PLoS ONE: piruvat kinaza M2 igra dvostruku ulogu na regulaciji EGF /EGFR signaliziranje putem E-kadherina ovisan način u rak želuca Cells

Sažetak pregled

Pozadina i ciljevi

aktivaciju EGFR i PKM2 izraz su instrumentalne u nastanku tumora. Aktivacija EGFR regulira PKM2 funkcije u substaničnog odjeljak ovisan način i potiče transkripciju gena i rast tumora. Osim toga, PKM2 je reguliran u EGFR induciranih puteva glioma malignih bolesti. No, otkrili smo da PKM2 također mogu regulirati aktivnost EGF /EGFR signalnog puta u želučanih stanica raka. željeli smo odrediti biološke mehanizme za PKM2 u reguliranju stanične pokretljivosti i invaziju. pregled

Metode

zaposleni smo stabilnu transfekciju sa kratkim hairpin RNA stabilno ušutkati ekspresiju PKM2 u BGC823, SGC7901 i AGS staničnih linija raka želuca. Učinci PKM2 in vitro se određuje procjenjivanjem migraciju i invaziju. Imunohistokemijska analiza korištena je istražiti odnos između PKM2 i drugih proteina. Pregled

Rezultati

Naši rezultati pokazuju da je obaranje PKM2 smanjena aktivnost E-kadherina i poboljšane EGF /EGFR signalne puteve u staničnim linijama želučane BGC823 i SGC7901 koje su pozitivne za ekspresiju E-kadherina. Međutim, u nediferencirane želučanom stanica karcinoma AGS, kojem nedostaju ekspresiju E-kadherina, PKM2 promovira staničnu migraciju i invaziju. Imunohistokemijske analize pokazale su da je razina ekspresije E-kadherina, ERK1 /2 fosforilacije i citoplazmatski PKM2 izražavanja bili povezani jedni s drugima pregled

Zaključak:. Pregled

PKM2 može imati različite uloge u različito diferencirane želuca stanica raka vrste, a ovo otkriće će biti u skladu s prethodnim kliničkim istraživanjima. Rezultati našeg istraživanja pokazuju značajnu vezu između PKM2 i E-kadherina u EGFR-stimulira želučane stanice raka pokretljivosti i invazije pregled

Izvor:. Wang LY, Liu YP, Chen LG, Chen IL, Tan L, Liu JJ et al. (2013) piruvat kinaza M2 igra dvostruku ulogu na regulaciji EGF /EGFR signaliziranje putem E-kadherina ovisan način u želudac stanica raka. PLoS ONE 8 (6): e67542. doi: 10,1371 /journal.pone.0067542 pregled

Urednik: Hiromu Suzuki, Sapporo Medicinski fakultet, Japan pregled

Primljeno: 7. veljače 2013. godine; Prihvaćeno: 20. svibnja 2013; Objavljeno: 28. lipanj 2013 pregled

Copyright: © 2013 Wang et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo je podržan od strane Nacionalne zaklade prirodoslovni Kine (br 30971362, 81072013 & 91229201), temeljna istraživanja fondova za središnju sveučilišta u Kini (br 2010111082) i Ministarstvo zdravstva zaklade za State Key Kliničkom zavodu. U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

piruvat kinaze (PK) posreduje konačne ograničava brzinu korak glikolize kataliziranjem defosforilizacije fosfoenolpiruvata (PEP) i piruvat, čime se dobiva jedna molekula ATP. Stanice sisavaca imaju četiri piruvat kinaze izoenzima (M1, M2, L i R), koji se selektivno izražene u različite vrste stanica i tkiva [1]. U sisavaca, M1 izoforma (PKM1) izražava se u većini odraslim tkivima. M2 izoforma (PKM2), An alternativno spojeni varijanta M1, izražena tijekom embrionalnog razvoja. [2] Studije su otkrili da stanice raka isključivo izražavaju PKM2 [3], [4]. PKM2 Pokazano je da je neophodna za aerobnu glikoliza u tumorima (Vvarburg učinak). Tijekom godina, značajan napredak su napravljene u razumijevanju funkcije i regulacije PKM2 kao piruvat-kinaze i protein kinaze u stanicama raka. [5] Nedavno istraživanje je potvrdila da je PKM2 inducirana epidermalnog faktora rasta (EGF) premješta u jezgri stanica glioblastoma, interakciju s P-katenina i vodi cyclinD1 ekspresije, koji potiče staničnu proliferaciju i nastanku tumora [6]. Ovi rezultati otkrivaju novi ulogu PKM2 kao transkripcijski koaktivatora. Međutim, postoje neke kontroverze u pogledu specifičnosti i potencijala PKM2 kao metu protiv raka u liječenju raka. Nedavno otkriće otkrila da je ekspresija PKM2 snažno je povezana s želučanom diferencijacije karcinoma. Diferencirane vrste raka izražavaju više PKM2 proteina nego oni s nediferencirane. PKM2 bio nepovoljan prognostički čimbenik stanica raka pečatni prsten želuca [7]. Biološka uloga PKM2 u različitim diferencijaciju fazama i za razvoj karcinoma želuca treba dodatno razjasniti. Pregled

