PLoS One: resveratrol gátolja a gyomorrák indukálva G1 fázis leállását és az öregedés egy Sirt1-függő módon

absztrakt katalógusa

A resveratrol, a természetben előforduló polifenol vegyület, leírták, hogy gyakoroljon rákellenes aktivitását befolyásoló különböző molekuláris célpontokat. Ebben a vizsgálatban vizsgáltuk a hatását és az alapjául szolgáló mechanizmusok resveratrol gyomorrák. Azt találtuk, hogy resveratrol gátolta a proliferációt a gyomor rákos sejtek dózis-függő módon. A koncentrációja 25 és 50 um, a rezveratrol gátolta a sejtek életképességét, és csökkent a klonogén potenciálja gyomor rákos sejteket. Resveratrol kezelés letartóztatott gyomor rákos sejtek a G1 fázisban és vezetett öregedés helyett apoptózist. Szabályozói a sejtciklus és öregedés utat, beleértve a ciklin D1, ciklin-függő kináz (CDK4 és 6. ábra), p21 és p16 voltak diszreguláit által rezveratrol kezelést. A gátló hatását resveratrol gyomorrák is ellenőrizték in vivo
alkalmazásával csupasz egerek xenograft modellben. Resveratrol (40 mg /kg /nap) kifejtett gátló hatás a gyomor rák fejlődését, és jelentősen csökkent a frakciók Ki67-pozitív sejtek a tumorban egyedeire csupasz egerekben. Miután a resveratrol kezelés, az indukció az öregedés és a változások a kifejezés a szabályozók részt vesz a sejtciklus és öregedés utak hasonló volt ahhoz, amit megfigyelt in vitro katalógusa. Ugyanakkor kimerülése Sirtuin (Sirt) 1 fordított a fent leírt hatások resveratrol mind in vitro katalógusa és in vivo katalógusa. Adataink arra utalnak, hogy a resveratrol gátolja a gyomorrák egy Sirt1-függő módon, és részletes bizonyítékokat alkalmazásának lehetőségét resveratrol a gyomorrák megelőzésében és gyógyításában. Katalógusa

Citation: Yang Q, Wang B, Zang W, Wang X , Liu Z, Li W, et al. (2013) A resveratrol gátolja a gyomorrák indukálva G1 fázis leállását és az öregedés egy Sirt1-függő módon. PLoS ONE 8 (11): e70627. doi: 10,1371 /journal.pone.0070627 katalógusa

Szerkesztő: Dominique Heymann, Faculté de médecine de Nantes, Franciaország katalógusa

Beérkezett: március 20, 2013; Elfogadva: június 19, 2013; Megjelent: november 21, 2013 katalógusa

Copyright: © 2013 Yang et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatta a Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (No. 81101869, 81100103, 81171536 és 81000868), a Nemzeti Alap Research Program of China (973 Program, No. 2012CB911202), és független innovációs Alapítvány Shandong Egyetem (2012TS108) .A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. katalógusa

Érdekütközés: a szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. katalógusa

Bevezető

a gyomorrák (GC) a negyedik leggyakoribb daganat a második vezető oka a rákkal összefüggő halálozás a világon. Szerint a globális becslés, összesen 989.600 új GC esetet diagnosztizáltak, és minimum 738.000 beteg halt meg ebben a betegségben, 2008-ban, számviteli 10% -a az összes halálozás a rák [1]. Bár az előfordulási GC már csökken világszerte, de továbbra is magas a fejlődő országokban, különösen Kínában, [1] [2]. Korábbi tanulmányok kimutatták, a bensőséges kapcsolata krónikus gyomorhurut okozta Helicobacter pylori fertőzés katalógusa és a fejlesztés a GC [3]. Továbbá, a befogadó genetikai, környezeti, táplálkozási és más tényezők játszanak szerepet a gyomor onkogén folyamat [1]. Mivel ez még mindig nehéz, hogy a korai diagnózis a GC, a legtöbb betegnél csak előrehaladott szakaszában. Annak ellenére, hogy a javulás a hagyományos terápiák fejlett GC, beleértve a műtét, kemoterápia és sugárterápia, a hossza vagy életminőségét betegek előrehaladott GC továbbra is gyenge [2], [4]. Ezért a feltárása új preventív gyógyszerek vagy terápiás célpontjai GC sürgősen szükség van. Katalógusa

