PLoS One: SIRT3 Javítja Glikolízis és elterjedése SIRT3 expresszáló gyomorkarcinóma Cells

absztrakt katalógusa

SIRT3 kulcsfontosságú NAD ^{+ - függő protein dezacetiláz a mitokondriumokban emlős sejtek működését, hogy megakadályozza a sejtek öregedését és transzformáció szabályozásában mitokondriális anyagcsere homeosztázis. Azonban SIRT3 is megtalálható kifejezni bizonyos humán tumorok; szerepe az ezekben SIRT3 expresszáló tumorsejtek kell tisztázott. Ez a tanulmány igazolta, hogy a kifejezés a SIRT3 emelkedett volt egy csoport gyomorrák-sejtek, mint a normál gyomornyálkahártya sejtekben. Bár SIRT3 expressziós szinteket nőtt a gyomor tumor szövetekben, mint a szomszédos, nem tumoros szövetben, SIRT3 pozitív rákos sejtek gyakrabban kimutatni az intesztinális típusú gyomor rákos megbetegedések, mint a diffúz típusú gyomor rák, jelezve, hogy SIRT3 kapcsolódik altípusok gyomor- rák. Overexpressziója SIRT3 mozdítani sejtproliferáció és a fokozott ATP-termelés, a glükóz felvételét, glikogén képződés, MnSOD aktivitás és a laktát termelést, amelyeket gátolható SIRT3 knockdown, jelezve, hogy SIRT3 szerepet játszik átprogramozni a bioenergetika a gyomor tumorsejtekben. További elemzés azt mutatta, hogy SIRT3 kapcsolatban, és dezacetilezett a laktát-dehidrogenáz A (ldhA), kulcsfontosságú fehérje szabályozásában anaerob glikolízis, fokozza ldhA tevékenység. Konzisztens, a klaszter a glikolízis-asszociált gének fokozódik a SIRT3 overexpresszáló gyomor daganatos sejteket. Így amellett, hogy a jól dokumentált SIRT3-mediált mitokondriális homeosztázis a normális sejtekben, SIRT3 fokozhatja glikolízis és a sejt proliferációt SIRT3-t expresszáló rákos sejteket.}

bevezető hivatkozás: Cui Y, Qin L, Wu J, Qu X, Hou C, a Sun W, et al. (2015) SIRT3 Javítja Glikolízis és elterjedése SIRT3 expresszáló Gyomor rákos sejteket. PLoS ONE 10 (6): e0129834. doi: 10,1371 /journal.pone.0129834 katalógusa

Szerkesztő: Xianglin Shi, University of Kentucky, Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: április 16, 2015; Elfogadva: 13. május 2015; Megjelent: június 29, 2015 katalógusa

Copyright: © 2015 Cui et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra katalógusa

Az adatok elérhetősége: Minden lényeges adatot belül a papír és az azt támogató információs fájlokat. katalógusa

Forrás: Ez a tanulmány részben támogatta a Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína, Key Program (30930105), a Nemzeti 05/12 Support terv Projekt Minisztérium Tudományos és Technológiai Kína (2012BAH30F03), a Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (31070740), a 985 és 211 Projects Xi'an Jiaotong Egyetem (JKL) és a National Cancer Institute RO1 támogatás CA152313-01-A1 (JJL).

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. katalógusa

Bevezető katalógusa

sirtuins, egy család NAD ^{+ - függő hiszton dezacetilázok (HDAC-k) az emlősök sejtek, érintettek a sokféle fizikai folyamatok, beleértve a sejtek túlélését, az apoptózis, anyagcsere, stressz válaszok, az öregedés és a hosszú élettartam [1,2]. Közül hét Sirtuin tagok (SIRT1-7), SIRT3 a legjobban jellemzett mitokondriális Sirtuin, működését, hogy szabályozza a mitokondriális részt vevő proteinek oxidatív foszforiláció, zsírsav-oxidáció, a karbamid ciklus, és az antioxidáns válasz [2-9]. Számos tanulmány kiemelte a SIRT3 az anyagcserében és a homeosztázis a normális sejtekben, és kiderült, az új célok és szubsztrátjai SIRT3 függő deacetilálás [10]. Kim és munkatársai számoltak be, hogy SIRT3 kulcsfontosságú mitokondriumok fehérje, és a hiánya a SIRT3 kifejezés kapcsolódik fokozott mitokondriális DNS-károsodás és az öregedés, valamint a nagyobb potenciállal Ras által indukált sejt átalakulás és SIRT3 közvetített MnSOD aktiválás hozzájárul a mitokondriális homeosztázis [11,12]. Alátámasztására, humán embrionális vese 293 sejteket (HEK293) sejtek fokozottan SIRT3 kifejezés alatt az oxidatív stressz, ami a dezacetilezés és aktiválását MnSOD [13]. SIRT3 úgy működik, mint egy tumor szuppresszor gén, és kulcsfontosságú szerepet játszik a fokozásában sejt homeosztázisban az öregedés ellen és a karcinogenezis.}

