survie [13, 14].
De nombreux rapports ont montré que les niveaux de ERK1 d'expression élevés /2 en étroite corrélation avec du sein, colorectal et le cancer du pancréas, ainsi que d'un mélanome malin, la leucémie et le myxome [15-18]. le plus Nos recherches ont montré que chez les patients atteints d'un cancer gastrique, l'incidence positive de DcR3 et de ERK1 /2 ARNm était plus élevée que dans le non- tissus cancéreux (P < 0,05). RT-PCR et transfert de Western a montré que les taux d'ARNm et l'expression de la protéine de DcR3 et de ERK1 /2 dans les tissus tumoraux étaient significativement plus élevés que dans les tissus non cancéreux, ce qui suggère que DcR3 et de ERK1 /2 niveaux en corrélation avec le développement de la tumeur, mais pas avec l'âge , le sexe ou la différenciation (P
> 0,05). le plus Nos résultats ont montré que l'incidence positive de l'expression de DcR3 et de ERK1 /2 et l'ARNm DcR3 et ERK1 /2 protéines adaptée à l'autre. Les résultats d'immunohistochimie ont également démontré que dans les tumeurs gastriques, ERK1 /2 a été fortement exprimé.
Chen et al.
[19] a rapporté que le taux positif d'expression DcR3 était de 74,4% (32/43) dans le carcinome hépatocellulaire, et qu'il y avait une corrélation significative entre l'expression DcR3 et les métastases ainsi que la récurrence et la différenciation.
dans le modèle gastrique de la souris, la RT-PCR a montré que l'ARNm DcR3 peut être détectée dans les tumeurs de six jours. ERK1 /2 ARNm et la protéine ont également été détectés dans les tumeurs et les niveaux de ERK1 progressivement augmenté dans les tumeurs gastriques. En outre, ils ont également été détectés dans le cœur, le foie, la rate, les poumons et les reins du modèle animal de cancer de l'estomac, ce qui suggère qu'ils ont un rôle important dans la progression tumorale. ERK1 /2 L'ARNm a été détectée à partir de quatre jours dans les tissus tumoraux, et a atteint un pic de ERK1 ARNm au jour 10. protéine ERK1 pourrait aussi être détecté sur quatre jours dans les tissus tumoraux, et a continué à augmenter chaque jour. ERK1 est resté à un niveau stable dans le cœur, le foie et les reins, mais elle a diminué dans les poumons et la rate au jour 10, après avoir atteint le sommet. ERK2 a été détectée sur deux jours dans les tissus de la rate et de la tumeur. Dès le premier jour quatre, ERK2 a été détectée dans l'ensemble des six tissus, et a continué à augmenter jusqu'à ce jour 12. ERK2 n'a pas pu être détectée dans le cœur, le poumon et la rate par RT-PCR au jour 12 chez des modèles animaux, mais les taux de protéine n'a pu être détectée. Ces résultats suggèrent que ERK1 et ERK2 pourraient avoir des effets différents sur la présence de la tumeur, le développement et l'expansion clonale. De nombreuses études ont indiqué que l'expression de l'ARNm de 2 ERK1 /et de la protéine varie en fonction des tumeurs et des cellules [20, 21]. Des rapports récents ont suggéré qu'ils pourraient être tout à fait contraire dans certains cas. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

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