PLoS ONE: Reg IV je izravna Target crijevnih transkripcijskog čimbenika CdX2 u želučanom Cancer

Sažetak pregled

REG4 pregled, koji kodira Reg IV proteina, član je lektin kalcija ovisna nadobitelj i snažan aktivator receptora epidermalnog faktora rasta /Akt /aktivator protein-1 signalnog puta. Nekoliko ljudskih raka ekspresiju Reg IV, a Reg IV ekspresija je povezana s crijevnom fenotipa diferencijacije. Međutim, regulacija REG4 pregled transkripcija ostaje nejasno. U ovom istraživanju, istraživali smo da li CdX2 regulira Reg IV izraz u raka želuca (GC) stanica. Izraz Reg IV i CdX2 analiziran je Western blot i kvantitativne reverzne lančanom reakcijom polimeraze transkripcijom u 9 staničnim linijama GC i 2 kolona staničnim linijama raka. Funkcija 5-bočnoj regiji REG4 pregled gena bila je obilježena Luciferaze u. U 9 ​​staničnim linijama GC, endogeni Reg IV i CdX2 izraz dobro su povezane. Pomoću estrogen receptor-reguliranu oblik CdX2, brza indukcija Reg IV ekspresije zabilježeno je HT-29 stanica. Analize gena Reporter otkrio važnu ulogu u transkripciji za konsenzus CdX2 DNA elemenata u 5-bočnoj regiji REG4
gena obvezujuće. Kromatina imunoprecipitacijski testovi su pokazali da CdX2 veže direktno na regiju REG4 Netlogu 5'-bok. Ovi rezultati upućuju na to da protein CdX2 izravno regulira Reg IV ekspresiju pregled

Izvor. Naito Y, Oue N, Hinoi T, Sakamoto N, Sentani K, Ohdan H, et al. (2012) Reg IV je izravna Target crijevnih transkripcijskog čimbenika CdX2 u rak želuca. PLoS ONE 7 (11): e47545. doi: 10,1371 /journal.pone.0047545 pregled

Urednik: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Sjedinjene Američke Države Netlogu

Primljeno: 24. svibnja 2012; Prihvaćeno: 12. rujna 2012; Objavljeno: 2. studenoga 2012 pregled

Copyright: © 2012 Naito et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo bio podržan od Grants-in-potpore za istraživanje iz Ministarstva obrazovanja, kulture, znanosti, sporta i tehnologije Japana, te, djelomično, o potpori-u-Aid za treći sveobuhvatnoj 10-godišnje strategije za kontrolu raka a za istraživanje raka iz Ministarstva zdravstva, rada i socijalne skrbi Japana, a za Nacionalni institut za biomedicinsku inovacije (program za promicanje temeljnih studije u Health Sciences). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca (GC) je jedna od najčešćih oblika raka kod ljudi u svijetu. Rak se razvija kao rezultat više genetskih i epigenetičkim promjene [1]. Mi smo ranije provedena serijski analizu ekspresije gena (kadulja) od četiri primarne GCS i identificirali nekoliko gena GC-specifične [2]. Od tih gena, regeneraciju član obitelji otočić-izvedeni 4
( REG4 pregled, koji kodira Reg IV protein) je gen kandidat za rak specifičnih izraza [3]. REG4 pregled je član Reg pregled gena obitelji, koja spada u lektina superfamilije kalcija ovisna. REG4 pregled izvorno identificirani 'high-throughput analizi sekvence velikog upalne bolesti crijeva cDNA biblioteke [4]. Reg IV je snažan aktivator receptora epidermalnog čimbenika rasta (EGFR) /Akt /aktivator protein-1 (AP-1) signalnog puta u stanicama karcinoma debelog crijeva te povećava ekspresiju Bcl-2, Bcl-XL i survivina što su proteini povezana s inhibicijom apoptoze [5]. Pojačanje REG4 pregled gen je prijavljen u rakom gušterače [6]. Reg IV je identificiran kao jednog od gena koji reguliraju prema gore u stanicama raka pokretanje [7]. Mi smo ranije ispitan učinak prisilnog izražavanja Reg IV u GC stanicama. Pokazali smo da Reg IV inhibira 5-fluorouracil (5-FU) koji inducira apoptozu preko aktivacije EGFR u GC stanicama [8]. Nasuprot tome, Reg IV hipereksprimiraju stanice nisu pokazale značajne razlike u proliferaciji i invazijom djelovanje u usporedbi sa stanicama koje su transfektirane s praznim vektorom [8]. Ovi rezultati podupiru ideju da Reg IV protein sudjeluje u želučanoj karcinogeneze pregled

