Stomach Health > želudac Zdravlje >  > Gastric Cancer > Rak želuca

PLO ON: S100A6 Protein negativno regulira CacyBP /SIP posredovanoj inhibiciji proliferacije stanica raka želuca i tumorigenezu

Sažetak pregled

Calcyclin-vezujući protein (CacyBP /SIP), identificiran na temelju svoje sposobnosti da međusobno reagiraju s S100 proteina na način ovisan o kalciju, prethodno utvrđeno da inhibiraju proliferaciju i nastanku tumora želučanog stanice raka u našem laboratoriju. Važno je da se učinci S100 proteina na biološkom ponašanju CacyBP /SIP kod raka želuca ostaju nejasni. Ovdje smo izvješće konstrukcije eukariotske ekspresije vektora za divlji tip CacyBP /SIP i skraćeni mutanta kojem nedostaje S100 vezujući protein domenu (CacyBP /SIPΔS100). Izrazi divljeg tipa i skraćenih rekombinantnih proteina su pokazala transfekcijom MKN45 stanica raka želuca. Co-imunoprecipitacijski testovi pokazali interakciju između S100A6 i divljeg tipa CacyBP /SIP u MKN45 stanica. Uklanjanje S100 proteina vezne domene i dramatično smanjio afinitet CacyBP /SIP za S100 proteina kao što je naznačeno smanjenjem ko-imunoprecipitacijom S100A6 po CacyBP /SIPΔS100. MTT test, FACS analiza, klonogenskog testa i tumor ksenograft eksperiment provedena su za procjenu učinka CacyBP /SIP na rast stanica i tumorigenezi In vitro
i in vivo pregled. Prekomjerna ekspresija CacyBP /SIP inhibiraju proliferaciju i nastanku tumora od MKN45 stanica raka želuca; stope proliferacije i nastanku tumora su čak i dalje smanjena za izražavanjem CacyBP /SIPΔS100. Također smo pokazali da S100 proteini negativno reguliraju CacyBP /SIP posredovanu inhibiciju proliferacije stanica raka želuca, kroz učinak na ekspresiju β-katenina proteina i transkripcijska aktivacija u TCF /LEF. Iako je temeljni mehanizam djelovanja zahtijeva daljnju istragu, ova studija daje novi uvid u interakciju između S100 proteina i CacyBP /SIP, koji bi mogli obogatiti naše znanje o S100 proteina i biti korisna za naše razumijevanje razvoja raka želuca. Pregled

Izvor: Ning X, Sun S, Zhang K, Liang J, Chuai Y, Li Y, et al. (2012) Protein S100A6 negativno regulira CacyBP /SIP-posreduju da inhibicija proliferacije stanica raka želuca i tumorogenezom. PLoS ONE 7 (1): e30185. doi: 10,1371 /journal.pone.0030185 pregled

Urednik: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu, Italija pregled

Primljeno: 27. listopada 2011. godine; Prihvaćeno: 15. prosinac 2011; Objavljeno: 25 siječanj 2012 pregled

Copyright: © 2012 Ning i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ova studija bio podržan od potpora iz Nacionalne zaklade za znanost priroda Kine (br 30872964, broj 30772461). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

S100 proteini najveći su podgrupa unutar EF-ruke Ca 2 + -vezujući proteina obitelj i odlikuju se staničnoj i tkivno specifične ekspresije uzoraka. Ovi su proteini poznati regulirati unutar stanične procese poput tranzicije staničnog ciklusa i stanični rast, diferencijacija i pokretljivost [1]. Jedinstvena značajka tih proteina je da su pojedini članovi lokaliziran u specifičnim staničnim odjeljcima od kojih su neki u stanju preseliti na Ca 2 + aktivacija [2], [3]. Po izgon, ovi proteini mogu zaraziti na Ca 2+ signala u vremenskom i prostornom način u interakciji s različitim S100 ciljeve protein specifičan. Zanimljivo, većina S100 geni se nalaze u skupini gena na ljudskom kromosomu 1q21, site čestih kromosomskih abnormalnosti [4]. Ovo udruženje predlaže vezu između kromosomskih abnormalnosti i deregulacije ekspresije S100 gena u različitim tumorima. Do danas, mnogi članovi obitelji S100 su identificirani da je povezan s razvojem tumora i metastaza [5], [6]. Međutim, precizne uloge i značaja S100 proteina u razvitku i promicanju raka slabo razumio. Razumijevanje biološke funkcije (ov) S100 proteina ovisit će o identifikaciji proteinom S100 ciljeva. Do sada, nekoliko mogućih proteinskih ciljeva, uključujući gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze, aneksin II, VI, aneksin aneksin XI caldesmon i CacyBP /SIP, pokazano je u interakciji s proteinima S100 In vitro pregled u Ca 2 + ovisna način [5], [7]. pregled

