PLoS ONE: TWIST1 Promuove cancro gastrico proliferazione cellulare attraverso up-regolazione di FoxM1

Astratto

Twist-related protein 1 (TWIST1), noto anche come classe A base di proteine ​​elica-ansa-elica 38 (bHLHa38), è stato implicato nella determinazione del lineage cellulare e la differenziazione. Studi precedenti hanno dimostrato che l'espressione TWIST1 è up-regolato in cancro gastrico con risultati clinici povere. Inoltre, TWIST1 è suggerito di essere coinvolti nella progressione del cancro gastrico umano. Tuttavia, le sue funzioni biologiche rimangono in gran parte inesplorato. Nel presente studio, dimostriamo che Twist 1 sovraespressione porta ad un significativo up-regulation di FoxM1, che svolge un ruolo chiave nella progressione del ciclo cellulare nelle cellule di cancro gastrico. Al contrario, l'abbattimento di Twist 1 riduce l'espressione FoxM1, suggerendo che FoxM1 potrebbe essere un bersaglio trascrizionale diretta di Twist 1. A livello molecolare, ci rivelano, inoltre, che Twist 1 potrebbe legarsi alla regione del promotore di FoxM1, e, successivamente, reclutiamo p300 per indurre FoxM1 mRNA trascrizione. Pertanto, i nostri risultati scoprire un precedente Twist sconosciuta 1 /FoxM1 percorso normativo, che può aiutare a comprendere i meccanismi di proliferazione cancro gastrico

Visto:. Qian J, Luo Y, X Gu, Zhan W, Wang X ( 2013) TWIST1 Promuove cancro gastrico proliferazione cellulare attraverso up-regolazione di FoxM1. PLoS ONE 8 (10): e77625. doi: 10.1371 /journal.pone.0077625

Editor: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, Stati Uniti d'America

Ricevuto: 31 maggio 2013; Accettato: 3 settembre 2013; Pubblicato: 24 ottobre 2013

Copyright: © 2013 Qian et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Gli autori non hanno alcun sostegno o finanziamento di riferire

Conflitto di interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

epitelio-mesenchimale transizione (EMT) è un processo mediante il quale le cellule epiteliali perdono polarità e cellula-adesione cellulare, e sottoposti drammatica rimodellamento del citoscheletro [1,2]. In concomitanza con la perdita di componenti di adesione cellulare e del citoscheletro epiteliali, cellule in fase di EMT acquisire espressione di componenti mesenchimali e un fenotipo migratorio [2,3].

Diversi induttori chiave della EMT sono fattori di trascrizione tra cui Twist 1, Chiocciola, e Slug, che reprime l'espressione E-caderina [4,5]. TWIST1 appartiene al elica-ansa-elica fattore di trascrizione della famiglia [6]. Inizialmente, TWIST1 stato suggerito essenziale nello sviluppo dei tessuti derivanti dal mesoderma, tra muscolare e linee cellulari osteogeniche [7,8]. Studi successivi hanno dimostrato che Twist 1 promuove EMT e svolge un ruolo essenziale nella metastasi in diversi modelli tumorali [9,10]. Espressione di Twist 1 è stato anche coinvolto nella promozione di metastasi e sottotipi patologici invasive in diversi tipi di carcinoma [11]. Pertanto, Twist 1 è stato suggerito per avere proprietà oncogeniche. Ad esempio, la sovraespressione di Twist in rabdomiosarcoma inibisce l'apoptosi Myc indotta e interferisce con la soppressione del tumore p53 [12]. Up-regolazione di Twist è associata a trasformazione maligna nel linfoma a cellule T [13]. espressione forzata di Twist innesca la resistenza delle cellule tumorali umane ai farmaci che inibiscono la formazione dei microtubuli [14].

Tuttavia, l'effetto e il meccanismo di gene Twist sulla proliferazione del carcinoma gastrico rimangono enigmatico. Recenti studi hanno dimostrato che TWIST1 è up-regolato in gastrici fibroblasti cancro associato a esiti clinici poveri [15]. Inoltre, down-regolazione del Twist 1 gene soppresso la proliferazione delle cellule di cancro gastrico regolando negativamente l'attività di AP-1 con la conseguente espressione della ciclina D1 diminuendo [16]. Nel presente lavoro, due linee di cellule di cancro gastrico sono stati impiegati per studiare l'effetto e il meccanismo di Twist 1 gene sul proliferazione cellulare.