Prethodne studije u vezi PKM2 su usmjerene na metabolizam tumora i rast tumora. Bilo je samo nekoliko izvješća o tumorskih metastaza. E-kadherina igra kritičnu ulogu u održavanju epitelnu cjelovitost i gubitak E-kadherina utječe ljepljivu repertoar je [8] stanica. Prethodne studije [9] in vitro su pokazala da je gubitak E-kadherina u ljudske stanične linije karcinoma povezuje se s lošom diferencijacije i fibroblastoid morfologiju. EGF ovisna aktivacija EGFR objavljeno je da mogu inhibirati na E-kadherina adhezije ovisan način, koji inhibira ligand-ovisnu aktivaciju različitih receptorskih tirozin-kinaza [10]. Naša istraživanja pokazali su da je obaranje PKM2 smanjena aktivnost E-kadherina i poboljšane EGF /EGFR signalni put u staničnim linijama BGC823 i SGC7901 koje su bile pozitivne za ekspresiju E-kadherina. Međutim, u nediferencirane želučanom stanica karcinoma AGS, kojem nedostaju ekspresiju E-kadherina, PKM2 promovira staničnu migraciju i invaziju. Cilj ovog istraživanja bio je da se razjasni funkciju i mehanizam PKM2 s obzirom na staničnoj pokretljivosti u različito diferenciranih staničnih linija. Pregled

Materijali i metode pregled

Kultura stanica, uvjetima i TRANSFICIRANJE pregled

ljudskih staničnih linija raka želuca BGC823 (slabo diferencirani prema pružatelju) i SGC7901 (umjereno diferencirani) uzgojene su u RPMI 1640 mediju (HyClone, Logan, UT, USA). Stanična linija AGS (nediferencirani) se kultivira u F12K medija. Sve stanice su kultivirane u mediju koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) (Gibco, Detroit, MI, USA) i 100 IU /ml penicilin-streptomicina na 37 ° C u CO s 5% _{2 vlažnoj atmosferi. Ljudska stanična linija karcinoma želuca AGS naloženo iz American Type Culture Collection (ATCC, USA), a ljudsko želuca staničnim linijama karcinoma SGC7901 i BGC823 dobiveni su iz Kine Centra za Type Culture Collection (Shanghai, Kina). SGC7901, BGC823 i AGS stanice su transfektirane s siPKM2 (pcPUR + U6-siPKM2) ili PU6 (pcPUR + U6-siRenilla) plazmida korištenjem Fugene HD (Roche, Indianapolis, IN). Puromicin (0.1 ug /ml) korišten je za skrining za stabilno transfektiranih klonova. Ekspresija PKM2 proteina je ispitan s Western blot analizom korištenjem protutijelo PKM2 za provjeru sposobnost konstrukata da inhibiraju ekspresiju ciljnog gena; Ovi eksperimenti su ponovljeni tri puta. Stanične kulture su izrađene nepokretan raste ih konfluencije, a medij je zamijenjen sa svježim medijem koji sadrži 0,5% seruma za 1 dan. EGF sa 100 ng /ml konačne koncentracije se koristi za stimulaciju stanica. EGF je dobiven od Cell Signaling Technology. Pregled}

Stabilno obaranje PKM2 i prekomjerna ekspresija PKM2 pregled

plazmid koji sadrži RNA interferencije sekvencu koja ciljani gen PKM2 u BGC823, SGC7901 i AGS stanice je izgrađena. Smisao oligo za siPKM2 sekvencije 5'-CACCGCGGCAAGATTTATGTGGAACGTGTGCTGTCCGTTCCACGTAGATCTTGCTGCTTTTT-3 ', a antisense oligo bio je 5'-GCATAAAAAGCAGCAAGATCTACGTGGAACGGACAGCACACGTTCCACATAAATCTTGCCGC-3'. BGC-823, SGC-7901 i AGS stanice su transfektirane s pcPUR + U6-siPKM2 ili pcPUR + U6-siRenilla (kontrola), a odabrani su puromicin otporni na klonova. Western blot analiza je izvršena kako bi potvrdili PKM2 potiskivanje. Plazmid koji sadrži PKM2 cDNA sekvenca dobivena od Invitrogen. BGC-823, SGC-7901 i AGS stanice su transficirane s pcDNA6.0-PKM2 ili pcDNA6.0-Mock (kontrola) i odabrani kao blasticidin-rezistentnih klonova. Western blot analiza je izvršena da potvrdi ekspresiju PKM2. Pregled

