Imunizacija s imunodominantan Helicobacter suis ureazu B uzrokuje djelomičnu zaštitu protiv H. suis infekcije miša model

imunizacija s imunodominantan Helicobacter suis pregled ureazu B uzrokuje djelomičnu zaštitu protiv H. suis
infekcije u mišjem modelu
Sažetak pregled Helicobacter pregled (H. pregled) suis pregled je svinja i ljudske želučane patogena. Prethodne studije na miševima pokazali su da je H. suis pregled infekcije ne rezultira zaštitnog imuniteta, dok je imunizacija s H. suis
cijele stanice lizat (Lizat) štiti od ponovne eksperimentalne infekcije. Stoga dvodimenzionalni gel elektroforeza H. suis
proteina izvršena zatim imunoblota sa združenim serumima dobivenim iz H. suis
- zaraženih miševa ili miševa imuniziranih lizata. Slaba reaktivnost protiv H. suis
proteina zabilježeno je nakon infekcije seruma. Serumi lizat imuniziranih miševa, međutim, pokazao imunoreaktivnost protiv ukupno 19 proteinskih točaka, koji su identificirani pomoću LC-MS /MS. H. suis pregled ureaza podjedinica B (UreB) pokazala je najizraženiji reaktivnost protiv serumi se lizat imuniziranih miševa, a nije otkriven na serume iz zaraženih miševa. Nitko od spojeni serumi otkriti H. suis
neutrofila koji aktivira protein A (NAPA). Je zaštitna učinkovitost intranazalnog cijepljenja BALB /c miševa s H. suis
UreB i Napa, i rekombinantno izražen u Escherichia coli
(rUreB i rNapA, respektivno), je uspoređena s H. suis
lizat. Sva cjepiva sadržane choleratoxin kao pomoćno sredstvo. Imunizacija miševa s rUreB i lizat izazvala je značajno smanjenje H. suis
kolonizaciju u odnosu na ne-cijepiti H. suis pregled -infected kontrole, dok rNapA imao značajan zaštitni učinak. Vjerojatno, kombinacija lokalnih Th1 i Th17 odgovora, dopunjena reakcija antitijela igraju ulogu u zaštitni imunitet protiv H. suis
infekcija. Pregled Uvod pregled Helicobacter pregled (H. pregled) suis pregled je svjetski raširena patogen, uglavnom kolonizaciji svinje. Infekcija sa ovim gram-negativna bakterija je povezan s čira na želučane sluznice bez žljezdanog [1, 2] i uzrokuje gastritis i smanjeni dnevni dobitak na težini [3] u svinja. H. suis pregled je također najčešći non-Helicobacter pylori Helicobacter pregled vrsta kod ljudi koji pate od želučanih bolesti [2] i svinje mogu poslužiti kao izvor H. suis
infekcije za ljude [2, 4 ]. Kontrola H. suis
infekcija zbog antibiotika na bazi terapiju se ne preporučuje dijelom zbog povećanog rizika od razvoja stekao antimikrobne rezistencije H. suis sojeva
i bakterije koje pripadaju normalnom svinjskog mikrobiota [5]. Imunizacija protiv H. suis Netlogu stoga može predstavljati vrijedan alternativu. Do sada je, međutim, nekoliko studija se bavila cijepljenja protiv ove svinje i uzročnika patogena.
Prethodnih studija u mišjem modelu pokazala je da je H. suis pregled infekcija ne rezultira zaštitnog imuniteta, a cijepljenje se temelji na homolognih (H. suis pregled) ili heterologne (H. bizzozeronii pregled ili H. cynogastricus pregled) lizat cijeloj stanici izaziva smanjenje ili čak potpuni klirens želučanog kolonizacije s H. suis Netlogu [6]. Međutim, upotreba ovog tipa vakcina ima nedostatke, uključujući i naporan in vitro kulturi H. suis
, što rezultira u poteškoćama proizvesti dovoljnu antigen. Također, cjelostaničnim lizati mogu sadržavati i zaštitni antigeni i antigeni supresije zaštite [7]. Učinkovita podjedinično cjepivo može biti korisno kao alternativa za kontrolu H. suis
infekcija. Immunoproteomics je odgovarajući pristup za brzu identifikaciju proteina kandidata za cijepljenje, a primjenjuje se za proučavanje i razvoj podjedinica cjepiva za širok raspon patogena [8].
