Stomach Health > gyomor egészség >  > Gastric Cancer > gyomorrák

PLoS One: epigenetikai elnémítása miR-338-3p Hozzájárul tumorgenézisre gyomorrákban megcélozva SSX2IP

absztrakt katalógusa

mikroRNS nemrég elismerték, mint amely kitüntetett szerepet játszik a tumorok és áttétek. Itt azt jelentették, hogy a miR-338-3p volt epigenetikusan elhallgattatta a gyomorrák, és leszabályozza szignifikáns korrelációt gyomorrák klinikopatológiai jellemzők. Meglepő, helyreállítása miR-338-3p expresszió SGC-7901 gyomorrák gátolt sejtek szaporodását, a migráció, invázió és tumorgenézisre in vitro katalógusa és in vivo katalógusa, legalábbis részben apoptózist indukáló. Továbbá bemutatjuk az onkogén SSX2IP célpontját miR-338-3p. Azt javasoljuk, hogy a miR-338-3p működik, mint egy tumorszuppresszor a gyomorrák, a metilációs állapotát annak CpG-szigetre szolgálhat a potenciális diagnosztikai markereként gyomorrák.

bevezető hivatkozás: Li P, Chen X, Su L, Li C, Zhi Q, Yu B., et al. (2013) epigenetikai elnémítása miR-338-3p Hozzájárul tumorgenézisre gyomorrákban megcélozva SSX2IP. PLoS ONE 8 (6): e66782. doi: 10,1371 /journal.pone.0066782 katalógusa

Szerkesztő: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Spanyolország katalógusa

Beérkezett: január 17, 2013; Elfogadva: május 10, 2013; Megjelent: Június 24, 2013 katalógusa

Copyright: © 2013 Li et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a tanulmány ben támogatták Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (szám 30872476, 81072012, 81172324, 91229106, 30900670 és 81272749), Tudományos és Technológiai Bizottságának Shanghai Önkormányzat (számok 10jc1411100, 09DZ1950100, 09DZ2260200, 11jc1407602 és 101.409.042.000), Shanghai Key Discipline ( S30204), és a kulcsfontosságú projektek a Nemzeti Tudományos & Technology pillér Program of China (számok 2008BA152B03 és 2011BA203191), Kína posztdoktori Science Foundation (szám 2011M500796). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a gyomorrák egy rosszindulatú daganat, magas előfordulási gyakorisága és a második vezető daganatos halálok világszerte. [1] A korai diagnosztikai aránya gyomorrák alacsony, és a páciensek általában nehéz diagnosztizálni, amíg a rák fejlődött előrehaladott állapotban vagy áttét. Így is nagy jelentőségű, hogy végezzen alapos vizsgálatot patogenezisében gyomorrák és keresni az új molekuláris döntéshozók és terápiás célokat. Katalógusa

A mikroRNS-ek vannak kis RNS, amelyek szabályozzák a génexpresszió, és részt vesznek a különböző biológiai jelátviteli útvonalak [2]. Több tanulmány kimutatta, szignifikáns különbséget a mikroRNS expressziós profil között tumorsejtek és származó sejtek normális szöveteket, jelezve, hogy mikroRNS játszott fontos szerepet tumorigenezisben [3], [4]. Így mikroRNS nemrégiben vált hotspot genetikai diagnózis és a kezelés cél, mint új onkogének vagy szupresszor gének [5], [6]. Abnormális expressziója mikroRNS szövetekben vagy szérumban szorosan kapcsolódik a többszörös humán rosszindulatú beleértve gyomorrák [7], [8], és számos alulszabályozott mikroRNS gyomorkarcinómában szövetek tumor elnyomó funkciókat. Például a let-7 microRNS család először találtak, mint egy represszor a RAS, represszáló RAS és a c-myc expresszió transzlációs szinten [9]. Az expressziós szintje Let-7a jelentősen csökken a gyomor tumorok, míg Ras protein egy szignifikánsan magasabb gyomor tumor [10]. Sőt, a miR-15b, miR-16 és miR-21, stb már a fejlesztése és klinikai diagnózisa gyomorrák [11], [12]. A csoport azt is jelentette, a rákellenes szerepe miR-126, miR-409-3p és miR-155 gyomorrákban [13] - [15]. Katalógusa

