Stomach Health > gyomor egészség >  > Stomach Knowledges > kutatások

MikroRNS-144 gátolja az áttétek gyomorrák megcélozva MET expression

mikroRNS-144 gátolja az áttétek gyomorrák megcélozva a MET kifejezés katalógusa Abstract katalógusa gyomorrák (GC) továbbra is az egyik leggyakoribb rosszindulatú daganatos, és a molekuláris mechanizmusa a metasztázis nagyrészt még mindig nem tisztázott. A mikroRNS-ek alakultak, mint fontos szabályozói metasztázis, mert képesek fellépni több jelátviteli utak. Tanulmányunkban azt találtuk, hogy a miR-144 jelentősen downregulált mindkét erősen szóródó GC sejtvonalak és a szöveteket. Eredmények mindkét gain-of-function és a veszteség-of-function kísérletek azt bizonyítják, hogy a fokozott miR-144 expressziója szignifikánsan csökkent GC sejtek migrációját, míg a csökkent miR-144 expresszió drámai módon megnöveli a GC sejtek migrációját. A találkozott protoonkogén (MET), amely gyakran felerősödik a humán rákok és funkciókat, mint egy fontos szabályozója a sejtnövekedés és a tumor invázió, azonosították közvetlen célpontjai miR-144. Sőt, elhallgattatása MET segítségével kis interferáló RNS (siRNS) összefoglalt anti-metasztatikus funkciója miR-144, míg helyreállítása MET kifejezés csökkentette a funkció a miR-144 GC sejtekben. Továbbá azt találtuk, hogy a miR-144, megcélozva MET, elnyomja Akt foszforiiáció. Végül megfigyeltük fordított korrelációt expressziójának miR-144 és a MET mRNS GC metasztatikus szövetekben. Összefoglalva, a miR-144 elnyomja GC progressziót közvetlenül mTOR gátlása miatt csökken MET kifejezés, amely később megakadályozza aktiválását a pro-onkogén Akt pálya. Újbóli miR-144 expresszió GC sejtek bemutatja vonzó terápiás megközelítés, hogy blokkolja a metasztázis gyomorrák. Katalógusa Kulcsszavak katalógusa mikroRNS miR-144 MET Gyomorrák áttétek Bevezetés katalógusa Globálisan gyomorrák (GC) egyike a legelterjedtebb típusú rosszindulatú betegség. 2008-ban mintegy 989.600 új esetet a GC diagnosztizáltak. Továbbá, a GC-ben játszik, mint egy oka a 738.000 haláleset, ami a GC a negyedik leggyakoribb rosszindulatú daganat és a vezető daganatos halálok világszerte [1]. Ahogy a daganat fejlődik, alakul a képesség, hogy megtámadják a környező szöveteket és áttétet. A hepatocita növekedési faktor receptor, Met, ismert, hogy elősegíti a motilitás és invazív képességét a tumorsejtek [2]. MET tagja a receptor tirozin-kináz család, és kimutatták, hogy fokozódik számos daganat [3-5]. Azt javasolják, hogy a MET expresszió szintje emelkedett mindkét gén amplifikáció vagy hypoxia keresztül HIF1a. Ebben a metasztatikus GC, MET erősítés és az erős fehérje expressziója nem ritka. Ezek az események úgy tűnik, hogy szignifikáns összefüggést a kedvezőtlen klinikai kimenetellel [6]. Mintegy 10% -a fehér betegek kikötő nyereséget öt vagy több példányban MET. Továbbá, ez a nyereség a MET kópiaszám szignifikánsan összefügg a kedvezőtlen prognózissal [7]. Továbbá a miR-34a /C mikroRNS kimutatták, hogy negatívan modulálják a MET-expresszió származó sejtvonalakban prosztatarák, hepatocelluláris karcinóma és GC [8-10].