Azonban néhány tumorsejtek mutatják expresszióját SIRT3 és a lehetséges szerepét SIRT3 ezekben tumorsejtek , különösen annak potenciális kapcsolatban az agresszív fenotípusa, eddig ellentmondásos [14]. SIRT3 expresszió alacsonyabb vagy nem kimutatható egy sor emberi rákos megbetegedések, beleértve a mellrák, glioblasztóma, vastagbélrák, és oszteoszarkóma, prosztata- és petefészekrák [11,15,16]. SIRT3 indukálja a növekedés és apoptózis szelektív silencing a Bcl-2 HCT116 sejtek keresztül modulációs JNK2 jelátviteli [17]. Továbbá, SIRT3 tűnik, hogy hozzájárulhat a fokozott érzékenység a humán leukémia sejtek a kemoterápiás esetleg indukciója révén a mitokondrium-közvetített apoptózis [18]. Másrészt, SIRT3 kifejezés is megtalálható növelni kell a szájüregi rák, nyirokcsomó-pozitív emlőrák, nyelőcsőrák, és a pajzsmirigy karcinómák; és a megnövekedett SIRT3 társul magasabb malignus fenotípussal és alulszabályozása SIRT3 fokozza a tumor érzékenységét rákellenes kezelést [19-23]. Ezek az eredmények figyelmezteti a másik szerepét SIRT3 bizonyos tumorok, hogy kell értelmezni. Katalógusa

A rákos sejtek aktív anyagcserét, és többet fogyasztanak celluláris üzemanyagot fogyaszt, mint a normál sejtek. Ugyanakkor a rákos sejtek támaszkodnia elsősorban az ATP szintézist aerob glikolízis, a funkció, az úgynevezett Warburg hatás [24]. Egy ilyen aerob glikolízis úgy vélik, hogy megvédje a rákos sejtek képezik az oxidatív stressz, mivel a mitokondriális légzés a fő forrása a ROS [25]. A laktát-dehidrogenáz A (ldhA) egy enzim szabályozására egymásba között piruvát és az L-laktát reverzibilisen az utolsó lépésben az anaerob glikolízis [26]. Gátlása ldhA csökkenti a tumorkeltő potenciál fokozott mitokondriális oxigénfogyasztás és a csökkent mitokondriális membránpotenciál [26] és a teljes sejt ATP-termelését és glikolízis [27]. Katalógusa

Ebben a tanulmányban azt vizsgáltuk, hogy lehetséges szerepét SIRT3 a gyomor rákos sejtek, amelyek kifejezik SIRT3. Expression of SIRT3 ben kapcsolódik az agresszív növekedés, melyet közvetítik SIRT3-dezacetilezett és aktivált ldhA, fokozva glikolízis és kifejezése egy csoport glikolízis-asszociált gének. Így SIRT3-ldhA közvetített glikolízis anyagcsere lehet potenciális terápiás célpont a rák kezelésére expresszáló sejtek SIRT3. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Sejtvonalak és tenyésztési katalógusa

Az emberi gyomorrák sejtvonalak MGC-803, HGC-27, SGC-7901 [28] és AGS [29] és immortalizált humán gyomornyálkahártya sejtvonal GES-1 [30] RPMI-1640 tápközegben (Invitrogen), kiegészítve 10% magzati borjú szérumot és 1% penicillin /sztreptomicint, és a tenyésztést 37 ° C-atmoszférában, 5% CO2.

Immunprecipitáció és Western-blot-

szubkonfluens sejteket lizáltuk, és a lizátumot inkubáltuk protein a /G agarózgyöngyöt plusz az ajánlott mennyiségű elleni antitestek vagy SIRT3 (Cell Signaling Technology) vagy ldhA (Mikulás Cruze), 4 ° C-on egy éjszakán át. A mintákat centrifugáljuk, és elválasztottuk SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel és elektroblottolással nitrocellulóz membránra. Blokkolás után 5% -os nem zsíros tejjel TBST-ben, membránokat primer antitest, 4 ° C hőmérsékleten egy éjszakán keresztül, majd inkubáltuk szekunder antitesttel 1 órán át szobahőmérsékleten kevertetjük. Proteinek tettük láthatóvá ECL kimutatási kit (Thermo Fisher).