mikroRNS microarray módszerrel vizsgáltuk a miRNS profilok a gyomor rák, és azt találtuk, hogy a miR-338-3p szignifikánsan down-szabályozott (nem közölt adatok). miR-338-3p, található kromoszóma 17q25.3, amelynek teljes hossza 22 NT, először számoltak be prion által indukált neurodegeneráció, mint a kifejezés a miR-338-3p csökken az agy fertőzött egerek egér-adaptált kaparja [ ,,,0],16]. miR-338-3p lehetne szabályozni a mRNS szintje a gazdaszervezet gén-apoptózist társult tirozin-kináz (AATK) patkány neuronokban [17]. Másrészt, a miR-338-3p volt, akár szabályozott betegeknél sporadikus amiotrófiás laterális szklerózis (Sals), egy másik fajta idegrendszeri elváltozások [18]. Fontos megjegyezni, hogy a szerepe a miR-338-3p a tumorok már korábban is jelezte, a miR-338-3p van szabályozva a végbélrák [19], és szabályozza a hepatitis B vírus X protein (HBX) proliferációt gátló és invázió a hepatoma sejtek kötődését a megcélzott gének CyclinD1 és simítani a hepatocelluláris karcinóma [20] - [22]. Azonban a szerepe a miR-338-3p GC még mindig ismeretlen. Katalógusa

A jelen tanulmányban azt tovább elemezzük leszabályozza kifejezése miR-338-3p GC szövetekben, mint a beteg illesztett normális szöveteket, és megállapította, hogy ez a kifejezés szintjén miR-338-3p szoros korrelációt mutatott a klinikai és patológiai változók GC. Méhen kívüli expressziója miR-338-3p proliferációját gátolja, invázió és metasztázis a gyomor rákos sejtek, csökkenti a daganatkeltő képességét gyomorrák sejtek csupasz egerekbe, és elősegíti az apoptózist. Azt is kimutatták, hogy a miR-338-3p működhet egy tumor szupresszor által közvetlenül megcélzó SSX2IP. Így eredményeink arra utalnak, hogy a miR-338-3p potenciális diagnosztikus marker és terápiás célpont a gyomorrák. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

1. Sejtvonalak és tenyésztési katalógusa

Az emberi gyomor rákos sejtvonalak SGC-7901, NCI-N87, BGC-823 és AGS vásároltunk a Shanghai Institutes for Biological Sciences, a Kínai Tudományos Akadémia [23] - [26]. KATO-III és SNU-1 cégtől vásároltuk az ATCC (American Type Culture Collection) [24], [27], MKN28 és MKN45 kaptuk a japán Cancer Research Resources Bank [28], az immortalizált gyomornyálkahártya sejtvonal, GES -1, ajándéka volt Prof. Feng Bi (Huaxi Kórház Szecsuán Egyetem, Chengdu, Szecsuán tartomány, Kína) [29], [30]. HEK293T humán embrionális vese sejtvonal megőrizte intézetünkben. A gyomor rákos sejtvonalak ben tenyésztettük RPMI1640, kiegészítve 10% FBS-sel (borjúembrió-szérum), 37 ° C-on nedvesített atmoszférában, 5% CO2. HEK293T-sejteket tenyésztettünk DMEM (Dulbecco-féle módosított Eagle-féle tápközeg) kiegészített azonos tenyésztett állapot fenti.

2. Etikai Nyilatkozat katalógusa

írásos beleegyező nyilatkozatot a vizsgálat kapott minden résztvevő számára. A vizsgálati protokollt jóváhagyta az etikai bizottság a Ruijin Kórház, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong Egyetem. Katalógusa

3. A szövetminták

Elsődleges gyomorrák szövetek és kiegyenlített a nem daganatos szöveteket gyűjtöttünk 66 átesett betegek radikális gastrostomán a Sebészeti Osztály, Ruijin Kórház, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Egyik beteg részesült preoperatív kezelést. Minden szövetet gyűjtöttünk a betegek beleegyező nyilatkozatot, és megerősítette a kórbonctani vizsgálat, és a szövettani tipizálás alapult Lauren besorolás. A TNM osztályozás definíciókat szerint a Nemzetközi Rákellenes Unió (2002). Katalógusa

4. RNS-izolálás és qPCR

Teljes RNS-t izoláltunk a sejtvonalakból és szöveti minták mir
Vana ™ miRNS Isolation Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. A minőség és a mennyiség az RNS mintákat megbecsülhetjük standard elektroforézissel és spektrofotometriás módszerekkel. Az expressziós szintje miR-338-3p sejtvonalakban és szövetminták mértük qPCR és számított leírtak [13]. Az expressziós szintjének SSX2IP mRNS mértük qPCR szerinti TaqMan® Gene Expression Assay Protocol (Applied Biosystems). A GAPDH mRNS-szint használt normalizálás. Katalógusa