Calcyclin-vezujući protein (CacyBP /SIP), 30 kDa protein identificiran na temelju njegove sposobnosti da se vežu S100A6 u Ca 2 + ovisna način na Ehrlich ascites tumora (EAT) stanice [8], ranije mislio kao otpor višestrukim lijekova (MDR) su povezane s molekulom u rak želuca u našem laboratoriju [9]. Upotrebom monoklonalnog antitijela protiv CacyBP /SIP [10], pokazali smo da prekomjerna ekspresija CacyBP /SIP inhibira proliferaciju i tumorgenesis renalnih stanica raka [11]. Daljnje istraživanje je sugerirao da CacyBP /SIP suzbija rast raka želuca [12]. Unatoč tom napretku, efekti S100 proteina na CacyBP /SIP kod raka želuca ostaju nejasni. Osim toga, CacyBP /SIP Također je pronađeno da je komponenta nekog ubikvitiranja kompleksa putem vezanja Siah1 i Skp1 [13]. A to ligaza opisao regulirati razgradnju nisu fosforilirani P-katenina [13]. Pregled

CacyBP /SIP mogao vezati S100, Siah1 i Skp1 različitim regijama. N-terminalna regija (aa 1-80) od CacyBP /SIP je pokazano da imaju afinitet za Siah1. C-terminalno područje svih CacyBP /SIP (aa178-229) poznato je da se dobije a-uzvojnicu, to područje može komunicirati sa S100 proteina, uključujući S100A6 [14]. Skp1 vezna domena ne preklapaju s S100 vezne regije i Skp1 veže do središnjeg dijela (aa78-155) od CacyBP /SIP [15], [16]. Promatrati učinke S100 proteina u biološkom ponašanju CacyBP /SIP kod raka želuca, eukariotske ekspresije vektora divljeg tipa CacyBP /SIP i njegovog krnjeg mutanta kojem nedostaje S100 vezujući protein domenu (CacyBP /SIPΔS100) uspješno su izgrađene i učinkovito izrazio u MKN45 stanicama. MTT test, FACS analiza, klonogenskog testa i tumor ksenograft eksperiment su provedena za procjenu učinaka CacyBP /SIP na rast stanica i nastanku tumora i in vitro
i in vivo pregled. Rezultati ovih istraživanja mogu pridonijeti rasvjetljavanju učinaka S100 proteina na biološkom ponašanju CacyBP /SIP u želučanih stanica raka. Pregled

Materijali i metode pregled

Stanične linije i životinje

rak želuca stanična linija MKN45, što je utvrđeno da je najniži izraz CacyBP /SIP u našem prethodnom istraživanju [12], bio je sačuvan u našem laboratoriju. Stanice su kultivirane u RPMI 1640 medij (GIBCO, Grand Island, NY, USA), uz dodatak 10% toplinski inaktiviranog fetalnog telećeg seruma, penicilin (100 U /ml) i streptomicina (100 ug /ml) u CO 2 inkubatoru (Forma Scientic, Marjetta, OH, USA). BALB /c miševe na 4-6 tjedana starosti osigurana su u Šangaju Cancer Institute za in vivo
tumorigenezi studija. Ova studija je provedena u strogo u skladu s preporukama u Vodiču za njegu i korištenje laboratorijskih životinja iz National Institutes of Health. Protokol je odobren od strane Odbora za etiku u životinjama u Vojnomedicinsku Sveučilišta Četvrte (broj dozvole: 11016). Sve operacije se izvode pod natrijev pentobarbitala anestezijom, a svaki napor je napravljen kako bi se smanjili patnju. Pregled