Immunhisztokémia assay

Patológiai diákat gyomorrák szomszédos normális szövetekben immunhisztokémiával analizáltuk assay végeztük a gyártó utasításai szerint. A polimer Detection kit az immunhisztokémiai analízis vásárolt Zhongshan Golden Bridge biotechnológia. Röviden, paraffin metszeteket viaszmentesített és újra hidratált etanolban (100%, 90% és 75%). A metszeteket 3% -os H _{2 O 2 szobahőmérsékleten 10 percig, majd blokkoltuk nem-immun kecske szérummal szobahőmérsékleten 15 percig. A metszeteket ezután primer antitesttel inkubáltuk, hogy SIRT3 (Cell Signaling Technology) 2 órán át szobahőmérsékleten, majd anti-nyúl szekunder antitesttel inkubáltuk 15 percig szobahőmérsékleten. A metszeteket ezután inkubáltuk DAB kimutatási reagenssel 2 percig minden egyes, ellenfestjük hematoxilinnel és dehydraded etanolban (90% és 100%). A metszeteket szerelve, és a festést szerint analizálandó mikroszkópiával.}

Plazmid építési és sejt transzfekciós

SIRT3 teljes hosszúságú cDNS-t szintetizáltunk RT-PCR kivont teljes RNS-GES-1 sejtek sablon (primerek: 5 'CCGCGGTACCATGGCGTTGTGGGGTTG 3' és 5 'CCGCTCTAGACTATTTGTCTGGTCCATCAAGC 3'). A cDNS-t ezután klónoztuk pcDNA3.1 + expressziós vektorba (Invitrogen). A pGPH1 /GFP /Neo-SIRT3-shRNS plazmid célzási humán SIRT3 (5 'CTTGCTGCATGTGGTTGAT 3') és a kontroll shRNS plazmidot kaptuk GenePharma. A generál Stabil transzfektánsok AGS, SGC-7901 sejteket Lipofectamine 2000 reagenssel (Invitrogen) és a stabil transzfektánsokat által kiválasztott 400ug /ml G418 (Gibco). Katalógusa

A sejt proliferációt és clonogenicity assay katalógusa

a proliferációs vizsgálathoz a sejteket szélesztünk egy 6 mérőhelyes lemez 2 x 10 ^{4 sejt /lyuk. A sejtproliferációt számítottuk a 2., 4., 6., és 8. szélesztés után. A clonogenicity vizsgálathoz a sejteket szélesztünk egy 6 mérőhelyes lemez változatos sejt számok és tenyésztjük 14 napig, és kolóniákat ezután megfestettük kristályibolya, és a telepek számát (> 50 sejt /telep) megszámoltuk a kialakult módszerek [31].}

mérése glükóz, laktát és a glikogén

a fenolvörös-mentes táptalajt használunk kultúra sejteket 6 mélyedéses lemezen 24 óra hosszat, és a szintek glükózfelvétel és laktát-termelés mértük a glükóz vizsgáló Kit és a tejsav Kit (Jiancheng Biomérnöki Intézet). A relatív értékeket normalizáltuk, hogy a sejtek száma minden egyes lyukba. Cellular glikogén szint alkalmazásával detektáltuk glikogén Assay Kit (BioVision). Röviden, 1 × 10 ^{6 sejteket homogenizáltuk 200 pl vizet adtunk, és a homogenizátumokat 5 percig forraljuk, hogy inaktiváljuk az enzimek és centrifugáltuk 13.000 rpm-en 5 percig 4 ° C-on oldhatatlan anyag eltávolítása céljából. A glikogén termelés mértük az OD-érték 570 nm-en.}

mérése ATP termelés

sejt ATP és a ROS-szinteket mértünk, mint a korábban leírt [32]. A sejteket tenyésztettük, egy 6 mérőhelyes lemez után különböző kezelések, lizáltuk és a sejt ATP-szinteket mértük az ATP biolumineszcencia Assay Kit (Sigma). Mérésére glikolízis-mediált ATP termelés sejteket kezeltünk 2 uM rotenon előtt 24 órán át mérésekkel.

mérése ROS-termelés

Cellular ROS-termelés mértük 5- (és 6) karboxi-2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetát (DCFDA) módszerrel mikrolemez spektrométert (Thermo Fisher) 488 nm /530 nm-es hullámhosszon.

MnSOD aktivitás

tenyésztett sejteket egy 6-lyukú lemez lizáltuk és MnSOD aktivitását úgy határoztuk meg, WST-8 módszerekkel a MnSOD assay kit (Beyotime) a gyártó utasításai szerint.

tumorképző assay nude egerekben

SGC7901 sejteket (7,5 x 10 ^{6) a SIRT3 túltermeléssel vagy knockdown szuszpendálunk 0,1 ml PBS-ben, és beoltjuk vagy horpasz 5-hetes hím BALB /c csecsemőmirigy nélküli csupasz egereket, és a 28 napon az inokulálás után, amikor a maximális tumor térfogata (~ 1500 mm 3) elérte a kontroll csoportban, a kísérleteket megszűnik, és minden tumorok minden csoportból kimetszettük és lemértük. A kísérleti eljárás állatkísérleteket igénylő végeztek összhangban intézményi előírásoknak; Az Institutional Animál Care and Use Committee (IACUC) at Xian Jiao Tong University kifejezetten jóváhagyja a jelen tanulmány (jegyzőkönyvx181). katalógusa}