5. DNS izolálása és metilációs elemzés

genomiális DNS-t szöveti minták alkalmazásával tisztítottuk DNAzol (Invitrogen). Nátrium-hidrogén átalakítás zajlott a Qiagen Epitect Bisulfite Kit (Qiagen) a gyártó szerint. A metiláció szobrok végeztük Metiláció specifikus PCR (MSP). A primereket metilált vagy metilálatlan DNS tervezte a szoftver Metil Primer Express v1.0 (ABI) .A metilezési forward primert a CpG miR-338-3p: 5'-GGCGGAGTTTATGGTTTTC-3 'és a reverz primer: 5' -AAACCTAACCGATCCTCG-3 ', a unmethylation forward primer a CpG miR-338-3p: 5'-TGGTGGAGTTTATGGTTTTT-3' és a reverz primer: 5'-AAACCTAACCAATCCTCACAA-3 '.

6. Tranziens transzfekciója miRNS utánozza katalógusa

miRNS-338-3p utánozza és negatív kontroll utánozza vásároltunk GenePharma (Sanghaj, Kína) .Cells oltottunk sejttenyésztő lemezeket 20 órán transzfekció előtt, hogy biztosítsa a 70% cella összefolyás a pillanatában transzfekció. Transzfekciója miRNS utánozza sejtekbe végeztük Lipofectamine2000 (Invitrogen) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. A miRNS utánozza dolgozott a végső koncentráció 100 nM. 48 óra post-transzfekció, qPCR és Western blot végeztünk.

7. Cell Proliferation Assay

A sejtproliferációt értékelték WST (vízben oldódó tetrazólium-só) vizsgálat alkalmazásával sejtszámláló Kit-8 (Dojindo) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. 24 óra post-transzfekciót miRNS-utánzatok, sejtek (2 × 10 3 sejt /mérőhely) voltak mag 96 mérőhelyes lemezeken. A lemezeket 5 napig inkubáljuk. Az életképes sejtek számát értékeltük mérésével, az abszorbancia 450 nm-en.

8. Soft Agar telepképző assay

GC transzfektált sejtek miRNS utánozza újra felszuszpendáltuk 0,3% -os lágy-agar RPMI1640, amely 10% FBS-t és rétegezzük 0,6% megszilárdult agar RPMI1640, amely 10% FBS-t egy 6 mérőhelyes lemezekre (1 × 10 3 sejt /mérőhely). A lemezeket inkubáljuk 37 ° C-on nedvesített atmoszférában, 5% CO 2. A telepeket, amelyek legalább 50 sejteket megszámláltuk.

9. Sejtvándorlásban és invázióban Assay

a sejtek vándorlását végeztünk QCM TM24-Well Kolorimetriás Migration Assay Kit (Millipore) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. Az inváziós vizsgálati eljárás, sejtek invázióját Assay Kit (Millipore) használtunk szerint a gyártó utasításai szerint. A sejteket (1 × 10 5), 300 ul szérummentes tápközeget adtunk a felső kamrák és tenyésztjük 48 órán át. Nem-áttelepítése vagy nem behatoló sejteket eltávolítottuk a pamut törlőkendő, a sejteket, amelyek vándoroltak, vagy megszállták, hogy az alján a membrán megfestettük a sejt foltot puffer biztosított az assay kit és megszámoltuk mikroszkóp alatt és lefényképeztük. Három független kísérletet végeztünk azonos feltételek mellett.

10. Apoptózis analízise

sejt apoptózis analízist preformált Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD), a gyártó utasításai szerint. Minden vizsgálatot három ismétléssel végeztük, és háromszor megismételjük függetlenül. A funkció nukleáris zsugorodás kapcsolódó apoptózist mutatta, a Hoechst 33342 (Beyotime) szerint protocol.The morfológia tettük láthatóvá fluoreszcens mikroszkóppal, hogy gerjesztettük hullámhossz 350 nm, és mérjük 460 nm-en.

11. Plazmidok és luciferáz aktivitás Assay

A fragmentumot a vad típusú (WT) 3'UTR a SSX2IP vagy helyek mutáns (MUT) 3'UTR a SSX2IP tartalmazó feltételezett miR-338-3p kötőhelyeket szintetizáltunk . A fragmentumokat klónoztuk pMIR-jelentés luciferáz vektor (Ambion) tartalmazó Firefly katalógusa és elemzi pMIR /SSX2IP-3'UTR tömeg és pMIR /SSX2IP-3'UTR mut.Cells voltak magot a 24 lyukú lemezeken előtt 24 órával a transzfekció. 500 ng pMIR /SSX2IP-3'UTR tömeg vagy pMIR /SSX2IP-3'UTR MUT transzfektáltunk minden egyes lyukba, együtt 20 ng PRL-TK vektor (Promega) tartalmazó, Renilla
luciferáz és 60 pmol miR-338-3p vagy ellenőrzés utánozza. A sejteket 48 óra után transzfekció. Firefly katalógusa és Renilla luciferáz katalógusa tevékenységeket mérjük Dual-luciferáz riporter assay (Promega), a gyártó utasításai szerint. Katalógusa