To je bio cilj ove studije za odabir H. suis
proteini koji mogu izazvati zaštitni imunitet protiv H. suis
infekcije. Stoga, H. suis
proteini priznata serumu miševa imuniziranih s H. suis
cijelo stanični lizat i zaštićene od zaraze su identificirani pomoću dvodimenzionalne (2D) gel elektroforeze, nakon čega slijedi imunoblot i LC-MS /GOSPOĐICA. Serumi H. suis
- zaraženi miševi su također uključene, budući da infekcija ne rezultira zaštitom. Na temelju ove analize, imunoreaktivnost H. suis
ureaza podjedinica B (UreB) izabran je za daljnju in vivo ispitivanja. Kao kontrola smo uključili H. suis
neutrofila aktivirajući protein A (Napa), koji je prethodno opisan kao mogući faktor virulencije [9], ali nije bio prepoznat od seruma miševa imuniziranih s cijelog staničnog lizata. Nakon toga, zaštitna djelotvornost protiv H. suis pregled infekcija obje podjedinice cjepiva je procijenjena i uspoređena s onom H. suis
lizat u standardiziranom modelu miša. Pregled Materijali i metode
bakterijski soj
U svim eksperimentima, H. suis pregled soj 5 (HS5 GenBank: ADHO00000000) se koristi. Taj soj je izoliran iz sluznice želuca svinje u skladu s postupkom koji su opisali Baele i sur. [10]. Pregled životinje
jedan tjedan prije početka eksperimenta, pet tjedana stari specifičnih patogena -besplatni ženkama BALB /c miševa je dobiveno od ovlaštenog uzgajivača (Harlan, Horst, Nizozemska). Životinje su smještene na steriliziranim drveno iverje u filter vrh kaveza. Oni su hranjeni s porastomu komercijalnih dijeta (Teklad 2018S, HARLAN) i primljenih autoklaviranc vodu ad libitum
. Svi pokusi laboratorijskim životinjama su odobreni od strane Njega i Etičkog povjerenstva Veterinarskog fakulteta, Ghent University životinja. Pregled Immunoproteomics H. suis
dvodimenzionalne gel elektroforeze (2D-PAGE) pregled HS5 je odrastao kao što je ranije [11] što je opisano. Bakterija je skupljena centrifugiranjem (5000 g
, 4 ° C za 10 min) i ispere se četiri puta sa Hankovom uravnoteženom slanom otopinom (HBSS). Ukupni proteini (i topljive i netopljive proteina) ekstrahiraju se u dva koraka pomoću ReadyPrep ™ Uzastopno Extraction Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) prema uputama proizvođača. Kako bi se dobila dobre rezultate 2D-PAGE, Homogenati se pomiješa s odgovarajućim dodacima (5 mg koktel inhibitora proteaze, 1 ul DNAze, 1 ul RNAze A, 10 inhibitora ul fosfataza PP2 i PP3 (Sigma-Aldrich, Steinheim, Njemačka) ). Konačno, koncentracija proteina se odredi pomoću RC DC pregled proteinsku analizu (Bio-Rad) i proteini su pohranjeni na -70 ° C do daljnje upotrebe. Potom je 100 ug HS5 proteina su bile rehidrirane u 200 uL pufera (rehidracije 7M uree, 2M thioureum, 2% CHAPS, 0.2% nosača amfolita pH3-4, 100 mM ditiotreitol (DTT) i bromfenol plavo). Uzorci su pasivno apsorbira u ReadyStrip (11 cm, pH 3 do pH 10, Bio-Rad) i izo-električni fokusiranje provodi se u Protean IEF Chamber (Bio-Rad) kako je prethodno opisano [12]. Nakon izo-električni fokusiranje, trake se uravnoteži tijekom 15 minuta u 1.5% DTT u puferu za ujednačavanje (50 mM TrisHCl, pH 8.8 6M uree, 20% glicerola, 2% SDS), a zatim još jedan uravnoteživanja u 4% jodacetamidom u puferu za ekvilibraciju. Gel elektroforeza provedena na 10% SDS-PAGE TrisHCl upotrebom 150V 30 minuta, nakon čega slijedi 200V 1 h. Dva Gelovi su paralelno: jedna je označena s Sypro® Ruby gel Protein bojenje (Bio-Rad), dok je drugi bio korišten za imunoblot (vidi Western blot je opisano u nastavku). Prije bojenja, gelovi su fiksirani u 10% MeOH, 7% octene kiseline. Nakon bojanja, H. suis
proteini su vizualizirani korištenjem VersaDoc Imaging System (Bio-Rad)
serum bazeni
tri bazena mišjeg seruma su korišteni u ovom istraživanju.