GC može se podijeliti u četiri fenotipova u skladu s mucin izrazom:. Želuca ili foveolar fenotipa; crijevna fenotip; crijevne i želučane mješoviti fenotip; a ni želuca, niti crijevna fenotip [9]. Čini se da je povezan s želuca i crijeva fenotipa GC [10] različite genetske promjene. U našim prethodnim opažanjima, Reg IV izražena je u 30% slučajeva GC i bio je u korelaciji s crijevnom fenotipom [11]. Niz imunohistokemijska analiza Reg IV su zabilježeni u humanim karcinomima [11] - [20]. Općenito, ove analize je izvijestio da Reg IV je izražen u adenokarcinoma stanice koje pokazuju crijevne fenotip. On je izvijestio da Reg IV ekspresija je inducirana GLI1, što je ključni faktor transkripcije na Hedgehog signalnog puta [21], ili čimbenicima rasta kao što su EGF, transformirajući čimbenik rasta-a (TGF-a), faktor rasta hepatocita (HGF), i bazični faktor rasta fibroblasta (bFGF) [22]. Međutim, ove molekule su vjerojatno da će račun za povezanost između Reg IV izražavanja i crijevne fenotipa diferencijacije. Pregled

Mi smo ranije otkrili da je ekspresija Reg IV povezana sa CdX2 izraza [11]. CdX2 je repna vezane crijevna faktor sisavaca transkripcija i važna za održavanje epitelnim stanicama crijeva [23], [24]. Nekoliko linija dokaza ukazuju da intestinalne metaplazije želuca i probavnom fenotipa GC su povezane s ekspresijom CdX2 ektopične [9], [25]. U ovom istraživanju, istraživali smo da li CdX2 regulira Reg IV izraz u GC i utvrdili da CdX2 direktno veže na 5-bočnoj regiji REG4
gena i pojačava aktivnost promotora. Pregled

Rezultati

Reg IV i CdX2 Expression korelirane u GC stanicama pregled

prvi ispitivanih indukciju Reg IV izražavanja CdX2 u staničnim linijama GC. Western blot analiza CdX2 u 9 GC staničnim linijama pokazala da niti jedan ili niske razina ekspresije CdX2 je otkriven u MKN-7, TMK-1 HSC-44PE i KATO-III (Sl. 1). Odrediti da li CdX2 i Reg IV ekspresiju dobro su povezana u GC stanicama, Western blot i kvantitativnom reverznom transkripcijom lančanom reakcijom polimeraze (PCR QRT-) analiza Reg IV provedena su na stanicama 9 GC. Kao što je prikazano na slici. 1A, Reg IV ekspresija proteina je otkriven samo u 3 staničnim linijama s visokom razinom REG4
transkripata mjerene QRT-PCR. Od stanične linije 5 GC s izrazom CdX2 proteina, 2 stanične linije (MKN-1 i MKN-28) nedostajalo mjerljivu izražavanje REG4
transkripata i proteina. Stanična linije sa ekspresijom undetectable CdX2 proteina (MKN-7 TMK-1 HSC-44PE i KATO-III) nije pokazala REG4
transkripta ili proteina (Sl. 1). Pregled

Nadalje, generira se poliklonski populaciju MKN-7 TMK-1 HSC-44PE i KATO-III stanice koje ekspresiraju visoke razine CdX2 inficiranjem stanica s replikacija-defektnim retrovirusom koji nose pune duljine humanog CdX2 cDNA jer nema ili izraz niske razine CdX2 otkrivena je u tim staničnim linijama. Međutim, pojačanom ekspresijom CdX2 nije aktivirati Reg IV izražavaju Western blota (podaci nisu prikazani). Zato je moguće da CdX2 sama nije dovoljna za aktiviranje Reg IV izraz, izraz CDH17 pregled (kodiranje LI-kadherina protein), koji je jedan od ciljeva CdX2 [24], bio je također istražen. Međutim, aktivacija ekspresije LI-kadherina nije pronađen u MKN-7, TMK-1, HSC-44PE i KATO III-stanice koje eksprimiraju visoke razine CdX2 (podaci nisu prikazani). Budući da smo pokazali aktivacije ekspresije LI-kadherina od CdX2 na HT-29 raka debelog crijeva, stanične linije [24], indukcija Reg IV ekspresije istraživana je u istoj staničnoj liniji. Kao što je prikazano na slici. 1B, indukcija Reg IV ekspresije je otkriven u HT-29 stanicama koje su zaražene retrovirusa nose pune duljine humanog CdX2 cDNA. Također smo generirali poliklonalnog populaciju SW480 (rak kolona stanične linije) koje eksprimiraju visoke razine CdX2 inficiranjem stanica s replikacija-defektnim retrovirusom koji nose pune duljine humanog CdX2 cDNA. Kao što je prikazano na slici. 1B, indukcija Reg IV ekspresije je pronađena u stanicama inficiranim SW480 retrovirusa nose pune duljine humanog CdX2 cDNA. Ovi rezultati sugeriraju da Reg IV ekspresija može inducirati CdX2 u staničnim linijama izvedenim iz karcinoma debelog crijeva. Budući da u intestinalne metaplazije od želuca, CdX2 i Reg IV izražavanja dobro koreliraju [11], upotreba raka stanične linije raka debelog može biti pogodna za modelu intestinalne metaplazije. Pregled