A fogyasztás a friss gyümölcsök és zöldségek hozzájárul csökkent rák előfordulása, beleértve a GC [2], [5]. Klinikai alkalmazások azt is sugallják, hogy bizonyos bioaktív diétás molekulák képesek gátolni többszörös onkogén lépéseket [5] - [7]. Resveratrol (Res, 3,5,4'-trihidroxi) egy természetben előforduló polifenol vegyület jelen van szinte 70 növényfaj, beleértve a bőr vörös szőlő, a földimogyoró, bogyók és társai [6] - [8]. Res először számolt be, hogy gyakoroljon tumorellenes hatást 1997-ben [8]. Később jelentések azt mutatják, hogy Res kölcsönöz gátló hatással többféle rák, mint például a vastagbél-rák, mellrák és a limfóma, és befolyásolja a különböző molekuláris célpontok [9] - [11]. Sirtuin 1 (Sirt1), a III osztályú nikotinamid-adenin-nukleotid (NAD ^{+) - függő hiszton /fehérje deacetiláz, leírták, hogy az egyik legfontosabb célpontja Res számos tumor modellekben [9], [10]. Azonban néhány adatok azt mutatják, ellentétes eredmények arra utalnak, hogy Res fejt kemoprotektív hatását független Sirt1 [11]. A gátló hatását Res GC és a mechanizmus nem tanulmányozták. Katalógusa}

A jelen tanulmányban azt mutatták, hogy Res gátolta elterjedése GC sejtek in vitro katalógusa. Res kezelés hatására sejtciklusmegállás a G1 fázisban és vezetett sejtöregedés. Ezek a hatások a Res visszavonásra kerültek a kimerülése Sirt1. A gátló Sirt1 függő tevékenysége Res GC sejteket is ellenőrizte in vivo katalógusa. Mindezzel együtt, az eredmények azt mutatják, hogy a Res fejt Sirt1 függő gátló hatást fejt ki GC és javasolja gyógyászati ​​szerepét Res GC. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Etikai Nyilatkozat katalógusa

Minden Állatkísérletekben hagyta jóvá az etikai bizottság Shandong Orvostudományi Egyetem (No. 001, 2011-ben az állat-etikai jóváhagyása), és minden erőfeszítést tettek arra, hogy minimálisra csökkentsék a szenvedést. katalógusa

Cell Lines, tenyésztési körülmények és Res kezelése

az emberi GC sejtvonalak AGS (nyert Cell Resource Center, Shanghai Biokémiai Intézet és Sejtbiológiai a kínai Tudományos Akadémia), BGC-823, SGC-7901 (vásárolt Kína Központ Type Culture Collection, Wuhan, Kína) alkalmaztunk ebben a vizsgálatban. A sejteket F12 (AGS) vagy RPMI 1640 (BGC-823, SGC-7901), amely 10% FCS-t, 100 egység /ml penicillinnel és 2 mmol /l L-glutamint, 37 ° C-on nedvesített atmoszférában, amely 5% CO _{2. Nagy tisztaságú Res a Sigma (St. Louis, MO, USA), DMSO-ban oldott és hozzáadjuk a táptalajba a jelzett koncentrációban. Minden kísérletet végeztünk 24 óra után Res pótlás, hacsak másképp nincs feltüntetve. Katalógusa}

kis interferáló RNS Transzfekció katalógusa

A kémiailag módosított kis interferáló RNS (siRNS) célzó Sirt1 és kontroll siRNS vásároltunk GenePharma (Shanghai , Kína). A szekvencia a Sirt1 siRNS 5'-CCAUCUCUCUGUCACAAAUTT-3 '. A sejteket egy éjszakán át inkubáltuk, majd a transzfektált siRNS Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) alkalmazásával a gyártó protokollja. Negyvennyolc óra elteltével siRNS transzfekció, a sejteket kezeltük 50 um Res 24 órán előtt további vizsgálat.

életképesség teszt

proliferációt pedig az a Cell Titer 96 ® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, Madison, WI, USA). Röviden, 2 × 10 ^{3 sejteket oltottunk egy 96 mérőhelyes lemezre, és hagytuk növekedni 24 órán át. Huszonnégy órával később 20 ul MTS (3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) -5- (3-karboxi-metoxi-fenil) -2- (4-szulfo-fenil) -2H-tetrazólium) adunk az egyes jól. Inkubálás után 3 órán át 37 ° C-on, az abszorbanciát 490 nm volt, a Varioskan Flash-Multiplate Reader (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). A sejtek életképességét úgy számítottuk ki, a következő képlet szerint: relatív sejtéletképességet = (átlagos abszorbanciája kezelt csoport - átlagos abszorbanciája üres) /(átlagos abszorbancia kontroll csoport- átlagos abszorbanciája üres). A vizsgálatokat háromszori ismétléssel végeztük, és háromszor megismételjük.}

telepképző assay

sejteket oltottunk 6 mérőhelyes lemezekre (300 vagy 500 sejt per lyuk), és 10 napig inkubáljuk, amíg a kolóniák elég nagy ahhoz, hogy egyértelműen felismerhető. A sejteket metanollal fixáltuk és megfestettük kristályibolyával, és a telepek számát több, mint 50 sejtet számoltunk manuálisan. Kísérletet végeztünk, három párhuzamosban, és háromszor megismételjük.