A laktát dehidrogenáz assay katalógusa

A laktát-dehidrogenáz aktivitás meghatározása a kialakult protokoll csökkenésének mérésével ráta az abszorbancia 340 nm hullámhosszon eredő NADH oxidációját [27]. Röviden, a sejteket tenyésztjük 10 cm-es csészékben és homogenizáljuk PBS-ben, jégen. A homogenizátumokat adagoltunk pufferben, amely 6,6 mM NADH-t, 30 mM nátrium-piruvátot és 0,2 M Tris-HCl, pH = 7,3 és összekevertük. Inkubáljuk a keveréket 5 percig, hogy elérjék hőmérséklet kiegyenlítődése, majd rögzíti a csökkenés mértéke abszorbancia 340 nm-en.

SIRT3 in vitro
dezacetilezési assay

Emberi SIRT3 rekombináns enzim ( BPS) inkubáltunk L-tejsav-dehidrogenáz a szarvasmarha szív (Sigma) reakció puffert (50 mM nátrium-klorid, 4 mM MgCI _{2, 10 mM NAD ^{+, 50 mM DTT, 50 mM Tris, pH = 8,0) /nélkül SIRT3 inhibitor nikotinamid (NAM, 10 mmol) 37 ° C-on 1,5 órán át, majd a reakciót használják ldhA aktivitás assay le, mint fentebb.}}

Real-time PCR

Teljes RNS-t izoláltunk TRIZOL reagens (Invitrogen) végzett kezelés követ fenol /kloroform és a csapadék 2-propanollal. A teljes RNS-üledéket ezután mossuk, 75% -os etanollal, és újra szuszpendáljuk vízben. Az RNS-t reverz transzkripció PrimeScript RT-PCR Kit (Takara), és kvantitatív valós idejű PCR-analízise bíró gének végeztük SYBR PremixExTaq II készlet (Takara), a gyártó utasításai szerint. Adatokat normalizáltuk a szintje γ-tubulin.

Immunfluoreszcens

AGS sejteket oltottunk a fedőlemez egy 6 mélyedéses lemezen fixáltuk 4% paraformaldehiddel 10 percig, és blokkoltuk 1% BSA, 1 órán át szobahőmérsékleten kevertetjük. Inkubáljuk a sejteket primer antitestekkel elleni SIRT3 és ldhA át 4 ° C-on egy éjszakán át, majd inkubáltuk fluoreszcens-konjugált másodlagos antitesttel 1 órán át szobahőmérsékleten kevertetjük. Counterstaining végeztük DAPI felhasználásával immunfluoreszcens készlet (Beyotime). A sejteket rögzítése és képalkotása lézer konfokális mikroszkóppal. Katalógusa

A statisztikai elemzés katalógusa

Az adatokat átlag ± SE legalább három független kísérlet. A statisztikai analízist a páratlan kétfarkú Student-féle t-teszt, kivéve, ha másként nem jelezzük. P katalógusa < 0,05 értéket tekintettük szignifikánsnak. Katalógusa

Eredmények katalógusa

SIRT3 kifejezés a gyomorrák sejtek katalógusa

SIRT3 jól definiált szabályozásában mitokondriális homeosztázis anti-aging és anti-transzformáció. A közelmúltban, különböző eredményeket illetően, hogy SIRT3 által közvetített sejt-gátlás és proliferációját, ami a vita a szerepek rákok [19,20]. Annak megállapításához, a lehetséges szerepét SIRT3 a gyomorrák, expresszióját SIRT3 detektáltunk 4 gyomor rákos sejtvonalak AGS, SGC-7901, MGC-803, HGC-27 és egy csoport gyomorrák tumor szövetekben. Azt találtuk, hogy SIRT3 fehérje szintje emelkedett volt a mind a 4 gyomor rákos sejtvonalak, mint az immortalizált gyomornyálkahártya GES-1 sejteket (AGS, 1,9-szeres; SGC-7901, 1,5-szeres; MGC-803, 2,0-szeres, és HGC -27, 1,8-szerese GES-1-sejtek) (1A ábra). Megfelelően, a mRNS-szintjét SIRT3 ezekben sejtvonalakat is nőtt (AGS, 2,6-szeres; SGC-7901, 1,7-szeres; MGC-803, 2,5-szeres; HGC-27, 2,2-szeres), mint a GES- 1 sejteket (1B ábra).