Imunofluorescencija bojenje pregled

Ćelije su bile stavljene na očišćenim pokrovnim i učvršćen s 95% alkohola tijekom 20 minuta na sobnoj temperatura. Stanice na pokrovnim su isprani s PBS i permeablized 10 minuta s 0,5% Triton X-100 u PBS. Stanice su inkubirane s anti-S100A6 protutijelom (razrijeđen 1:2000) nakon blokiranja s 3% albumina goveđeg seruma kroz 1 sat. Stanice su zatim inkubirane s FITC-konjugiranim anti-mišjim IgG (Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, SAD) i postavljene na stakalca s mješavinom glicerola i polivinil alkohola, koja sadrži DABCO (1,4 diazobicylo- [2,2 , 2] - oktan). Imunofluorescencija analizirana je s MRC-1024 Laser za skeniranje Konfokalna Imaging System (Bio-Rad). Pregled

plazmida izgradnja i stanična transfekcija pregled

oligonukleotidnim klicama koje sadrže Eko pregled RI ili Eco RV pregled restrikcijsko mjesto sintetizirani su, odnosno, za amplifikaciju CDS slijeda CacyBP /SIP ili C-terminalno brisanje (aa178-229) mutant CacyBP /SIP (Accession AF_314752). Dva primera su: 5 'gggaattcgaatatggcttcagaagagcta 3' (osjećaj) i 5 'gcgatatctcaaaattccgtgtctcctttg 3' (anti-sense); 5 'gggaattcgaatatggcttcagaagagcta 3' (osjećaj) i 5 'ccgatatcacacaatataagaactgta 3' (anti-sense), respektivno. PCR uvjeti su bili: 5 min pri 94 ° C tokom početne denaturacije, zatim je slijedilo 35 ciklusa 45 sekundi na 94 ° C ° C, 45 s na 60 ° C, i 60 s na 72 ° C, uz konačno proširenje pri 10 min na 72 ° C. Duljine PCR proizvoda su 687 bp za CD-ove i 534 bp za C-terminalne delecije. Svaki PCR produkt je izrezan s EcoR pregled I i EcoR
V ograničenom probavom i klonira u isto digestiran pFLAG-CMV. Novi vektori su nazvani pFLAG-CacyBP (divlji tip) i pFLAG-ΔS100 (CacyBP /SIPΔS100). Inserte sekvence su potvrđene su sekvenciranjem DNA. Pregled

Cell Transfekcija je izvedena s lipofektaminom 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) kao što je opisano od proizvođača. Ukratko, stanice su nasađene i uzgaja do 70-90% konfluence bez antibiotika. Oni su zatim transficirane sa 1 ug pFLAG-CacyBP ili pFLAG-ΔS100. 24 sata nakon transfekcije, G418 (350 mg /ml) se doda u medij kulture za izbor transfektiranih stanica. Miješani klonovi su se kroz još 6 tjedana. Stanice transfektirane s praznim vektorom, pFLAG-CMV, korišteni su kao negativne kontrole. Ove stabilne stanične linije su ime MKN45-CacyBP, MKN45-ΔS100 i MKN45-pFLAG za divlji tip, krnje i negativne kontrole transfektanata, respektivno. Pregled

