PLoS One: kis molekula R1498 egy jól tolerált és orálisan aktív kináz inhibitor a hepatocelluláris karcinóma és a gyomorrák kezelése révén célzás Az angiogenezis és Mitosis Pathways

absztrakt katalógusa

A protein kinázok fontos szerepet játszanak a tumorok kialakulásában és progressziójában. Sok kináz inhibitorok lépett piacra, és azt mutatják, ígéretes klinikai előnyöket. Itt beszámolunk a felfedezés egy új kis molekula, jól tolerálható, orálisan aktív kináz inhibitor, R1498, majorly egyaránt célzó angiogén és mitotikus utak kezelésére hepatocelluláris karcinóma (HCC) és a gyomorrák (GC). Egy sor biokémiai és sejtalapú vizsgálatokban azt mutatta, hogy a cél-kináz klaszter R1498 tartalmazza Aurora kinázok és VEGFR2 et al. R1498 megmutatta mérsékelt in vitro
növekedés gátlás egy panel tumorsejtek IC50 mikromol tartományban. A in vivo
tumorellenes hatékonyságát R1498 értékeltük a panel a GC és a HCC xenograftok egy párhuzamos összehasonlítás másik multikináz inhibitor szorafenibbel. R1498 bizonyították kiváló hatékonyságot és toxicitást profil felett szorafenibbel minden vizsgálati modellek > 80% tumor növekedés gátlás, és a tumor regresszióját néhány xenogratfts. A terápiás potenciálját R1498 is rámutatott annak hatékonyságát három emberi GC primer tumor eredetű xenograftmodellekben 10-30% tumor regresszió mértéke. R1498 kimutatták, hogy aktívan gátolja az Aurora A tevékenység in vivo katalógusa, és csökkenti a vérellátásának tumorokban. Emellett R1498 bemutatott jó in vivo katalógusa expozíció és terápiás ablak a farmakokinetikai és a dózis nagyságának tanulmányokat. Tézisek bizonyítékok azt mutatják, hogy R1498 hatékony, jól tolerálható orálisan aktív multitarget kináz gátló egyedülálló antiangiogén és sejtburjánzást gátló profil, és hogy erős bizalmat továbbfejlesztését HCC és GC kezelés. Katalógusa

Citation: Zhang C, Wu X, Zhang M, Zhu L, Zhao R, Xu D, et al. (2013) kis molekula R1498 egy jól tolerált és orálisan aktív kináz inhibitor a hepatocelluláris karcinóma és a gyomorrák kezelése révén célzás Az angiogenezis és Mitosis utak. PLoS ONE 8 (6): e65264. doi: 10,1371 /journal.pone.0065264 katalógusa

Szerkesztő: Claude Prigent Institut de Génétique et Développement de Rennes, Franciaország katalógusa

Beérkezett: február 22, 2013; Elfogadva: 23. április 2013; Megjelent: június 5, 2013 katalógusa

Copyright: © 2013 Zhang et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Finanszírozás: A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. katalógusa

Érdekütközés: Minden szerzők alkalmazottak vagy korábbi alkalmazottai Roche R &D Center (Kína), kivéve Taiping Chen , aki alkalmazottja a CRO cég neve Crown Bioscience Inc. Pekingben, Kínában. Ez nem változtat a szerzők betartása minden PLoS One politikák adatok megosztása és anyagok. Katalógusa

Bevezető katalógusa

A protein kinázok szolgálnak célokat terápiás beavatkozás rák, amely érvényesíti és bizonyít a sikeres és széles körű alkalmazása a protein-kináz-inhibitorok több rák, akár önálló hatóanyagként, akár kombinációban sémák. Azonban, mint egy heterogén betegség okozta felhalmozódó több génmutációt helyett hajtott egyetlen kináz mutáns, rákok, hogy tartsa a jó válasz, hogy egyetlen ügynök terápia nagyon korlátozottak. Ezen túlmenően, a szerzett rezisztencia tumorok segíteni magukat gyorsan kikerülni a kemoterápia, majd visszaesés. A komplexum aberráns jelátviteli rákok vonzza a fejlesztési stratégiák cél több biológiai útvonalak vonatkozó tumorbiológiában mint a proliferáció, metasztázis és anti-apoptózis. Az egyik stratégia magában foglalja a racionális hatóanyag kombinációja. Például, a kombináció a VEGF célzott monoklonális antitest hagyományos kemoterápiás bebizonyította szignifikáns túlélési előnyt emlő-, vastagbél-, és a tüdőrák [1]. Egy másik stratégia kifejlesztése vegyületek, amelyek lefedik több mechanizmus egyetlen ügynök. Ennek a megközelítésnek számos potenciális előnnyel kombinációs stratégiák, köztük az egyszerűség a fejlődés útján, a piaci sebesség, és kevesebb átfedés a mellékhatások. Jelenleg multikináz gátló sorafenib használják ki az elsővonalbeli kezelés az előrehaladott, metasztatikus HCC javításával; a medián túlélési idő 7,9 hónap (placebo csoportban) 10,7 hónap [2]. Azonban szorafenibbel eredményeket statisztikailag szignifikáns, de klinikailag enyhe javulás a teljes túlélés, a progresszióig eltelt idő és a betegség kontroll aránya [3]. Eközben hagyományos ciszplatin-alapú terápia még mindig széles körben használják a klinikai beállítások haladó és metasztatikus GC. HER2 /neu expressziót mutató gyomor adenocarcinoma, trastuzumab kemoterápiával kombinálva elnyújtja a medián teljes túlélés 11,1 hónap (csak kemoterápiával) 13,8 hónap [4]. Bár companioned diagnosztikai módszert hoztak létre, hogy képernyőre cél a betegek, trastuzumab nincs aktivitás nagy részét hordozó betegeknél magas szintű HER2 /neu az oka, hogy azonosítható [5]. Figyelembe véve a magas halálozási HCC és GC és a jelenlegi terápiás rendek korlátozott eredmény, még mindig hatalmas kielégítetlen orvosi igény mindkét ráktípusok.

