PLoS ONE: Resveratrol inhibira rast raka želuca by Izazivanje G1 faza boravišta i starenje u Manner

Sažetak

Resveratrol SIRT1-ovisan, javljaju u prirodi polifenolnih spojeva, objavljeno je da izvrši antikancerogeno djelovanje koje utječu raznolike ciljane molekule. U ovom istraživanju ispitali smo učinke i temeljne mehanizme resveratrola na karcinoma želuca. otkrili smo da resveratrol inhibiraju proliferaciju stanica raka želuca na način ovisan o dozi. U koncentraciji od 25 i 50 uM, resveratrol inhibira staničnu vijabilnost i umanjilo klonogenskog potencijal želuca stanica raka. Resveratrol tretman uhićen želučanog stanice raka u G1 fazi i dovelo do starenja umjesto apoptoze. Regulatori staničnog ciklusa i starenje puteva, uključujući ciklina D1, ciklinski ovisna kinaza (CDK4 i 6), p21 i p16, su po dereguliran resveratrol liječenja. Inhibicijski učinci na resveratrola karcinoma želuca i potvrđeni su in vivo pregled uporabom golih miševa modelu ksenografta. Resveratrol (40 mg /kg /d) djeluje inhibitorne aktivnosti na razvoj raka želuca i značajno je smanjila frakcija Ki67-pozitivnih stanica u tumorskim uzorcima iz miševa. Nakon resveratrol tretmana, indukcija starenje i promjene u ekspresiji regulatora koji su uključeni u stanični ciklus i starenje putevi bili su slični onome što smo opazili in vitro pregled. Međutim, iscrpljivanje Sirtuin (Sirta) 1 obrnuta gore opisani učinci resveratrola i In vitro pregled i in vivo pregled. Naši podaci pokazuju da resveratrol inhibira rak želuca u SIRT1 ovisan način i pružiti detaljne dokaze za mogućnost primjene resveratrol u želučanom prevenciji raka i terapiji pregled

Izvor:. Yang Q, Wang B, Zang W, Wang X Liu Z, Li W, et al. (2013) Resveratrol inhibira rast raka želuca pomoću poticanja G1 faza Uhićenje i Starenje u SIRT1 ovisan način. PLoS ONE 8 (11): e70627. doi: 10,1371 /journal.pone.0070627 pregled

Urednik: Dominique Heymann, Faculté de Medecine de Nantes, Francuska pregled

Primljeno: 20. ožujka 2013. godine; Prihvaćeno: 19. lipanj 2013; Objavljeno: 21 studeni 2013 pregled

Copyright: © 2013 Yang i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo je podržan od strane Nacionalne zaklade prirodoslovni Kine (br 81101869, 81100103, 81171536 i 81000868), Nacionalni Osnovni istraživački program Kina (973 programa, br 2012CB911202) i Nezavisni Foundation inovacije Sveučilišta Shandong (2012TS108) .The donatori imali nikakvu ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

u konkurenciji interese.. autori su izjavili da nema suprotstavljenih interesa postoji

Uvod

rak želuca (GC) je četvrti najčešći karcinom i drugi vodeći uzrok smrtnosti od raka se odnose na svijetu. Prema globalnoj procjeni, ukupno 989,600 novih GC slučajeva dijagnosticira i minimalno 738,000 pacijenata umrlo od ove bolesti u 2008. godini, što čini 10% ukupnih smrtnih slučajeva od raka [1]. Iako je incidencija GC je globalno u opadanju, i dalje je visoka u zemljama u razvoju, posebice u Kini [1], [2]. Prethodne studije su pokazale intimni odnos između kroničnog gastritisa uzrokovanog Helicobacter pylori pregled infekcije i razvoj GC [3]. Nadalje, domaćini genetski, okoliša, prehrambenim i drugi faktori su uključeni u želučanoj onkogene postupku [1]. Kao što je uvijek teško napraviti ranu dijagnozu za GC, većina pacijenata se dijagnosticira u naprednim stadijima. Unatoč poboljšanju konvencionalne terapije za napredno GC, uključujući operacije, kemoterapije i radioterapije, duljine ili kvalitete života bolesnika s uznapredovalim GC je i dalje loša [2], [4]. Stoga je hitno potrebno istraživanje novih preventivnih lijekova ili terapijskih ciljeva GC. Pregled