Co-imunotaloženje pregled

MKN45 transfektanti su isprane u PBS, prikuplja i lizira na ledu u puferu koji sadrži 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 8 mM MgCl 2, 150 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, i 1% Nonidet P-40. Ekstrakti su centrifugirani pri 12.000 okretaja u minuti tijekom 25 minuta na 37 ° C u mikrocentrifugi. Supernatanti su korišteni za eseja imunoprecipitacije nakon dodatka inhibitora proteaze (10 mg /L leupeptina, 5 mg /L aprotinina, 20 mg /L inhibitora tripsina iz soje, 1 mM fenilmetilsulfonil fluorida) i kvantificira se Bradford metodom. Supernatanti su inkubirani s 30 ul protein A /G-Sepharose i 1 ug nepovezanih antitijela za 1-3 h na 37 ° (pred-vrijeme). Nevezane frakcije su zatim inkubirane sadrži serum antitijela CacyBP /SIP tijekom 1.5 sati na 4 ° C. Smjesa se zatim inkubira s dodatnih protein A /G-Sepharose preko noći na 4 ° C. Smola je zatim isprana tri puta u puferu koji sadrži 20 mM tris HCl (pH 7,5) i 150 mM NaCl, dva puta u puferu koji sadrži 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), i 500 mM NaCl, te na kraju u 20 mM Tris -HCl, pH 7,5. Svi puferi koji su korišteni su bili nadopunjeni s inhibitorima proteaze. Smole i vezana proteini su otopljeni u SDS pufer za uzorke, kuha se 5 minuta pri 98 ° C, te prebaci na SDS poliakrilamidnom gelu. Ekspresija S100A6 se analiziraju pomoću western blottinga s antitijelima protiv S100A6. Pregled

Western blot pregled

stanice su skupljene i lizirane na ledu u puferu koji sadrži [50 mmol /L Tris-Cl (pH 7,5), 150 mmol /L NaCl, 0,2 mmol /L EDTA, 1 mmol /L PMSF i 1% NP 40], zatim kvantificira Bradford metodom. Mjera 100 ug lizata se elektroforezi u 10% SDS-PAGE i osušene na nitroceluloznu membranu. Membrane su blokirane s 10% nemasnog mlijeka, na sobnoj temperaturi tijekom 2 h i inkubirane s anti-CacyBP (1:1500) i anti-p-aktin antitijelo (Sigma, 1:5000) pri 4 ° C preko noći. Nakon tri ispiranja za 15 minuta svaki u TBS uz dodatak 0,1% Tween 20 (TBST), membrana se inkubira s peroksidaza konjugirani kozji anti-mišji /zečji IgG protutijela (Amersham-Pharmacia Biotech, Beijing, Kina) 2 sata pri sobnoj temperatura. Hemiluminiscencija (Amersham, Freiburg, Germany) se koristi za detekciju. Pregled

metil -tiazolil tetrazolij (MTT) Test pregled

Stanice su stavljene na ploču s 96 jažica, po 2,5 × 10 3 stanica /jažici u RPMI 1640 mediju koji sadrži 10% toplinom inaktiviranog fetalnog telećeg seruma. Svaki uzorak je imao tri ponavljanja. Medij je zamijenjen na 2-dnevnim intervalima, tijekom 6 dana. Stanice su inkubirane s 50 ul 0,2% MTT 4 sata pri 37 ° C u CO s 5% 2 atmosfere. Nakon inkubacije MTT, 150 ul alikvota 100% DMSO se doda u svaku kulturu bi se rastopili kristali. Žive stanice su prebrojene svaki dan od očitavanjem apsorbancije na 490 nm, na čitaču ploča 96, BP800 (Dynex Technologies, Chantilly, VA). Pregled

staničnog ciklusa analiza pregled

Subkonfluentne stanice su isprane s ledeno hladnim PBS, suspendirane u 0.5 ml etanola i zatim se drži pri 4 ° C kroz 30 min. Suspenzija je filtrirana kroz 50 um najlonsku mrežu i sadržaj DNA obojanih jezgri analizirana s protočnom citometru (EPICS XL, Coulter, Miami, FL). Profil staničnog ciklusa je analiziran pomoću Multicycle-DNA Cell Cycle Analizirano softvera. U proliferativni indeksi (PI) izračunate su na sljedeći način:. PI = (G2 + S) /(G1 + S + G2) pregled

klonogenskog testa pregled

za mjerenje brzine širenja jedne stanice in vitro pregled, ploča klonogenskog i mekog agara klonogenskog testovi su izvedeni [17]. Za ploče klonogenskog testa, 1 × 10 3 stanice su posađene u 9 cm zdjelicama od i uzgajane u RPMI 1640 mediju za dva tjedna kako bi se omogućilo formiranje kolonija. Kolonije su fiksirane u 70% etanolu, obojeni Giemsa otopinom i broje. Za mekom agaru klonogenskog testa, stanice su odvojene i nanešene na 0.3% agaroznom s 0,5% -tnom agaroznom podloge (1 × 10 3 /jažici u 24 jažica). Broj žarišta > 100 um zbrojena nakon 20 dana pregled