immunhisztokémiai analízis a tumor és a szomszédos nem-tumoros normális szövetekben a csoportból a gyomor rákos betegek igazolták, hogy SIRT3-pozitív sejtek gyakrabban kimutatható tumor szövetekben, mint a normál szövetekben. Az eredmények azt mutatták, hogy 55,1% a daganatos szövetekben (7% -a normális szövetek) mutatott magas szintű (erős pozitív), 41,4% a tumor szövetek (28% a normális szövetekben) mutatott közepes magas szint (gyenge pozitív), míg 3,5% a tumor szövetek és 64% -a normális szövetek negatív volt SIRT3 kifejezés (ábra az 1C és 1D S1A ábra). Érdekes, SIRT3 expresszió bél típusú daganatos szövetek (15 eset; 93,3% erős pozitív és 6,6% gyenge pozitív) szignifikánsan magasabb, mint a diffúz típusú tumor szövetekben (14 eset; 14,3% erős pozitív, 78,6% gyenge pozitív és 7.1 % negatív) (ábra 1C és 1E, S1B ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy SIRT3 expressziója megnő bizonyos tumorok képest kapcsolódó normális szövetek és SIRT3 kifejezés lehet lehetnek az egyes tumorok, amelyek tovább kell vizsgálni. Katalógusa

SIRT3 szintek kapcsolódnak sejtburjánzás katalógusa

Ezután létre SIRT3 túltermelése és akciós sejtvonalak felhasználásával AGS, SGC-7901 sejtek. A kifejezés a SIRT3 stabil transzfektánsok megerősítette Western-blottal. Overexpressziója SIRT3 sejtek fokozott növekedést, míg SIRT3 knockdown gátolta a sejtek növekedését mindkét gyomor rákos sejtvonalat (2A ábra). Továbbá, overexpressziója SIRT3 kiváltott több kolónia képződését, mint a kontroll transzfektált sejteket, hogy volt szemben csak annál kevesebb telep képződik a SIRT3 knockdown sejtek (2B ábra).

további meghatározása a szerepe SIRT3 a tumor kialakulását képesség, mi injektált SIRT3 túltermelése és akciós SGC-7901 sejtek szárnyakon nude egerek és a tumor növekedését hagytuk követő 28 napig sejt oltással (S2 ábra). Az átlagos súlya a daganatok származó SIRT3 overexpresszáló sejtek 0.7079g, lényegesen nagyobb, mint az átlagos tumor tömeg (NC), p katalógusa = 0,015, (2C, bal panel). Ezzel szemben az átlagos súlya daganatok származó SIRT3 knockdown sejtek 0.0588g, lényegesen kisebb, mint amelyet a tülekedés shRNS kontroll sejtek (SCR) (0.2033g; p katalógusa = 0,009) (2C, jobb panel) . Az átlagos mennyisége daganatok származó SIRT3 overexpresszáló sejtek emelkedett, mint a kontroll sejtek (NC) (2C, bal panel akár sarokban). Éppen ellenkezőleg, az átlagos mennyisége daganatok növő SIRT3 knockdown sejtek drámai képest kicsi, hogy a kontroll sejtek (SCR) (2C, jobb panel akár sarokban). Katalógusa

Továbbfejlesztett glikolízis SIRT3 kifejező gyomorrák sejtek

ezután vajon hogyan celluláris bioenergetika lehet változtatni a SIRT3 overexpresszáló gyomor rákos sejteket. SIRT3 túltermelése drámaian megnövekedett glükóz felvételét (1,4-szeresére AGS és 1,9-szorosára SGC-7901), míg SIRT3 akciós csökkent glukóz felvétel (körülbelül 40% mindkét AGS, SGC-7901) (3A és 3B). Összhangban a minta a glükóz használat, SIRT3 overexpresszáló sejtek megnövekedett laktát szekréció (1,2-szeresére AGS és 1,3-szorosára SGC-7901), mivel SIRT3 knockdown sejtek csökkent laktát- szekréció (55% AGS és 45 % -ban SGC-7901) (3C és 3D). Azt is megállapították, hogy a glikogén-képződés szignifikánsan nőtt, SIRT3 overexpressziója (1,5-szeresére AGS és 1,3-szorosára SGC-7901), jellemző a gyors növekedés a tumorsejtek [33], míg a csökkentett SIRT3 kiütése (40% -ban AGS és 70% SGC-7901) (ábra 3E és 3F). katalógusa

SIRT3 bebizonyosodott részt dezacetiiezettségi globális anyagcsere enzimek és karbantartása bazális ATP szinteket a sejtekben mind a normál állapotban és betegségek [1 , 2]. Összesen sejt ATP és glikolízis ATP termelés mutattunk AGS, SGC-7901 sejtek vagy SIRT3 túltermelése vagy SIRT3 leütést. A teljes sejtes ATP szint emelkedett volt SIRT3 overexpresszáló sejteket (körülbelül 1,3-szeres, mindkét sejtvonalban), de csökkent SIRT3 knockdown sejtek (körülbelül 75% mindkét sejtvonal), mint az NC vagy Scr kontroll sejtek (ábra 4A és 4B) . Aztán kezelt sejtekhez rotenone gátolni oxidatív foszforiláció és tesztelt ATP-termelés glikolízis. Amint az ábrán látható a 4C és 4D, SIRT3 overexpresszió növekedéséhez vezetett a glikolízis ATP termelés (1,4-szeresére AGS és 1,6-szorosára SGC-7901), míg a SIRT3 knockdown vezetett jelentős csökkenése glikolízis ATP termelés (20% AGS, 40% SGC-7901), mint az NC vagy SCR vezérlés. katalógusa