Serumi miševa imuniziranih H. suis
cijele stanice lizat (u daljnjem tekstu: "Lizat imuniziranih miševa") (n pregled = 10). Ove životinje su inokulirane intranazalno dva puta s tri tjedna intervala od 100 ug HS5 lizat + 5 ug toksin kolere (CT) (List Biological Laboratories Inc., Madison, NJ, USA). HS5 lizat je pripravljen kao što je ranije ali bez konačne filtracije supernatanta [6] opisano. Tri tjedna nakon posljednje imunizacije, krv je sakupljena i serum su skupljene. Ova imunizacijski protokol je pokazala da je (djelomično) kao zaštita protiv H. suis
izazivanja [6] i zaštitni učinak je potvrđen ovdje u preliminarnom eksperimenta (podaci nisu prikazani).

Sera iz H. suis
-infected miševima (u daljnjem tekstu: "zaraženih miševa") (n pregled = 10). Ove životinje su inokulirane intragastrično s 200 ul Brucella juhe na pH 5, koji sadrži 10 ^{8 svježe pripravljenog H. suis
bakterije [11]. Četiri tjedna nakon infekcije, krv je sakupljena i serum su skupljene.}

Serumi negativnih kontrolnih miševa (n = 10 pregled). Ove životinje su dobile HBSS intranazalno dvaput s tri tjedna intervala, nakon unutaržclučanom inokulacije s 200 ul Brucella juhe na pH 5 (4 tjedna nakon zadnjeg lažne imunizacije). Nakon četiri tjedna, krv je sakupljena i serum su skupljene.
Svi serumi su čuvani na -70 ° C do daljnje upotrebe.
Western upijanja pregled Proteini su electrotransferred od gelova na nitroceluloznim membranama (Bio-Rad), kao što je opisano na drugom mjestu [12]. Membrane su blokirane u 5% obranim mlijekom u fosfat puferiranoj otopini soli (PBS) (pufer za blokiranje), inkubiraju preko noći (ON) s razrijeđenom mišjeg seruma (1/100 u puferu za blokiranje) na sobnoj temperaturi (RT), isprana u PBS sa 0.3% Tween-20 (wash pufer) i inkubirane 1 sat na sobnoj temperaturi uz stabilizirane kozji anti-mišji imunoglobulin G (IgG) hrena-peroksidaze (HRP), koje je konjugirano (1/1000 u puferu za blokiranje, Pierce, Rockford, IL, USA). Nakon koraka ispiranja u puferu za ispiranje, Imunodetekcija proteina izvedena je pojačanom detekcijom kemiluminescencije koristeći SuperSignal West Dura produženo podlogom (Pierce). Proteinski uzorci su skenirani i digitalizirana pomoću VersaDoc Imaging sustav. Svi pokusi su provedeni u triplikatu.
U gelu probavljanje proteina i identifikacije su masenom spektrometrijom
u gelu je izvedena razgradnja proteina kao što je opisano u Cheung i sur. [13]. Prije masene spektrometrije su izolirani peptidi su odvojeni na U3000 nano-visokodjelotvornom tekućinskom kromatografijom (HPLC) (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) kao što je prethodno opisano [14]. Pregled Identifikacija peptida je provedeno pomoću elektrospreja ionizacija četveropolno vremenska masena spektroskopija (ESI-Q-TOF) Ultima (Waters, Milford, MA, USA) kao što je prethodno opisano [14]. Analiza podataka izvršena je protiv Helicobacter pregled proteina podataka iz NCBI (146 612 unosa) pomoću in-house tražilice maskota Daemon (2.3, Matrix Science, London, UK). Pogreške tolerantni pretraživanje je provedeno s carbamidomethyl (C) kao fiksni modifikacije. Carbamidomethyl (N-terminalna) i oksidacija (M) su bili postavljeni na varijabilnim modifikacije. Peptid masa tolerancije i fragment mase tolerancije bila je postavljena na 0.35 Da i 0,45 Da, respektivno. Maksimalno dvije miscleavages bilo dopušteno. Proteini su uzete u obzir samo mora biti pravilno označeni kada značaj bio ispod 0.05 (p pregled < 0,05) i najmanje jedan peptid prošao tražene podebljano crvena od kriterija Maskota Daemon, što znači da je najmanje jedan peptid je imao rang 1 i značenje ispod 0,05.