Potrošnja svježeg voća i povrća pridonosi smanjenom incidencijom karcinoma, uključujući GC [2], [5]. Kliničke primjene također pokazuju da neke bioaktivne dijetetski molekule imaju sposobnost inhibicije više onkogene koraka [5] - [7]. Resveratrol (Res, 3,5,4'-trihydroxystilbene) je prirodni polifenolni spoj prisutan u gotovo 70 biljnih vrsta, uključujući i kožu crnog grožđa, kikiriki, bobičasto voće i drugima [6] - [8]. Res je prvi izvijestio da izvrši protiv tumora aktivnosti u 1997. godini. [8] Kasnija izvješća su pokazala da Res daje inhibitorni učinak na nekoliko tipova karcinoma, kao što su rak debelog crijeva, rak dojke i limfoma, a utječe na različite molekularne ciljeve [9] - [11]. Sirtuin 1 (SIRT1), klasa III nikotinamid adenin nukleotid (NAD ^{+) - ovisna histona /proteina deacetilaze, je izvijestila da se ključni cilj Res u nekoliko tumorskih modela [9], [10]. Međutim, neki podaci pokazuju suprotno rezultate koji su pokazali da je Res vrši kemoprotektivnog učinke neovisne o SIRT1 [11]. Inhibitorni učinci obnovljivih izvora energije na GC i temeljni mehanizam nije dovoljno istražena. Pregled}

U ovom istraživanju, pokazali smo da Res inhibiraju proliferaciju GC stanicama in vitro pregled. Res liječenje izazvanog staničnog ciklusa u fazi G1 i dovelo do staničnog starenja. Ovi učinci Res se vratio po iscrpljivanja SIRT1. Inhibitorni SIRT1 ovisne aktivnosti Res na GC stanice su također potvrdili in vivo pregled. Uzeti zajedno, naši rezultati pokazuju da Res ispoljava SIRT1 ovisan inhibitorni učinak na GC i predlaže terapeutsku ulogu OIE u GC. Pregled

materijali i postupci

Izjava Etika pregled

Sve studije na životinjama su odobreni od strane etičkog povjerenstva Shandong University School of medicine (br 001 u 2011. godini za životinje etiku odobrenje), a donesene su svi napori kako bi se smanjili patnju. pregled

staničnim linijama, Kultura uvjeti i Res Liječenje

Ljudski GC stanične linije AGS (dobivene iz stanica Resource Center, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology na kineske akademije znanosti), BGC-823 i SGC-7901 (kupljen od China Centra za Type Culture Collection, Wuhan, Kina) su bili korišteni u ovom istraživanju. Stanice su kultivirane u F12 (AGS) ili 1640 (BGC-823 i SGC-7901) koji je sadržavao 10% FCS, 100 jedinica /ml penicilina i 2 mmol /L L-glutamina u 37 ° C u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5% CO _{2. Visoke čistoće Res je kupljen od tvrtke Sigma (St. Louis, MO, USA), otopljen u DMSO i dodan u medij kulture u naznačenoj koncentraciji. Svi pokusi su provedeni 24 sata nakon Res nosa, osim ako nije drukčije naznačeno. Pregled}

Mali Smetnje RNA TRANSFICIRANJE pregled

Kemijski modificirani mala ometanja RNA (siRNA) Ciljanje SIRT1 i kontrolu siRNA su kupljeni od GenePharma (Shanghai Kina). Sekvenca SIRT1 siRNA bio je 5'-CCAUCUCUCUGUCACAAAUTT-3 '. Stanice se inkubiraju preko noći i potom transfektirane s siRNA pomoću Lipofectamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) prema protokolu proizvođača. Četrdeset osam sati nakon siRNA transfekcije, stanice su tretirane s 50 uM Res 24 sata prije daljnje studije. Pregled

vijabilnost stanica u testu pregled

Proliferacija je procijenjena pomoću staničnog titra 96 ​​® vodena otopina proliferacije stanica (Promega, Madison, WI, USA). Ukratko, 2 × 10 ^{3 stanice su posađene na ploču s 96 jažica i ostavljeni da rastu kroz 24 h. Dvadeset i četiri sata kasnije, 20 ul MTS (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-karboksi-metoksi-fenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazolij) je dodan u svaku dobro. Nakon inkubacije tijekom 3 sata na 37 ° C, apsorbancija pri 490 nm je sniman na Varioskan Flash višestrukih Reader (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Sposobnost stanica za život je izračunata pomoću slijedeće formule: održivost relativna stanica = (prosječna apsorbancija tretirane skupine - prosječna apsorbancija blank) /(prosječne apsorbancije kontrole razini grupe prosječne apsorbancije od prazan). Testovi su izvedeni u tri primjerka i ponovljena su tri puta. Pregled}