SIRT3 szabályozza a homeosztázis ROS gyomorrákban sejtek katalógusa

a testület bizonyítékok alátámasztják fokozott ROS szint a kritikus jellemző a rákos sejtekben, amelyek a rákos sejtek sokkal érzékenyebbek a további ROS stressz [34]. Itt azt találtuk, hogy overexpressziója SIRT3 csökkent ROS szintek 70% -os és 80% a AGS, SGC-7901 sejteket, míg a gátlása SIRT3 expresszió fokozott ROS szintek (1,4-szeresére AGS sejtek és 1,6-szeres a SGC-7901 sejtek) rendre (5A és 5B). Egyetértésben a szakirodalomban, amelyek SIRT3 ■ dezacetiiezett és aktiválja MnSOD (11, 12), a gyomor rákos sejtek, MnSOD aktivitás fokozható SIRT3 overexpressziója (1,4-szeresére AGS sejtek és 1,2-szorosára SGC-7901 sejtek), de csökkent a SIRT3 knockdown (50% AGS sejtekben és 65% a SGC-7901 sejtek) (ábra 5c és 5d) a, ami arra utal, hogy a SIRT3 lehet megvédeni a sejteket az oxidatív stressz által kiváltott károsodás által kiegyensúlyozását intracelluláris ROS keresztül fokozza MnSOD aktivitás gyomor rákos sejtekben.

SIRT3 dezacetiiezett és aktiválja ldhA katalógusa

ldhA kulcsszerepet játszik a tumor elindításában, fenntartásában és progressziójában. Gátlása ldhA aktivitás blokkok tumorképző és a tumor progresszióját [26,27] és ldhA aktivitás lehet szabályozni acetilezéssel /dezacetilezést módosítás [35]. Mi vajon SIRT3 részt vesz a szabályozás a ldhA tevékenység. Azt találtuk, hogy a gyomor rákos sejtek, ldhA aktivitás szignifikánsan nőtt SIRT3 overexpresszáló sejtekben, míg a csökkent SIRT3 knockdown sejtekben, mint az NC SCR vagy kontroll sejtekben külön-külön nélkül kimutatható változás ldhA fehérje szinten a stabil transzfektánsok (ábra 6a). Immunfestés eredmények azt mutatták, hogy a ldhA és SIRT3 voltak co-lokalizált a citoplazmában (6B), és a társ-IP elemzés akár ldhA vagy SIRT3 ellenanyag kiderült, hogy SIRT3 képes kölcsönhatásba ldhA (ábra a 6C). Ezen túlmenően, a szint a ldhA acetilezés csökkent az SIRT3 overexpresszáló sejtekben, de növekedett SIRT3 knockdown sejtekben (ábra 6D). Továbbá, in vitro
ldhA aktivitás assay alkalmazásával végzik kereskedelmi humán rekombináns SIRT3 és a szarvasmarha szív L-tejsav-dehidrogenáz jelezte, hogy ldhA aktivitás megnövekedett a jelenléte SIRT3 a reakcióban, amely megfordult hozzáadásával SIRT3 inhibitor , nikotinamid (ábra 6E). Ahhoz, hogy a potenciális SIRT3 dezacetiiező hely (ek) ldhA kerestünk adatbázis és megállapította, hogy a K5, K14, K57, K81, K118, K126, K222 és K318 potenciális acetilezése helyei ldhA, és a korábbi tanulmány számolt be, hogy K5 acetilezés /deacetilálás volt szabályozásában részt a ldhA tevékenység [35]. Aztán csináltunk ldhA aktivitás assay lizin 5 és lizin 318 acetilezéssel utánzó (K5Q /K318Q) vagy dezacetiiező utánozzák (K5R /K318R) mutáns ldhA, és megállapította, hogy sem a K5 sem K318 volt szükség SIRT3 közvetített ldhA aktiválás (S3 ábra). További azonosítása SIRT3 közvetített ldhA deacetilálás szorul. Katalógusa