MikroRNS (miRNS-ek) között nem kódoló RNS-molekulák, körülbelül 21-23 nukleotid hosszúságú, amelyek szabályozzák a génexpressziót a transzkripciós vagy poszt-transzkripciós szinten [11-13]. miRNS expressziós profil elemzések feltárták a globális alulszabályozása érett miRNS szintek humán tumorok viszonyítva a normál szövetekben [14]. Továbbá miRNS működhet akár egy tumorszuppresszor vagy onkogén szerepét, attól függően, a funkciója a cél. Például a miR-133B szignifikánsan down-szabályozott GC szövetek és kifejtett annak tumorszuppresszor szerepet GC sejtekben [15]. Expression miR-337-3p szignifikánsan csökkent expressziót nyirokcsomó áttétes szöveteiben GC betegek, és indukciós miR-337-3p kifejezés nem csökkenti a gyomorrák sejtek invázióját kapacitás [16]. miR-25 elősegíti GC progressziót közvetlenül mTOR gátlása miatt csökken TOB1 kifejezés; Ezért fokozott expressziója miR-25 bemutat egy potenciális noninvazív biomarker prognózisát GC betegeknél [17]. Továbbá, a miR-7 szignifikánsan downregulált mindkét erősen szóródó GC sejtvonalak és áttétes szövetekben. Túlexpressziója miR-7 jelentősen gátolja a GC metasztázis célzásával expresszióját az inzulin-szerű növekedési faktor-1 receptor (IGF1R) onkogén [18]. GC sejtvonalak, újbóli miR-144 expressziós eredményeket elnyomása ZFX, amely mérsékelten növeli a rákos sejtek érzékenysége 5-fluorouracil kemoterápiával. 93 esetben a primer GC, csökkent miR-144 expresszió rossz prognózissal társul [19]. Ezek a példák rávilágítottak kulcsszerepét miRNS GC malignance és daganatos progresszió.
Ebben a tanulmányban jellemeztük a célokat és meghatározta a hatásmechanizmusa a miR-144 GC. Indukálva ectopiás expresszióját miR-144, felfedeztük MET egy új cél a miR-144 szabályozás. Ezt a megállapítást megerősítette mind mRNS, mind fehérje szinten, és a riporter gén luciferáz assay igazolta közvetlen kötődését miR-144 a szabályozó kötőhely 3'UTR MET. Megállapítottuk továbbá, hogy a MET kifejezés fordítottan korrelál a miR-144 szintje egy kicsi, de jól dokumentált GC korosztály. Feltételezzük, hogy a miR-144 gátolja GC áttét, és hogy néhány ilyen gátlás által közvetített célba a MET kifejezést. Katalógusa Anyagok és módszerek
emberi szövetminták és sejtvonal katalógusa GC gyűjtöttünk átesett betegek műtét Fudan Egyetem Shanghai Rákkutató Központ között 2012-ben és 2013-protokollt jóváhagyta a Klinikai kutatási Etikai Bizottságának Fudan Egyetem, valamint a kutatást végeztek rendelkezései szerint a Helsinki nyilatkozat 1975. Minden mintát kaptunk a tájékozott beleegyezés a betegek. Az emberi GC sejtvonal AGS (ATCC® CRL-1739 ™), SNU-1 (ATCC® CRL-5971 ™), SNU-5 (ATCC® CRL-5973 ™), SNU-16 (ATCC® CRL 5974 ™) , NCI-N87 (ATCC® CRL-5822 ™), és KATO III (ATCC® HTB-103 ™) tartottunk fenn DMEM, amely 10% magzati borjúszérumot. Minden sejtvonalat tartalmazó táptalajban tartottuk fenn penicillinnel (100 NE /ml) és streptomicint (100 mg /ml) 37 ° C-on, 5% CO2-t. A miRNS utánozza és inhibitorokat vásárolt Ambion (Austin, TX, USA).