Az angiogenezis aiapú rákterápia, beleértve az anti-VEGFR-2 antitest, kis molekulák ellen VEGFR -2 jelátviteli [6], [7] és a VEGFR kiméra protein [8], bebizonyosodott, hogy egy hatékony stratégia kezelésére többféle rák típusok. Ezen túlmenően, a hatásosságát multikináz inhibitorok szunitinib és a szorafenib lenne részben annak tulajdonítható, hogy a VEGF jelátvitel blokkoló [9]. Azonban számos beteg eredendően rezisztens vagy rezisztenssé az anti-antiangiogén terápia után több kezelési ciklus [10], [11]. Így a klinikai vizsgálatok kombinálásával angiogén gátlók és kábítószer alternatív hatásmechanizmus várható a hatékonyságot, illetve leküzdeni az ellenállást az antiangiogén kezelés [12]. Ez már széles körben elismerik, hogy a túlzott mértékű expressziója az Aurora kinázok különböző rákokban vesz részt a folyamatban tumorigenezis [13], [14]. Aurora kináz inhibitor VX-680 képes volt hatékonyan gátolja a rákos sejtek növekedését in vitro
és a in vivo katalógusa, és ezt követően lépett klinikai vizsgálatok, ami arra utal, hogy az Aurora kinázok druggable célokat [15] .

Annak fényében, akkumulatív bizonyítékok az angiogenezis és az Aurora kinázok rák és azok terápiás értékek bizonyítják a biológiai és a kis molekulájú inhibitorokkal, felfedeztük, egy kináz inhibitor, R1498, amely lényegesen befolyásolja a kulcsfontosságú utak az angiogenezis és mitózis. R1498 egyedülálló kinázgátlő profil, nagy hatékonyságú, és jó farmakokinetikai és toxikokinetikus profilok, ezek támasztják alá a további klinikai fejlesztés. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Etikai Nyilatkozat katalógusa

A felhasználási és gondozás kísérleti állatok jóváhagyta az Institutional Animál Care and Use Committee (IACUC), Roche R &D Center (Kína). Crown Bioscience, CRO szolgáltató cég elkötelezett a betegek védelme magánéletét, és kövesse az összes etikai alapelveket beteg származó anyagok, összegyűjtött frissen eldobott humán tumorminták IRB (helyi kórház azonos bizottság) jóváhagyása és a páciens beleegyezése követelményeknek. Az összes sejtvonalat az ATCC-től, USA, vagy a Shanghai Institutes Biokémiai és Sejtbiológiai, Kínai Tudományos Akadémia. Katalógusa

vegyületek katalógusa

R1498 (tisztaság > 98%) előállítása a Roche által az R &; D Center (Kína). Az enzimatikus vizsgálatok és a in vitro
sejtalapú esszék, R1498 DMSO-ban oldottuk, mint 0,01 mol /l törzsoldat. Az állatkísérletekben R1498 feloldunk 1% -os Klucel EF /0,1% poliszorbát 80 /0,09% metil-parabent /0,01% propil-parabén vizet, az oldatot készítünk hetente. Sorafenib szintetizáljuk a Roche R &D Center (Kína) és oldottunk fel Cremophor EL /etanol (50:50, Sigma), hogy készítsen egy 5 mg /ml-es törzsoldatot, fólia csomagolva, és tároljuk szobahőmérsékleten. Ezt a törzsoldatot frissen készített 3 naponként. Végleges adagolási oldatokat készítünk a felhasználás napján történő hígításával a törzsoldat sterilizált vízzel.

