Stomach Health > gyomor egészség >  > Gastric Cancer > gyomorrák

PLoS One: antrakinon G503 apoptózist indukál a gyomorrák sejtek a mitokondriális út

absztrakt katalógusa

G503 egy antrakinonszínezék izolált vegyület szekunder metabolitok egy mangrove endofita gombák a Dél-kínai-tengeren. A jelen tanulmány megvilágítja a tumor-ellenes aktivitást, valamint a mögöttes mechanizmus G503. Életképesség teszt végzett kilenc rákos sejtvonalakat és két normális sejtvonal bizonyította, hogy a gyomorrák sejtvonal SGC7901 a leginkább G503-érzékeny rákos sejteket. G503 indukált SGC7901 sejthalált keresztül apoptózist. G503 expozíció aktivált kaszpázok-3, -8 és -9. Előkezelés pán-kaszpázgátló Z-VAD-FMK és a kaszpáz-9 inhibitor Z-LEHD-FMK, de nem a kaszpáz-8 inbibitor Z-IETD-FMK, legyengített hatását G503. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az intrinsic mitokondriális apoptózis útvonal helyett az extrinsic részese volt G503-indukált apoptózist. Továbbá, G503 növelte az arány a Bax, hogy Bcl-2 a mitokondriumban és csökkent az arány a citoszolban. G503 kezelés eredményezett mitokondriális depolarizáció, a citokróm c felszabadulását és az ezt követő hasításával kaszpáz -9 és -3. Ezen felül azt is jelentette, hogy az endoplazmás retikulum apoptózis útvonal is aktiválható G503 indukálva capase-4 hasítás. Figyelembe véve az alsó 50% -ban gátló koncentrációt gyomorrák-sejtek, G503 szolgálhat ígéretes jelölt gyomorrák kemoterápia.

bevezető hivatkozás: Huang L, Zhang T, Li S, Duan J., Ye F, Li H, et al. (2014) antrakinon G503 apoptózist indukál a gyomorrák sejtek a mitokondriális út. PLoS ONE 9 (9): e108286. doi: 10,1371 /journal.pone.0108286 katalógusa

Szerkesztő: Javier S. Castresana, Navarrai Egyetem, Spanyolország katalógusa

Beérkezett: április 19, 2014; Elfogadva: augusztus 19, 2014; Megjelent: szeptember 30, 2014 katalógusa

Copyright: © 2014 Huang et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Az adatok elérhetősége: A szerzők megerősítik, hogy az összes adatot a megállapításokat alátámasztó teljes mértékben hozzáférhető, korlátozás nélkül. Minden lényeges adat a papír és az azt támogató információs fájlokat. Katalógusa

Forrás: Ez a tanulmány által támogatott Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína, Grant száma: 30973449, 81172163, 81272515, 81272338, 81200706; National Key Sci-Tech Special Projekt Kína, Grant száma: 2009ZX09103-642, 2013ZX09102053; Program Doktori Station Egyetem, Grant száma: 20120171110053, 20130171110053; Key Project Természettudományi Alapítvány Guangdong tartomány, Kína, Grant száma: 10251008901000009; Key Sci-tech kutatási projekt a Guangdong tartomány, Kína, Grant száma: 2011B031200006; Guandong Természettudományi Alap, Grant száma: S2012010009250, S2012040006986; Key Sci-tech kutatási projekt Guangzhou Önkormányzat, Kína, Grant száma: 2011Y1-00017-8, 12A52061519; Programot a fiatal tanár a University Grant száma: 10YKPY28; Changjiang Tudósok és innovatív Research Team Egyetem száma: 985 projekt PCSIRT 0947. A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. katalógusa

Bevezető katalógusa

Sebészet, sugárkezelés és a kemoterápia az elsődleges klinikai tumor kezelések. Azonban a műtét és sugárkezelés hatástalan áttétes rák; ha kemoterápia helyesen használják, metasztázis gátolható [1]. Ami a rákellenes gyógyszerek kifejlesztésének, antraciklinek a leghatékonyabb rákellenes gyógyszerek [2]. Természetes termékek óceánok fontos forrásai a daganatellenes szerek [3]. Marine mikroorganizmus metabolitok egyedi struktúrákat és farmakológiai aktivitását jellemzően használt, mint vezető, daganatgátló hatású vegyületek [4]. Antrakinon vegyületek, például daunorubicin, doxorubicin, epirubicin és mitoxantrone, a leghatékonyabb klinikai rákellenes gyógyszerek [2]. A tengeri antrakinon SZ-685C elnyomja elterjedése a humán emlőrák [5] - [6] és az emberi orr-garat karcinóma (NPC) sejteket [7]. Huang és munkatársai. Kimutattuk, hogy az antrakinonok származó rebarbara, mint például emodin, aloe-emodin és rein, gátolják a növekedését és szaporodását a különböző rákos sejtek, mint például a tüdő adenokarcinóma, mielogén leukémia, neuroblasztóma, hepatocelluláris karcinóma, hólyagrák és társai [8].

a mechanizmus a tumorellenes aktivitását antrakinon elsősorban részt vesz a következő szempontokat [9] - [10]: DNS kölcsönhatások révén kötelező interkalátozó és zavaró elválasztása a DNS kettős szál; közvetlen membrán hatások; DNS-károsodás válaszul topoizomeráz II gátlását vagy a szabad gyök, mint például a reaktív oxigénfajták (ROS), és az apoptózis indukálása révén topoizomeráz II gátlását, funkcionális p53 vagy a ROS-termelés. Ezen túlmenően, az antrakinonok is apoptózist indukálnak a JNK (c-Jun N-terminális kináz) [11], Akt /PKB (Protein kináz B) [5], [12], valamint a mitokondriális útvonalak [13] - [14].