jednodimenzionalna gel elektroforeze (1D-PAGE) i Western upijanja rUreB pregled 1D-PAGE 10 ug rekombinantnog H. suis pregled ureaza podjedinica B (rUreB) je izvedena kao što je opisano od strane Van Steendam et al. [12]. Serumi priprema i Western blot analize su izvedene kao što je opisano gore. Pregled Zaštitna djelotvornost rekombinantnog H. suis
proteina u mišjem modelu pregled Priprava rekombinantnog UreB pregled fragment koji kodira H. suis
UreB sekvenca (GenBank locus oznaka HSUHS5_0285) amplificiran je PCR-om upotrebom Pwo polimeraze s korekciju aktivnost (Roche, Mannheim, Njemačka) iz DNA HS5 (prednji primer 5'ATG AAA AAA TCT ATC AGG AAA GAA TAT G -3 'reverzni primer 5'CTA GTG ATG GTG ATG GTG ATG GAA CAA GTT GTA GAG AGC tTG 3') i klonira u ekspresijski vektor protein pET-24D. RUreB je izražen u E. coli
soju BL21 (DE3). Stanice su lizirane sonikacijom (5 puta po 30 sekundi) u puferu koji sadrži 50mM Na.PO 4 pH 7, 0,5 M NaCl, 1M DTT, 1% Triton X-100 i 1 mM PMSF. Nakon centrifugiranja (4 ° C, 20 000 g pregled za 30 min), rUreB pročisti iz topljive frakcije pomoću Ni-afinitetne kromatografije u puferu koji se sastoji od 1 M NaCl, 50 mM PBS, 1% Triton X-100, 250 mm imidazola i 10% glicerol (His GraviTrap GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden), nakon čega slijedi gel filtracijom na Superdex ™ 200 HR 16/60 kolona (GE Healthcare Bio-Sciences AB). Nakon čišćenja, rUreB analizirana je pomoću SDS-PAGE i Western blot analizom korištenjem anti-heksahistidin-tag mišje monoklonsko protutijelo (Icosagen Cell Tvornica, Tartu, Estonija). Detergent Triton X-100 je uklonjen iz pročišćenog rUreB pomoću Pierce deterdžent za uklanjanje Spin Columns (Pierce) u skladu s uputama proizvođača. Koncentracija proteina je određena RC DC pregled protein test (Bio-Rad). pregled, izradu rekombinantne Napa pregled Protein je izražen u E. coli
Expression sustava s Gateway® Technology (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) kao što slijedi. Fragment kodira H. suis
neutrofila aktivirajući protein A (Napa) sekvenca (GenBank locus oznaka HSUHS5_0014) amplificiran je PCR-om upotrebom Pwo polimeraze s korekciju aktivnost (Roche) s DNA HS5 (prednji primer: 5 ' - CACCATG AAAGCAAAAACAGTTGATGTACTC -3 'reverzni primer 5'TTAAGCCAAACTTGCCTTAAGCATCC 3') i klonira u pENTR ™ /TEV /D-TOPO® vektorom i prenese u pDEST17 ™ odredište vektor. Odabrani pDEST17-Napa plazmid je transformiran u BL21-AI ™ E.coli
i zatim se uzgajaju na 37 ° C do OD 600 od 0.6-1.0 u Luria Broth obogaćenom s 50 ug /mL karbenicilina. Rekombinantne H. suis pregled Napa (rNapA) izražavanja bila je izazvana dodatkom 0,2% L- arabinoza. Nakon 4 h inkubacije pri 37 ° C, stanice su sakupljene i ponovno suspendirane u puferu za lizu: 50 mM TrisHCl, 100 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,2 mg /ml lizozima, 20 ug /ml DNAze, 1 mM inhibitora proteaze (Sigma) i 1 mM MgCl 2. Stanice su lizirane s ultrazvukom (5 puta za 30 sekundi). Talog i inkluzijskih tijela je izolirana centrifugiranjem na 4 ° C (20 000 g