Colony Formacija Ispitivanje

Stanice su nasađene u ploče sa 6 jažica (300 ili 500 stanica po jamici) i inkubirane u trajanju od 10 dana, dok kolonije nisu dovoljno velik da se jasno razabrati. Stanice su fiksirane s metanolom, te oboji kristal violetom, a broj kolonija sa više od 50 stanica je izbrojan ručno. Eksperimenti su provedeni u triplikatu i ponovljena su tri puta. Pregled

Cell Cycle Analiza pregled

Stanice su uzete, fiksirane s prethodno ohlađenom 70% etanolu pri 4 ° C preko noći, a zatim bojaju s propidij jodidom (Beyotime , Jiangsu, Kina) sadrži RNA-ze A na 37 ° C tijekom 30 min u mraku. Distribucija staničnog ciklusa je određena primjenom protočnom citometru (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), a podaci su analizirani s Multicycle softvera (Phoenix sustava protoka, San Diego, CA, USA). Eksperimenti su provedeni neovisno tri puta. Pregled

Test apoptoze pregled

detekciju i kvantifikaciju apoptoze su izvedene u označavanju lanaca prekide DNA in situ Cell Death Detection Kit, TMR bijeli (Roche Applied Science, Basel, Švicarska). Stanice ili parafinskim rezovima ksenografta označene su tunel u skladu s uputama proizvođača. Za stanice, liječenje s 0,2 mM H _{2O 2 za 12 h služio kao pozitivna kontrola. Za parafinskim rezovima, pozitivne kontrole su kupljeni od Millipore (Billerica, MA, USA). Jezgre su prebrojane s DAPI (Beyotime) i dijapozitive ili sekcije su snimljena sa fluorescentnim mikroskopom (Olympus, Tokyo, Japan) uporabom cellSens dimenzija softver. Eksperimenti su provedeni neovisno tri puta. Pregled}

β-galaktozidaza bojenje pregled

Starenje procijenjen je starenje P -galaktozidaze kompleta za bojanje (Beyotime). Ukratko, stanice ili zamrznute sekcije ksenografta su fiksirane i zatim inkubirane sa svježe pripravljenim P-galaktozidaza (β-gal) bojenje otopinu na 37 ° C preko noći. Eksperimenti su provedeni neovisno tri puta. Pregled

Stabilni lentivirusni kratko ukosnica RNA (shRNA) GC Stanice pregled

lentivirusni vektor koji sadrži kontrolu ili SIRT1 shRNA su izgrađene od GenePharma i upotrijebiti za promjenu BGC-823 stanice. Učinkovito obaranje SIRT1 je potvrđena western blot. Za stabilnu prijenosa, upravljačke lentivirus-om ili SIRT1 shRNA-lentivirus-om BGC-823 stanice su kultivirane u kompletnom mediju isporučenom s 2 ug /ml puromicina za četiri tjedna, a smatra LV-C i LV-S.

golim miševima modelu ksenografta pregled

Ženski bez štitnjače BALB /c miševe (6~8 tjedana) kupljeni su od Sveučilišta u Pekingu (Beijing, Kina) te su održavani pod specifičnim uvjetima bez patogena na ključ Laboratorij za kardiovaskularne pregradnja i funkcije istraživanja, Qilu bolnici, Shandong University. Miševi su nasumično podijeljeni u četiri skupine (8 miševa za svaku skupinu): skupina I i II, BGC-823 stanice (1 × 10 ^{6 stanica po injekciju u 0.1 ml PBS) supkutano su injicirane u područje slabina od golih miševa; skupina III, LV-C (BGC-823 stanica) se injicira; i skupina IV, LV-S (BGC-823 stanica) injektira se. Nakon implantacije, miševe iz grupe II, III i IV su tretirani s Res (40 mg kg -1 u 0.1 ml biljnom ulju, dan sondom, jednom dnevno). Potkožno veličina tumora je mjerena pomoću kalipera, a volumeni tumora su izračunati pomoću formule (duljina) x (širina 2) /2. Miševi su žrtvovani četiri tjedna kasnije. Tumori su sakupljene i obrađene za Western blot i imunokemijskih studije. Pregled}