12. Stabil transzfekciója miR-338-3p expressziós vektor

pSilencer-miR-338-3p vektort és pSilencer-miR-kontroll vektort transzfektáljuk SGC-7901 sejtek rendre használatával Lipofectamine2000 (Invitrogen), és a kiválasztott 100 ug /ml higromicin B (Invitrogen) 4 héten keresztül. Stabilan transzfektált sejt klónokat szedtünk és karbantartott felében a kiválasztási koncentráció. Katalógusa

13. Tumor xenograft modellben

SGC-7901 sejteket (2 × 10 6 sejt /egér) stabilan transzfektált pSilencer-miR-338-3p vagy pSilencer-vezérlő vektor szubkután injektáltunk 4-hetes hím nude egerekben (Zoológiai Intézet, a kínai Tudományos Akadémia, Shanghai, Kína) .A egereket hetente ellenőrizve, a tumorcsomók mértük féknyereg. Az egereket elaltattuk 4 héttel az injekció beadása után, és a tumorokat eltávolítottuk, és lemértük. A tumor térfogatát értékeltük az alábbi képlet segítségével: Térfogat = (szélesség + hossz) /2 x szélesség x hosszúság x 0.5236.Tumor növekedési görbéket számítottunk.

14. Immunhisztokémia

kimutatása SSX2IP végeztük paraffin metszeteket anti-SSX2IP antitest (ABCAM, hígítás 1:1000). Az immunkomplex tettük láthatóvá a Dako REAL TMEnVision ™ Detection System, Peroxidase /DAB, Rabbit /egér (Dako) szerint a gyártó eljárást. A magokat kontrasztfestést hematoxilinnel. Katalógusa

15. Statisztikai elemzés katalógusa

A kapcsolat a miR-338-3p expressziós szintjét és a klinikopatológiai paraméterek elemeztük a személy X katalógusa 2 teszt. A csoportok közötti különbségeket elemeztük Student T
teszt. Minden statisztikai analízist az SPSS 13.0 szoftver (SPSS Inc., Chicago, IL, USA), a P katalógusa < 0,05 értéket tekintettük szignifikánsnak. Katalógusa

Eredmények katalógusa

1 . Az Expression miR-338-3p Down-szabályozott GC sejtvonalak és szövetek katalógusa

tárni, hogy a miR-338-3p GC, először mint expressziós szintjének miR-338-3p a nyolc gyomorrák sejtvonalak immortalizált normál gyomornyálkahártya epiteliális sejtvonalat (GES-1). Ábrán látható. 1A, miR-338-3p jelentősen lefelé szabályozni a GC sejtvonalak képest GES-1. Annak igazolására, ez az eredmény, mi is, mint az megnyilvánulásai miR-338-3p GC szövetek és a szomszédos, nem daganatos szövetekben. 66 GC párosított mintákat ebbe a vizsgálatba. Az eredmények azt mutatják, hogy az átlagos expressziós szintje a miR-338-3p szignifikánsan alulszabályozott a tumor szövetekben, mint a szomszédos, nem-tumor szövetekben (ábra. 1B). Továbbá azt derítették közötti korreláció miR-338-3p a klinikopatológiai faktorokkal. Amint az 1. táblázatban látható 59,1% (39/66) GC minták mutatták, down-regulációja miR-338-3p alatt két-szeres cut-off (relatív expressziós arány < 0,5), ez a helyzet úgy gondolták, hogy jelentősen le -szabályozott. Ennek alapján a cut-off, a 66 klinikai esetek két csoportra oszthatók: a miR-338-3p alacsonyabb expressziót csoport (n = 39) és a miR-338-3p magasabb kifejeződési (n = 27). Az alsó kifejezés csoport mutatta hajlam nagyobb a daganat mérete, több nyirokcsomó áttét, mélyebb lokális invázió és fejlettebb TNM, de nincs szignifikáns kapcsolatban az életkor, a nem, vagy a szövettani típus (1. táblázat). Katalógusa