cell cycle analysis

A sejteket összegyűjtöttük, fix előhűtött 70% -os etanollal 4 ° C hőmérsékleten egy éjszakán, majd propidium-jodiddal festettük (Beyotime , Jiangsu, Kína), amely RNáz a 37 ° C-on 30 percig sötétben. A sejtciklus eloszlása ​​alkalmazásával határoztuk meg áramlási citométer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), és az adatokat elemeztük Multicycle szoftverrel (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA, USA). Kísérleteket végeztünk függetlenül háromszor. Katalógusa

Az apoptózis assay katalógusa

kimutatására és mennyiségi apoptózis végeztünk címkézéssel DNS törések segítségével in situ Sejtpusztulás Detection Kit, TMR piros (Roche Applied Science, Basel, Svájc). A sejteket vagy paraffin szakaszai xenograftjait jelölt TUNEL szerint a gyártó utasításai szerint. A sejteket, a kezelés 0,2 mm-es H _{2 O 2 12 órán szolgált pozitív kontrollként. A paraffin szakaszok, pozitív kontrollok vásároltuk a Millipore (Billerica, MA, USA). A magokat kontrasztfestést DAPI (Beyotime), valamint a diák vagy metszeteket képalkotása fluoreszcens mikroszkóp (Olympus, Tokió, Japán) alkalmazásával cellSens Dimension szoftver. Kísérleteket végeztünk függetlenül háromszor. Katalógusa}

β-galaktozidáz festése katalógusa

Öregedés alkalmazásával vizsgáltuk a Senescence β-galaktozidáz festőkésziettei (Beyotime). Röviden, a sejteket vagy fagyasztott metszeteken xenograftok fixáltuk, majd inkubáljuk frissen elkészített β-galaktozidáz (β-gal) festéssel oldatban 37 ° C-on egy éjszakán át. Kísérleteket végeztünk függetlenül háromszor. Katalógusa

Stabil lentivírus-rövid hajtű-(shRNS) GC Cells katalógusa

lentivírus vektorok tartalmazó kontroll vagy Sirt1 shRNS hoztunk GenePharma és használt transzfektáljunk BGC-823 sejtekben. Hatékony kiütése Sirt1 igazoltuk western blot. A stabil transzdukció, vezérlő-lentivírus-fertőzött vagy Sirt1 shRNS-lentivírus-fertőzött BGC-823 sejteket tenyésztettünk komplett tápközegben mellékelt 2 ng /ml puromicin négy hétig, és tekinthető LV-C és az LV-S, ill.

nude egerek xenograft modell katalógusa

női csecsemőmirigy nélküli BALB /c csupasz egerek (6~8 hét) vásároltunk a pekingi egyetem (Peking, Kína) és tartottuk alatt specifikus kórokozóktól mentes körülmények a Key laboratórium Kardiovaszkuláris átalakítás és Function Research, Qilu kórház, Shandong Egyetem. Az egereket véletlenszerűen négy csoportra osztottuk (8 egér minden csoportban): csoport I és II, BGC-823 sejteket (1 × 10 ^{6 sejt per injekció 0,1 ml PBS-ben) szubkután injektáltunk horpasz régiójának nude egerekben; csoport III, LV-C (BGC-823 sejtek) injektáltunk; és a csoport a IV, LV-S (BGC-823 sejtek) injektáltunk. A beültetés után a meztelen egerek csoportok II, III és IV kezeltük Res 40 mg (kg -1 0,1 ml növényi olaj, adminisztrátora gyomorszondán át, naponta egyszer). A szubkután tumor mérete mértük tolómércével, és a tumor térfogatát az képlet alapján számítva (hossz) x (szélesség 2) /2. Az egereket feláldoztuk négy héttel később. A tumorokat gyűjtöttünk és feldolgozott Western blot és immunkémiai vizsgálatokban.}

Real Time-kvantitatív PCR (RT-QPCR)

Teljes RNS-sejtekben izoláltuk TRIzol reagens (Invitrogen), és alakították át cDNS felhasználásával PrimeScript ™ RT reagenskészlet (Takara, Tokió, Japán). RT-QPCR végeztünk gének, beleértve a ciklin D1, ciklin-dependens kináz 4 (CDK4), p21 és β-aktin a korábban leírtak [12]. A szekvenciákat az amplifikációs primerek táblázatban felsorolt ​​S1. A mRNS expressziója a cyclin D1, CDK4 és p21 normalizáltuk p-aktin-a kontrollhoz viszonyítva a 2 ^{-ΔΔCt módszerrel. Mindegyik kísérletet megismételtük három példányban.}