RNS extrakció és valós idejű PCR
Az összes RNS-t extraháltuk a sejtekből TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). A miRNS analízis, a poli (A) farok adtunk a teljes RNS alkalmazásával poli (A) polimeráz (Ambion, Carlsbad, CA), a reverz transzkripció előtt. A MiRcute miRNS qPCR Detection Kit (TIANGEN, Peking, Kína) alkalmaztunk kvantitatív expressziós szintjét miR-144 szerint, feltéve, protokoll. Az alábbi PCR-körülményeket alkalmaztuk: 95 ° C-on 30 s, majd 40 ciklus: 95 ° C 5 s és 60 ° C-on 31 s. Az összeg a cél (MET /miR-144), normalizált az endogén háztartási gén GAPDH /U6snRNA és relatív referencia minta, adja meg a következő egyenletet: mennyiségű target = 2- △△ CT. Katalógusa Microarray hibridizáció
Röviden, az RNS mintákat szintetizálására használt kettős szálú komplementer DNS (cDNS), és a kettős szálú cDNS-t jelzett és hibridizáltuk a Microarray (Arraystar, Rockville, MD). Hibridizáció és mosás, feldolgozott lemezeket szkennelt Axon GenePix 4000B microarray scanner (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). P-érték alkalmazásával számítottuk a párosított t-teszt. Meghatározott küszöböt felfelé és lefelé gének volt szeres változást > 2.0 és egy p-érték < 0.05. Hierarchikus klaszterezés alapján történt differenciáltan expresszálódó gének és miRNS segítségével Cluster Treeview szoftver a Stanford University (Palo Alto, CA). Katalógusa Mirna-gén hálózat katalógusa építettünk a hálózat szomszédsági két gén, i és j, definiált a hatalom a Pearson korreláció a megfelelő gén-expressziós profilok, xi és xj. A szomszédsági mátrix, M (i, j), tettük láthatóvá, mint egy grafikon, valamint a topológiai tulajdonságait grafikon vizsgáltuk. Ahhoz, hogy egy vizuális ábrázolás, csak a legerősebb korreláció (0,98) állították ezekben vakolatok. Ezen miRNS-gén hálózatok minden gén felel meg egy csomópontot. Két gén összekötve egy él, jelezve, egy erős korreláció. A hálózaton belül elemzés, diplomát a legegyszerűbb, legfontosabb intézkedés a központi gén hálózaton belüli és meghatározza a relatív fontosságát. Egy bizonyos fokú definiáljuk száma közvetlenül kapcsolódik a szomszédok. Katalógusa Jóslás miR-144 kötőhely katalógusa vélt miR-144 kötőhelyek MET mRNS 3 'le nem fordított terület jósoltak a Target Scan programot (http: //www.targetscan.org). Pozíció 1430-1436 MET 3 'UTR-egy konzervált kötőhelye miR-144 célzást.
Plazmid transzfekció
ORF-szekvenciákat, a MET amplifikáltunk genomi DNS-t izoláltuk a SNU-5 sejtvonalat és azután szubklónoztuk a plenti vektorba. A plazmidot transzfektáljuk SNU-5 sejteket Lipofectamine 2000 (Invitrogen). 24 óra elteltével a sejteket használják a mentési kísérletben.
Oligonukleotid transzfekció
miR-144-utánzatok, miR-144 gátló (anti-miR-144), és a MET-siRNS (siRNS-MET) szintetizáltuk Genepharma , Shanghai, Kína. Oligonukleotid transzfekciót végeztünk Lipofectamine 2000 reagensek (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). A végső koncentráció a miR-144 utánozza, anti-miR-144 vagy siRNS-MET a transzfekciós rendszer volt 100 nm. A transzfekció hatékonyságát az egységes és ko-transzfektált tanulmányok határoztuk meg fluoreszcens mikroszkóp.
Immunblotolást
Egyenértékű mennyiségű sejtlizátumokat megoldani 7% SDS /PAGE és vittük át polivinilidén fluorid membrán. A membránt inkubáltuk egy nyúl poliklonális anti-met antitest (1: 500, ABCAM, ab47431), egy kecske poliklonális anti-ADAM12 antitestet (0,3 ug /ml, ABCAM, ab28747) és egy nyúl poliklonális anti-verzikán antitestet (1 ug /ml, ABCAM, ab19345). IRdye-jelzett szekunder antitesteket használtunk mennyiségi az immunoblot jel, és a jeleket analizáltuk Odyssey szkenner (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA).
RNS-chip assay
RNS-fehérje kölcsönhatások fix formaldehiddel, és a kromatin nyírás párosul DNáz kezelés, így az RNS /fehérje komplexek, hogy lehet antitestekkel Met fehérjéket. Határon linkeket a későbbiekben megszűnik; RNS-t kinyerjük, és újra kezeljük DNáz, hogy biztosítsák a hiányát DNS-t. RNS-t kicsapjuk a immunkomplex ezután analizáltuk a valós idejű PCR-rel. Ebben az RNS-chip vizsgálattal, a következő képlet használható:% input (helyreállítás) = AE (Ct input-Ct minta) * Fd * 100%. Itt AE az erősítési hatásfok (10 (-1 /meredekség)) és FD hígítási faktora bemenő RNS egyensúlyt a különbség összegét RNS-chip mintát és bemenő RNS használt real-time PCR.
luciferáz assay
teljes MET-3'UTR-t PCR-rel sokszoroztuk SNU-5 cDNS mint templát és klónoztuk pGL3 kontroll vektorral. Mi használt Quick Change mutagenezis mutáció a miR-144 feltételezett kötőhely (Strata, Santa Clara, CA, USA). SNU-5 sejteket és AGS sejteket transzfektáltunk miR-144 utánozza /inhibitorok és pGL3 luciferáz riporter-konstrukciók megtelepedését a MET-3'UTR. 24 óra eltelte után, a tevékenységét a szentjánosbogár luciferáz és Renilla luciferáz a sejtlizátumokban mértük a Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, USA).