Materiali e Metodi

Cell Culture

Quattro linee di cellule epiteliali (NCI-N87, AGS, HGC-27 e MGC80-3) derivate da carcinoma gastrico sono stati ottenuti da American Type Culture Collection (USA). Le cellule sono state coltivate in DMEM /F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) supplementato con 10% di siero fetale bovino (Gibco, Pechino). Le colture sono state mantenute a 37 ° C in atmosfera umidificata con 5% di CO _2.

small interfering RNA, estrazione di RNA e analisi in tempo reale

Le cellule sono state seminate a 6- pozzetti poi trasfettate con oligonucleotidi 50nm siRNA mirati Twist umana 1 (Dharmacon, Stati Uniti d'America). La molecola specifica siRNA per la proteina fluorescente verde (GFP) è stato utilizzato come controllo negativo. Totale RNA sono stati estratti dalle cellule da TRIzol reagente, e trascrizioni inversa sono stati eseguiti da kit Takara RNA PCR (Takara, Cina) seguendo il protocollo del produttore. Al fine di quantificare le trascrizioni dei geni di interesse, real-time PCR è stata effettuata utilizzando un SYBR Green Premix Ex Taq (Takara, Giappone) sulla Cycler luce 480 (Roche, Svizzera).

transitori trasfezioni e saggi luciferasi

promotore FoxM1 umana è stato amplificato dal modello di DNA genomico umano e inserito nel pGL4.15 vettore di base (Promega). motivo di legame mutante TWIST1 è stata generata utilizzando un kit di mutagenesi PCR (Toyobo) con un primer (siti di mutazione sottolineati): 5'-CGCATTACGAATCAGGTTAAGCCAGTT-3 'e un primer complemento inverso. Tutte le trasfezioni transitorie sono state effettuate da Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Shanghai), secondo le istruzioni del produttore. Per i saggi di luciferasi, le cellule sono state seminate in piastre da 24 pozzetti e trasfettate con i plasmidi indicati. 48 ore dopo la trasfezione, le attività luciferasi sono stati misurati utilizzando il reporter luciferasi sistema di analisi Dual (Promega, USA).

co-immunoprecipitazione

Le cellule sono state raccolte, risospese in tampone di lisi contenente 50 mM Tris- HCl (pH 7,3-7,5), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% inibitori TRITON X-100) e proteasi. Lisati state incubate con 2,5 mg di p300 o IgG notte a 4 ° C. Proteina A perline sono stati aggiunti per ulteriori 4 ore. Perline contenenti immunocomplessi sono stati lavati con 1 ml di tampone di lisi ghiaccio freddo per quattro volte. Precipitati sono stati denaturati a Laemmli (gel di carico) tampone a 95 ° C per 10 minuti.

Western Blot

Le cellule sono state raccolte da tripsinizzazione, lisate in un tampone Laemmli, denaturato per 10 minuti a 80 ° C, e risolti su gel SDS /PAGE. Dopo immunoblotting, le membrane sono state bloccate in PBS /0.1% Tween-20 con 7,5% latte in polvere senza grassi, e anticorpi primari sono stati incubati in PBS /0.1% Tween-20 0,1% -5% senza grassi del latte secco. Gli anticorpi diretti contro Twist 1, FoxM1 sono stati acquistati da Santa Cruz Biotechnology (USA). Anti-p300 e anticorpi GAPDH sono stati ottenuti da Abcam Company (USA). Anti-p21, p27, ciclina B1, ciclina D1, ciclina D2, ciclina E e E-caderina anticorpi erano da Cellsignaling (USA):

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) test

immunoprecipitazione della cromatina (. Chip) kit di analisi sono stati utilizzati (Upstate, stati Uniti d'America). Brevemente, le cellule sono state fissate con 1% di formaldeide e ulteriormente elaborati usando il circuito integrato kit di analisi di Upstate. cromatina Solubile stato immunoprecipitato con l'anti-torsione 1 e anticorpi IgG. Dopo la purificazione, campioni di DNA sono stati quantificati dalla quantitativa real-time PCR utilizzando primer che comprende regione prossimale del promotore FoxM1 umana.

Analisi statistica

Tutti i dati sono presentati come media ± SEM. Le differenze statistiche sono state determinate da un test t a due code. La significatività statistica è mostrato come * (P < 0,05), ** (P < 0,01) o *** (P < 0,001).

Risultati

Effetto della TWIST1 sulla proliferazione delle cellule di cancro gastrico

Al primo, per esplorare il ruolo funzionale di Twist 1 nella proliferazione cellulare, abbiamo trasdotte NCI-N87 o AGS cellule con adenovirus contenenti Twist 1 o vettore vuoto (Figura 1A e 1B). In linea con gli studi precedenti, l'espressione di E-caderina, un biomarker di processo EMT [4,5], è stato down-regolato da Twist 1 sovraespressione (Figura S1A-1B). Inoltre, Twist 1 sovraespressione determinato un significativo aumento del numero di cellule di tutte le cellule testati (Figura 1C e 1D). Coerentemente, bromodeossiuridina (BrdU) L'analisi ha inoltre confermato che Twist 1 sovraespressione promosso la proliferazione delle cellule (Figura 1E e 1F). Inoltre, Twist 1 cellule che sovraesprimono avevano una percentuale significativamente inferiore di cellule nella fase G1 /G0 e aumento della percentuale di cellule nella fase S, rispetto alle cellule trasfettate vettore vuoto (Figura 1G-1H).