2. miR-338-3p van epigenetikusan Silenced gyomorrákban katalógusa

Mivel epigenetikus hangtompító gyakori eszköze leszabályozza miRNS expressziós [31], [32], úgy döntöttünk, hogy elemezze a CpG sziget eloszlása ​​a promoter régió miR-338-3p metil Primer Express v1.0 szoftver. Az eredmények azt mutatták, hogy a CpG-szigetek létezik a szakasz (-690 hogy -241) áramlásirányban a transzkripciós starthelyet (TSS). Megvizsgáltuk a metiiációs állapotát CpG-szigetek a promoter régió által metiláció-specifikus PCR-t (MSP), amely a régió -366 hogy -576 (2A.). Segítségével MSP, azt találtuk, hogy a miR-338-3p CpG-szigetre alaposan metilezzük a GC sejtvonalak képest a gyomor nyálkahártya epiteliális sejtvonalat (GES-1). Amint várható volt, kezelés 5-aza indukált jelentős demetilezési (ábra. 2b). A reprezentatív eredményeket az MSP elemzés miR-338-3p GC tumorszövetekben, és kiegyenlített szomszédos, nem-daganatos szöveteket ábrán látható. 2C. A metiláció aránya miR-338-3p CpG szigetek tumorszövetmintákból szomszédos, nem daganatos szövetek 66 GC betegek 78,79% és 24,24% volt (** P katalógusa < 0,01, ábra. 2D) . Amikor a Receiver Operating jelleggörbe és a görbe alatti terület (AUC) metilált állapotát miR-338-3p GC számoltuk, az AUC 0,773 ± 0,042, ami jelentősen magasabb, mint a nullhipotézis ( P <
0,001), és a 95% -os megbízhatósági intervallum 0,690-0,856 (ábra. 2E). Így a metilációs állapotát miR-338-3p CpG sziget szolgálhat egy esetleges molekuláris markere GC. Katalógusa

3. miR-338-3p gátolja a gyomorsav rákos sejtek proliferációs katalógusa

Mivel a miR-338-3p jelentősen lefelé szabályozni a GC, mint láttuk, ilyenkor mint egy tumor szupresszor. Ezért a következő eldönteni túltermelése miR-338-3p gyomorrákban sejtek befolyásolja a sejtek növekedését. Szintetikus miR-338-3p utánozza, vagy negatív kontroll utánozza t transzfektáltunk SGC-7901 sejteket, amelyekben az expressziós szint a miR-338-3p a legalacsonyabb, majd a WST assay nyomon követése a sejtnövekedést.

ectopiás expresszióját miR-338-3p az SGC-7901 sejtek igazoltuk qPCR, SGC-7901 transzfektált sejtek miR-338-3p utánozza nőtt jelentősen lassabb, mint a kontrollcsoportban (3A.) (* P
< 0,05, ** P < katalógusa 0,01). További jellemzése hatásának miR-338-3p a sejtnövekedésre, lágy-Ager telepképző assay-t végeztünk. Azt találtuk, hogy a telepek számát származó SGC-7901 transzfektált sejtek miR-338-3p utánozza szignifikánsan kevesebb, mint a kontroll csoport (ábra. 3B-C) (** P
< 0,01) . Következetesen, gátlása miR-338 által kiváltott elterjedése SGC-7901 (ábra. S2 File S1, * P katalógusa < 0,05). Hasonló eredményeket figyeltünk meg a kontroll GES-1-sejtek (ábra. S1-B File S1, * p
< 0,05). Összefoglalva, ezek az eredmények arra utalnak, hogy a miR-338-3p elnyomja a növekedés üteme mindkét GC sejtek és gyomornyálkahártya-sejtek katalógusa vitro. Matton

4. miR-338-3p Gátolja migrációs és behatolás GC Cells in vitro Matton

Ennek a lényege, hogy a miR-338-3p szolgál tumorszuppresszorként GC-ben tovább vizsgálni annak hatása a sejt migrációs és behatolás, a kritikus meghatározó malignus progresszió és a metasztázist. Ábrán látható. 4. számú vándorló SGC-7901 transzfektált sejtek miR-338-3p utánozza szignifikánsan kisebb volt, mint a kontroll csoportban (105,00 ± 11,16 vs. 145,00 ± 7,00, ** P katalógusa < 0,01. Ábra. 4 a-B), és száma invazív SGC-7901 transzfektált sejtek miR-338-3p szignifikánsan kisebb volt, mint a kontroll csoportban (41.33 ± 4.04 vs 76 ± 10,54, ** P
< 0,01. ábra. 4 ° C-D). Következetesen, gátlása miR-338-3p kiváltott migráció és invázió SGC-7901 sejtek (ábra. S3 File S1, * P katalógusa < 0,05). Ezzel szemben, a miR-338-3p nem volt hatása a migráció a GES-1 (ábra. S1 E File S1), valószínűleg azért, mert GES-1 sejtek nem a migrációs és invazív jellege rákos sejteket. Ezek az eredmények jelennek meg a szerepét a miR-338-3p gátlásában mind a migráció és invázió GC sejteket. Katalógusa