30 min). Inkluzijska tijela su zatim isprane dva puta na osnovi slijedećim protokolom talog se ponovno suspendira u hladnom puferu za lizu, sonicirane 5 puta po 30 sekundi i zatim centrifugiranjem (4 ° C, 20 000 g pregled za 30 min). Isprane Inkluzijska tijela su solubilizirana u puferu za vezanje, pH 8 (6M HCl gvanidijev, 20 mM TrisHCl, 0,5 M NaCl, 5 mM imidazola, 1 mM β-mercaptomethanol) laganim okretanjem tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi. Netopljivi materijal je uklonjen centrifugiranjem brzinom visoka pri 4 ° C (100 000 g
30 min). rNapA je pročišćen iz pročišćenog supernatanta na Ni-Sepharose stupca (His GraviTrap GE Healthcare Bio-Sciences AB) u skladu s uputama proizvođača. rNapA se ispere s puferom za ispiranje, pH 8 (8 M urea, 20 mM TrisHCl, 0,5 M NaCl, 0,5 M imidazola, i 1 mM P-merkaptoetanol) i ON dijaliziran od PBS na 4 ° C. Nakon toga, rNapA analiziran je pomoću SDS-PAGE i protein se odredi koncentracija pomoću RC DC pregled za ispitivanje proteina (Bio-Rad). Pregled Imunizacija i infekcije eksperimenti
Eksperimentalni postupak je sažet u slici 1. pet skupina 10 miševa je intranazalno inokuliran dva puta sa 3 tjedna intervala, svaki put s 17,5 ul inokuluma. U grupama 1, 2 i 3 sastoji se inokulum HBSS s 5 ug CT, koji sadrži 30 ug rUreB, 30 ug rNapA i 100 ug HS5 lizat, respektivno. Skupina 4 (sham imuniziranih skupina) i 5 (negativna kontrolna skupina) su inokulirane HBSS. Tri tjedna nakon druge intranazalnu imunizaciju, krv je skupljena rep krvarenje iz pet životinja po skupini i jedan tjedan kasnije, sve životinje, osim negativnoj kontrolnoj skupini, su inokulirane intragastrično s 200 ul Brucella smjese na pH 5, koji sadržava 10 8 izvediv H. suis
bakterija [11]. Negativa kontrolna skupina je inokulirano intragastrično s 200 ul Brucella smjese na pH 5. Četiri tjedna nakon inokulacije unutarželučane, miševi su eutanazirani cervikalnom dislokacijom slijedećim anestezijom izofluranom (IsoFlo, Abbott, IL, USA). Od eutanazirana životinje, krv je sakupljena srčanom punkcijom, sterilnoj, centrifugira (1000 g pregled, 4 ° C, 10 min), a serum je zamrznuta na -70 ° C do daljnje upotrebe. Želudac bili odstranjeni i razrezani uzduž veće zakrivljenosti. Jedna polovica želuca, uključujući antruma i fundusa odmah stavi se u 1 ml RNA poslije (Ambion, Austin, TE, USA), i pohranjeni na -70 ° C za daljnju RNA- i DNA-ekstrakciju. Uzdužnih traka želučanog tkiva je odsječen od jednjaka do duodenuma uzduž veće zakrivljenosti za histopatološko ispitivanje. Slika 1 Eksperimentalni dizajn studija cijepljenja. Po skupini 10 miševi su intranazalno imunizirani dvaput 3 tjedna intervala, svaki put s 30 J..lg rUreB + 5 J..lg toksin kolere (CT); 30 ug rNapA + 5 ug CT i 100 ug HS5 lizat + 5 ug CT (skupine 1, 2 i 3, respektivno). Skupina 4 (sham imuniziranih skupina) i 5 (negativna kontrolna skupina) su intranazalno inokuliranih sa HBSS. Tri tjedna nakon druge imunizacije, krv je sakupljena iz 5 miševa po skupini i jedan tjedan kasnije miševi skupina 1, 2, 3 i 4, intragastrično su inokulirani s 108 izvediv H. suis
bakterija. Skupina 5 intragastrično inokulirano sa HBSS. Četiri tjedna nakon unutarželučanom pobude miševi su eutanazirani.