Protein Ekstrakcija i Western blot analize pregled

Stanice se ponovo suspendiraju u puferu za lizu koji sadrži koktel inhibitora proteaza, i ekstrahira proteini se odvajaju koristeći 8-10% SDS-PAGE gela. B-tubulin se koristi kao kontrola doziranja. Antitijela protiv E-kadherina, i p-E-kadherina su dobiveni od Epitomics. Fosfo-EGFR (Tyr1068), fosfo-PLCγ1 (Tyr783), fosfo-AKT (Ser473), fosfo-Gab1 (Tyr627), fosfo-c-CBL (Tyr700) i fosfo-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) antitijela su dobiveni od Cell Signaling Technology. pregled

RNA ekstrakcija, reverznom transkripcijom i real-time PCR pregled

Ukupna RNA je ekstrahirana korištenjem TRIzol reagensa (Invitrogen, CA, USA). Uzorci su zatim tretirani s DNase tijekom 15 minuta na sobnoj temperaturi, a RNK je dalje pročišćena korištenjem RNA čišćenje kit (Qiagen, CA, USA). Reakcija reverzne transkripcije (RT) za prvu lanca sinteze cDNA izvedena je primjenom reverzne transkriptaze (Bio-Rad) s 2 ug ukupne RNA. Kvantitativna RT-PCR analiza izvršena je pomoću ABI 7500 (Applied Biosystems) i određena je razina ekspresije gena za svaki pojedini uzorak su normalizirani na GAPDH. Srednja ekspresije gena relativni je određena i razlike izračunate su pomoću 2 ^{-ΔΔCt postupak agaroza gel elektroforezom. RT-PCR sekvence bile su kako slijedi: 5'-smisla TGTGGGAATCCGACGAATG-3 'i 5'-protusmisleni GTCATATGGTGGAGCTGTGGG-3' za N-kadherina; Osjećaj 5'CGGGAATGCAGTTGAGGATC-3 'i negativnu 5'AGGATGGTGTAAGCGATGGC-3' za E-kadherina; Osjećaj 5'TGTATGGGGAACTGCTGACA-3 'i negativnu 5'GCGTTCATCCTCATCGAAGT-3' za MMP7; smislu 5'CGACAGTCAGCCGCATCTT-3 'i 5'-antisense CCCCATGGTGTCTGAGCG-3' za GAPDH. pregled}

stanične proliferacije pregled

Stanična proliferacija izmjerena je pomoću brojanja Kit-8 (Dojindo, Kamimashiki -gun, Kumamoto, Japan) u skladu s uputama proizvođača. Ukratko, stanice su posađene na četiri ploče s 96 jažica u gustoći od 2 × 10 ^{3 stanica /jažici. Jedna pločica je uzeta u isto vrijeme svaki dan nakon stanice su pridržavao jažice. Apsorbancija je mjerena pomoću čitača mikroploče na valnoj duljini od 450 nm. Svi pokusi su provedeni u triplikatu. Pregled}

Transwell® invazije i zacjeljivanje rana Testovi

transjažice invazija testovi provedeni su s umecima 8,0 um do pora u 24 jažice transjažičnih ploča. Bazalna membrana je hidratiziran s 500 ul medija bez seruma bez RPMI 1640 ili F12K 30 minuta prije uporabe. Za test invazije, želučani stanične linije raka su dodani u gornju komoru transjažice s 0.5 mg /mL kolagen tipa l (BD Bioscience, San Jose, CA) obložene filtera. RPMI 1640 ili F12K mediju s 10% fetalnog goveđeg seruma i 1% svakog antibiotika se doda donje komore. BGC i 7901 stanice su inkubirane 36 sati. A AGS Stanice su inkubirane tijekom 24 sata. Napadačkih Stanice su prebrojane nakon gorčica ljubičastog obojenja. Svaki eksperiment je izveden u tri puta, a podaci su izraženi kao srednje vrijednosti. Je test za liječenje rana je provedena u ploče sa 6 jažica. Tumorskih stanica u mediju koji sadržava 10% FBS su nasađene u ploče sa 6 jažica (Corning, CA). Stanične kulture su izrađene nepokretan raste ih konfluencije, a medij je zamijenjen sa svježim medijem koji sadrži 0,5% seruma za 1 dan. Rane na jednoslojne su s sterilnim pipete savjete. Zatim EGF sa 100 ng /ml konačne koncentracije se koristi za stimulaciju stanica. Stanice su zatim isprane s PBS i osvježene mediju koji sadrži 10% FBS. Fotografije su snimljene na 0 i 24 sati. Svi pokusi su izvedeni u tri primjerka pregled