Real Time-kvantitativni PCR (RT-qPCR) pregled

Ukupna RNA u stanicama izoliranim pomoću Trizol reagensa (Invitrogen) i prevede u cDNA pomoću PrimeScript ™ RT seta (Takara, Tokyo, Japan). RT-qPCR izvođeno gena, uključujući ciklina D1, ciklinski ovisna kinaza 4 (cdk4), p21 i p-aktin kao što je opisano [12]. Sekvence primer amplifikacije su dani u Tabeli S1. Ekspresija mRNA ciklina D1, CDK4 i p21 normalizira se p-aktin u odnosu na kontrolu uz korištenje 2 ^{-ΔΔCt metodom. Svaki eksperiment je ponovljen tri puta. Pregled}

Western blot pregled

Ukupni proteini iz stanice ili tumorskih uzoraka ekstrahirana s RIPA ližu Buffer (Beyotime), kao što je opisano u [12]. Koncentracija proteina je određena pomoću BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL, SAD). Membrana je ispitana s antitijelima protiv SIRT1 (Abcam, Cambridge, MA, USA), bcl-2, Bax, kaspaze-3, ciklina D1, CDK4 i 6 (stanične signalizacije, Danvers, MA, USA), p16 i p21 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Sekundarna protutijela upotrijebljen je peroksidaza iz hrena (HRP), koje je konjugirano anti-kunić ili mišjeg protutijela. Proteinske vrpce su vizualizirani pomoću sustava ECL (Pierce). β-aktin (Cell Signaling) poslužio je kao kontrola za punjenje. pregled

Imunohistokemija pregled

uzorci tumora iz golih miševa su deparafmizirani, rehidratirano i antigen preuzeti. Sekcije su inkubirane s protutijelom Ki67 (1:500, Abcam) preko noći na 4 ° C. HRP-konjugirani anti-zec IgG i DAB bojanje je zaposlen vizualizirati Ki67 antitijela. Rezovi su konačno negativno hematoksilinom. Rezovi se oslikavaju Olympus svjetlosnim mikroskopom (Tokyo, Japan) uporabom cellSens dimenzija softver. Na Ki67-pozitivne stanice su prebrojane ručno i postotak Ki67 pozitivnih stanica ispitana po poljima. Pet zasebna polja su izbrojani za svaki dio. Pregled

Statistička analiza pregled

Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD. Statističke analize provedene su pomoću statističkog paketa za društvene znanosti (SPSS, verzija 16,0, Chicago, IL, SAD) od strane jednog ANOVA s Tukey post-hoc testom. P-vrijednosti manje od 0,05 smatrane su statistički značajnima. Pregled

Rezultati

Res Koči održivost GC stanicama u SIRT1 ovisan način Netlogu

Tri GC stanične linije (AGS, BGC-823 i SGC-7901) su ispitani u našim eksperimentima. Kultiviranjem stanica u nosaču (0,1% DMSO) nije utjecala vijabilnost stanica (podaci nisu prikazani). Međutim, kada se tretiraju sa različitim koncentracijama Res 24 h, stanična proliferacija je ovisno o dozi zaustavlja na 25, 50, 100 i 200 uM Res (Slika 1A). Napomenuti, proliferacija AGS očito je inhibirana pri obradi s 10 uM Res, što nije primjećeno kod druge dvije stanične linije (Slika 1A). U sve tri stanične linije, prisutnost 100 uM Res bila je dovoljna za indukciju je više od 50% inhibicije rasta (56.78% za AGS, 54.87% za BGC-823 i 52.16% za sGC 7901, respektivno). Stoga, 25 i 50 uM Res su korišteni za daljnje eksperimente. Da bi se odredio funkcionalnu ulogu SIRT1 u Res liječenja, ispao mi se SIRT1 izraz upotrebljava određeni siRNA. Učinkovita Inhibicija SIRT1 ekspresije je potvrđena pomoću Western blota (Slika 1B). Rezultati analize su pokazali da se u MTS SIRT1 osiromašene stanice, Res ne inhibira proliferaciju stanica (slika 1C). Ovi podaci ukazuju na to da Res može inhibirati proliferaciju GC stanicama i da je inhibicijski učinak može se spasio SIRT1 osiromašeni. Pregled

Res smanjuje klonogenskog potencijal GC stanicama na način SIRT1 ovisan pregled

tumorskih stanica, stvaranje kolonija je utvrđeno da je osjetljivija od parametar vijabilnosti za procjenu učinka lijeka. Dakle, onda su poduzeti napori kako bi se odredio učinak Res na klonogene potencijal GC stanicama. Res, u koncentraciji od 25 uM, dovela do značajnog smanjenja u broju žarišta kao veličina u GC stanicama. Nakon tretmana s 50 um Res je klonogenskog potencijal smanjena dalje. Međutim, obaranje SIRT1 prije Res liječenja povećao broj žarišta na razinu usporedivu sa grupom koja je (slika 2). Pregled