Da bi se bolje procijeniti odnos između CdX2 i Reg IV izraz, proučavali smo Reg IV izraz u HT-29-izvedene sukladno čvrsto reguliran CdX2 aktivnosti. Koristili smo poliklonalnog HT-29 staničnu liniju koja je bila transduced s pCDX2-ER vektora. PCDX2-ER vektor kodira kimerni protein u kojem su sekvence CdX2 pune dužine spojeni uzvodno od mutiranog receptora estrogena (ER) vezne domene liganda. Mutirani ER ligand-vezujuća domena više ne veže estrogen, no zadržava sposobnost vezanja tamoksifen. Liječenje /CdX2-ER stanične linije-29 HT sa 4-hidroksitamoksifen (4-OHT) rezultirala je snažnim indukcije Reg IV ekspresije proteina u roku od 48 sata (Sl. 1 C). Ovi rezultati pokazuju da Reg IV je izravni ili primarni cilj gen reguliran CdX2. Međutim, CdX2 sama nije dovoljna za aktiviranje Reg IV izraz. Pregled

Inhibicija CdX2 strane RNA interferencije (RNAi) Rezultati u Down-regulacija Reg IV u GC stanicama pregled

Kako bi se utvrdilo je li CdX2 je potrebno za Reg IV ekspresiju u GC stanicama, analizirali smo učinak da inhibiraju ekspresiju CdX2 od RNAi u razini Reg IV ekspresije u HSC-39 stanične linije, jer visoka endogeni CdX2 i Reg IV ekspresija je otkriven u HSC-39 stanične linije. CdX2 specifične male interferirajuće RNA (siRNA) značajno suprimira CdX2 ekspresija proteina 3 dana nakon transfekcije, a ekspresija Reg IV transkripta je podregulirao oko 50% po CdX2 iRNK na HSC-39 u usporedbi s razinama u kontrolnim stanicama siRNA tretiranih ( Sl. 1D). Ovi rezultati pokazuju da CdX2 sudjeluje u održavanju ekspresiju gena Reg IV. Pregled

Funkcionalni Karakterizacija 5'-bočnoj regiji REG4 pregled Gene by analizu luciferaze Netlogu

Kako prepoznati potencijalnog CdX2 -vezujući mjesta u repnu REG4 pregled promotorska regija, potraga genomskih sekvenci odmah 5 'vjerojatne početka transkripcije je izvedena pomoću konsenzusa elementa obvezujući za CdxA piletine
homologa (5'-a, a /T, T, a /T, a, T, a /G-3 '), [26], a prethodno opisani algoritam za pretraživanje [27]. Pronašli smo četiri pretpostavljena CdX2-veznih mjesta u dvije kilobazna (KB) 5'-bočnoj regiji REG4 pregled gena (sl. 2a). To su bili: stranica A (5'-AATAATA-3 ', od -1828 do -1834), stranica B (5'-CTTTACAG-3', od -901 do -908), stranica C (5'-TTTTATGG-3 ', od -114 do -121), web-D (5'AATAATA -3', od -90 do -96). Za procjenu uloge tih vjerojatnih CdX2 vežu mjestima u reguliranju REG4 pregled transkripcija, ostvarila su razni reporter gena konstrukti. Kao što je prikazano na slici. 2B, konstrukti reporter gena koji sadrže 2.1, 1.2 ili 0.6 kb 5-bočnoj sekvence iz REG4 pregled gena pokazala snažne aktivnosti u HSC-39 stanica, u kojima se prikazuje snažnu endogeni izražavanje REG4
transkripata i proteina. Za usporedbu, MKN-1 stanice imaju malo endogenog REG4
prijepis i prikazuje malo ili nimalo transkripcijska aktivnost uzrokovanu 2.1, 1.2 ili 0.6 kb REG4 pregled reporter gena konstrukti (podaci nisu prikazani) , REG4 pregled reporter gena konstrukti koji sadrže parova baza -116 do +58 i -87 do +58 je smanjena aktivnost u HSC-39 stanica (Slika 2b.), Što pokazuje da sekvence između parova baza -634 i - 116 igraju ključnu ulogu u aktiviranju REG4
transkripciju. Nadalje, analizirali smo sa jednim i više mutacija u vjerojatnih CdX2 vežu web stranice u 5-bočnoj regiji REG4
gena uporabom HSC-39 stanice (Sl. 2c) u. Kao što se očekivalo, sumnjivih CdX2 vezanja C, koji se nalazi između parova baza -634 i -116, igra ključnu ulogu u aktiviranju REG4 pregled transkripcija. Pregled

