Jelentősége csali receptor 3 (DcR3) és külső jel szabályozott kináz 1/2 (Erk1 /2) a gyomorrák

Jelentősége csali receptor 3 (DcR3) és külső jel szabályozott kináz 1/2 (Erk1 /2) a gyomorrák katalógusa Abstract Background katalógusa katalógusa csali receptor 3 (DcR3), tagja a tumor nekrózis faktor receptor (TNFR) szupercsalád, társul tumorellenes immunitás elnyomás. Ez erősen expresszálódik számos daganatok, és expresszióját lehet szabályozni a MAPK /MEK /ERK jelátviteli. A MAPK /MEK /ERK útvonal leírták, hogy egy szabályozó tumor előfordulás, a fejlesztés és a klonális expanzió. Külső-jel szabályozott kináz (ERK) létfontosságú tagja ennek útvonalnak.
Eredmények
expresszióját DcR3 és ERK1 /2 a daganatos szövetekben a gyomorrák betegek szignifikánsan magasabb volt, mint a nem-rákos csoportban (P
< 0,05). Nem volt statisztikai különbség a daganatos szöveteket a betegek különböző korú, vagy nem, és akár különböző differenciálódási (P katalógusa > 0,05). Azonban stádiumú I gyomorrák, a DcR3 és ERK1 /2 szintje szignifikánsan alacsonyabb, mint a betegek több előrehaladott szakaszában van. Katalógusa Következtetések katalógusa DcR3 és ERK1 /2 fontos szerepet játszanak a gyomorrák kialakulásával, és lehetnek új markerek jelzésére hatékonyságát gyomor rák kezelésére a jövőben.
alapon
Decoy receptor 3 (DcR3) egy tagja a tumor nekrózis faktor receptor (TNFR) szupercsalád. Bebizonyosodott, hogy a csali receptora Fas ligandum (FasL), könnyű és TL1A [1-3], vagy más néven TR6 [4]. DcR3 többnyire kifejezve a tumorsejtekben és kompetitíven gátolja a TNF jeladást. Túlexpressziója DcR3 a tumorsejtek megvédi őket a apoptózist. DcR3 megvédi tumorsejtek immunfelügyelet, mivel hozzájárul a elnyomása a gazda tumorellenes immunitás.
DcR3 mRNS és fehérje felerősödnek különböző rosszindulatú szövetekben, mint például a tüdőrák, vastagbélrák, gyomorrák, nyelőcső karcinóma, a hasnyálmirigy rák és malignus melanóma [1, 5, 6]. Wu és munkatársai.
[7] számoltak be, hogy DcR3 nem lehetett kimutatni a nem-tumoros betegek, de kimutatható volt 98,8% (82/83) betegek rosszindulatú rákok.
Ez a jelenség azt mutatja, hogy az emelkedett DcR3 expresszió szignifikánsan összefügg a tumorigenezis és a tumor progresszióját. Wu és munkatársai.
[8] számoltak be, hogy DcR3-ben erősen expresszálódik a humán gyomorrák (GC), és pozitívan korrelált a fejlődés és a metasztázisok a gyomor elváltozások. Gyomorrákos betegek magas DcR3 kifejezés bemutatott egy fejlettebb pN2-3 betegség, mint az alacsony DcR3 kifejezés.
A DcR3 a FasL is be lehet vonni a progresszió a gyomorrák. További értékelésének lehetséges szerepei DcR3 és szabályozásának DcR3 expresszió malignus sejtek nagyon fontos az új stratégiák szabályozására rosszindulatú sejtek növekedését, hogy elkerülje a gazda immunrendszer felügyelet.
A korai szakaszban, a MAPK /ERK útvonal aktiválódik, daganatok, ami figyelemre méltó jele a sokféle rák emberben. Nemrégiben számos bizonyíték azt javasolta, hogy az ERK lehet egy paraméter előrejelzésére a prognózis különféle rákok, így például mellrák, vastagbélrák, hasnyálmirigyrák és kolangiokarcinóma. Wang és munkatársai.