Rast tumora u miševima

logaritamski uzgoj stanica (1 x 10 7 stanice) su tripsinizirane, ponovno suspendirane u 0,1. D'ml Hanks otopini i ubrizgava u vratu hypodermia svakog atimičkih bezdlakih miševa. Nakon toga miševi su praćeni zapremine tumora, općem zdravlju, i ukupne tjelesne težine. Veličina potkožnog mase tumora mjeren je čeljust pet tjedana. Volumen tumora je izračunat prema formuli: 0,5 x dužina x širina 2. Svaka eksperimentalna skupina se sastojala od pet miševa. Pregled

Reporter test genske pregled

Za ispitivanje učinka CacyBP /SIP i CacyBP /SIPΔS100 na transkripcije aktivnosti TCF /LEF je reporter gena je izvršena kao što je opisano [18]. Ukratko, stanice u 24-jažica (50.000 stanica po jažici) su ko-transfektirane sa ili bez pFLAG-CMV, pFLAG-CacyBP, pFLAG-ΔS100 i reporter plazmid, pTOPFLASH sadrže divlji tip lokacije TCF /LEF vezanja koristeći Lipofektaminje 2000; pRL-TK Renilla pregled luciferazni reporterski služio kao kontrola djelotvornosti transfekcije. Aktivnost luciferaze je izmjerena, a kvantificira u luminometru korištenjem Dual-Luciferase reporter Assay System (Promega, Southampton, UK). Eksperimenti su izvedeni u tri primjerka i ponovi se dva puta. Rezultati su izraženi kao srednja vrijednost omjer aktivnosti luciferaze krijesnice i aktivnosti Renilla luciferaze. Pregled

Statistička analiza pregled

Svi podaci su analizirani SPSS statističkom programskom podrškom paketa (SPSS Inc., Chicago, Illinois) i P izvoznici < 0,05 smatrana je statistički značajna. Značaj razlika u učestalosti CacyBP /SIP-pozitivnim bojanjem između susjednih tumorskih uzoraka i tumori su bili analizirani pomoću hi-kvadrat testa. Student je t pregled testa i jednosmjerna analiza varijance uz Dunnettov više usporednih testova bili zaposleni za analizu drugih podataka. Pregled

Rezultati

Endogeni izraz S100A6 kod raka želuca stanična linija MKN45 pregled

S100A6 izabran je kao model za promatranje učinak S100 proteina na biološku funkciju CacyBP /SIP. Endogeni ekspresija S100A6 na rak želuca stanične linije MKN45 najprije je otkriven Western analizom i imunofluorescencije bojanja. Kao što je prikazano na slici. 1A, S100A6 je izražen u MKN45 stanicama. Imunofluorescencija bojanja pokazuju da S100A6 uglavnom distribuiran u staničnu membranu s vrlo malo se u nuklearnom plazmi MKN45 stanica (sl. 1b). Pregled

Interakcija S100A6 i CacyBP /SIP u stanicama raka želuca MKN45

u prethodnom izvješću, CacyBP /SIP, koji je izražen na relativno niskoj razini u MKN45 stanica, naširoko je izražen u nekoliko različitih vrsta želučanog staničnim linijama karcinoma [12]. Kako bi se procijenio interakciju između S100A6 i CacyBP /SIP, divlji tip i mutantni (aa178-229) CacyBP /SIP cDNA kloniran u pFLAG-CMV vektor i stabilno se transficira u MKN45 stanice. Procijenili smo ekspresiju CacyBP /SIP u tim stabilnim staničnim linijama western blot. Kao što je prikazano na slici. 2A, FLAG-tagged CacyBP /SIP je otkriven u divljem tipu i mutanta CacyBP /SIP transfektanata s anti-Flag protutijelima, a nikakav signal je pronađena u stanicama koje su transfektirane sa praznim vektorom. Pregled