SIRT3 upregulálja gének sejtmetabolizmusban katalógusa

jellemzésére molekuláris aláírása SIRT3-ldhA közvetített bioenergetika gyomorrák sejtek mértük gének expressziójának kapcsolódó glükóz szállítás és a glikolízis. Adatok 7A és 7B azt mutatták, hogy overexpressziója SIRT3 AGS vagy SGC-7901 által indukált expresszióját HK2 (1,47-szeres AGS sejtekben, 1,3-szeresére SGC-7901 sejtek), MCT4 (2,3-szeresére AGS sejtekben, 1,34 -szeres in SGC-7901 sejtek) és Glut1 (1,55-szeres AGS sejtekben, 1,38-szorosára SGC-7901 sejtek) mRNS-szinten vizsgáltuk real-time PCR. Éppen ellenkezőleg, SIRT3 knockdown csökkentette a gén expresszióját HK2 76%, MCT4 73% és Glut1 62% -ban AGS sejtekben, míg HK2 80% -os, MCT4 62% és Glut1 74% -ban SGC-7901 sejteket. Ezen túlmenően, amikor SIRT3 volt overexpresszált, MCT1 mRNS szintje magasabb volt AGS sejtekben 1,6-szeres, de nem SGC-7901 sejtek, és amikor SIRT3 volt knockdown, MCT1-ra csökkentettük 59% AGS és 65% a SGC-7901 sejtek , ill.

Discussion

Ez a tanulmány a bizonyíték arra, hogy SIRT3 kifejezett bizonyos rákos sejtekben, mint például a gyomor rákos sejtek, lehet kapcsolni a fokozott agresszivitás által SIRT3 közvetített bioenergetika keresztül dezacetilezést és aktiválása LADH. Bár a felhalmozódó bizonyítékok azt jelzi, hogy SIRT3 játszik kulcsfontosságú szerepet védelme a normális sejtek az öregedés ellen és a malignus transzformáció, a funkcióját már transzformált sejtekben, mint például a tumor sejtek, amelyek kifejezik SIRT3 kell vizsgálni [19]. Hiánya SIRT3 a MEFs vezet genetikai instabilitást és nagyfrekvenciás sejt átalakulás által közvetített Ras számának emelkedésével a tumor kialakulása és az öregedés, ami arra utal, hogy a SIRT3 szükséges a megelőzés, a sejtek öregedését és karcinogenitás [11,15]. Ezen túlmenően, a kevés vagy alacsonyabb expressziója SIRT3 észlelt számos humán rákos megbetegedések és SIRT3 szint társul a daganatos sejtek érzékenysége a kemo- és sugárterápia [11,15,16]. Azonban SIRT3 is látható overexpresszióját humán rákos megbetegedések és a terápiával kapcsolatos ellenállás [19,21,36]. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy SIRT3 célozhatnak különböző fehérjék közötti normális és a rákos sejteket, és hogy SIRT3 kifejezés változtatható a különböző típusú rák, mint például a jelenlegi eredmények azt jelzi, hogy a bél típusú gyomorrák magasabb szinten expresszálja a SIRT3, mint a diffúz típusú gyomorrák.

általánosan elfogadott, hogy a tumorsejtek fogyasztanak több sejt energia, hogy támogassa a gyors növekedés és a proliferációt, mint a normál sejtek felhasználásával glikolízis, mint a fő forrása a ATP-termelés helyett oxidatív foszforiláció [24] . Ebben a jelenlegi tanulmányban kimutatták, hogy a gyomorrák sejtek SIRT3 kölcsönhatásba lép, és dezacetiiezett ldhA, ami fokozott ldhA tevékenység; és SIRT3 túltermelése megnöveli a sejt ATP-termelését és MnSOD aktivitás párhuzamba csökkent celluláris ROS szint, jelezve fokozott oxidatív megkötő képessége SIRT3 lehetöleg deacetilálás közvetítette MnSOD enzimaktiváció. Egyre több bizonyíték jelzi, hogy SIRT3 szükséges a karbantartási a celluláris és a mitokondriumok homeosztázist szabályozó mitokondrium anyagcsere és a celluláris redox egyensúly rendszer, védi a sejteket az oxidatív stressz elleni keresztül szabályozó ROS-termelés, a kritikus mechanizmus öregedés, a rák és a szívbetegségek [1,2, 37]. SIRT3 deacetilál- csoportja mitokondriumok célok szabályozásában részt mindkét glikolízis és oxidatív stressz. Nemrégiben SIRT3 található képes deacetilál- és növeli a piruvát-dehidrogenáz aktivitás a rákos sejtekben, amelyek növelik mind a mitokondriális bioenergetika és a glikolízis [38]. Egyetértésével, a jelenlegi tanulmány azt mutatja, hogy SIRT3 deacetilál- és aktiválja ldhA lehet használni mind a mitokondriális légzést és a glikolízis. Másrészt, SIRT3 deacetilál-, és ezt követően aktiválja az egyéb mitokondriumok szubsztrátok, mint például a MnSOD [11,12], Foxo3 [39] és a IDH2 [9] lekötésére ROS által termelt oxidatív foszforiláció, védi a sejteket az oxidatív károsodás [40] . Szintén összhangban ezeket a megállapításokat, ebben a tanulmányban azt találtuk, hogy túltermelése SIRT3 növeli MnSOD aktivitás, ami az egyik oka a csökkent celluláris ROS szint alatt fokozott sejtmetabolizmusban állapotban. Katalógusa