Sejtvonalak

Az összes sejtvonalat az American Tipikus Collection Center (ATCC), és sejtbank, Shanghai Institutes Biokémiai és sejtbiológiai a kínai Tudományos Akadémia volt 37 ° C-on, 5% CO _{2 nedvesített atmoszférában tápoldatot javasoljuk a szállítók és alá kell in vitro vizsgálatokban katalógusa között átjárók 8~15 a sejtvonalak Állatkísérletekben között voltak átjárók 5~10. Humán köldökvéna endoteliális sejteket (HUVEC) nyert Allcells (Emeryville, CA) tartottuk EGM-2 (Lonza Allendale, NJ) endoteliális sejt növekedési kiegészítők és 10% magzati borjú szérumot (Invitrogen, Carlsbad, CA).}

Cell Proliferation Assay

Valamennyi sejtvonalat oltunk egy 96 lyukas szövettenyésztő lemez (Corning, NY), egy előre meghatározott sűrűséggel 180 jii teljes közegben, csatolt egy éjszakán át és a kezelt vegyület által további 72 h. Ezután a tápközeget eldobjuk, és helyére 10% CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Japán) komplett tápközegben, ezután inkubáljuk a lemezeket újabb 2 óra hosszat. Az OD _{450 mértük SpektraMAX 190 spektrofotométerrel (MDS, Sunnyvale, CA). A háttér abszorbanciája OD üres kivontuk az összes lyukhoz. Ezután gátlási arány (IR) határoztuk meg az alábbi képlet alapján: IR (%) = (OD DMSO-OD vegyület) /OD DMSO × 100%.}

a VEGF által indukált HUVEC proliferációs assay, a HUVEC szuszpendáljuk 170 jil EGM-2, 0,5% FBS-t a maggal és egy éjszakán át inkubáljuk. Miután a sejtek csatolt 10 ul 1 ng /ml rekombináns humán VEGF 165 (R &D Systems, Minneapolis, MN) adunk az egyes lyukakhoz, amely 20 pl vegyületet készített oldatok EGM-2 0,5% FBS-sel. A CCK-8 assay mint fent alkalmaztunk meghatároztuk a sejtek életképességét.

kináz vizsgálatok

A affinitását R1498 ellen 402 kinázok határoztuk meg KINOMEScan® (Ambit Biosciences, San Diego, CA) és az adatokat be, mint disszociációs konstanssal (Kd) értékeket [16]. A gátlás a kináz aktivitást az Aurora kinázok és VEGFR2 tovább jellemezzük Z'-Lyte kináz aktivitás assay alatt megfelelő ATP koncentrációját.

HUVEC csőképződés assay

HUVEC csőképződés assay szerint végeztük korábban jeleztük [17]. Röviden, Matrigel ™ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) felolvasztottuk 4 ° C-on 3~4 órán át. 100 ul folyékony Matrigel ™ adunk előhűtött 96 lyukú szövettenyésztő lemezen, és a tálcát 37 ° C-on, 5% CO _{2 nedvesített atmoszférában 1 órán át megszilárdulni Matrigel ™. A HUVEC-ben tenyésztettük EGM-2, 0,5% FBS-sel egy éjszakán át, és leoltottuk 90 jil EGM-2, 0,5% FBS-sel, a sejtsűrűség 2,2 x 10 ^{5 sejt /ml a Matrigel ™ bevont lemez. A sejteket kezeltük vegyületet vagy ekvivalens mennyiségű DMSO-ban. A lemezt 37 ° C-on, 5% CO 2, nedvesített atmoszférában 7 órán át, majd sejtek morfológiáját készített fáziskontraszt-mikroszkóp (IX71, Olympus, Hamburg, Németország).}}

Western-blot

sejtlizátumot elő RIPA pufferben, és mennyiségileg a bicinchoninsav- (BCA) módszerrel (Pierce, Rockford, IL). Harminc mikrogramm fehérje egy mintát felvittük egy 4~12% NuPAGE® Novex SDS gél (Invitrogen). A fehérjét átvittük egy iBlot® száraz blot eszköz (Invitrogen) nitrocellulóz membránra. Blokkolás után a nem specifikus kötődés a TBS /Tween-20 (0,1%) (TBS /T), amely 5% zsírmentes tej 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük, a membránt a foszfo-Aurora A (Thr288) (C39D8) nyúl monoklonális antitesttel ( Cell Signaling Technology, CSTij9, Beverly, MA) vagy foszfo-hiszton H3 (Ser10) nyúl poliklonális antitesttel (CSTϊ1) (1:1000 TBS /T, amely 3% szarvasmarha szérum albumin (BSA), és óvatosan rázzuk 4 ° C-on egy éjszakán át. a membránt mostuk TBS /T háromszor, hogy eltávolítsuk a nem kötődött antitestet, majd inkubáljuk a szekunder antitesttel (HRP-konjugált kecske anti-egér IgG-t, vagy kecske anti-nyúl IgG-t, 1:10000, KangChen Biotech, Shanghai, Kína) 1 órán át szobahőmérsékleten, ill. Protein sávok láthatóvá fokozott kemilumineszcencia (ECL) kit (Pierce, Rockford, IL).