Etika Izjava pregled

Ova studija je odobren od strane Etičkog povjerenstva (br: 20081012). U Zhongshan bolnici povezan s Sveučilište Xiamen, Xiamen, provinciji Fujian, Kina, i mi smo dobili pisani pristanak izjave od svih sudionika u ovom istraživanju. pregled

Priprema uzoraka tkiva

primjerci tumorskog tkiva su prikupljeni iz 15 različitih pacijenata s rakom želuca koji su se podvrgnuli ljekovito resekcija u Zhongshan bolnici Sveučilište Xiamen, Xiamen, Kina. Neovisna niz odgovarajućih susjednih nekancerozno tkiva od 15 istih bolesnika, skupljen je u isto vrijeme. Svi uzorci tkiva se prikupe i podijeljena u dva dijela odmah nakon odstranjivanja tumora. Jedan dio se prikupi u tekućem dušiku i pohranjeni na -80 ° C do RNA i proteina ekstrakcije. Drugi dio fiksira se u 4% -tnom formaldehidu i stavljeni u parafin za histološku analizu (Hematoxylin eozinom i IHH bojanje). Svi primjerci su potvrđeni patološku dijagnozu (u patohistološko dijagnoza temelji se na kriterijima SZO). Svi testni slučajevi su grupirani sporazum-ma Međunarodne unije protiv tumorski čvor-metastaza (TNM) sustava staging Cancer (revidiran 2002. godine).

Imunohistokem pregled

Četiri mikrona debele parafinskih sekcija su ili obojeni hematoksilinom i eozinom (H &E) i analizirana na PKM2, p-ERK1 /2 i E-kadherina ekspresiju imunohistokemije. Imunohistokemija je provedena u skladu s procedurama koje su preporučene od strane proizvođača. Reakcije se vizualizira pomoću diaminobenzidin kao kromogenog supstrata. Sekcije su prebrojane koristeći hematoksilinom i potom očišćeni i montiran. Srednja gustoća (IOD /područje) otkrivena je u različitim pozitivnim područjima 15 ljudskih jedinki želučanog raka pomoću slika-pro Plus softver. Pregled

Statističke analize pregled

Statističke analize provedene su pomoću SPSS v13. 0 (SPSS Inc.) softver. Nezavisni-Uzorci T test i korelacijska analiza korišteni su za usporedbu podataka. Sve vrijednosti su izražene kao prosjek ± SD. Razlike su smatrane za statistički značajne na P pregled. ≪ 0,05 pregled

Rezultati

Iscrpljivanje PKM2 promoviranih Cell migracije i invazije na BGC823 i SGC7901 stanica s EGF stimulaciju Netlogu

ekspresija PKM2 proteina u staničnim linijama raka želuca BGC823, SGC7901 i AGS procijenjena pomoću Western blot analize. Ove stanične linije su pokazali visoku razinu ekspresije PKM2. Zatim, stabilne želučani stanične linije raka s promijenjenom PKM2 izraza su postavljene uporabom RNA interferencije (PKM2 obaranje) U BGC823, SGC7901 i AGS stanica. Kao što je prikazano na slici. 1A, osnovana su BGC823, SGC7901 i AGS stanične linije s PKM2 obaranje. Uočili smo da je proliferacija je smanjen u BGC823 i AGS stanica nakon PKM2 je potrošena (Sl. 1b). Ovi rezultati su u skladu s prethodnim istraživanjima.

Da bi ispitali učinak PKM2 na migracije stanice i invaziju, mi zaposlenih dobro uspostavljen za liječenje rana i Transwell testovi kako bi se karakterizirao odgovor pokretljivost stanica u BGC823 i SGC7901 stanica , Konfluentnom sloj stanica najprije se inkubira preko noći u mediju, ogrebotina rana uveden je dodan medij koji sadrži najprikladnija doza EGF (100 ng /ml) da stimulira migraciju, a postotak cijeljenja rane uočeno je nakon 24 sata ( Slika S1). Nadirući Stanice su prebrojane 36 sata nakon EGF (100 ng /ml) dodan je donje komore. Rezultati pokazuju da je liječenje BGC823-sipk i stanica SGC7901-sipk s EGF sljedećim ogrebotine rane i na bunara značajno povećao udio zacjeljivanja rana (sl. 1 C, D) i invaziju (sl. 1 E, F) u usporedbi s onom od kontrolnih stanica. pregled