Res potiče akumulaciju GC stanica u G1 fazi u SIRT1 ovisna o načinu pregled

Da bi ispitali inhibitorni učinak Res na GC stanicama, proveli smo analizu staničnog ciklusa. Ustanovljeno je da se 25 do 50 uM Res povećao udio stanica u fazi G1 i u BGC-823 i SGC-7901 stanica (Slike 3A i 3B). Indukcija G1 faze zastoja do Res bio je ovisan o dozi. Res u koncentraciji od 50 uM pokazao jači učinak nego što je na 25 pM. Povećanje broja stanica u G1 fazi bilo je popraćeno smanjenjem stanične populacije uglavnom u S fazi. Iscrpljivanje SIRT1 prije Res liječenje smanjilo G1 faza indukcije Res (slike 3a i 3b). Za dokaz ove rezultate, ispitali smo ekspresiju staničnog ciklusa regulatori u fazi G1, uključujući i ciklina D1, CDK4, CDK6, p21 i p16 u BGC-823 stanicama. Kao što je prikazano na slici 3C, na Res tretiranih BGC-823 stanice, razina proteina u aktivatora G1 /S tranziciju (ciklin D1, CDK4 i CDK6) smanjen, dok se razina proteina inhibitora CDK (CDKIs) (p21 i P16) povećana. S druge strane, ove promjene nisu pronađene u SIRT1 osiromašene BGC-823 stanicama kad su tretirani s 50 um Res. Slični rezultati dobiveni su s RT-qPCR ciklina D1, CDK4 i p21 (slika 3d). Pregled

Nedostatak sub-G1 stanicama pokazali su da tretman nije Res pokreću apoptozu u GC stanicama (Slika 3A) , što je u skladu s rezultatima pokusa Tunel označavanju iz BGC-823 stanicama (Slika S1A). Razine proteina molekula apoptozno-povezan, kao što je bcl-2, Bax i kaspaze-3, iz svake skupine bio je usporediv (Slika S1B). Uzeti zajedno, naši rezultati ukazuju da Res inducira G1 faze zastoj u GC stanicama u SIRT1 ovisan način i ne inducira apoptozu. Pregled

Res inducira Starenje GC stanica u SIRT1 ovisan način pregled

u našim rukama, Res rezultira zaustavljanjem rasta, a ne povećane apoptoze. Dakle, napravili smo dodatne napore za istraživanje li Res će pomoći starenje u GC stanicama. B-Gal bojenje, specifični marker za starih stanica sisavaca, je korišten. Nakon Res tretmana, našli smo povećali frakcije stanica su obojene s P-Gal. Međutim, predtretman SIRT1 siRNA blokiran Res-induciranu staničnu starenje (Slika 4). Slični rezultati dobiveni su s obje BGC-823 i SGC-7901 stanice, što upućuje Res ovisne o SIRT1 inducirati staničnu starenje u GC stanicama. Pregled