Migrációs assay
A transwell migrációs assay, 1 × 105 sejtet szélesztünk a felső kamrában, amely egy nem-bevont membrán. A sejteket szélesztjük, a szérummentes tápközegben, és közepes kiegészítve 10% (v /v) szérumot használtunk, mint egy kemoattraktáns az alsó kamrában. A sejteket 37 ° C hőmérsékleten egy szövettenyésztő inkubátorban, 5% (v /v) CO2. 16 óra elteltével a nem-migrált sejteket eltávolítottuk a felső oldalán a transwell membrán szűrő lapkák. A migrált sejteket az alsó oldalán a lapkák megfestettük Coomassie Brilliant kék, és a sejteket megszámláltuk.
Cell proliferációs vizsgálati katalógusa A transzfektált sejteket oltottunk 96 lyukú lapokra, a sejtsűrűség 1 × 104 sejt /jól. A sejtproliferáció vizsgálatot végeztünk a sejtszámlálás Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japán) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. Hozzáadása előtt CCK-8, a sejteket mossuk meleg táptalaj spinning a lemezt 500 rpm-en, 3 m, majd A felülúszót eldobjuk.
Alapozók
Az alábbi primereket használtuk valós idejű PCR: miR-144: 5-TACAG TATAG ATGAT GTACT-3; U6snRNA: 5-CGCAA GGAUG ACACG CAAAU UCGUG AAGCG UUCCA UAUUU UU-3; SKIL forward primer: 5-GTTAA GCGAA CCTGT ACTTC TGT-3, reverz primer: 5- GTAGG CGACA TGCTT TCTTG G-3; MET-forward primer: 5-GTCGG AGTAG AGCGT CGAGA-3, reverz primer: 5-CAGCG CGATC AGGTA GAGC-3; TOP2A forward primer: 5-ACCAT TGCAG CCTGT AAATG A-3, reverz primer: 5-GGGCG GAGCA AAATA TGTTC C-3; ADAM12 forward primer: 5-TCAAC CTGGA TACCC GATTC C-3, reverz primer: 5-GCTCT GTCTG CCGAT GGAG-3; VCAN forward primer: 5-GTAAC CCATG CGCTA Cataa AGT-3, reverz primer: 5-GGCAA AGTAG GCATC GTTGA AA-3. A következő primereket használtuk a teljes MET 3UTR alkalmazás: MET 3'UTR menetirányú primer: 5-TCACT GCCTG ACCTT TA-3, MET 3'UTR reverz primer: 5-ATCAC TTACT CCCAC AAT-3. Az siRNS nukleotid MET-ben a következőek: siRNS-MET előre: 5-GUGCC ACUAA Cuaca UUUAU U-3, siRNS-MET hátra: 5-UAAAU GUAGU UAGUG GCACU U-3. Katalógusa Statisztikai analízis katalógusa Az eredmények kerülnek bemutatásra átlag ± SEM, és az adatokat analizáltuk a Student-féle t-teszt. A p < 0,05 értéket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. Katalógusa Eredmények katalógusa mikroRNS expressziós profil gyomorrákban katalógusa összehasonlítása peritoneális áttétes szövetek párosított elsődleges gócok minták GC segítségével hierarchikus klaszterezést elemzés kimutatta, szisztematikus különbségek kifejezése miRNS és a gének (ábra Az 1A és B). Adataink arra utalnak, hogy egy sor miRNS-ek és gének gyakran abnormálisan expresszált a peritoneális metasztázisos szövet GC. Emellett azt is megállapították, hogy bizonyos, korábban jól bevált molekulák, mint például a miR-7 [18], a miR-25 [17], TOB1 és IGF1R, nem azonosítható a microarray. Azt gondoltuk, ezek különbsége által kiváltható sokfélesége klinikai minta származott különböző területeken. 1. ábra Core miRNS-gén hálózat, beleértve a 8-as gombot miRNS és a célokat. Hierarchikus klaszterezést elemzése 27 miRNS (A) és 32 gén (B), amelyek eltérően expresszált között metasztatikus szöveteket a peritoneális és párosított elsődleges minták GC (nagyobb, mint 2,0-szeres; p < 0,05). Expression értékek szerepelnek árnyalatú piros és zöld, jelezve kifejezés alatt és felett a medián kifejezés értéke az összes mintát. (C) A miRNS-gén hálózat mutatja a kapcsolatok között 8 kulcs miRNS és a tumor-asszociált gének azok megjósolt szabályozni. A színek jelzik a annotált expressziós szintjét a miRNS-ek és gének.