Immunfluoreszcens

oltott sejtek kamra tárgylemezeket fixáltuk 4% paraformaldehiddel szobahőmérsékleten, majd permeabilizáltuk 0,15% Triton-X100 TBS és blokkoltuk 3% BSA TBS-ben /T. a primer antitestekkel (foszfo-Aurora A (Thr288) (CSTĵ7), foszfo -Histone H3 (Ser10) (CSTϊ1), és MPM2 (anti-foszfo-Ser /Thr-Pro) Millipore-368) inkubáltunk lemezeket egy nedves kamrában 4 ° C hőmérsékleten egy éjszakán át. A másodlagos antitestek Alexa Fluor® 488 kecske anti-nyúl IgG (H + L) vagy Alexa Fluor® 594 kecske anti-egér IgG-t (H + L) (Invitrogen) alkalmaztunk rendre egy órán után a lemezeket mostuk TBS alaposan. Miután a nem kötődött antitesteket eltávolítottuk, a lemezeket megszárítottuk és szerelt DAKO antifide rögzítő médium. A képeket készített IX71 alatt megfelelő gerjesztési és emissziós szűrőket.

áramlási citometria

DNS-tartalmat mértük FACS-Calibur citométerrel (Becton Dickinson, San Jose, CA), és a sejtciklus eloszlása számoltuk a korábban leírtak szerint [18].

tubulin in vitro
polimerizáció assay

in vitro
tubulin polimerizációs vizsgálattal végeztük a korábban leírtak szerint [18 ].

egyszeri dózisú farmakokinetikai (SDPK) tanulmány katalógusa

A használata és gondozása a kísérleti állat hagyta jóvá Institutional Animál Care and Use Committee, Roche R &D Center (Kína). Hím csupasz egereket (testtömeg: 19-24 g) használtunk SDPK tanulmány. Mielőtt a farmakokinetikai vizsgálatban az állatokat véletlenszerűen a mintavételi egység (3 állatot időpont). Tíz további egereket használtunk az összegyűjtött plazma üres kalibrációs görbéket. Az egereket éjszakán át éheztetjük, mielőtt az orális beadás.

A vérmintákat összegyűjtöttük, retro-orbitális szúrás előre dózis és 0,033, 0,083, 0.25,0.5, 1, 2, 4, 6, 8 és 24 órával adagolást követően. A plazma-mintákat és az adag készítményt tároljuk -20 ° C hőmérsékleten, amíg bioanalízishez. Az adatgyűjtő és vezérlő rendszer segítségével jött létre Analyst 1.4 szoftver ABI Inc. plazmakoncentráció határ alatti mennyiségi (LOQ = 1 ng /ml) jelölték nulla. A farmakokinetikai adatok analízist nem kompartmentes analízis modul WinNoniin Professional v5.2 (Pharsight, USA) .A biohasznosulás számították F (%) = (dózis _{iv × AUC po (0-∞)) /(dózis po × AUC iv (0-∞)) * 100%. Patkány, kutya és majom SDPK vérmintákat gyűjtöttünk nyaki véna szúrás. Katalógusa}

xenograft hatékonyság vizsgálata sejtvonalakon és beteg eredetű tumorok

A használata és gondozása a kísérleti állat hagyta jóvá intézményi Animal Care and Use Committee, Roche R &D Center (Kína). A tumor sejtet oltunk a jobb horpasz BALB /c nu /nu
nőstény szőrtelen egerek (5~6 hét, 16~18 g nyert kínai-brit SIPPR /BK Lab. Animal Ltd, Shanghai, Kína) optimális sűrűség alapján a házon belüli validálási vizsgálat. Miután a tumor alakult, és elérte 100~150 mm ^{3, az egereket véletlenszerűen tíz egér csoportonként és kezelést kapott az ütemezésnek megfelelően. A tumor növekedést értünk heti három alkalommal a mérés a hosszúság (L) és szélességét (W) által féknyereg, és számítjuk ki a daganat térfogatát (TV, mm 3) = 0,5 * L * W * W (mm) . A tumor növekedés gátlás kiszámítása a TGI% = (1- (átlagos tumortérfogat a kezelési csoport az első nap-tumor átlagos térfogata a kezelt csoportban a végén napon) /(átlagos tumortérfogat a kontroll csoport az első nap-tumor átlagos térfogata a kontroll csoport a végén nap)) × 100%. A tumor regresszió egyes egér definiáltuk - a tumor térfogata a végén volt, kisebb, mint a tumor térfogata a kezelés megindításakor.}