Kvantifikacije H. suis
u želucu pregled Nakon otapanja u želucu tkiva homogenizirana (MagNAlyser, Roche, Mannheim, Njemačka) u 1 mL Tri Reagent® RT (MRC, Brunschwig Chemie, Amsterdam, Nizozemska) i DNA je izvađen iz inter- i organska faza u skladu s uputama Tri Reagent® RT proizvođača. Bakterijskog opterećenja u želucu je određena primjenom prethodno opisanog H. suis
određeni kvantitativni PCR u realnom vremenu (qPCR) [5]. Pregled Analiza odgovora želuca citokina
ekspresije IFN-y, IL-4, IL-10, IL-17 i TNF-α određene su pomoću qPCR korištenjem cDNA sintetizirana iz želuca tkiva kao što je prije opisano [15]. Prag ciklusa (CT) se normalizira na geometrijske sredine od CT-vrijednosti iz referentnih gena nakon što su normalizirani mRNA razine izračunate su pomoću 2 -ΔΔCt metoda [16]. Pregled Mjerenje odgovora seruma protutijela po imunoenzimski testu (ELISA)
proteina detektor ™ ELISA Kit (KPL, Gaithersburg, MD, USA) je korišten za procjenu rUreB-, rNapA- i HS5 lizat specifični IgG u serumu. Ukratko, 96 jažica ravnog dna (Nunc MaxiSorp, Nalge Nunc Int., Rochester, NY, USA) obložene su s 2 ug /jažici pročišćene rNapA, 1 | ig /jažica pročišćene rUreB ili 1 ug /jažica H. suis pregled stanični proteini cijeli razrijeđen u 100 ul pufera za oblaganje (24 h, 4 ° C). Nakon blokiranja s 1% albumina goveđeg seruma u PBS-u, 100 uL 1/400 razrijeđenog seruma dodan je u svaku jažicu. Nakon dodatnog ispiranja, 100 ul HRP-obilježeni anti-mišji IgG je dodan (H + L), u konačnoj koncentraciji od 50 ng po jažici. Pet minuta nakon dodavanja 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonske kiseline) (ABTS) otopina peroksidaznog supstrata, apsorbancija je očitana na 405 nm (OD 405 nm). Pregled Histopatološka ispitivanja pregled uzdužne trake želučanih tkiva su fiksirani u 4% fosfatno puferiranoj formaldehida obrađuje standardnim postupcima i uklopljene u parafin. Za procjenu gastritis, hematoksilinom - eozinom (HE) Obojeni dijelovi 5 um su slijepo boduju na stupanj infiltracije limfocita, plazma stanica i neutrofili, koristeći vizualne analogne skale sličan Obnovljeno Sydney sustava (na skali od 0 i 3) [17] sa sljedećim specifikacijama za svaki gastritis bodova: 0 = nema infiltracija mononuklearnih i /ili polimorfonuklearnih stanica; 1 = blaga difuzno infiltracija mononuklearnih i /ili polimorfonuklearnih stanica; 2 = umjereno difuznog infiltraciju mononuklearnih i /ili polimorfonuklearnih stanica i /ili prisutnosti jednog ili dva upalnih agregata; 3 = obilježena difuzno infiltracija mononuklearnih i /ili polimorfonuklearnih stanica i /ili prisutnost najmanje tri upale agregata.