ldhA, mint egy családtag laktát dehidrogenáz (LDH), megtalálható létezett glikolitikus sejtekben és lokalizálódik mitokondriumok mellett a citoszolba [41], és főleg katalizálja az inter-konverzió piruvát és laktát [42]. LdhA Látható, hogy kulcsfontosságú szerepet játszanak az aerob glikolízis és tumorgenézisre rosszindulatú sejtekben [26,27]. A ráksejtekben ldhA rohamosan elfogyasztja piruvát által termelt glikolízis, ami növeli az aerob laktát termelés [26]. Gátlása ldhA indukálja a ROS-termelés, csökkenti a sejt ATP-szinteket, és gátolja a glikolízis, ezért gátolja a sejtek növekedését, és kiváltja sejthalált rák [27]. Amely ezeket a jelentéseket, azt találtuk, hogy SIRT3 kölcsönhatásba léphet, és aktiválja ldhA. A SIRT3 overexpresszáló sejtek, ldhA acetilezéssel csökkent fokozott ldhA enzimaktivitást. Bár a pontos mechanizmus okozza SIRT3 közvetített ldhA szabályozás tovább kell vizsgálni, ezek az eredmények azt mutatják, hogy ldhA ellenőrzött glikolízis útvonal, amely felgyorsítja a tumor bioenergetika hatással lehet SIRT3 szinteket. Katalógusa

A jelenlegi tanulmány azt is kimutatta, hogy ez a kifejezés egy csoport gének, mint például a MCT1, MCT4, HK2 és Glut1 ismert kulcsfontosságú szabályozói energia metabolizmus rák is emelkedett SIRT3 overexpresszáló gyomorrák-sejtek, bizonyítva potenciális szerepét SIRT3 fokozásában glikolízis a tumorsejtekben. HK2 katalizálja foszforiláció a glükóz glükóz-6-foszfát, a kezdeti lépés a glikolízis [43]. Glükóz transzporter (GLUT) vezérli a szállítási glükóz plazmamembránján keresztül, működő, mint az első sebességmeghatározó lépést a glükóz metabolizmus [44]. MCT1 és MCT4 tagjai monokarboxilátok (mint például a laktát és a piruvát) transzporter család, szintén részt vesz a növekedés a glikolízis-függő daganatok [45]. Együttesen ezek az eredmények arra utalnak, hogy a potenciális összjátéka SIRT3 és egy csoport a glikolízis-asszociált gének jelátviteli tumor agresszív növekedés, ami még tovább kell vizsgálni. Katalógusa

Összefoglalva, bár SIRT3 jól jellemzi a mitokondriális homeosztázis ellen sejt öregedés és az átalakulás, expressziója SIRT3 tumorsejtekben kapcsolódik fokozott proliferációját és agresszív növekedés a gyomor rákos sejteket. SIRT3 kölcsönhatásban és aktiválja ldhA, ami megnövekedett glikolízis, ATP-termelését, amelyek együtt fokozott mitokondriális antioxidáns MnSOD aktivitás és csökkent ROS szint (a hipotetikus modellt javasoltak ábra 7C). Így a növekedés-serkentő funkcióját SIRT3 bizonyítja potenciális célpontja tumorok kezelésére SIRT3 kifejezést.

Támogató információ
S1 ábra. Reprezentatív patológiás csúszdák meghatározására SIRT3 expresszió humán gyomorrák példányok.
Egy, paraffinba ágyazott humán gyomorrák és párosítva szomszédos kórosan normális szövet mintákat vetettük alá, immunhisztokémiai festéssel SIRT3 antitest (barna), majd sejtmagok Counterstain hematoxilinnel ( kék, minden tumor volt látható a szomszédos normál szövetben, egy sorban 20 × 40 ×). B, reprezentatív képek SIRT3 kifejezés a bél és a diffúz típusú gyomorrák. Skála, 50 nm. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0129834.s001 katalógusa (TIF) hotelben S2 ábra. Overexpressziója SIRT3 mozdítani tumorterhelés in vivo.
SGC-7901 sejtek SIRT3 overexpressziója (A) vagy kiütése (B) szubkután injektáltunk jobb szárnyon a csupasz egerek a relatív kontroll sejtek (NC vagy SCR) a bal lágyék. Xenograft tumorokat kimetszettük és lemértük a 28. napon, miután sejtek inokulálása. Képek a jobb oldali panel azt mutatta, xenograft tumorok in vivo a a kísérlet végén. Kép kimutatta a tumor növekedését egerekben. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0129834.s002 katalógusa (TIF) hotelben S3 ábra.

• PLoS One: nyirokcsomó-metasztázis, a Unique független prognosztikai faktor a korai Gyomor Cancer
• PLoS One: azonosítása és jellemzése CXCR4-pozitív gyomorkarcinóma Stem Cells