Iscrpljivanje PKM2 Smanjena E-kadherina izražavanja i poboljšane aktivnosti EGF /EGFR Nizvodno signalnih putova PLC-γ1 i ERK1 /2 pregled

kako istražiti mehanizam promjene stanične migracije i invazije nakon obaranje PKM2, analizirali smo ekspresiju članova Ca ^{2 + ovisna stanične adhezijske molekule, obitelj i metaloproteinaze. otkrili smo da je E-kadherina protein razine ekspresije smanjena u BGC823 i SGC7901 stanica kada je smanjena ekspresija PKM2 (sl. 2). pregled}

Stupanj E-kadherina mRNA i fosforilacija E-kadherina su određivani BGC823 i SGC7901 stanice s PKM2 osiromašeni procijeniti da li je promatrana razlika u izrazu E-kadherina dogodila prije ili nakon translacije. opazili smo podreguliranjem E-kadherina mRNA i povećanom fosforilacijom koje inducira endocitozom E-kadherina, u PKM2 iscrpljena stanicama (Sl. 2a, b). Također smo otkrili da je razina ekspresije proteina N-kadherina je povećan u staničnim linijama BGC823 i SGC7901 kada PKM2 je potrošena (Sl. 2). Pregled

migracije stanice i invaziju uglavnom su utvrđena EGFR aktivnosti. Analizirati li EGFR je uključen u migraciji i invaziji BGC823 i SGC7901 stanica, stanice su tretirane s EGF-om, koji se veže na i aktivira EGFR nizvodne signalne putove. Liječenje EGF rezultiralo fosforilacije EGFR i naknadnim aktiviranjem PLCγ1, AKT i ERK1 /2 putova (Sl. 2C). Otkrili smo da je PLC γ1 imali višu razinu aktivnosti u PKM2-iscrpljena stanicama nego u stanicama UN-iscrpljena nakon bilo kratko ili dugo (24 h) inkubacije s EGF. Međutim, nije bilo značajna razlika u AKT aktivnosti između PKM2-iscrpljena stanica i UN-osiromašene stanice. PLCγ je ključni regulator stanične migracije nizvodno od RTK signalizaciju [11]. Fosforilacija na ostatke tirozina 783 od PLCγ1 je presudan za njegovu aktivaciju [12]. PLCγ1 aktivacija poboljšane staničnu pokretljivost, a taj učinak je opažen u ranu nule i transjažična testovima i vidjeti na slici. 1C. Pregled

Sljedeći istraživali učinak na EGFR liganda na ekspresiju MMP pomoću RT-PCR u BGC823-sipk i SGC7901-sipk stanicama u usporedbi s njihovim kontrolnim stanicama. Liječenje s EGFR ligand, EGF, pojačana ekspresija MMP na razini transkripcije u BGC823 i SGC7901 stanica. Međutim, nije bilo očitih razlika u razinama ekspresije MMP2 i MMP9 između PKM2 iscrpljena stanica i njihovih kontrolnih stanica (podaci nisu prikazani). Izraz MMP7 se regulira prema gore u stanicama PKM2-iscrpljena s EGF liječenja (Sl. 2d). ERK /MAPK putanja igraju kritičnu ulogu u EGFR MMP7 ekspresije inducirane ligandom. Nadalje, očito povećanje ERK1 /2 aktivnost zabilježena je nakon 0 sati i 24 h tretmana s EGF u PKM2-iscrpljena stanica. Pregled

Iscrpljivanje PKM2 prigušuje pokretljivosti od AGS stanica i funkcionalne promjene nakon Spašavanje PKM2 u staničnim linijama raka želuca

ekspresija E-kadherina u želučanom staničnim linijama raka BGC823, SGC7901 i AGS je bila procijenjena s Western blot analize. U BGC823 i SGC7901 stanične linije izražavaju E-kadherina. Nasuprot tome, AGS stanice nemaju ekspresiju E-kadherina (Sl. 3A). Pregled

ispitao efekt PKM2 obaranje na migraciju stanica, invaziju u AGS stanicama, što je koristio dobro utemeljena zacjeljivanje rana i Transwell testovi za obilježavaju staničnu pokretljivost. Konfluentnom sloj stanica najprije se inkubira preko noći u mediju, rana ogrebotina uveden, dodan je medij koji sadrži EGF (100 ng /ml) da stimulira migraciju, a postotak cijeljenja rane uočeno je nakon 24 sata. Invazije stanice u pokusu transjažična kvantificirane 24 sata nakon EGF (100 ng /ml) dodan je donje komore. Na naše iznenađenje, utvrdili smo da tretiranje AGS-sipk stanica s EGF-om nakon rane nule i transjažice značajno je smanjio brzinu cijeljenja rane i invaziju u usporedbi s onom u kontrolnim stanicama (Sl. 3b, C). Bilo je osobiti razlike između BGC823 /SGC7901 i AGS stanica. Pregled