5. miR-338-3p indukálhat gyomorkarcinóma sejtek apoptózis katalógusa

Hogy világosabb mechanizmusa a miR-338-3p GC sejtnövekedést gátló hatását megvizsgáltuk az apoptózist áramlási citometriás elemzés. Az eredmények azt mutatták, hogy az apoptózis mértéke szignifikánsan nagyobb volt a miR-338-3p utánozza transzfektált csoportban, mint a kontroll csoportban utánozza transzfektált (** P katalógusa < 0,01) (ábra. 5A-B). Mi tovább vizsgáltuk morfológiai jellemzőit apoptózis, beleértve a kondenzált kromatin és a nukleáris töredezettség Hoechst 33342 festéssel, és megerősítette, hogy az apoptózis mértéke magasabb volt a miR-338-3p utánozza transzfektált sejtek (ábra. 5C). Következetesen, gátlása miR-338 gátolja az apoptózist az SGC-7901 sejtek (ábra. S4 File S1, * P katalógusa < 0,05). Hasonló eredményeket figyeltünk meg a kontroll GES-1-sejtek (ábra. S1 C-D File S1, ** P
< 0,01). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy túltermelése miR-338-3p apoptózist indukál GC sejtekben, amelyek hozzájárulhatnak a növekedést gátló tulajdonságait miR-338-3p. Katalógusa

6. miR-338-3p Gátolja tumorgenézisre és Növeli apoptózis in vivo Matton

A következőkben megvizsgáltuk, hogy a méhen kívüli kifejezése miR-338-3p befolyásolhatja a növekedést és az apoptózis a gyomor tumor in vivo .
SGC-7901 sejteket a miR-338-3p expressziós vektorba (p Silencer katalógusa -miR-338-3p), vagy a vezérlő vektor (p Silencer katalógusa -miR -ellenőrzés). A stabil klónok mindkét p Silencer
-miR-338-3p vagy p Silencer
-miR-Control választottak és szubkután injektáltuk csupasz egerekbe, és a tumor kialakulását követtük nyomon. SGC-7901 transzfektált sejtek miR-kontrollként progresszív növekedés azonban gátolta, amikor a méhen kívüli kifejezése miR-338-3p. 28 nap elteltével, a csupasz egerek leöltük, és a tumor súlyát és térfogatát mértük (ábra. 6 A-E). Az átlagos súlya tumorok eredő pSil encer katalógusa -miR-338-3p sejtek csoportban szignifikánsan kisebb tumorok p Silencer katalógusa -miR-kontroll sejtek csoportja (1200 ± 193,26 mg vs 1800 ± 229,52 mg, ** P katalógusa < 0,01). katalógusa

Annak vizsgálatára, hogy az apoptózis hozzájárul ehhez a megfigyelt in vivo katalógusa tumor növekedésének gátlása után miR-338-3p felett -expression, TUNEL assay-t a tumor szövetekben. Az eredmények azt mutatták, hogy a daganatos szöveteket a p Silencer katalógusa -miR-338-3p tartalmazott lényegesen pozitívabb festés sejtek a kontroll csoporthoz képest (** P katalógusa < 0,01, Fig. 6F-G ). Ebből kifolyólag, eredményeink azt mutatták, hogy a miR-338-3p gátolja a gyomorsav tumorigenezis in vivo katalógusa, legalább részben apoptózis indukálásával in situ.

7. miR-338-3p célok 3'-UTR az onkogén SSX2IP Matton

Mivel a miRNS-ek gyakran szabályozzák a célgének expresszióját kerestünk miR-338-3p a feltételezett célpontokat internetes keresőrendszer (pl TargetScan, Microrna.org és PicTar). A gének által előre jelzett összes használt programok tartották jelölt célokat miR-338-3p. Között az összes találatot, SSX2IP okozott a figyelmet, a korábbi tanulmányok azt mutatták, hogy SSX2IP egy akut myeloid leukémia-asszociált antigén és a potenciális immunterápia célpontja leukémia [33] - [35], és a korábbi munka azt mutatta, hogy SSX2IP elősegíti az invázió és vándorlása hepatocelluláris karcinóma sejtek és hozzájárul a kemoterápia rezisztencia [36]. katalógusa