Statistička analiza pregled, normalnosti i varijance homogenosti podataka analizirana je pomoću D'Agostino-Pearson i Shapiro- Wilk Test normalnosti. Značajne razlike u H. suis
kolonizacije i mRNA ekspresije citokina između skupina ispitana izvodeći jednosmjernu ANOVA analize. Bonferronijev višestruke usporedbe test korišten je kao post-hoc, kada se procjenjuje jednake varijance. Dunnett T3 post-hoc test je korišten kada su ocijenjeni nema jednake varijance. OD razina 405nm sa ELISA i histološke upale rezultata uspoređene su Kruskall-Wallis analiza, nakon čega slijedi Mann-Whitney U pregled, test. Za korelacija između različitih varijabli, izračunat je Spearmanov koeficijent p (ρ pregled). GraphPad Prism5 software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) je korišten za sva analize. Statistički značajne razlike između skupina bile uzete u obzir pri p Netlogu < 0,05. Pregled Rezultati
Immunoproteomics H. suis
H. suis
proteini su razdvojeni na 2D-PAGE (slika 2a). Nakon 2D imunoblota sa združenim serumima dobivenim iz lizata imuniziranih (slika 2b) ili H. suis
-infected životinje (slika 2c), odabrani su ukupno 19 imunoreaktivnih proteina mjesta. Te točke su uspoređeni s proteinskim mrlje koje se mogu vidjeti u paralelnom 2D-PAGE (Slika 2a). Malo reaktivnost protiv H. suis
proteina je zabilježena u serumu nakon infekcije u odnosu na velike reaktivnosti od seruma lizat imuniziranih miševa. Kada je mrlja bila ispitana s bazenom seruma dobivenog od negativnih kontrolnih miševa, nema specifičnih Imunoreaktivni proteinske mrlje su otkrivene (Dodatni file1). Mjesta od interesa (n pregled = 19) su izrezana iz gela, probavlja i identificirati pomoću LC-MS /MS analizom. Detaljne rezultate tih proteina su prikazani u tablici 1. Mjesta s najvećom reaktivnost (točke 1 do 5) je identificiran kao UreB. H. suis pregled chaperonin GroEL, a označeni kao mrlja 9 i 10 na slici 2a, pokazalo je također snažan hibridizacija serumi se lizat imuniziranih životinja. Osim toga, serum iz lizat imuniziranih miševa pokazali su jaku reaktivnost protiv ureaza pribora proteina (UreH) i ureazu A (urea) (vidio 15 do 19), što je manje izražena u inficiranom skupini. Slaba reaktivnost protiv velikog flagellin ZBPP (vidio 11 do 13) bila je prisutna u oba mrlja. Slika 2 H. suis 2D Proteom profil (A) i Western hibridizacija duplikatu 2D-gelu reagira sa sakupljenim seruma lizat imuniziranih miševa (B) ili H. suis -infected miševa (C). 100 J..lg ukupnog proteinskog ekstrakta H. suis Netlogu odvojen je 2D-elektroforeza linearnom pH 3 do 10 gradijenta u prvoj dimenziji i 10% TrisHCl SDS-PAGE u drugoj dimenziji. Razdvojene proteini detektirani su SYPRO®Ruby Protein bojanja. Uokvirenih područja pokazuju gdje Imunoreaktivni antigeni su izrezana iz gela i podvrgnuti LC-MS /MS. Identificirani proteini označeni su nasumičnih brojeva danih u tablici 1. Kutije i brojevi u crvenom su identificirani kao UreB. Položaj molekularne mase (MW) se daje na desnoj strani, a pH se daje na dnu. Pregled Tablica 1 imunoreaktivnog proteini H. suis identificirati LC-MS /MS pregled Spot br.1
pregled ime Protein
NCBI ID2
Gene
PI3
MW3
br nađeno peptidi pregled
maskota score4
korica. (%) 5
1 pregled ureazu B pregled EFX42254 pregled ureB
5.97 pregled 62,967
117 pregled 1589
72
2 pregled ureazu B pregled EFX42254 pregled ureB
5.97 pregled 62,967
80 pregled 1042
58 pregled trconila-tRNA sintetazu pregled EFX41598 pregled thrS
6,34 pregled 69,315
7
186 pregled 60 pregled 3 pregled ureazu B pregled EFX42254 pregled ureB pregled
5,97 pregled 62,967
80 pregled 903 pregled 46
4 pregled ureazu B pregled EFX42254 pregled ureB