CdX2 Izravno se veže na 5 ' -flanking regiji REG4 pregled Gene pregled

kako analizirati da li CdX2 direktno veže sa pretpostavljenim CdX2 vežu mjesta u REG4 pregled 5-bočnoj regiji, proveli smo kromatina imuno (chip) testovi pomoću HSC-39 stanice. Korištenje 6 primera za REG4 pregled 5-bočnoj regiji (sl. 3a), oporavio se DNA fragmenata koji sadrže REG4 pregled 5-bočnoj regiji od primera 1, koja obuhvaća postavljanje vjerojatne CDX2- vezanja C (Sl. 3B). DNA fragmenti iz regije REG4 pregled, koje su stvorene pomoću klica 2, 3, 4, 5 i 6, tako da oni nisu sadrže vjerojatne CdX2 vezna mjesta, nisu oporavila od strane anti-5'-bok CdX2 antitijela. Specifičnost oporavka REG4 pregled promotorska regija sljedeće čip s anti-CdX2 antitijela pokazala je i činjenica da su drugi nebitno DNA fragmenti nedostaje CdX2-veznih mjesta (npr eksona 3 CDX1
gen) nisu oporavili (Sl. 3B). Osim toga, lažna imunotaloženje (IgG-om) dala je nekoliko REG4 pregled ili CDX1 pregled specifičnih DNA fragmenti (Sl. 3B). Svi ovi rezultati ukazuju na to da CdX2 aktivira REG4
transkripciju izravno vežu na sekvence u 5-bočnoj regiji gena. Pregled

Trimethylation histona H3 Lizin 27 (H3K27me3) na REG4 pregled Promotor u GC staničnim linijama pregled

Iako je pronađen izraz CdX2 proteina u MKN-1 i MKN-28 stanične linije, te 2 stanične linije nisu imali mjerljivu izražavanje REG4 pregled transkripta i proteina. Jer je izvijestio da DNA Hipermetilacija CpG otočića je povezan s prigušenje različitih gena [28], da ispita da li DNA metilacije inducirana transkripcijsku inaktivaciju Reg IV u MKN-1 i MKN-28 stanica. pomiješa se te stanice sa sredstvom demethylating, 5-aza 2'-deoksicitidin-(aza-dC), a zatim se vrši QRT-PCR. Međutim, Reg IV izraz nije vraćena u tim staničnim linijama (podaci nisu prikazani), što ukazuje da je DNA metilacije nije vjerojatno da će utjecati na Reg IV izraz. Također je izvijestio da H3K27me3 je povezana s potisnute ekspresiju gena [29]. Mi dodatno istražiti H3K27me3 u GC staničnim linijama. Da bi se odredio obogaćivanje H3K27me3 na REG4 pregled promotor u staničnim linijama GC, čip analize su izvršene. U MKN-1 i MKN-28 stanične linije, razine H3K27me3 na REG4 pregled promotorska regija bili su visoki, dok je u HSC-39 stanične linije, H3K27me3 razini na REG4 pregled promotorska regija bila je niska (Sl. 3C). Ovi rezultati ukazuju na to da zatvoreni kromatina struktura REG4 pregled, promotor može spriječiti Reg IV ekspresija CdX2. Pregled