Western Blot

Összes fehérje a sejtekből vagy a tumor minták extraháljuk RIPA Lysing-pufferben (Beyotime) leírt [12]. A fehérje koncentráció meghatározása a BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). A membránt próbaként elleni antitestek Sirt1 (ABCAM, Cambridge, MA, USA), a Bcl-2, a bax, a kaszpáz-3, a ciklin D1, CDK4 és a 6. (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), a p16 és p21 (a Santa Cruz Biotechnology santa Cruz, CA, USA). A szekunder használt antitest egy torma-peroxidáz (HRP) konjugált anti-nyúl vagy egér antitest. A fehérje sávokat láthatóvá alkalmazásával ECL rendszer (Pierce). β-aktin (Cell Signaling) szolgált kontrollként. katalógusa

Az immunhisztokémiai katalógusa

A tumor egyedeire csupasz egereket paraffint, rehidratálódott és antigén letöltésére. A metszeteket egy olyan antitest ellen Ki67 (1:500, ABCAM) egy éjszakán át 4 ° C-on. HRP-konjugált anti-nyúl IgG és DAB festést alkalmaztunk, hogy szemléltesse a Ki67 antitesttel. A metszeteket végül kontrasztfestést hematoxilinnel. A tárgylemezeket leképezett egy Olympus fénymikroszkóppal (Tokió, Japán) alkalmazásával cellSens Dimension szoftver. A Ki67-pozitív sejteket megszámoltuk kézzel, és a százalékos Ki67-pozitív sejteket értékelték per mezőket. Öt különböző területeken megszámoltuk az egyes részekben. Katalógusa

Statisztikai elemzések katalógusa

Az adatokat fejeztük az átlag ± SD. A statisztikai elemzések során Statisztikai Csomagot Social Sciences (SPSS 16.0, Chicago, IL, USA) egyutas ANOVA Tukey post hoc teszt. P-értékek 0,05-nél kisebb statisztikailag szignifikánsnak tekintettük. Katalógusa

Eredmények katalógusa

Res Gátolja az életképességét GC sejtek Sirt1-függő módon katalógusa

Három GC sejtvonalak (AGS, BGC-823, SGC-7901) vizsgáltuk kísérleteinkben. A sejtek tenyésztése a jármű (0,1% DMSO) nem befolyásolta a sejtek életképességét (az adatokat nem mutatjuk). Azonban, amikor különböző koncentrációival kezeltük a Res 24 órán, sejtburjánzás dózis-függő módon gátolta a 25, 50, 100 és 200 uM Res (1a ábra). Említésre, proliferációját AGS nyilvánvalóan gátolta, ha kezeljük 10 nmol Res, amely nem volt megfigyelhető a másik két sejtvonal (1a ábra). Mindhárom sejtvonal, a jelenléte a 100 pM Res elegendő volt indukálására több, mint 50% növekedés gátlás (56,78% az AGS, 54,87% a BGC-823 és 52.16% az SGC-7901 esetében). Ezért a 25 és 50 um Res használtunk további kísérletekben. Annak megállapításához, a funkcionális szerepe Sirt1 Res kezelés, mi leütötte Sirt1 kifejezés segítségével egy adott siRNS. A hatékony gátlása Sirt1 kifejezés igazoltuk western blot (1B). Az eredmények a MTS-vizsgálat azt mutatta, hogy a Sirt1-hiányos sejtek, Res nem gátolta a sejtproliferációt (1C). Ezek az adatok azt jelzik, hogy Res képes gátolni a proliferációját GC sejtekben és, hogy a gátló hatás lehet megmenti Sirt1 kimerülése.

Res csökkenti a Klonogén Lehetséges GC sejtek Sirt1-függő módon

tumorsejtek kolónia képződését találtuk, hogy egy sokkal érzékenyebb paraméter mint életképesség, hogy értékelje a gyógyszer hatásának. Így erőfeszítések ezután végzett, hogy meghatározza a hatását Res a klónképző potenciáljának GC sejteket. Res, a koncentráció 25 uM, ahhoz vezetett, hogy jelentős csökkentése gócok számokat, valamint a méretek GC sejtekben. A kezelés után 50 nM Res, a klonogén potenciálja tovább csökkentek. Azonban kiütése Sirt1 előtt Res kezelés növelte a gócok, hogy hasonló szintű jármű csoport (2. ábra). Katalógusa