humán primer tumor modellek, friss humán gyomor tumor szöveteket közvetlenül beültettük nem túlsúlyos diabéteszes és súlyos kombinált immunhiányos (NOD-SCID) egerek 5 órán belül műtét utáni 5 mm ^{3 fragmentumok létrehozására primer tumor xenograftmodellekben. Mindegyik tumor modell igazoltuk legalább három soros in vivo katalógusa még bizonyítani megtapadást stabilitást. Daganatok származó részeket 4-7 szubkután beoltunk trokárok be jobb lágyék BALB /c nu /nu nőstény szőrtelen egerek (5~6 hét, 16~18 g). A kezelés akkor kezdődött, amikor a daganat térfogata elérte 100~150 mm 3. A tumor mérését és működés protokoll ugyanaz volt, mint származó sejtvonal tumor modell.}

Immunhisztokémia

A 8 um, paraffinba ágyazott tumorszövet diákat készített daganata in vivo
hatásosság tanulmányok melegítünk száraz szárítószekrényben 60 ° C-on 1 órán át, majd paraffint és hidrolizáljuk Leica autostainer XL ST5010, szobahőmérsékleten. Antigén-visszanyerés végeztük 95~99 ° C-citrát-pufferben (0,01 M, pH = 6,0) melegítjük egy orvosi mikrohullámú 92-98 ° C-on 5 percig, majd lehűtjük szobahőmérsékletre. Ezután peroxidáz-blokkoló reagenssel (DAKO, DK-2600, Glostrup Dánia) alkalmaztunk, hogy leállítsuk a endogén peroxidáz. A tárgylemezeket inkubáltuk blokkoló szérum 20 percig, majd által lefedett 100 ul foszfo-Aurora A (Thr288) (C39D8) nyúl mAb (CSTij9, 1:200 TBS /T) vagy nyúl anti-humán CD31 poliklonális antitest ( santa Cruz Biotech, az SC-8306, santa Cruz, CA, USA; 1:200 TBS /T), 4 ° C-on egy éjszakán át, majd inkubáljuk 100 ul DAKO Envision + /HRP, nyúl /egér, miután alaposan mossuk TBS-ben. Száz mikro liter szubsztrát kromogén oldatot (DAB) vittük fel a lemezekről, és szobahőmérsékleten inkubáljuk 10 percig. A tárgylemezeket öblítettük óvatosan csapvízzel 15 percig. Counterstain és kiszáradás végeztük XL ST5010, szobahőmérsékleten. Végül a metszeteket szerelt Permount fedőoldattal (Fisher Scientific, Miami, Florida). Katalógusa

dózis nagyságának és toxikokinetikai Study katalógusa

dózis nagyságának és toxikokinetikai vizsgálatot végeztünk patkányokon és Beagle kutyák alapján in vitro katalógusa metabolitok azonosítása. Wistar-patkányokat (hím: 3, a női 3 minden csoportban, származó Vital River, Beijing, China) éjszakán át éheztettük, majd a kapott vizsgálati cikkek, mint 0, 6,25, 50 és 100 mg /kg naponta kétszer per orális gyomorszonda egy 14 -nap folyamatos kezelés. A motilitást megfigyelés felhordtuk egy napi bázisok, hogy megtalálják a maximális toleráns dózis az állatok számára. Az állatokat áldoztak a D14 és a következő toxikológiai megfigyelés végeztük testsúly változás, a klinikai megfigyelés, autopsziának, hematológia kémia és kórszövettani. Az 1. napon és a 14. napon vérmintákat keresztül szerezhetők nyaki vénába szúrt valamennyi állatból (ha életben használva EDTA-K2 csövek). A mintákat óvatosan összekeverjük, és helyezzük zúzott nedves jégen centrifugálás, amelyet azonnal el kell végezni. A mintákat centrifugáltuk, körülbelül 15 percen át 4 ° C-on 2700 fordulat. A kapott plazmát elválasztottuk, átvittük egyedileg jelzett tiszta polipropilén csövekbe és azonnal lefagyasztottuk, szilárd szén-dioxidot (szárazjeget), amíg át körülbelül -80 ° C-on. Minden egyes állatot elvéreztetjük az alábbi időpontokban: Körülbelül 5 perc, 15 perc, 30 perc, 1, 2, 4, 8 és 24 órával az első dózis az adott napon. A gyógyszer koncentrációját a plazmában meghatároztuk LC-MS /MS. A farmakokinetikai elemzést végeztük WinNonlin szoftver (Version 5.2, Pharsight Corporation, CA, USA), valamint a farmakokinetikai paramétereket számítottuk ki nem-kompartmentes modell módszerrel.