Rasprava pregled

Iako je izvijestio da je Reg IV ekspresija izazvana je GLI1 [21] ili EGF [22], te molekule su vjerojatno da će račun za povezanost između Reg IV i crijevne diferencijacije. U ovom istraživanju, pokazali smo da endogeni CdX2 i Reg IV izraz su dobro usklađene u GC staničnim linijama. Osim toga, koristeći obrazac ER reguliran od CdX2, otkrili smo da je brza indukcija Reg IV izražavanja nakon 4-OHT liječenja. Analize gena Reporter otkrio važnu ulogu za konsenzus CdX2 DNA elemente u REG4
promotorske regije obvezujuća u transkripcije. Naknadne Chip testovi su pokazali da CdX2 veže direktno na REG4 pregled promotora. Mi smo ranije pokazali da je u osnovnoj GC tkiva i intestinalne metaplazije od želuca, CdX2 i Reg IV izraza su dobro korelira [11]. Ovi rezultati upućuju na to da protein CdX2 izravno regulira Reg IV ekspresiju u GC i crijevnu metaplazije želuca. Pregled

CdX2 ekspresija mu je povećana u crijevnom fenotipa GC i u crijevnom metaplazije želuca [9], [25]. Nasuprot tome, gubitak CdX2 ekspresije opažena u podskupu primarnim kolorektalnim karcinomima, obično u slabo diferencirani kolorektalnog raka [30]. Značaj promjene izražavanja CdX2 u ljudskim karcinoma ostaje nejasno, i stoga je važno definirati ciljne gene koji su nizvodno od CdX2. Identificirali smo nekoliko CdX2 regulirano gena poput CDH17 pregled (koji kodira Li-kadherin) [24], HEPH pregled (koji kodira hephaestin) [31], ABCB1
(koji kodira rezistenciju 1) [32], i DSC2 pregled (koji kodira desmocollin 2) [33]. Među tim genima, ABCB1 pregled izvorno je identificirana kao ekstracelularne i pojačan gena u više stanica otpornih na lijekove, a njegov proizvod, P-glikoprotein, čini se da igra ključnu ulogu u otpornosti na lijekove [34]. Ranije smo izvijestili da prisilni ekspresija Reg IV u GC stanicama inhibirana 5-FU-induciranu apoptozu izazivanjem Bcl-2 i dihidropirimidm [8] dehidrogenaze. Uzeti zajedno, moguće je da se u crijevnom fenotipa GC, izraz (ili ekspresija ektopičnog) od CdX2 inducira Reg IV i višestruka rezistencija 1 ekspresiju, što rezultira povećanjem otpornosti na lijek. U stvari, to je izvijestio da je postoperativna kemoterapija nije korisno za pacijente s crijevna fenotipa GC [35].

Iako su naši podaci podržavaju mišljenje da CdX2 igra ulogu u regulaciji REG4
transkripcije putem vezanja na promotorske regije, nekoliko rezultati pokazuju da CdX2 sama nije dovoljna za aktiviranje REG4 pregled izraz. U ovom istraživanju, generira se poliklonski populaciju MKN-7, TMK-1 HSC-44PE i KATO III-stanice koje eksprimiraju visoke razine CdX2 infekcijom s retrovirusom koji nose pune duljine humanog CdX2 cDNA. Međutim, pojačanom ekspresijom CdX2 nije uspio aktivirati Reg IV izraz. U staničnim linijama GC, nitko od stanične linije s nemjerljivom izražavanja CdX2 proteina imala je detektabilne REG4
transkripata i proteina. Dakle, CdX2 je potreban za Reg IV izražavanja, ali CdX2 sama nije dovoljna za aktiviranje Reg IV izraz. U ovom istraživanju, devet GC stanične linije su proučavali. Korijeni staničnim linijama bili su kako slijedi. MKN-7, MKN-28, a MKN-74 stanične linije uspostavljene su od crijevnih tipa GC. U TMK-1 i MKN-45 stanične linije uspostavljene su iz difuznog tipa GC. U Kato-III, HSC-39, a HSC-44PE stanične linije uspostavljene su od karcinoma pečatnjak stanica prsten. Stanična linija MKN-1 je osnovan od karcinoma adenosarkom, adenoskvamozni stanica. Budući da u intestinalne metaplazije u želucu, CdX2 i Reg izraz IV su dobro povezane, GC stanične linije uspostavljene od difuznog tipa GC ili karcinom stanica pečatnjak svibanj ne biti pogodna za analizu Reg IV indukcije CdX2. U stvari, Reg IV ekspresija može inducirati CdX2 u staničnim linijama izvedenim iz karcinoma debelog crijeva u ovom istraživanju. Nadalje, pokazali smo da H3K27me3 etaže na REG4 pregled promotorske regije bile visoke u staničnim linijama MKN-1 i MKN-28 GC. Ova 2 stanične linije nisu imali mjerljivu izražavanje je pronađen REG4 pregled iako izražavanja CdX2 proteina. Dakle, H3K27me3 etaže na REG4 pregled promotorska regija može biti visoka u MKN-7, TMK-1, HSC-44PE i KATO-III stanice, u kojima pojačanom ekspresijom CdX2 nije uspio aktivirati Reg IV izraz.