Res inhibira rast tumora in vivo u SIRT1 način ovisan o

Nakon toga, dodatne studije su provedena kako bi se utvrdilo učinke Res na rast BGC-823 ksenografta u golih miševa. Za in vivo
studiji su korišteni stabilne transducirane lentivirusni-shRNA BGC-823 stanice. Od četiri SIRT1 shRNA-lentivirusima, LV-1 i LV-4 vrši očite utišavanje učinke na SIRT1 izražavanja (Slika S2). Nakon četiri tjedna probira, izraz SIRT1 se drži na manje vrijednosti u stabilnim lentivirusni-shRNA BGC-823 stanicama (Slika S2). Stabilni LV-1-lentivirusni shRNA BGC-823 stanice su korišteni u naknadnim ispitivanjima ksenografta, jer je jači inhibitorski učinak na ekspresiju SIRT1 odnosu na LV-4. Sve su životinje preživjele na kraj pokusima, niti očigledan nađena razlika u tjelesnoj težini (podaci nisu prikazani). Četiri tjedna nakon implantacije, mjerenja volumena tumora ukazuje da Res tretman značajno smanjuje rast BGC-823 ksenografta (Res vs kontrola: 0.5728 ± 0,2276 cm ^{3 vs 1.4288 ± 0,1741 cm 3, P < 0.001) , Stabilan prijenosu kontrolnog shRNA-lentivirus nije značajno utječu na volumen tumora (Res vs Res + CI: 0.5728 ± 0,2276 cm 3 vs 0,68 ± 0,0672 cm 3, P = 0,603). Međutim, u SIRT1 osiromašene ksenografta, inhibitorne učinke Res na rast tumora su spašeni (Res + Si vs Res + CI: 1.2313 ± 0,1777 cm 3 vs 0,68 ± 0,0672 cm 3, P < 0,001, Res + Si vs kontrola: 1.2313 ± 0,1777 cm 3 vs 1,4288 ± 0,1741 cm 3, P = 0,123) (slika 5A). U tretiranim Res-ksenografta na, proliferacija marker, Ki67 značajno smanjen (slika 5B) (% od Ki67-pozitivne stanice, Res vs kontrola: 3 ± 1,8 vs 44.67 ± 3.79, P < 0.001). Starenje je zabilježena u ksenografta tretiranih Res-miševa naznačeno β-Gal bojanja (slika 5B). Međutim, ne postoji jasan apoptoza inducirana je Res u stranih tijela (Slika S1D), a nije došlo do promjene u regulatori apoptoze, kao što je bcl-2, Bax i kaspaze-3 (Slika S1C). Ovi rezultati su u skladu s in vitro
eksperimentima. Osim toga, promjene u ekspresiji regulatori staničnog ciklusa, uključujući ciklina D1, CDK4, CDK6, p21 i p16 bili su slični onome što smo opazili In vitro pregled (Slika 5C). Sve promjene koje su uočene u Ki67, P-Gal i regulatora staničnog ciklusa su poništena od strane SIRT1 iscrpljivanja (Slikama 5B i C) (% od Ki67-pozitivne stanice, Res + Si vs Res + CI: 46,32 ± 6,03 vs 2,65 ± 1,53, p < 0,001, Res + Si vs kontrolu: 46,32 ± 6,03 vs 44.67 ± 3.79, p = 0,946) pregled}

Rasprava pregled

Res, prirodni polifenola, trenutno se ocjenjuje kao obećavajući antikancerogeno. agent. Iako je dokazano da daju antiproliferativni učinak protiv nekoliko vrsta raka, kako u kulturi stanica i modelima sa [9] - [11], njegovi kcmoprcvcnciju učinci na GC i temeljni mehanizam nisu dobro istražena. U ovom istraživanju, pokazali smo da Res inhibiraju proliferaciju GC staničnih linija (AGS, BGC-823 i SGC-7901). Aktivnost protiv rasta opažena nakon stanice su tretirane s 25 uM Res 24 h, te je inhibicijski učinak bio je ovisan o dozi. U koncentraciji od 50 uM Res, omjeri inhibicije za ove tri stanične linije bile su 41%, 34% i 32%, pojedinačno. Kada je koncentracija Res dalje povećati, jačaju Inhibicijski učinci. Na 100 i 200 uM Res potiskivao rast za više od 50% u usporedbi s grupom koja je. Osim toga, to je veća doza Res je prevelika da bi se postigla in vivo pregled i tako nema smisla u kliničkoj praksi [13], [14]. Prema tome, dvije donje učinkovite koncentracije od 25 do 50 um Res se koristi u kasnijim studijama. Aktivnost inhibicije rasta Res čini se stanično specifičan, kao IC50 razlikuje se ovisno o tipu stanice te varira od 27 uM do 180 uM [9], [10], [15], [16]. Neke od ovih istraživanja su također pokazala da Res pokazuje inhibitorske učinke na vremenski ovisan način [15], [16]. Koncentracija i trajanje Res tretman koji se koristi u našem istraživanju bili su u skladu s većinom izvještaja iz ostalih skupina [8], [9], [16]. Za in vivo
studija, načinu davanja smo koristili je kljukanje jer je to metoda koja se obično koristi u miševa, kao alternativa za intraperitonealne injekcije [15], [17]. Osim toga, istraživanja na miševima su pokazala da Res se učinkovito apsorbira nakon oralne primjene i može se naći u cijelom tijelu [17], [18]. Kada se koristi in vivo pregled, Res značajno smanjila proliferacije stanica kao što karakterizira Ki67 izražavanja, što je u skladu s rezultatima naših in vitro
eksperimentima.