Kako bi se dodatno ilustriraju ulogu PKM2 u staničnoj pokretljivosti, napravili smo PKM2 spašavanje eksperimente. Mi taked stabilno transfektirane metodu pomoću prekomjerna ekspresija plazmida vektor pcDNA6.0-mock i pcDNA6.0-PKM2 baviti BGC823 i AGS stanica koje stabilno obaranje PKM2. Ekspresija p-EGFR, E-kadherina prikazani su u eksperimentima PKM2 spašavanje (Sl. 3d). Ustanovljeno je da kada je PKM2 izraz oporavio, fosforilacija EGFR znatno smanjen BGC823 stanica i povećao AGS stanicama. Štoviše, pokretljivost stanica od BGC823 stanica je smanjen i AGS stanice su pale nakon PKM2 spašavanje (Sl. 3e). Da pojasnimo mehanizam tih razlika, onda smo analizirali djelovanje EGF /EGFR signalnog puta. Pregled

PKM2 Poboljšana aktivnostima EGF /EGFR nizvodne signalne putove u AGS stanicama i korelaciji s ERK aktivnosti u želučanoj rak Uzorci pregled

za analizu je li EGFR mogu biti uključeni u migracije i invazije AGS stanica, stanice su tretirane s EGF-om, koji se veže na i aktivira EGFR nizvodne signalne putove. EGF liječenje rezultiralo fosforilacije EGFR i zatim aktivaciju nizvodno EGFR puteva, uključujući PLCγ1 i ERK1 /2 putova (Sl. 4A). Otkrili smo da su aktivnosti PLCγ1 i ERK1 /2 bile su veće u stanicama gdje PKM2 nije iscrpljena nego u stanicama PKM2 iscrpljena nakon bilo kratko ili dugo (24 h) inkubacije s EGF. Ovaj rezultat je suprotno od onoga što je opaženo s BGC823 i SGC7901 stanica; u AGS stanicama, PKM2 došao u igru ​​kao poticaj i promiče staničnu migraciju i invaziju. Sljedeće smo istraživali ekspresiju MMP7 pomoću RT-PCR u AGS-sipk stanica i kontrolnih stanica. Liječenje s EGF poboljšana MMP7 izražavanja na razini transkripcije u AGS-pu6 stanica, ali ne u AGS-sipk stanica (Sl. 4b). Aktivnost ERK1 /2 je očito bio veći u AGS-pu6 stanicama u usporedbi s AGS-sipk stanica nakon 0 sati i 24 h tretmana s EGF (Sl. 4a). Pregled

Sljedeći izvedena imunohistokemijski (IHH) analizira se ispitala ekspresija E-kadherina, PKM2 lokalizaciju i ERK1 /2 fosforilaciju serijske dijelovima 15 humanih uzoraka raka želuca upotrebom protutijela s provjerenim specifičnosti. Slika 4C prikazuje da je razina ekspresije E-kadherina, ERK1 /2 fosforilacije i citoplazmatsku PKM2 ekspresije korelira s drugim. Osim toga, opazili smo visok stupanj aktivnosti ERK1 /2 fosforilacije u jezgri stanica raka bez ekspresije E-kadherina. U područjima ERK1 /2 fosforilacije, također otkrili više razine PKM2 izražavanja. Međutim, nismo pronašli fosforilaciju ERK1 /2 u područjima pozitivnim za izražavanje E-kadherina (Sl. 4C). Analiza korelacija između PKM2, E-kadherina i P-ERK1 /2 provedena je pomoću slika-Pro Plus softver (Sl. 4D). Srednja gustoća (IOD /područje) zabilježen je u različitim pozitivnim područjima 15 ljudskih uzoraka raka želuca. Našli smo značajnu korelaciju između PKM2 i E-kadherina u E-kadherina pozitivne područja. Osim toga, postojala je značajna korelacija između PKM2 i p-ERK1 /2 u E-kadherina-negativne područjima. Pregled