[9] számolt be, hogy a kifejezés a ERK1 /2 magas volt cholangiocarcinoma, ami korrelált a TNM szakaszaiban.
Kim et al.
[10] megállapította, hogy az LPS által indukált DcR3 kiadás emberi intestinalis epithel-sejtek (IEC), amely úgy tűnt, hogy keresztül aktiválása mitogén-aktivált protein kinázok (MAPK), mint például extracelluláris szignál-szabályozott kináz 1 és 2 (ERK1 /2), és a c-Jun NH2-terminális protein kináz ( JNK). LPS-indukált DcR3 kiadás SW480 sejtek eltörölte ERK1 /2 és JNK inhibitorok. Emellett Yang et al.
[11] számolt be, hogy 3 g /ml DcR3 jelentősen indukálta foszforilációja ERK és a p38.
Megfelelően ezeket a jelentéseket, azt javasoljuk, hogy DcR3 és ERK1 /2 szorosan összefügg. A DcR3 gének szorosan összefügg az előfordulása és fejlesztése sokféle daganat. Ebben a tanulmányban a kifejezést, elhelyezése DcR3 és ERK1 /2 gyomorrákos betegek a különböző korú, nem, színpadi és differenciálódását, hogy vizsgálja meg a kapcsolat a DcR3 /ERK1 /2 és a gyomorrák előfordulása és fejlesztés. Továbbá, mi javaslatokat biztosítunk klinikai diagnózisa gyomorrák. Katalógusa Módszerek
Klinikai minták katalógusa Daganatok voltak gyomorrákos betegek, akik alávetették endoszkópos biopszia vagy gyógyító műveletek Zhongshan kórházi kapcsolatban Xiamen egyetemen. Daganatszöveteken ahonnan DNS és fehérje izoláltunk volt friss mintáját resectio műtét. Minden mintát kapunk a beteg beleegyezése és jóváhagyása bizottság Medical Ethics Zhongshan Kórház Xiamen Egyetem. Katalógusa Egerek katalógusa Valamennyi kísérletet végeztünk 6-8 hetes hím csupasz egereket vásárolt állat Research Center of Medical College Xiamen Egyetem. Minden Az állatokat alatt specifikus patogén mentes körülmények között állandó hozzáféréssel a vízhez és Chow. Minden vizsgálati eljárást végeztünk jóváhagyását követően az Animal Care and Use Committee of Xiamen Egyetem. Katalógusa Sejttenyésztés
humán gyomorrák sejtvonal BGC823 tartottuk laboratóriumunkban, ami tenyésztettük lombik Dulbecco módosított Eagle közegben (DMEM), amelyet 10% magzati borjúszérumot (FBS) és 1% penicillin-sztreptomicin, 37 ° C-nedvesített atmoszférában, 5% CO2.
Reagensek
DMEM, FBS-t és penicillin-sztreptomicin vásároltunk a Hyclone Corporation (Utah, USA). Hematoxilin-és-eozin (H &E) vizsgálati készlet, vásároltunk a Chemicon International, Inc (Temecula, CA, USA). ERK1 /2 és DcR3 Abs vásároltunk a Santa Cruz Bio technológia. RT-RCR reagenseket vásárolt Takara (Dalian, Kína). A primer szekvenciát szintetizáljuk Sangon (Shanghai, Kína).
In vivo állati tumor-modelleken
tumorokat keletkezett hím csupasz egerek intramuszkuláris (IM) injekció BGC823 sejtek (1,0 × 105 sejt 100 pl PBS-ben) a a jobb szárnyon. A tumor méréseket alakítjuk tumor térfogat (V) általános képletű (L × W2 × 0,52), ahol L és W a hosszát és szélességét, ill. A méréseket nóniuszos tolómércével. Minden tumort hordozó egereket osztottunk véletlenszerűen csoportokba (2 egér /csoport).