On je izvijestio da je em <> REG4 pregled mRNA je pojačana stimulacija s TGF-α, EGF, HGF, ili bFGF putem aktivacije protein kinaze mitogenima aktivirana (MAPK) stazi [22] , Dakle, moglo bi se pretpostavili da je Reg IV je također regulirano nizvodno transkripcijskih faktora MAPK putanja. Izvršili smo u silico pregled analize REG4 pregled gena 5-bočnoj regiji, a nađeni barem jedan vjerojatne AP-1 sljedove (na -883 baznih parova REG4
gena 5-bočnoj regiji), koji je nizvodno faktor transkripcije MAPK signalizacije. U ovom istraživanju, HSC-39 stanice pokazuju sličnu transkripcijsku aktivnost gena konstrukata reporter koji sadrže 1,2 kb i 0,6 kb REG4 pregled 5'-bok slijed. Kao učinak EGF ili TGF-a na REG4 pregled transkripcija nije ispitan je u ovom istraživanju su potrebna daljnja istraživanja kako bi se pojasnile signalne mehanizme koji induciraju regulaciju REG4 pregled transkripcije.

U zaključku, naši sadašnji podaci pokazuju da CdX2 proteina izravno regulira Reg IV izraz. Reg IV aktivira EGFR /Akt /AP-1 signalnog puta. Kao intestinalni fenotip GC često izražava EGFR [36], predlaže se da se ovaj Reg IV aktivirani put ima važnu ulogu u ovom podtip GC. Zato CdX2 također inducira ekspresiju gena za rezistenciju na mnoge lijekove, ABCB1 pregled, anti-EGFR terapija, ali ne i kemoterapija može biti korisno za pacijente s intestinalne fenotipa GC. Pregled

Materijali i metode pregled

Plazmidi pregled

CdX2 cDNA je umetnut u multiplo klonirano mjesto retrovirusnog vektora ekspresije PPG-CMV-navode-neo kao što je prethodno opisano [24]. Pune duljine, divljeg tipa CdX2 cDNA također je subklonirana u retrovirusni vektor pBabe-Puro ER kao što je prethodno opisano za stvaranje pCDX2-ER [24]. PCDX2-ER vektor kodira kimerni protein u kojem su sekvence CdX2 pune dužine spojeni uzvodno od mutiranog ER domena vezivanja liganda. Mutirani ER ligand-vezujuća domena više ne veže estrogen, no zadržava sposobnost vezanja tamoksifen. Genomske DNA sekvencije iz 5-bočnoj regiji humanog REG4 pregled gen se pojačati pomoću PCR korištenjem genomske DNA pročišćava iz HSC-39 stanica kao predloška i subkloniran u pGL4.10 [luc2] vektor (Promega , Madison, WI). pristupi PCR-based se koristi za uvođenje mutacija u vjerojatnih CdX2 veže na mjestima u konstruktu pGL4.10-REG4 reporter gena pomoću QuikChange ciljanom mutagenezom Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Četiri pretpostavljenih CdX2 vežu stranice su se promijenila. Svi fragmente nastale PCR potvrđene su automatizirani sekvenciranje. Plazmid pGL4.74 [hRluc /TK] vektor (Promega) je korišten kao kontrola za učinkovitost transfekcije reporterskih testovima. Pregled