G503 egy antrakinonszínezék izolált vegyület szekunder metabolitok a mangrove endofita gomba No. 1403 a Dél-kínai-tenger [15] .Azonban akár G503 rendelkezik rákellenes potenciálját antrakinon vegyületek nem vizsgálták. Ezért a jelen tanulmány célja az volt, hogy megvilágítsák az anti-tumor aktivitásának G503 és a mögöttes mechanizmus részt vesz.

Anyagok és módszerek

Vegyszerek és reagensek

3- (4 , 5-dimetil-tiazol-2-il) -2,5-diphenylterazolium-bromidot (MTT) és ROS scavenger N-acetil-cisztein (NAC) vásároltunk a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Hochest 33342, karboxi-H2DCFDA, MitoProbe DiOC2 (3) Assay Kit és MitoProbe tranzíciós pórus Assay Kit (M34153) kaptuk (Invitrogen, USA). Annexin V-FITC (fluoreszcein-izotiocianát) /PI (propidium-jodid) apoptózis Detection Kit-ben vásárolt Keygen (Nanjing, Jiangsu, Kína). RPMI1640 közeggel és magzati borjúszérumot (FBS) voltak Hyclon (Logan, UT, Amerikai Egyesült Államok ).
Kaszpáz-8 inhibitor Z-IETD-FMK, kaszpáz-9 inhibitor Z-LEHD-FMK és kaszpáz-család inhibitor Z-VAD-FMK voltak a Calbiochem (Gibbstown, NJ, USA) és Beyotime (Kína). Elleni antitestek kaszpáz-3, kaszpáz-4, kaszpáz-8, kaszpáz-9 és COXIV ellenanyag volt a Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Elleni antitestek citokróm A C katalógusa, Bax, Bcl-2, a p38, p-p38 és az anti-kecske IgG-HRP-t voltak a Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Egér anti-β-aktin és az anti-GAPDH elsődleges antibodywere a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Anti-nyúl IgG-peroxidáz és anti-egér-IgG-peroxidáz volt a Vector (Burlingame, CA, USA) .Mitochondria izolációs készlet vásároltunk a Pierce (Pierce, IL, USA), a protein assay kit vásároltunk a Bio-Rad (Hercules , CA, USA), és az ECL detektáló kit voltak Applygen Technologies Inc (Peking, Kína). katalógusa

az erjesztés, kitermelése és elkülönítése G503-re Nigrospora katalógusa sp. No. 1403 katalógusa

NO.1403 t izoláltunk korhadt fa Kandeliacandel katalógusa (L.) Druce és reidentified a Nigrospora katalógusa sp. (Génbank elérési száma: HQ891110) gyűjtött, Mai Po, Hong Kong, és egy sós tó a Bahamákon. G503 izoláljuk és tisztítjuk a másodlagos metabolitok NO. 1403 [15]. Starter tenyészeteket a kukoricadarát tengervíz agar. Dugók agar támogató micélium növekedés vágtunk és sterilen átviszünk egy 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban, amely 100 ml folyékony közegben (glükóz 10 g /l, pepton, 2 g /l, élesztőkivonat, 1 g /l, NaCI 2 g /l, pH = D 7,0). A lombikot 28 ° C-on. Rázás után rotációs rázógépen 3-5 napig, a micélium aszeptikusan átvisszük egy 500 ml-es Erlenmeyer lombikba, amely a tenyészetet folyékony (200 ml). A lombikot ezután inkubáltuk 28 ° C-on 25 napon át.

A tenyészeteket (150 liter) szűrjük át cheesecloth. A szűrletet bepároljuk, 5 l 50 ° C alatti, és háromszor rázással azonos térfogatú etil-acetáttal. Az egyesített szerves extraktumokat vetjük alá szilikagél-oszlopon, az eluálást gradienselúcióval petroléter és etil-acetát, így kapjuk a vegyületet.

A vegyületet feloldottuk dimetil-szulfoxidban (DMSO), egy készlet koncentrációja 50 mmol /l és a hígított specifikus koncentrációk az alkalmazás előtt.