Res mogu usporiti širenje stanica raka kroz različite mehanizme, među kojima je, regulacija staničnog ciklusa je važan jedan [9], [15], [19]. Naš In vitro pregled podaci pokazuju da je liječenje GC stanica s Res izaziva G1 faze uhićenja. G1 faza je prvi od četiri faze staničnog ciklusa koji se odvija u podjeli eukariotskih stanica. G1 je posebno važna faza staničnog ciklusa, jer je točka u kojoj je stanica obvezuje na krugu podjele. Napredovanje kroz G1 faza zahtijeva formiranje i djelovanje ciklin D-CDK4 ili -CDK6 kompleksa. Ovi kompleksi fosforiliraju zatim retinoblastom, što dovodi do otpuštanja faktora transkripcije E2F i nizvodnog transkripcije gena koji su uključeni u S faze progresije. Aktivnosti ciklinu D-CDK kompleksa regulirani su uzvodno inhibitorima, uključujući članove INK (P15, p16 i P18) i CIP obitelji (p21, p27 i p57) [20], [21]. Uz iste linije, u društvu s G1 faze uhićenja, gledali smo na downregulation ciklin D1, CDK4 i CDK6 i povećanje ekspresije p21 i p16 u tretiranih Res-GC stanicama. Naš in vivo
rezultati razinama ekspresije ovih staničnog ciklusa regulatora u tumorskih uzoraka u skladu su s in vitro | Rezultati. Naši rezultati su u skladu s onima iz prijašnjih studija [15], iako su neki drugi izvijestili da je faza S uhićenje izazvana je Res [9], [19]. Upornost zaustavljanje rasta može dovesti do apoptoze ili starenje u stanicama. Jer obje P21 i P16 signalni put sudjeluje u starenjem napredovanje posredovano različitim vrstama stresa [22], [23], izveli smo P-gal bojenje. Res liječenje znatno povećava učestalost star GC stanicama na način ovisan o dozi. Pokretnu starenje Program predstavlja važnu barijeru za inicijaciju raka i razvoj [24], [25]. Iako su prethodne studije pokazuju da, kroz slabljenje oksidativnog stresa i poboljšanje metabolizma, Res ispoljava anti-aging učinak i In vitro pregled i In vivo pregled [26] - [28], suprotni učinci uočeni su u liječenju raka. Res je nađeno da inducira starenjem, kao što su zaustavljanje rasta u nekoliko vrsta raka [29], [30]. Dvostrukoj ulozi Res u stanični starenje, usporava starenje u normalnim tkivima i ubrzava starenje u tumorima, čini ga idealnim kandidatom za prevenciju i liječenje raka. Pregled

Apoptoza je još jedan zajednički učinak koji je obično promatrana u tretira Res- stanice raka [9], [11], [15], [16]. Eksperimentalni dokazi ukazuju da je apoptoza može se ublažiti nekoliko različitih putova i brojnih regulatornih molekula. Među tim regulatorima, proteini koji sadrže bcl-2 obitelji su važni. Tu su i antiapoptotski proteini (bcl-2, Bcl-xl) i proapoptotska proteini (Bax, loše, Bak i Bcl-XS) u ovoj obitelji. Ovo povećanje pro-apoptoze Bax /anti-apoptotičkog bcl-2 omjeru povećava propustljivost mitohondrijske membrane uzrokuje oslobađanje citokroma c iz mitohondrija u citosolu, a zauzvrat, rezultira aktivacijom caspase-9 i nizvodni ciljati kaspaze-3, [31]. Usprkos ovom unutarnjoj apoptoze, a proapoptotska liganda, poput FasL, vezanjem na njihove receptore, uzrokuju aktivaciju kaspaze-8 i silaznih efektora, poput kaspaze-3. Aktivacija efektora kaspaze uzrokuje cijepanje mnoge stanične podloge i neposredno uzrokuje apoptozu [31] - [33]. Iako brojni prethodna izvješća ukazuju da apoptoza je odgovoran za Res-inducirane inhibicije rasta, nismo promatrati očigledan apoptoze u tretiranim Res-GC stanicama. Ovaj nedostatak apoptoze može biti s obzirom na koncentraciju i trajanje Res liječenja adaptiran u našem eksperimentu, jer istraživanja iz različitih skupina pokazuju da Res ispoljava dosage- i trajanje ovisne efekte [34], [35]. Osim toga, kao učinaka Res su i stanica specifičan [36] - [38], GC stanice korištene u našem istraživanju mogu biti otporni na Res-inducirane apoptoze pregled