Res indukálja felhalmozódása GC sejteket a G1 fázis egy Sirt1-függő módon

megvizsgálja a gátló hatását Res GC sejteken végeztünk sejtciklus elemzést. Megfigyeltük, hogy a 25 és 50 um Res megnövekedett aránya a sejtek a G1 fázisban mindkét BGC-823, SGC-7901 sejtek (3A és 3B ábrák). Az indukció a G1 fázis leállását által Res szintén dózisfüggő. Res koncentrációban 50 jiM mutatott erősebb hatást, mint akkor, a 25 jim. A növekedés a sejtek számának a G1 fázist csökkenése kíséri a sejtpopulációk főként az S fázisban. Kimerülése Sirt1 megelőzően Res kezelés csökkentette a G1 fázis indukálása Res (3A és 3B ábrák). Ahhoz, hogy alátámasztják a fenti eredmények azt vizsgáltuk, a kifejezés a sejtciklus szabályozóknak a G1 fázisban, beleértve a ciklin D1, CDK4, CDK6, p21 és p16 BGC-823 sejtekben. Ábrán látható a 3C, Res kezelt BGC-823 sejtek, a fehérje szintje aktivátorok a G1 /S átmenetet (ciklin D1, CDK4 és CDK6) csökkent, míg a fehérje szintje inhibitorok CDK (CDKIs) (p21 és p16) fokozott. Ezzel ellentétben, ezek a változások nem voltak találhatók Sirt1-kimerített BGC-823 sejtekben, ha azok kezeltük 50 um Res. Hasonló eredményeket kaptunk az RT-QPCR ciklin D1, CDK4 és P21 (ábra 3D).

A hiányzó Sub-G1 sejtek jelezte, hogy Res kezelés nem vált ki apoptózist GC sejtekben (3A ábra) volt, ami összhangban van eredményeit TUNEL- címkézés kísérletek BGC-823 sejtek (ábra S1A). A fehérje szintje apoptózis-rokon molekulák, mint például a Bcl-2, Bax és a kaszpáz-3, az egyes csoportokból összehasonlítható volt (ábra S1B). Mindent összevetve, az eredmények azt mutatják, hogy Res indukál G1 fázis leállását GC sejtek Sirt1-függő módon és nem indukál apoptózist. Katalógusa

Res indukál Senescence GC Cella Sirt1-függő módon katalógusa

a mi kezünkben, Res eredményez le a növekedést, nem pedig fokozott apoptózist. Ezért további erőfeszítéseket tett, hogy vizsgálja meg, hogy a Res idézhet öregedés GC sejtekben. P-gal festéssel, egy specifikusabb marker az emlős elöregedett sejtek, alkalmaztunk. Miután Res kezelés, azt találtuk, fokozott frakciói sejteket megfestettük β-Gal-t. Azonban az előkezelés Sirt1 siRNS blokkolt Res-indukálta sejtöregedés (4. ábra). Hasonló eredményeket kaptunk a két BGC-823, SGC-7901 sejteket, ami azt sugallja, hogy a Res eltartott on Sirt1 indukálni sejtöregedés GC sejtekben.