Sejtkultúra

HUVEC izoláljuk a humán köldökvéna zsinórok normál fialás és tenyésztjük alábbi protokoll a korábban leírt [16] - [ ,,,0],17]. Chang májsejtek és tumorsejtvonalak HONE-1, CNE-2, 5-8F, HepG2, B7402, Rb, PC3, A549 és SGC7901, AGS tartottuk a mi laboratóriumi és tenyésztjük RPMI1640 tápközegben, amelyet 10% FBS, 100 U /ml sztreptomicint és 100 egység /ml penicillinnel (Gibco), 37 ° C-on nedvesített atmoszférában, 5% CO 2. Ez a tanulmány megfelel az elveknek a Helsinki Nyilatkozat által jóváhagyott Orvosi Etikai Bizottságának Szun Jat-szen Egyetemen, és írásos beleegyezését adta a donor. Katalógusa

életképesség teszt katalógusa

a sejteket oltottunk sűrűségben 2 × 10 4 sejt /ml-24-lyukú lemezeket (HUVEC oltottuk zselatinnal bevont 24 lyukú lemezeken). Amikor a sejtek elért sűrűségben 60% -70%, kezeltük őket különböző koncentrációjú G503 48 óra RPMI1640 közeggel (1 ml /üreg) FBS nélküli; a negatív kontroll csoportot kezeltünk PBS-sel. Ezt követően 100 pl MTT-t (5 mg /ml) PBS-ben oldott adunk az egyes lyukakhoz, és inkubáljuk további 4 órán, hogy lehetővé váljon a kialakulását formazancrystals. A kristályokat oldunk 1 ml DMSO-ban minden egyes lyukba. Az optikai sűrűség (OD) értékeket a bíborszínű oldatot hogy képviselte sejtek életképességét mértük 570 nm-en [18] - [19]. Miután három független kísérlet, a sejtek túlélését segítségével számoltuk a következő képlettel: túlélés (%) = (átlagos kísérleti OD értéke /átlag kontroll OD értéke) × 100%. Az értékeket fejeztük az 50% -os gátló koncentrációt (IC 50), amely úgy számítottuk ki, a regressziós módszer a lineáris tartományban.

Hoechst 33342 festéssel assay

SGC7901 sejteket 6-lyukú lemezekre sűrűségben 10 5 sejt per lyuk, és kezeltük G503 koncentráció tartományban 0 nmol /liter és 40 nmol /liter 24 óra hosszat. A sejteket jelzett 10 ug /ml Hoechst 33342 [20] 10 percig 37 ° C-on és megfigyelt fluoreszcencia mikroszkópiával (Olympus X71-A12FL /PH).

Annexin V-FITC /PI festés assay

SGC7901 sejteket összegyűjtöttük sűrűségben 5 × 10 5-5 × 10 6 /ml G503 kezelés a koncentráció tartományban 0 nmol /liter és 40 nmol /liter 24 órán 6-lyukú lemezekre; kezelt sejtek 25 nmol /liter kolchicin használtunk pozitív kontrollként. A sejteket ezután mostuk, és megfestettük a gyártó utasításai szerint (Annexin V-FITC /PI Apoptosis Detection Kit). Röviden, a sejteket újra felszuszpendáltuk 500 pl 1 × kötőpufferrel. Ezután 5 jil Annexin V-FITC-t és 5 nl 20 ng /ml PI-t adunk a mintához, és szobahőmérsékleten inkubáltuk 15 percig a sötétben. A megfestett mintákat ezután áramlási citometriával vizsgáltuk (Becton Dickinson, NJ, USA), hogy azonosítsa az apoptózisos sejtek.

meghatározása A mitokondriális membrán potenciál

SGC7901 sejteket szélesztettünk 6 lyukú lemezeken. Amint elérte sűrűsége 60% -kal, a sejteket kezeltük 20 nmol /liter G503-on 18 órán át, majd összegyűjtjük, hogy értékelje a mitokondriális membrán potenciál szerint a gyártó ajánlásai (MitoProbe DiOC2 (3) Assay Kit). Röviden, 1 × 10 6 /ml a sejteket újra felszuszpendáltuk 37 ° C-PBS-ben. A pozitív kontroll csoportot előkezelt 1 pl 50 mmol /l CCCP 37 ° C-on 5 percig. Minden csoportot ezután 5 mikroliter 10 nmol /liter DiOC 2 (3) 30 percig 37 ° C-on és áramlási citometriával vizsgáltuk. A mitokondriális membránpotenciál alapján számították a következő egyenlettel: membránpotenciál = (vörös fluoreszcencia intenzitás) /(zöld fluoreszcencia intenzitás). Katalógusa

kimutatása megnyitásával a mitokondriumok átmeneti póruskomplexet (MPTP) hotelben

SGC7901 sejteket szélesztettünk 6 lyukú lemezeken. Amint elérte sűrűsége 60% -kal, a sejteket kezeltük 20μmol /l G503 18 órán át és összegyűjtjük, hogy értékelje MPTP nyílás áramlási citometriával (Becton Dickinson, NJ, USA) alkalmazásával a gyártó protokollja (MitoProbe tranzíciós pórus Assay Kit). Röviden, minden egyes mintát 3 részre osztottuk, és a következőképpen kezeltük: alikvot 1 készített oldatát 5 jil 2 nmol /liter Calcein AM a sötétben; aliquot 2 oldatához 5 jil Calcein AM és 5

Other Languages