A miRNS-gén-hálózat összeszerelve a cél azonosítására kulcsfontosságú miRNS, amelyek szabályozzák a tumor-asszociált génexpressziós progressziója során tumor metasztázist. Mivel koexpressziójának modulok valószínűleg megfelelnek biológiai útvonalak összpontosítottunk koexpressziójának modulok, amelyek kapcsolatban vannak a nagy számú fehérje-kódoló géneket. Továbbá, NCBI RefSeq részletezi a funkciók számos gén, amely elősegítette a mi azonosítását GC-asszociált gének. Ezt a módszert használva, azt jellemezve szerepe a miR-144 a peritoneális metasztatikus gócok GC. A rákos koexpresszió hálózat, miR-144 van csatlakoztatva 6 fehérjét kódoló géneket, amelyek részt vesznek a tumor növekedését és a metasztázist (1C).
Szabályozó szerepét miR-144 a gyomorrák metasztázis
Annak vizsgálatára, miR 144 funkció, először vizsgálta a miR-144 szintje a panel 6 humán GC sejtvonalak. Amint azt a 2A ábra, mi kiválasztott AGS, jellemezhető serkentett miR-144, és SNU-5, azzal jellemezve, a downregulált miR-144, a további vizsgálat. A AGS sejtvonal származik gyomor tumor fragmentumok kimetszettük egy beteget, aki nem kapott előzetes terápia, míg SNU-5 származik ascites beteg rosszul differenciált karcinóma a gyomor. 2. ábra miR-144 gátolja a migrációt a GC-sejtek. (A) expressziós szintjét miR-144 ellenőrizték a panel 6 humán GC sejtvonalak felhasználásával real-time PCR módszerrel. (B) migrációja SNU-5 sejteket kezeltek miR-144 utánozza ellenőriztük a nem-matrigelen kezelt transzwell kamrában. (C) migrációja AGS kezelt sejtek miR-144 inhibitor ellenőrizhető nem-matrigelen kezelt transzwell kamrában. (*** P < 0,001).
Tanulmányunkban azt tapasztaltuk, szoros összefüggést a miR-144 veszteség és áttételek GC (1A és C). Ennek megfelelően, a korábbi vizsgálat dokumentálta miR-144-alapú gátlását a tumorsejtek migrációját és invázióját epithelialis pikkelysejtes karcinóma. Feltételeztük, hogy újbóli miR-144 expressziós elnyomja a rákos sejtek migrációját. Célszerűen bevezetése miR-144 expresszió gátolta sejt migráció SNU-5 (2B). Összehasonlítva a SNU-5, AGS sejtek viszonylag magasabb szintű endogén miR-144 expressziót. Nem meglepő, hogy gátolja a miR-144 fokozott AGS sejt migráció (2C ábra). Sőt, mi is végeztünk az inváziós vizsgálati eljárás végzett Matrigel-kezelt transwell, és nincs különbség az invazív képességét SNU-5 /AGS sejtek után kezeltük miR-144 /anti-miR-144 (az adatokat nem mutatjuk be). Ezek az eredmények azt szemléltetik, hogy a miR-144 fontos szerepet játszik a migrációs de nem invázió GC sejtek.