Res gátolja a tumor növekedését in vivo egy Sirt1-függő módon

Ezután további vizsgálatokat végeztünk annak meghatározására, hatásainak RES BGC-823 xenograftok növekedését csupasz egerekben. A in vivo
vizsgálatban stabil transzdukált lentivírus-shRNS BGC-823 sejteket használtunk. A négy Sirt1 shRNS-lentivírusok LV-1 és LV-4 gyakorolt ​​nyilvánvaló hangtompító hatással Sirt1 kifejezés (S2 kép). Négy hét után a szűrés, a kifejezés a Sirt1 tartottuk a csökkent szint a stabil lentivirális-shRNS BGC-823 sejtek (ábra S2). Stabil LV-1 lentivirális-shRNS BGC-823 sejteket használtuk a későbbi xenograftok tanulmányokat, mert az erősebb gátló hatást Sirt1 expressziója összehasonlítva az LV-4. Minden állat túlélte a végén a kísérleteink, és nincs nyilvánvaló találtunk különbséget a testtömeget (adatokat nem mutatjuk). Négy héttel a beültetés után, mérés a tumor volumen jelezte, hogy Res kezelés szignifikánsan csökkentette a növekedést a BGC-823 átültetést hordoznak (Res vs kontroll: 0,5728 ± 0,2276 cm ^{3 vs 1,4288 ± 0,1741 cm 3, P < 0,001) . Stabil jelátviteli a kontroll shRNS-lentivírus nem befolyásolta jelentősen a tumor térfogata (Res vs Res + Ci: 0,5728 ± 0,2276 cm 3 vs 0,68 ± 0,0672 cm 3, P = 0,603). Azonban a Sirt1-hiányos xenograftok, a gátló hatását Res tumornövekedésre mentettek (RES + Si vs RES + Ci: 1,2313 ± 0,1777 cm 3 vs 0,68 ± 0,0672 cm 3, p < 0,001, res + Si vs kontroll: 1,2313 ± 0,1777 cm 3 vs 1,4288 ± 0,1741 cm 3, P = 0,123) (5A ábra). A Res kezelt xenograftok, a proliferációs marker, Ki67, jelentősen csökkent (5B ábra) (% Ki67-pozitív sejtek, Res vs kontroll: 3 ± 1,8 vs 44,67 ± 3,79, P < 0,001). Öregedés volt megfigyelhető xenograftok származó Res-kezelt egerekben által jelzett β-gal-festés (5B, ábra). Azonban nem nyilvánvaló apoptózis által indukált Res az átültetést hordoznak (ábra S1D), és nem figyeltek meg változást a szabályozók az apoptózis, mint például a Bcl-2, Bax és a kaszpáz-3 (ábra S1C). Ezek az eredmények összhangban voltak a in vitro
kísérletekben. Sőt, a változások a kifejezés a szabályozók a sejtciklus, beleértve a ciklin D1, CDK4, CDK6 p21 és p16 hasonló volt ahhoz, amit megfigyelt in vitro katalógusa (5C). Minden észlelt változása Ki67, β-Gal és a sejtciklus szabályozóknak fordított által Sirt1 kimerülése (számokat 5b és C) (% Ki67-pozitív sejtek, Res + Si vs RES + Ci: 46,32 ± 6,03 vs 2,65 ± 1,53, P < 0,001, Res + Si vs kontroll: 46,32 ± 6,03 vs. 44,67 ± 3,79, p = 0,946). katalógusa}

Vita katalógusa

Res, természetes polifenol, jelenleg értékelik, mint ígéretes daganatellenes ügynök. Bár bebizonyosodott, hogy átadják antiproliferatív hatásokat ellen számos ráktípus mind sejttenyészetben és xenograft modellek [9] - [11], annak kemoprevenció hatása GC és a mögöttes mechanizmus még nem tanulmányozták. Ebben a tanulmányban azt bizonyította, hogy Res gátolta elterjedése GC sejtvonalak (AGS, BGC-823, SGC-7901). Az anti-növekedési aktivitást figyeltünk után a sejteket kezeltük 25 uM Res 24 órán, a gátló hatás dózisfüggő volt. A koncentrációja 50 uM Res, a gátlási arányokat a három sejtvonal 41%, 34% és 32% volt. Amikor a koncentrációja Res tovább nőtt, az gátló hatást erősíteni. Mindkét 100 és 200 uM Res gátolta a növekedést több mint 50%, szemben a jármű csoport. Ezen túlmenően, a magasabb dózisú Res túl nagy ahhoz, hogy elérjék in vivo katalógusa, és így nincs értelme klinikai körülmények [13], [14]. Ezért a két alsó hatásos koncentrációja 25 és 50 uM Res használtuk a későbbi vizsgálatokban. A növekedés gátlását aktivitását Res tűnik sejt-specifikus, ahogy az IC50 különbözik szerint a sejt típusától és változik 27 jiM és 180 jiM [9], [10], [15], [16]. Néhány ilyen vizsgálatok azt is kimutatták, hogy a Res fejt ki a gátló hatások egy idő-függő módon [15], [16]. A koncentráció és időtartama Res alkalmazott kezelés az általunk vizsgált összhangban voltak a legtöbb jelentések más csoportok [8], [9], [16]. A in vivo
vizsgálatban a beadási mód szoktuk gyomorszondán át, mert ez a módszer, amely általánosan használt egerekben alternatívájaként intraperitoneális injekció [15], [17]. Emellett a tanulmányok egerekben kimutatták, hogy Res felszívódik hatékonyan orális beadás után, és megtalálható a szervezetben [17], [18]. Amikor használják in vivo katalógusa, Res szignifikánsan csökkentette a sejtek szaporodását, azzal jellemezve, Ki67, ami összhangban van az eredmények a mi in vitro
kísérletekben.