staničnim linijama, retrovirus infekcije i Drug Treatment pregled

amfotropno Phoenix stanična linija dao je G. Nolan (Stanford University, Stanford, CA) [37]. Korištene su devet stanične linije izvedene iz humanog GC i 2 staničnih linija izvedenih iz humanog raka debelog crijeva. Stanična linija TMK-1 je osnovan u našem laboratoriju [38]. Stanične linije HSC-39 i HSC-44PE su osnovana od strane jednog od autora (Kazuyoshi Yanagihara) [39], [40]. Pet GC linija stanica MKN serije su ljubazno daje dr Toshimitsu Suzuki [41], [42]. Stanična linija KATO-III ljubazno je ustupio dr Morimasa Sekiguchi [43]. U raka debelog crijeva stanične linije HT-29 i SW480 dobiveni su od American Type Culture Collection. Stanice su pohranjene u tekućem dušiku sve do početka studije. Nakon otapanja iz smrznute otopine, stanice su držane na niskim prolaz tijekom studije. Dosljedno morfologija stanica praćeno je usporedbom mikroskopske slike. Stanice Phoenix pakiranje su transfektirane sa retrovirusom ekspresijska (PPG-CdX2, PPG-neo i pCDX2-ER) i supernatant koji sadrži nonreplicating amfotropnog virus je sakupljeni kao što je opisano [24]. Na HT-29 stanice eksprimiraju CdX2-ER fuzijskog proteina (HT-29 /CdX2-ER), funkcija CdX2 aktivirana dodavanjem 4-hidroksitamoksifen (4-OHT) (Sigma Chemical, St. Louis, MO) na rast medij u konačnoj koncentraciji od 500 nmol. Istražiti da li DNA metilacije inducirana transkripcijsku inaktivaciju Reg IV, stanice su tretirane s konačnom koncentracijom od 1 uM aza-DC (Sigma Chemical) tijekom 5 dana prije nego se prikupe za RNA ekstrakciju. Pregled

Western blot analiza

Za Western blot test, stanice su lizirane, kako je prethodno opisano [44]. Koncentracije proteina određene su Bradford proteinskog testa (BioRad, Richmond, CA) s BSA korišten kao standard. Lizati (20 ug) je otopljeno u Laemmlijevom puferu za uzorke kuhanjem i podvrgnut 12% SDS-poliakrilamid gel elektroforeze, nakon čega elektroterapije prijenosa na nitroceluloznom filteru. Filter se inkubira 1 sat na sobnoj temperaturi sa anti-Reg IV protutijela (zečjim poliklonskim protutijelom razvijen u našem laboratoriju, Ref. 10) ili anti-CdX2 protutijela (BioGenex, San Ramon, CA). Peroksidaza-konjugiranog anti-zečja ili anti-mišji IgG je korišten u sekundarne reakcije. Imunokompleksa su vizualizirani s Plus Western blot sustava ECL detekcije (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). β-aktin (Sigma Chemical), također je detektirano kao kontrola za punjenje. pregled

QRT-PCR analiza pregled

Ukupna RNA se ekstrahira sa Rneasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) i 1 ug ukupne RNA se prevodi u cDNA s prvom Strand cDNA Synthesis Kit (Amersham Biosciences). Kvantifikacija REG4 pregled razine mRNA je provedena u realnom vremenu fluorescentnom detekcijom kako je ranije [45] što je opisano. PCR je proveden s SYBR Green PCR Temeljni Reagensi Kit (tnom City, CA). detekcija u realnom vremenu intenziteta emisije SYBR Green vezana za dvostruke uzvojnice DNA se izvodi s ABI PRISM 7900 za detekciju sekvenci (Applied Biosystems) kako je prethodno opisano [46]. ACTB pregled specifična PCR produkti su pojačani sa istim uzorcima RNA i služila je kao interna kontrola. Sekvence prajmera za REG4 pregled QRT-PCR su prikazani u Tablici 1. QRT-PCR su izvedene u tri uzorka za svaki vodeći skup, a srednja vrijednost i standardna devijacija (SD) za tri pokusa je izračunata kao relativna vrijednost kvantifikacija. Krajem 40 PCR ciklusa, reakcijski produkti su razdvojeni elektroforezom na 8% za denaturaciju poliakrilamidnom gelovi za vizualnu potvrdu PCR produkata. Pregled

RNAi pregled

Za obaranje endogene CdX2, RNAi je izvršena , Dva siRNA duplekse CdX2 ciljanje (5'-AACCAGGACGAAAGACAAAUA-3 ', CdX2 siRNA1 i 5'-AAGCCUCAGUGUCUGGCUCUG-3', CdX2 siRNA2) i nonsilencing siRNA dupleks (5'-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3 ') su sintetizirani (Qiagen). Transfekcija je provedena pomoću Lipofektamin RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA), sukladno protokolu proizvođača. Ukratko, 60 pmol siRNA i 10 ul Lipofectamina RNAiMAX su miješani u 1 ml RPMI mediju (10 nmol /L koncentracija konačna siRNA). Nakon 20 minuta inkubacije, smjesa se doda stanicama i one su stavljene na posudama za svaki test. Tri dana nakon transfekcije, stanice su analizirani su za sve eksperimente. Pregled