MiR-144 befolyásolja MET expressziós
keresztül ektopikus expresszióját miR-144 SNU-5 sejteket, meghatároztuk ADAM12 , VCAN és a PGS feltételezett miR-144 célokat. Amint az a 3a ábrát, miR-144 expressziós drámai hatással az mRNS-szintek ADAM12, VCAN és MET. ADAM12, VCAN és MET fehérje expressziós szinteket is felderítettek western blot rákos sejtek transzfektált miR-144 utánozza. Amint az a 3B ábra, csak találkozott protein szinteket downregulált által miR-144. Ez jelzi, hogy a miR-144 befolyásolja MET expresszióját transzkripciós szinten, esetleg hasítása vagy destabilizáció a mRNS szerkezetét. Ugyanakkor azt is megállapította, a ADAM12 és VCAN fehérje szint nem csökkent exogén bevezetése miR-144. Úgy gondoltuk, hogy mRNS és fehérje szinten nem lehet közvetlenül összefügg, mert a különböző felezési. Azt is gondoltam, hogy bemutatták, hogy lehet az oka, hogy a jelenléte a miR-144, amely folyamatosan elnyomja fordítást egy esetben, de nem a másik. A MET: miR-144 kölcsönhatás is bemutatták, az élő sejtekben RNS-CHIP vizsgálattal. Tény, hogy az endogén miR-144 találták kapcsolódó endogén MET anti-MET de nem anti-IgG immunoprecipitátumokban sejtjeiből (3C, ábra). 3. ábra A Met-ben szabályozta a miR-144. (A) mRNS-szinteket feltételezett miR-144 célokat vizsgáltuk valós idejű PCR SNU-5 transzfektált sejtek miR-144 utánozza, vagy miR-NC. (B) fehérje szinten feltételezett miR-144 célokat vizsgáltuk Western-blottal a SNU-5 transzfektált sejtek miR-144 utánozza, vagy miR-NC. (C) A% bemeneti behajtások az RNS-chip reakciók illusztrálja feldúsulása MET antitest. RNS-chip assay miR-144 végzett anti-MET antitest sejtek lizátumában. RNS-chip egy nem rokon IgG szolgáltak kontrollként. (D) A sematikus képe megjósolt miR-144 kötőhely 3'UTR MET. (E) SNU-5-sejteket tranziensen kotranszfektáltuk LUC-MET 3'UTR és miR-144 utánozzák. (F) AGS sejteket tranziensen kotranszfektáltuk LUC-MET 3'UTR és miR-144 inhibitor. (G) Mutating a miR-144 kötőhely MET 3'UTR megszüntette a miR-144-indukált luciferáz aktivitás elnyomása. A luciferáz-aktivitást mértünk 24 óra elteltével, és normalizáltuk a ko-transzfektált Renilla. (* P < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).
Használata bioinformatikai-alapú analízis, azonosítottunk egy miRNS kötőhelyet miR-144, a 3 'UTR MET mRNS (ábra 3D). Annak ellenőrzésére, hogy a miR-144 közvetlenül kötődik a 3'-UTR MET mRNS végeztünk luciferáz riporter vizsgálatokban SNU-5 sejteket. PCR-eredetű fragmentumokat MET 3'UTR illesztették a pGL3 kontroll vektor Xba1 helyén (LUC-MET 3'UTR). Együttes transzfekciójával LUC-MET 3'UTR és miR-144 utánozza a SNU-5 sejtek csökkenését eredményezte luciferáz jelet (szemben a miR-NC), amely megerősíti, hogy kötelező a miR-144 3'UTR MET van közvetlen gátló hatás (ábra 3E). A fordított kísérlet, befejezett blokkolásával endogén miR-144 termelő a miR-144 inhibitor AGS sejtek növekedését eredményezte luciferáz jelet (3F ábrán). Egy mutáns luciferáz riporter a miR-144 kötőhely is hoztuk létre (3D). Mutáció az miRNS kötőhely megszüntette a miR-144 által közvetített gátlását luciferáz aktivitását (ábra 3G). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a 1430-1436 helyzetben a MET 3'UTR kritikus miR-144-közvetítette gén szabályozása. Katalógusa MET közvetíti a miR-144-indukált rezisztenciát migráció katalógusa valós idejű PCR-MET expressziós szinteket meghatároztuk hat humán GC sejtvonalakon. Mint látható, sejtvonalak "downregulált" miR-144 szintje magasabb mennyiségű MET képest sejtvonalak "túlszabályozott" miR-144 szintje (4A). Használata nem paraméteres tesztekkel határoztuk szignifikáns fordított korreláció MET mRNS és miR-144 expresszió a GC áttétes minták (4B ábra). 4. ábra MET moduláció esetében a antimetasztatikus hatását a miR-144. (A) Western-blot mutatja a MET-expresszió egy sor humán GC sejtvonalak. (B) szignifikáns fordított korreláció figyelhető között a miR-144 és a MET expressziós szintek a GC szövetekben (n = 52). (C) A MET és foszforilált Akt gátolta az erőltetett expressziója miR-144 vagy siRNS-MET. (D, E) hatásai miR-144 vagy siRNS-MET a migráció és proliferáció kerültek meghatározásra SNU-5 sejteket. (F) A MET és foszforilált Akt állított helyre a túltermelése MET miR-144 utánozza kezelt SNU-5 sejteket. (G, H) hatásai miR-144 kombinált MET-ORF a migrációs és elterjedése SNU-5 sejteket. (I) A MET és foszforilált Akt került fel szabályozott blokkolásával a miR-144 AGS sejtekben. (J, K) az anti-miR-144 a migrációs és elterjedése AGS sejtek.