Beagle kutyákat (kb 8-10 hónap, Peking Marshall Biotechnology Co. Ltd., Beijing, China) vetettük alá, a vizsgálati protokoll a fent leírtak szerint. Minden csoport egy hím és egy nőstény kutya, a dózis a vizsgált cikk voltak: 0, 1, 7,5 és 15 mg /kg volt. A használata és gondozása a kísérleti állat hagyta jóvá Institutional Animál Care and Use Committee, Roche R &D Center (Kína). Katalógusa

Az adatok elemzése és Statisztika katalógusa

A független t-próbát használtunk az adatok folyamatos elemzése, és χ2 próbával kategorikus adatok. Az adatokat tekintettük szignifikánsnak, ha p értékeket < 0,05. Katalógusa

Eredmények katalógusa

1. Jellemzése R1498 mint egy multikináz inhibitor

Pyrazolobenzodiazepine analóg R1498, egy állvány alapuló fúziós benzodiazepin és pirazolgyűrű (1a ábra), korábban azonosítottak, hogy egy gyenge ciklinfüggő kináz 2 (CDK2) inhibitor [19]. Ez a molekula mutatta, a természet egy multikináz gátló amikor elemeztük a kináz gátló könyvtár. A kináz gátlási profilja R1498 (1 | iM), jellemzői keresztül KINOMEScan® át ATP-koncentráció körül Km egyes kináz. A gátlás mértéke R1498 több mint 80%, szemben a 39-kinázok közül 402-kinázok, beleértve a 359 vad típusú kinázok és 43. kináz mutáns (ábra S1). A disszociációs konstans (Kd) 39 hit kinázok ezután határozzuk meg, valamint a kinázok Kd < 0,2 uM voltak ábrán látható az 1B. A legtöbb potenciális találatok tartozik a tirozin-kináz (TK) család és az AGC család. Ezen túlmenően, a Z-Lyte vizsgálatot végeztünk további meghatározására-kináz inhibitor hatású R1498. Az eredmények azt mutatták, hogy IC50 az R1498 voltak 25 ± 6, 67 ± 4, 167 ± 13 nM ellen VEGFR2, Aurora kináz A, illetve B (1C). Akkor a tanulmány középpontjában az anti-angiogén és anti-mitotikus utak majorly befolyásolja R1498.

panel 16 rákos sejtvonalak, beleértve a hepatocarcinomát, gyomorrák és nazofaringeális karcinóma sejtvonalakban, arra használták, hogy meghatározzák a in vitro katalógusa sejtburjánzásgátlást képességét R1498. A legtöbb sejtvonalak létre az ázsiai rák, például az ázsiai elterjedt rákos megbetegedések a hangsúly. A májkarcinóma és a gyomorrák sejtvonal panel érzékenyebbek voltak R1498 kezelésre, mint orrgarat rákos sejtvonalak. Az összesített átlagos IC50 voltak: 7,81, 7,55 és 30,07 | iM, megfelelő epatocellular karcinóma, a gyomorrák, és nazofaringeális karcinóma sejtvonalakban, ill. Az érzékenység származó sejtvonalak ázsiai populáció (BEL-7402, QGY-7701 és QGY-7703) hasonló volt az érzékenysége Hep3B volt származó kaukázusi (1D). Katalógusa

2. R1498 Gátolja Aurora kinázok és sejtciklusleállást

Aurora kináz gátlás által R1498 tettük láthatóvá immunfluoreszcens gyomorrák sejtvonalon SGC-7901. Közvetlen foszforilációs helyek foszfo-Aurora kináz A (T288) és foszfo-hiszton H3 (S10) arra használható, hogy jelezze a kináz aktivitását Aurora A, illetve B [20], [21]. Phospho-Ser /Thr-Pro mitotikus protein monoklonális(MPM2) használtunk egy mitotikus markert (piros) címkézés mitotikus sejtekben. Aurora kináz A (T288) foszforilációja következik be a centroszóma mitotikus sejtek (zöld). Miután a sejteket kezeltük 5 nmol MR1498 24 órán az Aurora A T288 zöld gócok mitotikus sejtekben lett gyengébb vagy eltűntek (2A ábra, felső panel), jelezve, hogy az aktivitás az Aurora kináz A csökkent upon R1498 kezelést. A foszforiláció hiszton H3 (S10) elsősorban lokalizált a centromer mitotikus sejtekben. Miután a sejteket kezeltük R1498, a foszfo-hiszton H3 (S10) meredeken csökkent (zöld). Ez a megfigyelés azt javasolta, hogy a tevékenység a Aurora kináz B is leesett után R1498 kezelést. Ezek az eredmények immunfluoreszcens megerősítették Western-blottal. Amint azt a 2B ábra a foszforilációját foszfo-Aurora kináz A (T288) és foszfo-hiszton H3 (S10) csökkent a koncentráció-függő módon az akut kezelés által R1498.