RT-PCR és Western blot analízis vizsgálatára expressziójának DcR3 /ERK
teljes RNS-DcR3 és ERK1 /2-t extraháltunk a stimulált sejtek Trizol. Mérésére ERK /DcR3 gén kópiaszám, a DNS-t friss tumor minták elemzésekor RT-PCR-rel. Az upstream és downstream primereket ERK1 mRNS voltak: 5'-CCTGCTCATCAACACCACC-3 'és 5'-CGTAGCCACATACTCCGTCA-3', és az ERK2 mRNS voltak: 5'-TCTTCC AGCCCTCCTTCCTG-3 'és 5'-CGTTTCTGCGCCGTTAGGT-3'. A mintákat denaturáltuk 95 ° C-on 4 percig, ezt követi 35 amplifikációs ciklus (95 ° C, 45 sec; 55 ° C, 45 sec; és 72 ° C, 60 mp). A termékek 300 bp és 400 bp fragmentumok volt. Mert DcR3 mRNS, az upstream primer volt 5'GCAAAGCCAAGGATTCCCCCTG -3 "és a downstream primer 5'-GGCACTGCTCTGAGCTGGAGCTG-3 '. A mintákat denaturáltuk 95 ° C-on 4 percig, majd 30 amplifikációs ciklus (95 ° C, 45 sec; 55 ° C, 45 sec; és 72 ° C, 60 mp). A kapott termék 921 bp hosszúságú fragmenst.
BGC823 sejteket elkülönítettük, és lizáltuk sejt lízis puffer (1% (v /v) Nonidet P-40, 150 mM NaCI, 50 mM Tris-HCl (pH = 8), 1 mM PMSF, 2 g /ml aprotinin, és 2 g /ml leupeptin), ami felszabadítja DcR3 és ERK1 /2 fehérjéket. Huszonöt mikrogramm teljes lizátumot frakcionáltuk SDS-PAGE és Western-blot-analízis az anti-ERK vagy anti-DcR3 mAb (klón 3 H5).
Western blot és ELISA assay vizsgálatára expressziójának DcR3 /ERK után inhibitorok kezelés
BGC823 sejtek tenyészet-felülúszókat összegyűjtöttük különböző időközönként, és szintű U0126, PD98059, APDC, MEK1 /2 és ERK1 /2 interferenciák mennyiségi meghatározását kereskedelmi ELISA kitek szerint az eladó utasításai szerint. A sejteket kezeltük ERK1 /2 shRNS (5: 2, 6: 2), U0126 /PD98059 (0 nmol /l, 5 umol /l, 10 nmol /l, 20 nmol /l, 40 nmol /l) és APDC (0 nmol /l, 10 nmol /l, 20 nmol /l, 40 nmol /l, 80 nmol /l), ill. Miután egy 5 vagy 7 napos inkubálás sejteket vetjük alá a citokinek, mint jelzett vizsgálati eljárásban. Huszonöt mikrogramm teljes lizátumot frakcionáltuk SDS-PAGE és Western-blot-analízis az anti-ERK vagy anti-DcR3 mAb (klón 3 H5).
Immunhisztokémia elemzés a kifejezés a DcR3 és ERK1 /2
daganatos szövetek fixáltuk egy formaldehid közepes és paraffinba ágyaztuk. A 6 mm vastag volt üveg tárgylemezekre előkezelt 0,1% poli-L-lizin. Őket akkor deparaffinaged XY-lene, dehidráltuk etanol és áztatott 3% H 2 O 2-on 10 percig, hogy megszüntesse az endogén peroxidáz aktivitást. Ezután a tárgylemezeket merítettük citrát-pufferrel (pH = 6,0) és a főtt át 92-98 ° C-on mikrohullámú kemencében 10 percen át. Ezt követően ezeket leöblítettük 3-szor PBS-sel 10 percig minden egyes és blokkoltuk 10% -os normál kecske szérummal PBS-ben 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A tárgylemezeket ezután az affinitás-tisztított nyúl anti-TR6 Ab (1,67 g /ml) szobahőmérsékleten 2 óra hosszat keverjük. Mosás után a metszeteket biotinilált kecske-anti-nyúl antitesttel 10 percig. TR6 jel kiderült streptavidin-peroxidáz alkalmazásával DAB szubsztrátként utasításainak megfelelően a Histostain-Plus kitet (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA). DcR3 jelek derült fény barna. Végül a metszeteket hematoxilinnel ellenfestettük és lezárt vizes Rögzítő közeg (Zymed).