az egyik lehetséges miR-338-3p kötőhely megjósolta a 3'UTR a SSX2IP (ábra. 7A). Érvényesíteni ezt a kölcsönhatást, mi tesz egy vad típusú és mutáns 3'UTR töredéke SSX2IP a pMIR-JELENTÉS luciferáz vektor. A kapott konstrukciókat együtt transzfektáltunk miR-338-3p utánozza, vagy kontroll utánozza a HEK293T-sejtek, majd luciferáz riporter vizsgálat. A relatív luciferáz aktivitását pMIR /SSX2IP-3'UTR tömeg, de nem pMIR /SSX2IP-3'UTR mut, jelentősen elnyomja miR-338-3p (** P katalógusa < 0,01) összehasonlítva a kontroll utánozza (ábra. 7b), jelezve, hogy a miR-338-3p közvetlenül kötődik a 3'UTR a SSX2IP hogy működjön a szuppresszor.

következő vizsgált befolyása a miR-338-3p a kifejezése SSX2IP, mérésével mRNS és fehérje szint SSX2IP után transzfektálására SGC-7901 sejtek miR-338-3p vagy ellenőrzés utánozza. Ábrán látható. 7C-D, miR-338-3p nem volt hatása a SSX2IP
mRNS szintjén mérve qPCR, de nem okozott szignifikáns csökkenést a SSX2IP fehérje szinten, mint a kontroll-transzfektált. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a miR-338-3p elnyomja expressziójának SSX2IP a poszt-transzkripciós szinten, valószínűleg keresztül kötődnek a 3'UTR a SSX2IP. Nevezetesen, azt is megállapította, hogy a capase-3 és procasepase-3, két fontos apoptózis gének voltak csökkenteni kell (ábra. 7C). Katalógusa

8. Az Expression miR-338-3p fordítottan arányos expressziós szintjének SSX2IP Protein gyomorrákban katalógusa

miR-338-3p van szabályozva a gyomorrák és SSX2IP támogatja a megcélzott gén miR-338 -3p elősegítette minket a feltételezés, hogy SSX2IP lehet túltermelése gyomorrák szövetekben és a relatív kiegyenlített nem daganatos szövetekben. katalógusa

immunhisztokémiai vizsgálatát SSX2IP antigén feltárta a helyzetet festéssel SSX2IP fehérje tumorszövetmintákból kiegyenlített nem-daganatos szövetekben 66 gyomorrák samples.65% (43/66) gyomorrák szövetek jelenik megemelt immuostaining számára SSX2IP fehérje képest egyező nem tumoros szövetekben. Különösen a 84% (31/37) Gyomorrák szövetek jelenik emelkedett immunfestést GC mintát a miR-338-3p alacsony expressziós csoport, míg az adatok 41% (12/29) a miR-338-3p magas expressziós csoport. Így az elemzés a kifejezés a miR-338-3p és SSX2IP gyomorrákban szövetekben megerősítette a fordított összefüggés kifejezése miR-338-3p és megcélzott gén SSX2IP (Person Chi-négyzet próba: P
< 0,001, Spearman korrelációs: r = -0,442, P katalógusa < 0,001, Fig. 8). katalógusa

9. Méhen kívüli kifejezése SSX2IP megmenti a fenotípus okozta Over-termelő miR-338-3p GC Cells katalógusa

Ha SSX2IP az egyik fő cél elnyomta miR-338-3p GC, ectopiás expresszióját SSX2IP kell megmenteni a fenotípus okozta miR-338-3p feletti termelés GC sejtekben. A teszt ezt az ötletet, és SSX2IP expressziós vektort vagy üres vektort egyedileg transzfektáljuk SGC-7901, majd citológiai vizsgálatokkal mérhető sejt proliferáció, migráció, invázió és az apoptózis. Amint várható volt, overexpressziója SSX2IP részben vagy teljesen visszafordítja a gátló hatása a miR-338-3p GC sejtek valamennyi szempont vizsgáltuk (ábra. 9 A-D). Másrészt, SSX2IP nem befolyásolja a kifejezés a miR-338-3p (ábra. S5 a File S1). Így arra a következtetésre jutott, hogy a rák szuppresszor funkcióját miR-338-3p GC legalább részben keresztül elnyomja a megcélzott gén SSX2IP. Katalógusa