az Aurora kinázok gátlása A és B gyárt különböző fenotípusos változásokat sejtciklust. Elnyomása Aurora A által indukált sejtciklus G2 fázis leállását [22], míg a gátlás Aurora kináz B tűnik okoz poliploid sejtek miatt endoduplication nélkül citokinézis [15]. Miután a sejteket kezeltük 10 jiM R1498, mind SGC-7901 (gyomorrák sejt), és BEL-7402 (hepatocelluláris karcinóma sejt) azt mutatta, G2 /M fázis leállását és felhalmozódását poliploid sejtek. Bel-7402, a sejteket terjesztése a G2 /M fázisban emelkedett 25,6% 57,0%, eközben a sejtek kitermeléssel 4 N DNS-tartalom növekedett 6,7% -ról 17,6%. SGC-7901 érzékenyebb volt, és a G2 /M népesség nőtt 25,2% és 75,5%, és a poliploid sejtek megnövekedett 3,1% -ról 21,6% -ra (2C ábra). A mikrotubulus stabilizátor (például Taxol) és destabilizer (például kolchicin) hatására a G2 /M fázis leállását is. Ahhoz, hogy megértsük, hogy R1498 egy mikrotubulus célzott reagens, in vitro
tubulin polimerizációs vizsgálattal végeztük. Az adatok azt mutatták, hogy R1498 sem stabilizált sem destabilized mikrotubuluspolimerizáció még nagy R1498 koncentráció (40 mM) in vitro katalógusa (2D, ábra), ami arra utal, hogy a sejtciklus G2 /M letartóztatás nem okozott mikrotubulusok citoszkeleton zavar. Összefoglalva, ezek az adatok arra utalnak, hogy R1498 gátolta az Aurora kinázok A és B-sejtek és az előállított a fenotípusos változásokat a sejtekben.

3. R1498 antagonizálja az angiogenézis haladás az emberi endoteliális sejtek

Az angiogenézist inicializálja szekréciója angiogén növekedési faktor tumorsejtek, majd az endothel sejtek szaporodnak, vándorolnak és a forma hajó csövek válaszokat a VEGF stimulációt. A címet a specificitását R1498 antagonizálására endoteliális növekedési által stimulált VEGF, humán köldökvéna endoteliális sejteket (HUVEC) voltak kitéve a két különböző ingerekre, VEGF és FBS-sel, alatt kezelésére R1498 72 órán át. Szerinti tenyésztési körülmények tartalmazó VEGF vagy FBS-sel, HUVEC megmutatta különböző válasz R1498. Az IC50 voltak 89 és 2064 nM VEGF és FBS rendre; ezek azt javasolta, hogy R1498 antagonizálta a HUVEC növekedési által vezérelt VEGF hatásosabb, mint a FBS (3A ábra). HUVEC csőképződésre vizsgálat után 8 óra expozíció R1498, HUVEC alakult kevesebb ép cső szemek, mint DMSO kezelt csoportban (3B). R1498 nem befolyásolta HUVEC proliferáció mellett ez a kezelés feltétel (az adatokat nem mutatjuk be).