Rasprava pregled

invazivne i metastatski stadij raka progresije korelira sa slabom kliničkom prognozom i predstavlja najveći težak prepreku za uspješno liječenje. Pokretljivost stanica i invazivnost su definiranje karakteristika malignih tumora, koji omogućuju tumorskih stanica migrirati u susjedna tkiva ili putem ograničavanja podrum membrane i izvanstanične matrice. Pokretljivost stanica je potreban za fiziološkim procesima popravka rane i organogenezu i patoloških procesa tumorske invazije [13]. Invazivne tumorske stanice su karakterizirane nereguliranom staničnoj pokretljivosti, kao odgovor na izvanstanične signale od faktora rasta i citokina. Humani tumori eksprimiraju visoke razine faktora rasta i njihovih receptora, kao i mnoge vrste malignih stanica čini se da pokazuju autocrine- ili parakrinu stimuliranu rast. Među najviše dobro proučio receptora faktora rasta sustava je obitelj EGF receptor [14]. Signali iz izvanstaničnog miljea diktiraju staničnu pokretljivost. Mnogi čimbenici rasta, uključujući liganada koji djeluju preko receptora faktora rasta epiderma (EGFR), poboljšati staničnu pokretljivost [15]. Najmanje dva zasebna unutarstanični signalni put je potrebno za EGFR posredovane stanične pokretljivosti: putevi koji koriste PLC y i put MAP kinaze. PLC γ aktivnosti je bilo predloženo da bi se poboljšala staničnu pokretljivost kroz mobilizaciju aktina modifikaciju proteina iz neaktivnog membrana-povezanog lokalizacije aktivni pod-membranska citoskeleta lokalitetu [16]. ERK MAP kinaze prijenos signala u jezgru, kao i signale koji reguliraju stanica-matriks veze. Pregled

Kadherini obuhvaćaju veliku porodicu stanica molekula stanične adhezije, koje uključuju klasične, desmosomal i atipične kadherina. E-kadherina, koja se eksprimira u epitelnim stanicama je adhezija protein koji je kodiran genom i funkcijama CDH1 u više procesa, uključujući razvoj, integritet tkiva, migraciju stanica, morfologiju, i polarnosti [17], [18] [19]. E-kadherina je tumor supresor čija je ekspresija često smanjiti ili ušutkani, a njegov ponovni izraz može izazvati morfološku vraćanju [20], [21]. EGF ovisna aktivacija EGFR objavljeno je da mogu inhibirati na E-kadherina adhezije ovisan način, koji inhibira ligand-ovisnu aktivaciju različitih receptorskih tirozin kinaza. N-kadherina, kao invazije promotor, često je reguliran. Izraz N-kadherina u stanicama epitela uzrokuje promjene u morfologiji na fibroblastičnom fenotipa, čineći stanice više pokretljiv i invazivne. Nedavne studije ukazuju da stanice raka imaju doregulirani N-kadherin pored gubitka E-kadherina. Ova promjena u izrazu kadherina zove se "prebaciti kadherina». Pregled

Uočili smo regulacije na niže E-kadherina mRNA i povećanog fosforilacije koji izaziva endocitoze E-kadherina u PKM2-iscrpljena stanica. Također smo otkrili da je N-kadherina razina ekspresije proteina je povećan u liniji stanica BGC823 kada PKM2 je potrošena. Obaranje PKM2 promovira migraciju stanica i invaziju u BGC823 i SGC7901 stanica s EGF stimulacije. Pojačana aktivnost EGFR je kritični faktor u određivanju staničnu pokretljivost i invazivnost BGC823 i SGC7901 stanica. Mi smo pretpostavili da je down-regulacije ekspresije E-kadherina pojačan fosforilaciju EGFR i aktivira nizvodne signalne putove, koji uključuju PLCγ1 i ERK1 /2. PLC aktivacija γ pojačava staničnu pokretljivost i ERK1 /2 aktivnost ima važnu ulogu u MMP7 izražavanja.

Matrične metaloproteinaze (MMP) su uključene u invazije i metastaziranja raka zbog ekstracelularnog matriksa (ECM) -proteolytic aktivnost [22]. MMP-7 je izvijestila da se proizvodi u stanicama karcinoma želuca te je značajno povezan s agresivnim patoloških fenotipova rakom želuca [23]. MMP-7 može aktivirati pro-MMP-1, ima jak stromelizin nalik djelovanje i degradira netopivi elastin, kolagen tipa IV, laminin-1, fibronektin, proteoglikana i gelatine [24]. ERK /MAPK putanja igraju kritičnu ulogu u EGF-inducirane MMP7 ekspresije [25]. Pregled