Interakcija S100A6 i CacyBP /SIP u transfektiranih MKN45 ćelijama su ocijenjeni od strane ko-imuno. Nakon inkubacije s anti-CacyBP antitijelima Imunoprecipitat je otkriven S100A6 antitijela. Kao što je prikazano na slici. 2B, interakcija između S100A6 i divljeg tipa CacyBP /SIP je promatrana u MKN45-CacyBP staničnih lizata; Međutim, mutant CacyBP /SIP koji je odrezan od aa178-229 regiji, proizveden mali signal u testu ko-imunoprecipitacije. Stoga je krnji mutirani CacyBP /SIP je imenovan CacyBP /SIPΔS100 i pruža koristan alat za istraživanje učinaka S100A6 o biološkom ponašanju CacyBP /SIP u želučanih stanica raka. Pregled

Efekti S100A6 na staničnu proliferaciju inducirana CacyBP /SIP u želučanoj raka stanične linije MKN45 in vitro

MTT i FACS testovi su izvedeni kako bi se ispitali efekti S100A6 na proliferaciju stanica induciranu CacyBP /SIP u MKN45 stanicama in vitro pregled. U usporedbi s praznim vektorom transfektanata, MKN45-pFLAG, i divljeg tipa i /CacyBP SIPΔS100 transfektanti značajno pokazale smanjenu stope stanične proliferacije MTT pokusom ( P pregled < 0,05) (Sl. 3A). Međutim, CacyBP /SIPΔS100 transfektanti pokazuje značajno više smanjila stopu rasta u usporedbi s divljim tipom CacyBP /SIP transfektanata ( P izvoznici < 0,05). Pregled

Rezultati analize staničnog ciklusa po FACS slično pokazuju da prekomjerna ekspresija bilo divlje ili mutiranim CacyBP /SIP smanjuje MKN45 proliferaciju. Međutim, prosječna proliferacijske indeksi (PI) od MKN45-ΔS100 stanica (0,19 ± 0,03) bila je niža od one MKN45-CacyBP stanica (0,29 ± 0,02) ( P izvoznici < 0,05) (Sl. 3B) , Uzeti zajedno, ti podaci snažno ukazuju na to da divlji tip CacyBP /SIP inhibira proliferaciju MKN45 stanicama, dok CacyBP /SIPΔS100 pojačava ovu inhibiciju proliferacije. Pregled

Efekti S100A6 o nastanku tumora izazvanog CacyBP /SIP u MKN45 rak želuca stanične linije In vitro pregled i In vivo

Anchorage neovisan rast je važna karakteristika in vitro
rast tumora. Dakle, ispitali smo je li uzlazni CacyBP izražavanja /SIP potiskivao rast MKN45 stanica u medijima i mekom agaru. Kao što je prikazano na slici. 4A i B, CacyBP /SIP izraz rezultirala je značajnim smanjenjem rasta MKN45 stanica u ispitivanju formiranja kolonija, s prosječnim smanjenjem 32,1% u srednjim i 62,0% u mekom agaru ( P izvoznici < 0,05) , Međutim, transfekcija CacyBP /SIPΔS100 rezultirala je u još većem smanjenju rasta s prosječnim padom stope od 84,2% u srednjim i 82,8% u mekom agaru ( P izvoznici < 0,01). Pregled

da biste potvrdili ovaj efekt in vivo pregled, mi potkožno injicira MKN45-CacyBP, MKN45-ΔS100 and MKN45-pFLAG stanice u vratu hypodermia od miševa. Nakon tri tjedna, prosječni volumen tumora u svakoj grupi bio je značajno različit od drugih. Na 5 og tjedna, prosječni volumen tumora u MKN45-pFLAG skupine bio je 776.9 ± 90,9 mm 3, što je znatno više nego što je MKN45-CacyBP skupini (578,9 ± 51,2 mm 3 ) ( P izvoznici < 0,05), pa čak i više nego što je MKN45-ΔS100 skupini (364.9 ± 71,9 mm 3) ( P izvoznici < 0,05) (Sl. 4C). pregled