A MET fehérje funkcionál receptor tirozin-kináz és kulcsfontosságú szerepet játszik az előmozdítása a sejtnövekedést és a migráció által transzdukáló extracelluláris ingerek jelátviteli áramkörök. A kiemelkedő eleme a jelátviteli gép a PI3K (foszfatidil-3-kináz) útvonal [20,21]. Mivel a miR-144 gátolja a MET kifejezés, azt feltételeztük, hogy a miR-144 végeredményben csökkenteni Akt foszforiláció és az aktiválás révén csökkent a MET jelátviteli. Ennek megfelelően megvizsgáltuk Akt foszforiláció szintje után miR-144 túltermelése és szignifikáns csökkenés az Akt foszforiláció (4C). Katalógusa Úgy döntöttünk, hogy vizsgálja meg, hogy a miR-144-indukált MET alulszabályozottsághoz hatással volt a tumorsejtek migrációját és proliferációját. Mi transzfektált miR-144 és siRNS a MET (siRNS-MET) a SNU-5 sejteket. A sejtmigrációt értékeltük 16 órával a transzfekció után a Transwell assay, míg a sejtek proliferációját határoztuk keresztül CCK-8. Amint az ábrákon 4D és E, transzfekciót miR-144 gátolja a sejt migráció és proliferáció, mint kontroll. Hasonlóképpen, csökkenő MET-fehérje expressziójának siRNS is csökkent a tumorsejtek migrációját és proliferációját.
Annak megállapításához, hogy a MET a kritikus mediátor a miR-144 hatása a celluláris migrációja és proliferációja megkonstruáltuk két MET expressziós vektort. Az egyik, amely csak a nyitott leolvasási keret szekvenciáját a MET gén (MET-ORF), és egy másik vektor tartalmazza a teljes hosszúságú nukleotid-MET gén, beleértve a 3'UTR szekvencia (MET-teljes hosszú). Ezután végre western blot analízis 48 óra után transzfekciója MET-ORF /MET-tele nyúlóan miR-144 utánozza kezelt SNU-5 sejtek (4F). Összehasonlítva a negatív kontroll csoport (üres vektor), ectopiás expresszióját MET-ORF szignifikánsan növelte a teljes kifejeződését MET és foszforilált Akt. Továbbá kifejezése a MET-ORF támogatni migrációja és proliferációja GC sejtek (ábra 4G és H). Túlexpressziója MET megszüntette a miR-144-indukált gátlásának-migráció és szaporodását. Ezzel szemben a fehérje szintje MET és foszforilált AKT nőtt AGS kezelt sejtek anti-miR-144 (ábra 4I) és blokkolását miR-144 is elősegítette a migrációja és proliferációja AGS sejtek (ábra 4J és K). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a MET kritikus cél az anti-migráció hatása a miR-144 humán GC sejtekben. Katalógusa Megbeszélés katalógusa Ebben a tanulmányban már azonosított nem átfedő aláírásával kisszámú miRNS és a gének amelyek abnormálisan expresszált peritoneális metasztatikus szöveteiben GC, összehasonlítva párosított elsődleges szövetekben. Elemzés miRNS és génexpressziós profilokat a miRNS-gén-hálózat azonosított miR-144, mint a szabályozó nagy onkogén utak, mint a proliferáció és a migráció. GC betegek peritoneális áttétek alacsonyabb volt a miR-144 expressziós szintje, mint a betegek, áttét nélküli. Ez a megállapítás is érinti a miR-144, mint egy potenciális tumor szupresszor GC. Továbbá, a miR-144 van társítva a mechanizmusok metasztázist. Eredményeink megegyeznek a korábbi vizsgálatok eredményei azt a szerepét miR-144 rákos proliferáció, migráció, és invázió [22,23]. miR-144 gátolja a rákos sejtek metasztázis megcélozva A disintegrin és metalloproteináz (ADAM) fehérje családtag ADAMTS5. Mikro-RNS diszreguláció társul növelte a tumor invazív és metasztázis, valamint a csökkentett beteg prognózisa bizonyos epiteliális rákok [24]. Mi tovább vizsgálták a szerepe a miR-144 dereguláció GC. Hatását vizsgáltuk a miR-144 expresszió SNU-5 sejtvonalban, amint ez jellemzi alacsony kifejeződése miR-144. Méhen kívüli kifejezése miR-144 SNU-5 sejteket eredményez mélyreható fenotípusos változásokat, mint például csökkent a migráció. A fordított kísérlet, blokkoló miR-144 expresszió végeztek a AGS sejtvonal, amely viszonylag magas endogén szintje miR-144 expressziót. Gátlása miR-144 expresszió növekedését eredményezte AGS sejtek migrációját.