E-kadherin stanica adhezijska glikoprotein naznačen po prvi put u ljudskim staničnim linijama od Shimoyama et al [26]. Njegova uloga u razvoju raka želuca je prvi put definiran Guilford et al [27]. Postoji značajna korelacija između stupnja ekspresije E-kadherina i stupanj diferencijacije tumora, kao i histološkom tipu prema Lauren i klasifikacije SZO. Bolesnici s tumorima E-kadherina pozitivne imaju znatno bolje stope preživljavanja 3- i 5-godišnje od bolesnika s E-kadherina negativnim tumorima [28]. Nasljedna difuzni karcinom želuca (HDGC) je rijetka autosomno dominantni sindrom koji je u velikoj mjeri pripisati rasplodnih stanica mutacije i brisanja u genu CDH1 povezan s ranim početkom, histološki difuzna, tip stanica pečatnjak prsten rak želuca [29], [30]. pregled

Lim JY i suradnici objavili da je ekspresija PKM2 snažno povezana sa želučanom diferencijacije karcinoma. Diferencirane vrste raka izražavaju više PKM2 proteina nego nediferenciranih vrste; Nasuprot tome, veći izraz PKM2 korelaciji s kraćim ukupno preživljenje, neovisno o fazi raka stanica pečatnjak-ring. PKM2 izraz može biti nepovoljan prognostički čimbenik za karcinomi pečatnjak-ring koji nemaju E-kadherina [7]. Ovi rezultati su u skladu s našim istraživanjima želučanih stanica raka. BGC-823, SGC-7901 i stanične linije AGS su različito diferencirane vrste. Izraz E-kadherina postoji u SGC-7901 i BGC-823 staničnih linija; Nasuprot tome, AGS su stanice dobivene od zloćudnih želuca adenokarcinom tkiva i nedostaje E-kadherina posredovane stanične adhezije [31]. Uočili smo da je obaranje PKM2 promovira migraciju i invaziju SGC-7901 i BGC-823 staničnih linija, ali potisnuti ta svojstva u staničnoj liniji AGS. Druga grupa je izvijestila da je tip piruvat kinaze M2 je reguliran u raka debelog crijeva, a obaranje PKM2 potisnuti proliferaciju i migraciju raka debelog crijeva RKO stanica [32]. Znamo da RKO stanice nemaju ekspresiju E-kadherina [33]. Imunohistokemijska (IHH) analiza pokazuje da su razine ekspresije E-kadherina, ERK1 /2 fosforilacije i citoplazmatsku PKM2 ekspresije korelira s drugim. našli smo visoku razinu aktivnosti ERK1 /2 fosforilacije u jezgri stanica raka bez ekspresije E-kadherina, ali s visokom razinom ekspresije PKM2. pregled

Pretpostavljamo da PKM2 prigušuje staničnu pokretljivost i invaziju kada E-kadherin predstaviti. Ovaj roman funkcija PKM2 mogu igrati ulogu u reverzibilnu inhibiciju stanične pokretljivosti i invazije u ranim stadijima raka želuca kada su stanice pozitivne na izrazu E-kadherina. Vrijeme progresije tumora, nedostatak ili vrlo niska ekspresija E-kadherina inducira agresivan funkciju PKM2 u tumoru. Biološka uloga PKM2 u razvoju tih tumora treba dalje objasniti. Pregled

popratne podatke pregled Slika S1. pregled Ekspresija EGFR proteina u staničnim linijama raka želuca BGC823, SGC7901 i AGS procijenjena pomoću Western blot analize. AGS stanice pokazuju višu razinu EGFR izražavanja nego druge dvije stanične linije. Nema značajne razlike između BGC823 i SGC7901 stanica (Slika S1A). BGC-pu6 stanica i BGC-sipk stanice su tretirane s različitim dozama EGF. Nakon 40 minuta otkrili smo razine fosforilacije za EGFR. našli smo najvišu razinu fosforilacije u dozi od 100 ng /ml (Slika S1B). Stoga smo odabrali dozu 100 ng /mL, kao najpovoljnijem kandidatu. Transjažice pokus također je pokazao jači sposobnost prodrijeti u martrigel u BGC823 stanicama (Slika S1C) pregled, doi:. 10,1371 /journal.pone.0067542.s001 pregled (TIF) pregled

• PLoS ONE: genetske varijante u epidermalni faktor rasta receptor stazu gena i rizik od jednjaka pločastih stanica i rak želuca u kineskoj populaciji
• PLO ON: male molekule R1498 kao dobro podnosi i oralno aktivan kinaze za hepatocelularni karcinom i raka želuca liječenje putem ciljanja angiogeneze i mitozu putova