5.97 pregled 62,967 pregled 4. pregled 103 pregled 6
5 pregled ureazu B pregled EFX42254 pregled ureB
5.97 pregled 62,967
4
103 pregled 6 pregled 6 pregled 30S ribosomalni protein S1 pregled EFX42427 pregled rpsA
8,29 pregled 64,051
23 pregled 625 pregled 28 pregled Quinone-reaktivni Ni /Fe hydrogenase, velike podjedinice pregled EFX41851 pregled hydB
8,22 pregled 64,943
19 pregled 520 pregled 28 pregled Ureaza od H. heilmannii
AAA65722
8,86 pregled 25,844
8
258 pregled 26 pregled 7
metil-prihvaćanje kemotaksije proteina pregled EFX43528 pregled 7.1
48.907
35
905 pregled 50 pregled osam pregled faktor Istezanje G pregled EFX41637 pregled Fusa
5,15 pregled 77,242
57 pregled 1066
55
9 pregled Chaperonin GroEL pregled EFX42237 pregled GroEL
5,58 pregled 58,498
150 pregled 3085
78 pregled, 10 pregled Chaperonin GroEL
EFX42237 pregled GroEL
5,58 pregled 58,498
135 pregled 2647
73 pregled ureazu B pregled EFX42254 pregled ureB
5.97
62,967 pregled 43 pregled 682 pregled 41 pregled, 11 pregled Flagellin pregled EFX41982 pregled ZBPP
7,77 pregled 54,232 pregled 29 Netlogu 756 pregled 47 pregled, 12 pregled Flagellin pregled EFX41982 pregled ZBPP
7.77 pregled 54,232
57 pregled 1294
62
13
Flagellin pregled EFX41982 pregled ZBPP
7.77 pregled 54,232
46 pregled 1085
63 pregled faktor Trigger pregled EFX42378 pregled TIG
pregled 5.13 pregled 49,587
12 pregled 343 pregled 24 pregled, 14 pregled Hydrogenase izraz /formaciji proteina pregled EFX41790 pregled hypB
5,59
27,617 pregled 15 pregled 314 pregled 35 pregled nikotinatnc-nukleotid pyrophosphorylase pregled EFX42191 pregled NADC
6,46 pregled 30,591
11 pregled 219
25 pregled 7-alfa-hidroksisteroid dehidrogenaze pregled EFX41880
6,62
28.246
6
186 pregled 24 pregled konzervirani hipotetski izlučeni protein pregled EFX42511 pregled hdhA
5,84 pregled 28,011
5
174 pregled 19 pregled hipotetske protein HSUHS5_0308 pregled EFX42276
5,47 pregled 29,471
9 pregled 171
24 pregled Peroxiredoxin pregled EFX42277 pregled 5,84 pregled 25,811
7
107 pregled 19 pregled, 15 pregled Ureaza pomoćni protein pregled EFX42255 pregled ureH
pregled 6.79 pregled 30,447
4
106 pregled 13 pregled, 16 pregled ureazu pregled EFX42255 pregled urea
7,79
27,389 pregled 24 pregled 270 pregled 55 pregled, 17 pregled ureazu pregled EFX42255 pregled urea
7,79
27.389
28
112 pregled, 45 pregled, 18 pregled ureazu pregled EFX42255 pregled urea
7.79 pregled 27,389 pregled 57
418
69
19
ureazu pregled EFX42255 pregled urea
7.79 pregled 27,389 pregled 75
568 pregled 73 pregled 1 Protein Spot koji odgovara položaju na gelu i mrlja ( vidi sliku 2) pregled 2NCBI pregled.. Nacionalni centar za biotehnološke informacije pregled 3 Teorijski izoelektrične točke (pl) i molekularna težina (MW) pregled, 4 Helicobacter pregled podataka, maskotu rezultate veće. od 40 su značajne (p pregled ≤ 0,05). pregled, 5% od proteinske sekvence koje se odnosi peptida identificirani. pregled Potvrda serumu reaktivnost protiv rUreB Netlogu iz 2D-analize, UreB pokazali izrazitu reaktivnost serume iz Lizat imuniziranih miševa, što nije primjećeno u serumu od ne-imuniziranih ali zaraženih miševa. U cilju potvrde tih podataka, A 1D-PAGE učitava s rUreB je izvedena, a zatim imunodetekcijom sa serumima uzetim od Lizat imuniziranih i H. suis pregled -infected miševa. 0.01. Svi autori pročitali i odobrili konačnu rukopis. Pregled

• Karakterizacija profila genske ekspresije za različite vrste mastocita pomiješanih s mišem želuca subregija s metodom RNA amplifikacije
• Kliničkopatološkim karakteristike i prognostičku analizu Lauren klasifikaciji u želučanom adenokarcinoma u China