Vizsgálni mögötti mechanizmust miR-144-függő csökkent migrációja GC, azonosítottuk a feltételezett célokat miR-144 által jósolt miRNS-gén-hálózat. miR-144 túltermelése csökkentheti MET kifejezés mind mRNS, mind fehérje szinten, és ennek megfelelően luciferáz assay során kiderült, hogy a miR-144 közvetlenül befolyásolja a MET 3'UTR. Ezután értékeltük a MET expressziós szintek egy kohorsz 52 GC betegek és megállapította, hogy a miR-144-szint fordítottan arányos a MET kifejezést. Ebből az okból, azt feltételeztük, hogy a miR-144 gátolja GC tumorogenezisben megcélozva MET kifejezést. MET is le, mint egy miR-34a /C cél más celluláris modellek és ismert, hogy elősegíti motilitás és a invazív képességét tumorsejteket. Túlexpressziója MET szorosan összefügg a tumor invázió és a betegek prognózisa a GC [6]. GC, MET túltermelése független prognosztikai faktor és a potenciális gyógyszer cél. Továbbá MET túltermelése lehet megjósolni, hogy mely betegek számára előnyös lehet célzott terápia MET-inhibitorok [25]. Vizsgálatunkban MET expresszió szignifikáns összefüggést mutatott a GC differenciálódás, TNM és metasztázis [26]. Megállapítottuk, hogy változások a sejtek proliferációját és migrációját keresztül miR-144 hatni tudjanak szabályozásán keresztül MET kifejezés. miR-144 elnyomás vezet megnövekedett MET, ami magyarázhatja a metasztázis fenotípus a miR-144-hiányos sejtek. Érdekes módon, a miR-144 befolyásolja a hepatocita növekedési faktor (HGF) jelátvitelben. HGF, mint a ligand MET, indukálhat az aktiválás MET hámsejtek. Míg MET túltermelése nem tudta teljes mértékben helyreállítani GC daganatkelto adottságok, GC-migráció és proliferáció részben helyreállították MET túltermelése. Ezért miR-144 szabályozhatják más gének GC sejtekben. Korábbi tanulmányok azt mutatták, hogy a MET indukálhatja GC tumorigenezis aktiválásán keresztül a PI3K útvonal. Ebben a vizsgálatban azt találtuk, hogy a miR-144 szignifikánsan csökkentette az Akt foszforiláció és hogy az Akt foszforiláció teljesen felújított túltermelése MET. Eredményeink arra utalnak, hogy a miR-144 szabályozza Akt foszforiláció révén MET szabályozás GC.
Összefoglalva, a tanulmányban azonosított alapjául csökkent szintje a miR-144 látható GC áttétes szövetekben. miR-144 azonosították, mint egy potenciális tumor szuppresszor GC és kapcsolatba hozták a mechanizmusok GC metasztázist. Továbbá, a miR-144 gátolja GC tumorogenezisben megcélozva MET, később, a PI3K /Akt útvonal. Tudomásunk szerint ez az első alkalom, miR-144 Kimutatták, hogy a célba MET GC sejtekben. Ezért további tanulmányokat rákellenes szerepe miR-144 hozzájárulhat az új terápiás stratégiák GC. Katalógusa Notes
június Liu Hui Xue hozzájárult egyaránt ezt a munkát. Katalógusa nyilatkozatok katalógusa Köszönetnyilvánítás
Ez a tanulmány által támogatott Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (Grant No. 81201897). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat.
Érdekütközés katalógusa A szerzők kijelentik, hogy nem ellentétes érdekek. Katalógusa szerzôk hozzájárulása
JL végzett molekuláris biológiai vizsgálatok. HX készített kézirat. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a végleges kéziratot. Katalógusa