Res ima više ciljeva. među kojima je, na III klase NAD ^{+ - ovisi deacetilaze SIRT1 je najčešće studirao. Iako biokemijski studija pokazala da Res nije bio direktni aktivator SIRT1 [39], Res i dalje je smatran kao klasični agonista SIRT1. Brojne studije pokazuju da Res ispoljava različite učinke u različitim modelima na SIRT1 ovisan način [40], [41]. U našem eksperimentu, SIRT1-osiromašeni preinačio inhibiciju rasta Res i In vitro
i in vivo pregled. G1 fazi uhićenje i starenje izazvano Res liječenja su spasila SIRT1-osiromašeni. Ovi rezultati pokazuju da su učinci inhibicije Res na GC ovise o SIRT1. Prema ranijim istraživanjima, SIRT1 mogu regulirati ekspresiju gena kroz dva različita mehanizma. Prvo, izravno, SIRT1 direktno posreduje deacetilaciju proteina i poboljšava njezina ubikvintinacija i naknadno ubikvitina proteasomalni razgradnje [42]. Drugo, posredno, SIRT1 vrši deacetilaze utječu na potvrdu kromatina ili suzbijanja aktivnosti transkripcijskih faktora, a zatim regulira transkripciju gena [43] - [45]. Kao što je molekula (ciklin D1, CDK4, CDK6, p21 i p16) otkrivene u našim pokusima nisu prijavili kao izravni ciljeva SIRT1, nagađa se da je SIRT1 mogli regulaciju ekspresije tih gena uglavnom kroz posredno mehanizma. Rezultati RT-qPCR također podržava ovu hipotezu. Pregled}

Sve u svemu, naši rezultati ukazuju na to da Res inhibira oba proliferacija GC stanicama in vitro
i rast ksenografta in vivo pregled. Res tretman potiče G1 faze uhićenja u GC stanicama i dovodi do starenja umjesto apoptoze. SIRT1-osiromašeni spašava gore opisani učinci Res i in vitro
i in vivo pregled. Naš rad pokazuje da je Res inhibira GC u SIRT1 ovisan način i pruža detaljne dokaze za mogućnost primjene obnovljivih izvora energije u prevenciji GC i terapije. Pregled

popratne podatke
Slika S1. pregled Res ispoljava ne utječe na apoptozu BGC-823 stanicama. (A) Apoptoza je označeno TUNEL označavanja (crvena) i BGC-823 stanice su prebrojane s DAPI (plava). Tretman s H _{2O 2 je služio kao pozitivna kontrola. Izvorni povećanje: × 200. letvi 50 mm. (B) regulatora apoptoze u BGC-823 stanicama, uključujući bcl-2, Bax i kaspaze-3 su analizirani Western blot. (C) regulatora apoptoze u ksenografta, uključujući bcl-2, Bax i kaspaze-3 su analizirani Western blot. Za detekciju cijepanog kaspaze-3, BGC-823 stanice koje su tretirane s H 2O 2 je poslužio kao pozitivna kontrola (prikazano u desnom pravokutniku). (D) Apoptoza u ksenografta je otkriven TUNEL označavanje (crveno) i sekcije su prebrojane s DAPI (plava). Sekcije iz žena glodavca mliječne žlijezde dobiveni 3~5 životinjsko mladunčadi štakora (Millipore) služi kao pozitivna kontrola. Izvorni povećanje: × 200. letvi 50 mm. 'R' predstavlja resveratrol, "Ci 'predstavlja kontrolu siRNA i" Si "predstavlja SIRT1 siRNA pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0070627.s001 pregled (TIF) pregled Slika S2. pregled obaranje SIRT1 strane shRNA-lentivirus. (A) BGC-823 stanice su transficirane s kontrolnim ili SIRT1 specifičnim shRNA-lentivirusa. Učinkovitost transfekcije je bila procijenjena s fluorescentnim mikroskopom. Pri multiplicitetu infekcije (MOI) od 50, više od 90% stanica bilo transfektirano s shRNA-lentivirus. Nakon četiri tjedna screening s puromicinom, svi živih stanica su transducirani. Povećanje: × 100, bar za 200 um. (B) stanice su sakupljene 4 dana nakon infekcije i 28 dana nakon puromicinom probira. Dio za stišavanje buke učinkovitost SIRT1 je potvrđena western blot pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0070627.s002 pregled (TIF) pregled Tablica S1.
Primeri za RT-qPCR eksperimenata izvedenih u ovoj studiji pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0070627.s003 pregled (DOC) pregled}