RES lassítja a proliferáció a rákos sejtek révén különböző mechanizmusok, amelyek között, sejtciklus-szabályozás egy fontos [9], [15], [19]. A in vitro katalógusa adatok kimutatták, hogy a kezelés GC sejtek Res indukál G1 fázis leállását. G1 fázisban az első a négy fázisban a sejtciklus, hogy zajlik eukarióta sejtosztódást. G1 jelentése különösen fontos sejtciklus fázisban, mert ez a pont, ahol a sejt vállalja, hogy egy kör szétválás. Progressziót G1 fázisban megköveteli a kialakulását és cselekvési ciklin D-CDK4 vagy -CDK6 komplexek. Ezek a komplexek majd foszforilálja retinoblasztóma, ami a kibocsátás a E2F transzkripciós faktorok, és a downstream gén transzkripciós részt S fázis progressziójának. A tevékenységek a ciklin D-CDK komplexek szabályozzák upstream gátlók, beleértve a tagok INK (p15, p16 és p18) és CIP család (p21, p27 és p57) [20], [21]. Ugyanazon a vonalon, amelyhez a G1 fázis leállását, megfigyeltük a downregulációját ciklin D1, CDK4 és CDK6 és a túlszabályzását p21 és p16 Res kezelt GC sejtekben. A in vivo
eredményeit az expressziós szintek ezen sejtciklus szabályozóknak az tumorminták összhangban vannak a in vitro
eredményeket. Eredményeink is összhangban vannak a korábbi vizsgálatokkal [15], bár mások arról számoltak be, hogy az S fázis leállását indukálják Res [9], [19]. Makacsul tartja magát a növekedés-gátlás vezethet apoptózis vagy öregedés sejtekben. Mivel mind a p21 és p16 jelátviteli útvonalak vesznek részt öregedés progresszió által közvetített különböző típusú stressz [22], [23], végeztünk β-gal-festés. Res kezelés szignifikánsan növelte a gyakorisága öregedő GC sejtek dózis-függő módon. A sejtöregedés program jelentős akadályt a rák elleni kezdeményezése és [24], [25]. Bár a korábbi tanulmányok azt mutatják, hogy a csillapítás az oxidatív stressz és a meliorációs anyagcsere, Res fejt ki öregedésgátló hatása mind in vitro katalógusa és in vivo katalógusa [26] - [28], az ellentétes hatásokat mutattak a rák. Res találtuk indukálására öregedés-szerű növekedési gátlás többféle rák [29], [30]. A kettős szerepét Res celluláris öregedés lelassul az öregedés normális szövetek és gyorsuló öregedése tumorokban, így ideális jelölt a rák megelőzésére és kezelésére. Katalógusa

Az apoptózis egy másik gyakori hatása, hogy általában megfigyelhető a Res-kezelt rákos sejtek [9], [11], [15], [16]. Kísérleti bizonyítékok azt jelzik, hogy az apoptózis is közvetíti több különböző utak és számos szabályozó molekulák. Ezek közül a szabályozók, a fehérjéket tartalmazó Bcl-2 család fontosak. Vannak mind anti-apoptotikus proteinek (Bcl-2, Bcl-XL), és a pro-apoptotikus proteinek (Bax, rossz, Bak és Bcl-xs) ebben a családban. A növekedés a pro-apoptotikus Bax /anti-apoptotikus Bcl-2 arány növeli a permeabilitást a mitokondriális membrán, okozza a kibocsátás a citokróm C mitokondriumok a citoszolban, és viszont, az eredmények a kaszpáz-9, és a downstream célozzák kaszpáz-3 [31]. Annak ellenére, hogy ez az intrinsic apoptotikus útvonalak, a pro-apoptotikus ligandumok, mint például a FasL, kötődik a receptorokhoz, mert a kaszpáz-8 és a downstream effektorok, például kaszpáz-3. Az aktiválás az effektor kaszpázok indukálja hasítása számos celluláris szubsztrátok és közvetlenül apoptózist [31] - [33]. Bár számos korábbi jelentések azt mutatták, hogy az apoptózis megbízott Res-indukált növekedési gátlás, nem tapasztaltunk egyértelmű apoptózist Res kezelt GC sejtekben. Ez hiányzott az apoptózis oka lehet a koncentráció és időtartama Res kezelés igazítani a kísérlet, mivel a vizsgálatokat a különböző csoportok mutatják, hogy a Res fejt Adagoló és időtartam-függő hatások [34], [35]. Ezen túlmenően, mivel a hatása Res szintén sejt-specifikus [36] - [38], a GC használt sejtek az általunk vizsgált rezisztens lehet Res-indukált apoptózis.