4. R1498 Megakadályozza a növekedés az emberi rák xenograftok katalógusa

A farmakokinetikai tulajdonságokat egyszeri adag R1498 több fajt határoztak meg. A felezési idő (T1 /2) és az orális biohasznosulás (Oral BA%) támogatja a további hatékonysági vizsgálatot nude egér (táblázat S1) és a napi kétszeri orális szondán menetrend. A panel xenograftokkal köztük az ázsiai gyomorrák, hepatocarcinoma és orrgaratráknak alkalmaztunk összehasonlítását R1498 és a másik multikináz gátló sorafenib (4. ábra, táblázat S2). Sorafenib jóváhagyott első vonalbeli terápiaként hepatocarcinoma [2], és a klinikai vizsgálatban kombinatorikus terápia előrehaladott gyomorrák [23]. A párhuzamos összehasonlítás állt tumor növekedés gátlás, regresszió és a testtömeg változását állat adagolás 25 mg /kg, naponta kétszer per orális. Minden tesztelt xenograftok, R1498 mutatott jobb tumornövekedés gátlási arányt (TGI%) felett szorafenib. Mert hepatocarcinoma, a TGI% -a R1498 is 10-19% -kal több, mint a TGI% szorafenibnek, gyomorrák, 2-12% -kal TGI% szorafenib. A regressziós tumor is beépítettünk egy másik terápiás végpont. A hepatocarcinoma panel, a tumor regresszió volt megfigyelhető Bel-7402 modell, 8/10 (80%) állatok voltak regresszió R1498 csoportban, míg 1/10 (10%) állat volt regresszió szorafenib csoportban (4. ábra Bel-7402) . Gyomorrák panel, MGC-803, SGC-7901 xenograftok ugyanaz volt a regressziós ráta válaszul a teszt cikkek: 5/10 (50%) a R1498, és 2/10 (20%) a szorafenib (4. ábra, SGC -7901 és táblázat S2). Alapján a hatásossági végpontok minden 7 tesztelt modell, R1498-nak jobb hatékonyságú, mint Sorafenib alatt ugyanolyan kezelési program. Ezen kívül, R1498 mutatott jó hatásosság egyetlen nazofaringeális karcinóma xenograft, a TGI% -a R1498 (90%, 25 mg /kg, naponta kétszer, per orális gyomorszonda) jobb volt felett standard Ruhaápolási ciklofoszfamid (60%, 10 naponként, intraperitoneális injekció) (4. ábra, CNE-2). A testtömeg-változás, amely jegyeztek fel az összes modell a toxicitás összehasonlítás azt mutatta, hogy a meztelen egéren végzett elviselhetőbb az R1498 teljes tartama alatt a kezelés BEL-7402, SGC-7901 és CNE-2 modell, bár testsúlynövekedés enyhén csökkent után 10 nappal kezelés (4. ábra, táblázat S2). Azonban szorafenib okozott folyamatos csökkenése az állat testsúly. Mert szorafenibbel kezelt egér BEL-7402, SGC-7901 modellek, a százalékos testsúlycsökkenés meghaladta a 15%, a megszűnés napján. A táblázatból látható, S2, R1498 kevésbé voltak hatással a képre nagyobb testtömeg szorafenibbel volt, ami arra utalt, hogy R1498 tartott biztonsági profilja jobb. Katalógusa

5. R1498 downregulálja foszforilációja az Aurora A és Érrendszeri Sűrűség tumor

foszforilált Aurora A (T288), és CD31 származó tumorokban hatékonysági vizsgálatot alkalmaztunk meghatározására a célzott hatás R1498. A tumor tömege takarítják a BEL-7402 átültetést tanulmány készült paraffinba ágyazott diák és alá kell immunohistochemisty szemléltetésére angiogenezis készítő emberi CD31 és Aurora kináz A tevékenység marker foszforilált Aurora A (T288). Bel-7402 tumorok, a CD31 festődése R1498 kezelési csoportok csökkent dózisfüggő módon, amely azt sugallta a vaszkularizáció a tumorokban gátolva volt (5A ábra). A tevékenység a Aurora kináz szintén csökkent upon R1498 kezelés, ami tükröződött a gyengébb festés a foszforilált Aurora A (T288) az R1498 kezelt tumorok (5B ábra). Katalógusa

Az emberi primer gyomor tumor eredetű xenograftmodellben használták megjósolni hatásosságára vonatkozó klinikai fordítás. A rákos szövetek három különálló gyomorrákos betegek voltak beoltott egér, és xenograftokkal körülhatárolt különböző növekedési görbék in vivo katalógusa. A xenograftokkal megmutatta eltérő hatása van a testtömeg-változás a házigazdák. Az egereket kezeltük R1498 (25 mg /kg) a feltüntetett időszakban, a végső TGI% elérte a 73,6 ~ 91,6% -os, a regresszió aránya 10~30%. A korlátozott testsúly változások azt javasolta, hogy a tumor hordozó egereket jól toleráns R1498 (6. ábra).

6. R1498 jó farmakokinetikai profil (PK) és terápiás ablak

SDPK jelezte, hogy az elfogadható biológiai hozzáférhetősége és a felezési tulajdonságait R1498 között meztelen egér, patkány és kutya (táblázat S1). Összegyűjtöttük máj mikroszómákat megjósolni a fő metabolitok a különböző fajok. Patkány és beagle kutya hasonló mikroszómakészítményt metabolitjainak humán használták maximális toleráns dózis (MTD) tanulmány meghatározza a terápiás ablak hatásos és toxikus expozíció (táblázat S4). Női és férfi patkányoknál különböző válasz a eszkalálódott dózisú R1498.

• PLoS One: piruvát-kináz M2 kettős szerepe a rendelet az EGF /EGFR jelátvi- E-Cadherint-függő módon a gyomorrák sejtek
• PLoS One: prospektív vizsgálatban az előfordulási posztoperatív vénás trombózis és embólia koreai gyomorrákos betegek: egy vizsgálatot az alkalmazása nyugati iránymutatások az ázsiai C…