Statisztikai analízis
Az adatokat átlag ± SD. A jelentősége a különbség a csoportok között értékeltük Student`s kétmintás t-teszt. Valószínűség értéke kisebb, mint 0,05 értéket tekintettük szignifikánsnak. Minden eszköz számoltuk legalább három független kísérlet során.
Eredménye
rákos betegek megemelkedett DcR3 szintek
tanulmányozása közötti korreláció DcR3 expresszió és tumor előfordulás és a fejlődés, a daganatok 50 gyomorrákos betegek begyűjtése és vizsgálata a DcR3 mRNS és fehérje szinten. Amint az 1A ábrán látható, a 921 bp DcR3 sávokat állítottunk elő RT-PCR-rel a tumor szövetekben a legtöbb beteg (36/50), míg a nem-rákos szövetekben (2/50) ugyanabból a szerveket az ilyen betegek. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy DcR3 szint szignifikánsan növekedett (nyolc véletlenszerűen kiválasztott klinikai mintákat az 1A ábrán látható). Annak további igazolására, eredményeinket, a DcR3 fehérje szinten vizsgáltuk Western-blottal. Az eredmények azt mutatják, hogy a DcR3 protein volt kimutatható a legtöbb rákos betegek; DcR3 detektáltunk fehérjét 74% (37/50) a tumor szövetekben, de csak 6% (3/50), a nem-rákos szövetekben (1. táblázat és 1b ábra; nyolc véletlenszerűen kiválasztott klinikai mintákat ábrán mutatjuk be az 1b ). 1. ábra A expresszióját DcR3 a gyomorrák és nem-rákos szövetekből analizáltuk RT-PCR (Figure1a) és Western-blot (Figure1b). a: M oszlop DNS-markereket; lanes1-7, daganatos szövetek; 8. sáv, nem rákos szöveteket; DcR3 mRNS pozitív volt 36 50 tumor szövetekben (1-7) és a negatív nem-rákos szövetekből (8). b: lanes1-7, daganatos szövetek; 8. sáv, nem rákos szövetekben. DcR3 fehérje pozitív volt 37 50 minta a tumor szövet (1-7), amely mindössze 3, 50 nem-rákos szövetekből (8).
1. táblázat elemzése gyomorrák betegek DcR3 és ERK1 /2-expresszió tumoros és normál szövetek
esetek Matton pozitív szám Matton pozitív arány (%)
tumor katalógusa 50 katalógusa mRNS
Fehérje katalógusa + /+ katalógusa mRNS katalógusa Protein katalógusa + /+ katalógusa DcR3 katalógusa 36 katalógusa 37 katalógusa 28
72,0 katalógusa 74,0 katalógusa 56,0
ERK1 katalógusa 37 katalógusa 42 katalógusa 36 katalógusa 74,0 katalógusa 84,0 katalógusa 72,0 katalógusa P katalógusa > 0,05 katalógusa ERK2 katalógusa 32 katalógusa 37 katalógusa 27 katalógusa 64,0 katalógusa 74,0 katalógusa 54,0 katalógusa Nem rákos katalógusa 50 katalógusa DcR3 katalógusa 2

• MikroRNS-206 elnyomja gyomorrák sejtek növekedését és metastasis
• Optimális kezelés a trastuzumab kombinált oxaliplatin /kapecitabin elsővonalbeli kezelésére HER2-pozitív előrehaladott gyomorrák (CGOG1001): Egy multicentrikus, fázis II trial