Res többszörös célok; amelyek között a III osztályú NAD ^{+ - függő dezacetiláz Sirt1 a leggyakrabban tanulmányozott. Bár egy biokémiai vizsgálat azt jelezte, hogy Res nem volt közvetlen aktivátora Sirt1 [39], Res még mindig volt tekinthető, mint egy klasszikus agonista Sirt1. Számos tanulmány bizonyítja, hogy a Res fejt ki különböző hatások különböző modell Sirt1-függő módon [40], [41]. Kísérletünkben Sirt1-kimerülés megfordította a növekedés gátlása Res mind in vitro katalógusa és in vivo katalógusa. A G1 fázis leállását és az öregedés okozta Res kezelés mentettek Sirt1-kimerülés. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a gátlás hatásai Res GC függ Sirt1. Szerint a korábbi vizsgálatok, Sirt1 lehet szabályozzák a génexpressziót két különböző mechanizmusokat. Először is, közvetlenül, Sirt1 közvetlenül közvetíti dezacetilezési egy fehérje, majd növeli a ubikvitináció és az azt követő ubiquitin proteaszóma degradációs [42]. Másodszor, a közvetett módon, Sirt1 fejt dezacetiláz aktivitás befolyásolása kromatin megerősítés vagy elnyomását a tevékenységét transzkripciós faktorok, majd szabályozza a gének transzkripcióját [43] - [45]. Mivel a molekulák (ciklin D1, CDK4, CDK6, p21 és p16) kimutatott kísérleteinkben nem számoltak be, mint a közvetlen célpontjai Sirt1, azt gondolták, hogy Sirt1 esetleg expresszióját szabályozzák ezen gének elsősorban az közvetve mechanizmus. Az eredmények RT-QPCR is alátámasztják ezt a hipotézist. Katalógusa}

Mindent egybevetve, eredményeink arra utalnak, hogy Res gátolja mind az elterjedése GC sejtek in vitro katalógusa és a növekvő xenograftok in vivo katalógusa. Res kezelés indukálja G1 fázis leállását GC sejtek és vezet öregedés helyett apoptózist. Sirt1-depléció megmenti a fent leírt hatásait Res mindkét in vitro katalógusa, és a in vivo katalógusa. Munkánk arra utal, hogy Res gátolja GC egy Sirt1-függő módon és részletesen bizonyíték alkalmazásának lehetőségét Res GC megelőzésében és gyógyításában. Katalógusa

alátámasztó információk
ábra S1.
Res nem hat apoptózist BGC-823 sejtekben. (A) Az apoptózist jelzi TUNEL címkézés (piros) és BGC-823 sejteket ellenfestettük DAPI-t (kék). Kezelés H _{2 O 2 szolgált pozitív kontrollként. Az eredeti nagyítás: × 200 Scale bárok, 50 nm. (B) szabályozói apoptózis BGC-823-sejtek, beleértve a Bcl-2, Bax és a kaszpáz-3 analizáltuk Western-blottal. (C) szabályozói apoptózis a xenograftok, köztük a Bcl-2, Bax és a kaszpáz-3 analizáltuk Western-blottal. Kimutatására a hasított kaszpáz-3, BGC-823 sejteket kezeltek H 2 O 2 szolgált a pozitív kontroll (a jobb oldali panel). (D) Apoptózis xenograftok TUNEL címkézés (piros) és a metszeteket ellenfestettük DAPI-t (kék). Metszetet női rágcsáló emlőmirigy kapott 3~5 elválasztás után a patkánykölyök (Millipore) szolgált pozitív kontrollként. Az eredeti nagyítás: × 200 Scale bárok, 50 nm. 'R' jelentése resveratrol, "Ci" jelenti a kontroll siRNS, és a "Si" jelenti a Sirt1 siRNS. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0070627.s001 katalógusa (TIF) hotelben ábra S2.
kiütése Sirt1 által shRNS-lentivírus. (A) BGC-823 sejteket transzfektáltunk kontroll vagy Sirt1-specifikus shRNS-lentivírusok. A transzfekciós hatékonyság értékeltük fluoreszcens mikroszkóp. A fertőzési multiplicitás (MOI) 50, több mint 90% -a a sejteket transzfektáltuk shRNS-lentivírus. Négy hét után a szűrés és puromicin, mind az élő sejteket transzdukált. Nagyítás: × 100, bár a 200 um. (B) A sejteket 4 nappal a fertőzés után, és 28 nappal azt követően, puromicin szűrés. A hangtompító hatásfoka Sirt1 igazoltuk western blot. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0070627.s002 katalógusa (TIF) hotelben táblázat S1.
primereket az RT-QPCR végzett kísérletek ebben a vizsgálatban.
doi: 10,1371 /journal.pone.0070627.s003 katalógusa (DOC) katalógusa}

• PLoS One: RhoE Elősegíti metasztázis gyomorrákban mechanizmuson keresztül függően fokozott expressziójának CXCR4
• PLoS One: mikofenolsavra Gátolja migrációs és behatolás gyomorrák sejtek révén nagyszámú molekuláris Pathways