Vita katalógusa

Ebben a vizsgálatban azt találtuk, hogy az alacsony -expression miR-338-3p klinikailag társult nagyobb daganat mérete, több nyirokcsomó áttét, mélyebb helyi invázió és a fejlett TNM. A citológiai szinten, up-regulációját miR-338-3p gátolta a proliferációt, kolónia képződését, invázió és a migráció a gyomor rákos sejteket. Sőt, a túlzott kifejező miR-338-3p gyomorrákban sejtek szignifikánsan csökkentette tumorképzésért nude egerekben in vivo katalógusa. Mindent egybevetve, az eredmények határozottan arra utalnak, a tumor szupresszor szerepet miR-338-3p gyomorrák. Katalógusa

miRNS közelmúltban elismert alapvető tumorral összefüggő szabályozó faktorok. Bár a szabályozási mechanizmust miRNS expresszió a tumorok még mindig nem tisztázott, epigenetikai szabályozása felvetődött, hogy fontos szerepet játszik [31], [32]. DNS metiláció fordul elő, főleg a CpG-szigetre általában található a promoter régió a gén körülbelül 70% -át a promoter régiók emberi genom gazdag CpG-sziget [37]. A csökkentett kifejezések a miR-34b, miR-129 és miR-10b mind okozta hipermetiláció a promóterek [38], [39]. Összhangban van ez a fogalom, a metilációs szintje CpG sziget miR-338-3p gyomorrákban szövetek valóban magasabbak, hogy a kiegyenlített szomszédos, nem daganatos szövetekben, ami arra utal, hogy a miR-338-3p van epigenetikusan hallgatásra GC. Az oka ennek epigenetikus csend miR-338-3p gyomorrákban megfoghatatlan marad, és azt feltételezzük, hogy az olyan tényezők, mint a CagA, amelyet korábban már bejelentett epigenetikusan érinti a kifejezés a mikroRNS gyomorrákban [40], részt vehet az e rendeletben . Fontos, hogy a hiper-metilációs állapotát miR-338-3p promoter potenciális biomarker gyomorrák diagnosztizálására. Katalógusa

Mivel a miRNS-ek funkciót expresszióját szabályozó a downstream gének, a legfontosabb kérdésre, hogy hogyan miR-338- 3p hozzájárul GC melyik gén (ek) szabályozza. katalógusa

Itt azonosított SSX2IP fontos új cél a miR-338-3p, és amennyiben mind a citológiai és szövettani bizonyítékot arra utal, a daganatkeltő szerepe SSX2IP GC. Számos tanulmány azt mutatta, hogy SSX2IP egy akut mieloid leukémia-asszociált antigén és egy potenciális immunterápiás célpontot leukémia [33] - [35]. Fontos megjegyezni, hogy SSX2IP mutatkozott a korábbi tanulmányok támogatása a motilitás, invázió és a migráció és a kemoterápia ellenállása hepatomasejteken, jelezve, hogy fontos szerepet játszik a fejlesztés és a metasztázis. A homológ gén rágcsálókban ADIP katalógusa (afadin DIL domén-kölcsönható fehérje), az aminosav-szekvenciája ADIP fehérje egér és patkány kimutatta 88% és 87% -os azonosságot SSX2IP fehérje. ADIP lokalizálódik sejt-sejt adherens csomópontok, és ez elősegíti a sejtek mobilitását aktiválásával Rac1 keresztül Vav2 [41], [42]. Ez feltételezi, hogy SSX2IP elősegítheti sejtmotilitást, invázió és metasztázis aktiválásával Rac1.

Érdekes, a kifejezés a Rac1 a gyomorrák szövetekben magasabb volt, mint az egyező szomszédos, nem-tumor szövetekben, annak expressziós szint szignifikánsan kapcsolódó TNM. 7 gyomor rákos sejtvonalak, a kifejezések Rac1 magasabb volt, mint a gyomor nyálkahártya epiteliális sejtvonalat (GES-1) [43], melyet egybeesett a jelenség találtunk a miR-338-3p gyomorkarcinómában sejteket és szöveteket. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a miR-338-3p, mint gátló faktor a gyomorrák, csökkentheti expresszióját célgén SSX2IP elnyomni Rac1 aktiválást. A bevonása SSX2IP több rákos megerősíti a biológiai és élettani jelentősége a miR-338-3p /SSX2IP kaszkád rák fejlődését, és arra késztetett minket, hogy tovább vizsgálják állapotát miR-338-3p /SSX2IP más típusú rák. Azonosítása más potenciális célpontjai miR-338-3p is egy folyamatban lévő munka. Katalógusa

Összefoglalva, ez a vizsgálat le először miR-338-3p tumorszuppresszorként, amelyet gyakran elnémította keresztül epigenetikus hipermetilációt a promoter régió gyomorrák. Funkcionálisan miR-338-3p gátolja a metasztatikus jellemzői GC sejtek, mint a proliferáció, migrációs és behatolás in vitro katalógusa, és csökkenti a tumorképző GC sejtek apoptózis indukáló in vivo katalógusa. Sőt, mi azonosított SSX2IP mint döntő cél gén miR-338-3p GC fejlődését.

Other Languages