Reporterskog Gena Testovi

HSC-39 i MKN-1 stanice su posađene na ploče sa 6 jažica (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ ). Transformacija stanice na 50% -80% konfluentnosti izveden je s 3 ul FuGene6 transfekcijski reagens (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), 0.8 ug pGL4.10 reporter gena konstrukta, i 0.2 ug pGL4.74 [hRluc /TK] vektor (Promega). 48 sati nakon transfekcije, stanice su sakupljene i ponovno suspendirane u pufera za pasivnu razgradnju (Promega). Aktivnost luciferaze određuje s dvojnom Luciferaze sustava (GloMax 96 Microplate luminometru, Promega). Pregled

Chip Testovi

čip Ispitivanja su provedena pomoću EZ-chip kromatina imunoprecipitaciju Kit (Millipore, billerica , MA) po uputama proizvođača. Za analizu je li CdX2 direktno veže sa pretpostavljenim CdX2 vežu lokacija u REG4 pregled 5-bočnoj regiji, proveli smo čip analize pomoću HSC-39 stanice. Ukratko, HSC-39 stanice (1-2 × 10 ^{7) su međusobno povezani s 1% formaldehida u fosfatnoj puferiranoj fiziološkoj otopini (PBS) tijekom 15 minuta na 37 ° C, i glicin se doda da ugasi reagiraju aldehidi. Nakon ispiranja stanica s hladnim PBS-om, stanice su resuspendirane u SDS puferu za lizu (1% SDS, 10 mM EDTA i 50 mM Tris pH 8,1) sa proteinazom Inhibitor (Roche Diagnostics). Nakon što su obrađena ultrazvukom uzorci, kromatina ekstrakti koji sadrže fragmente DNA (prosječna veličina, 500 parova baza) se imunoistaloži pomoću 2 ug monoklonsko anti-CdX2 antitijela (BioGenex) ili 2 J..lg IgG-a (Millipore). Svaki imunoprecipitiran DNA uzorak je kvantificirana qPCR korištenjem primera navedenih u Tablici 1. Kao negativna kontrola, približno 200 parova baza fragment DNA od eksona 3. CDX1 pregled gen je pojačan pomoću PCR korištenjem specifičnih primera (Tablica 1 ). pregled}

Da bi se odredio obogaćivanje H3K27me3 na REG4 pregled promotor u staničnim linijama GC, čip ispitivanja izvedena su pomoću MKN-1, MKN-28, te HSC-39 stanične linije. Ukratko, GC stanicama (1-2 × 10 ^{7) su međusobno povezani sa 1% -tnim formaldehidom u PBS-u tijekom 15 minuta na 37 ° C, i glicin se doda da ugasi reagiraju aldehidi. Nakon ispiranja stanica s hladnim PBS, stanice su resuspendirane u SDS puferu za lizu s proteinazom Inhibitor (Roche Diagnostics). Nakon su sonificirane uzoraka kromatina ekstrakti koji sadrže fragmente DNA (prosječna veličina, 500 parova baza) je imunoprecipitiran pomoću 2 ug poliklonalni anti-H3K27me3 antitijela (Abcam, Cambridge, MA) ili 2 ug zečji IgG (Millipore). Svaki imunoprecipitiran DNA uzorak je kvantificirana pomoću qPCR REG4 pregled Primer 1 (Tablica 1). Pregled}

qPCRs su izvedeni u triplikatu za svaki uzorak vodeći skup, a srednja vrijednost i standardna devijacija (SD) za tri eksperimenata je izračunata kao relativna vrijednost kvantifikacije. Krajem 40 PCR ciklusa, reakcijski produkti su razdvojeni elektroforezom na 8% za denaturaciju poliakrilamidnom gelovi za vizualnu potvrdu PCR produkata. Pregled

Izvori pregled

Zahvaljujemo g Shinichi Norimura za izvrsnu tehničku pomoć i savjet. Ovaj rad je provedeno s ljubaznim suradnji istraživačkog centra za molekularnu medicinu Medicinskog fakulteta Sveučilišta Hiroshima. Zahvaljujemo Analiza Center of Life Science, Hirošima Sveučilište za korištenje njihovih sadržaja. Pregled