Efekti S100A6 na CayBP /SIP-posredovana ß katenina razgradnje Netlogu

Kao sastavni dio ubikvitina ligaze kompleksa CacyBP /SIP sudjeluje u razgradnji nefosforilirani β katenina putem vezivanje Skp1 i Siah1. Dakle, izraz beta katenina otkrivena je neizravno procijeniti utjecaj S100 na Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 unbiquitin ligaze. Prvo, ko-imunoprecipitaciju analiza je pokazala da je krnji mutirani CacyBP /SIP vežu i Skp1 i Siah1 (Sl. 5A), što upućuje na S100A6 nije utjecala na formiranje Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 unbiquitin ligaze kompleksa. Drugo, β- katenina proteina u MKN45-ΔS100 stanica značajno je smanjena u odnosu na MKN45-CacyBP stanica, a bez promjena dogodila u mRNA (sl. 5b). Osim toga, zbog β-katenina potreban kao kofaktor za aktiviranje transkripcijskog faktora, TCF /LEF utvrdili smo učinke CayBP /SIPΔS100 na TCF /LEF aktivnosti pomoću analize gena reportera prolazne transfekcije. Izraz CacyBP /SIPΔS100 posljedicu manje TCF /LEF aktivnost od divljeg tipa CacyBP /SIP (Sl. 5C). MG132, inhibitor proteazomu, moglo bi se uklonili efekt i divljeg tipa CacyBP /SIP i CacyBP /SIPΔS100 na TCF /LEF aktivnosti. Uzeti zajedno, zaključiti ćemo da S100A6 mogli utjecati na posredovan P CayBP /SIP katenina razgradnju putem interakcije s CayBP /SIP. Pregled

Rasprava pregled

S100 obitelji proteina stekli zanimanje zbog njihove diferencijalne ekspresije u tumor tkiva i njihovo sudjelovanje u progresiji karcinoma i metastaza [19] - [22]. S100 proteina u interakciji s nekim ciljnih proteina u kalcij-ovisnog ili kalcij-neovisni način i dalje regulirati funkcioniranje tih ciljeva [5], [23]. CacyBP /SIP je novi ciljni protein koji može komunicirati sa S100 proteina, uključujući S100A6, S100A1, S100B i S100P, ali ne S100A4, calbindin D, parvalbumin ili kalmodulina [8], [16]. Prethodni radovi u našem laboratoriju pokazalo je da prekomjerna ekspresija CacyBP /SIP može inhibirati proliferaciju i nastanku tumora raka želuca i karcinoma bubrega [11], [12]. Unatoč tom napretku, efekti S100 proteina na CacyBP /SIP koje treba istražiti. Pregled

Kako bi se razjasnila regulaciju S100 proteina na CacyBP /SIP funkcije, konstruirali smo skraćeni CacyBP /SIP mutant bez S100 proteina vezne domene tako da mutirani protein ne može komunicirati S100 proteina i zadržava sposobnost interakcije s Siah1 i Skp1. U ovom istraživanju, eukariotski ekspresijski vektori za divlji tip CacyBP /SIP i njegove mutante krnjeg učinkovito su izraženi u MKN45 stanicama. Co-imunotaloženje pokazao interakciju između S100A6 i divljeg tipa CacyBP /SIP u MKN45 stanica. Međutim, CacyBP /SIPΔS100 pokazao malo signala u testu ko-imuno taloženjem, što ukazuje na slabu ili nikakvu interakciju s S100A6. MTT test, FACS analiza, klonogenskog testa i tumor ksenograft pokus na miševe su provedena kako bi se testirao učinak divlje i mutirane CacyBP /SIP na rast stanica i tumorogeneze i in vitro pregled i in vitro
. Ovi eksperimenti su pokazali da prekomjerna ekspresija CacyBP /SIP može inhibirati proliferaciju i nastanku tumora od MKN45 stanica raka želuca. Važnije, stanice transficirane CacyBP /SIPΔS100 izložena intenzivnije efekte u odnosu na divlji tip transfektanata, što ukazuje da proteini S100 može negativno reguliraju inhibiciju proliferacije stanica inducirano CacyBP /SIP u želučanom stanica raka. Pregled

Mehanizam upotrijebljeni by S100A6 modulirati CacyBP /SIP funkcija može ležati u interakcije proteina i funkcija. CacyBP /SIP je utvrđeno da se uključe u ubiquitination i razgradnje beta-katenina [24] - [28]. β- katenina nađeno je da preekspresije ili aktivira u proliferirajuće stanice i u mnogim tumorima [29] - [31]. Fukushima et al. [32] su otkrili da pokazuju CacyBP /SIP knockout stanice vrijednosti (katenina degradacije i neispravan G1 staničnog ciklusa punktu, što ukazuje da je β-katenina degradacija put posredovan CacyBP /SIP definira važnu kontrolnu točku za razvoj thymocyte i napredovanja staničnog ciklusa. Naš prethodna istraživanja su također pokazala da CacyBP /SIP inhibira rast i proliferaciju stanica želuca raka djelomično putem degradacije beta katenina. Bilo S100 regulira CacyBP /SIP-posredovane ubikvitina ligaze zadržava nepoznat. Prikupljeni dokazi pokazali da je nekoliko članova S100 obitelji proteina može regulirati aktivacija svojih ciljnih proteina [33], [34]. nedavno otkriveni kvasac homologni od CacyBP /SIP, Sgt1, ne samo u interakciji s S100 proteina u kalcij reguliranim način, ali također se povezuje s Skp1 formirati Skp1 /cullin1 /F -.. kutija ubikvitina ligaze kompleks [35] utvrđeno je da S100A6 mogao spriječiti fosforilaciju Sgt1 by kazein-kinaze II utjecati na aktivnost [36] U našem sadašnjem eksperimentu, također je utvrdila da CacyBP /SIPΔS100 zadržati sposobnost za povezivanje sa Skp1 i Siah1, sugerirajući S100 molekule ne bi mogli utjecati na formiranje Siah1 /Skp1 /CacyBP ubikvitina ligaze kompleksa. Ipak, β-katenina protein bez promjene razine mRNA u CacyBP /SIPΔS100 transfektiranim stanicama je značajno niža od divljeg tipa transfektiranih stanica. Transkripcijsku aktivnost TCF /LEF, ciljnog gena P-katenina, smanjena je u kombinaciji s mutiranim CacyBP /SIP bez S100 vezanja, u usporedbi s divljim CacyBP /SIP. Accoding ovim rezultatima, možemo pretpostaviti da je S100 proteina moglo negativno reguliraju aktivnost Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 ubikvitina ligaze interakcijom s CacyBP /SIP. Na taj način blokira kombinaciju S100 i CacyBP /SIP promovirati ß katenina degradacije rezultiraju inhibira proliferaciju stanica raka. To nagađanja može djelomično poduprt, Lee et al da u stanicama s smanjenom razinom S100A6 iznos P katenina reducira [26]. Rezultati su u skladu s podacima u vezi regulaciji S100 proteina i manjkava degradacije beta katenina u tumoru i proliferacijom stanica [37]. Osim toga, CacyBP /SIP je pokazala da u interakciji s tubulin i ERK1 /2 i igraju važnu ulogu u pregradnje citoskeleta, stanične diferencijacije ili degeneracije [38] - [42]. Pregled

Zaključci pregled

S100A6 protein negativno regulira CacyBP /SIP posredovanu inhibiciju proliferacije stanica raka želuca, dijelom kroz utjecaj na razgradnju β-katenina i transkripcijska aktivacija u TCF /LEF. Međutim, temeljni mehanizmi za reguliranje S100A6 na protein ubiquitination i druge funkcije putem CacyBP /SIP-ovisne puta zahtijevaju daljnje istraživanje. Pregled

Other Languages