Avanti , NCI-N87 o cellule AGS sono state trasfettate con piccoli RNA interferenti (siRNA) mira Twist 1. Il oligo siRNA mostrato efficiente Twist 1 atterramento in queste due cellule, rispetto alle cellule GFP siRNA-trasdotte (Figura 2A-2D). Come risultato, down-regolazione di Twist 1 ha portato ad una notevole diminuzione del numero di cellule e la proliferazione in queste cellule (Figura 2E-2H). Inoltre, il silenziamento di Twist 1 aumentato significativamente la percentuale di cellule in fase G0 /G1 e diminuita la percentuale di cellule nella fase S (Figura 2I-2J). In particolare, abbiamo confrontato l'attività proliferazione delle cellule AGS NCI-N87 e con o senza transfezione di vettore vuoto o GFP siRNA. I nostri risultati suggeriscono che né vettore vuoto o GFP siRNA influenzano l'attività proliferazione cellulare (Figura S2A). Inoltre, la capacità di crescita di cellule che esprimono maggiore Twist 1 livelli (cellule NCI-N87 e AGS) è relativamente più elevata rispetto ad altri (HGC-27 e MGC80-3 celle) (Figura S2C). Nel loro insieme, i nostri risultati suggeriscono che Twist 1 potrebbe essere un importante regolazione positiva della proliferazione delle cellule del cancro gastrico.

TWIST1 influenza l'espressione di regolatori del ciclo cellulare

Come Twist 1 ha promosso la proliferazione cellulare, abbiamo esaminato le sue funzioni sulla espressione dei geni che regolano l'/S di transizione G1, tra cui il CDK inibitori p21 ^{Cip1, p27 Kip1, il regolatore di CDK ciclina B1, ciclina D1, D2 e ​​Cyclin ciclina E. i risultati di reale time PCR e analisi western blotting nelle cellule NCI-N87 hanno suggerito che l'espressione di p21 Cip1, p27 Kip1 stati downregulated mentre la ciclina B1, ciclina D1, ciclina D2 e ​​ciclina e i livelli sono stati upregulated in cellule Twist 1-trasfettate, rispetto alle cellule trasfettate vettore vuoto (Figura 3A-3B). Risultati simili sono stati osservati anche in cellule AGS (Figura 3C-3D), confermando inoltre che Twist 1 può influenzare la proliferazione delle cellule di cancro gastrico. Coerentemente, l'abbattimento di Twist 1 aumentato p21 Cip1 e p27 espressione Kip1 mentre ridotto ciclina B1, ciclina D1, D2 e ​​Cyclin ciclina E espressione in cellule NCI-N87 e AGS (Figura 4A-4D).}

Twist 1 obiettivi direttamente il fattore di trascrizione FoxM1 in cellule di cancro gastrico

studi precedenti hanno rivelato che diversi fattori trascrizionali possono regolare una serie di geni rilevanti per il ciclo cellulare, tra cui p21 ^{Cip1, p27 Kip1 e ciclina B1. Così, abbiamo analizzato i potenziali fattori di trascrizione che partecipano alla regolazione della proliferazione cellulare. Su cinque fattori trascrizionali testati, solo FoxM1 sono stati trovati ad essere significativamente aumentata nelle cellule NCI-N87 sovraesprimono Twist 1 (Figura 5A-5B). L'induzione di FoxM1 è stata osservata anche in cellule AGS (Figura 5C-5D). Inoltre, l'espressione FoxM1 è stata ridotta in queste cellule impoverito di Twist 1 (Figura 6A-6D), suggerendo che FoxM1 potrebbe essere un bersaglio di Twist 1.}

Twist 1 upregulates espressione FoxM1 attraverso il reclutamento di p300

in seguito, ci siamo concentrati sul meccanismo molecolare di Twist 1 regolazione della trascrizione FoxM1. Le analisi della sequenza ha mostrato che la regione del promotore del gene umano FoxM1 conteneva un potenziale Twist 1 sito di legame (tra -357 e -352 bp) (Figura 7A). saggio rapporto luciferasi ha mostrato che l'attività trascrizionale di wild-type FoxM1 promotore è stato drammaticamente upregulated dal Twist 1, mentre l'attività trascrizionale è stata abolita nel promotore che porta una mutazione a Twist siti di 1-di legame (Figura 7B). Inoltre, saggi di ChIP hanno dimostrato che Twist 1 potrebbe legarsi unicamente per FoxM1 promotore (Figura 7C). Per determinare se è necessario induzione di FoxM1 da Twist 1 per il suo effetto proliferativo, abbiamo condotto esperimenti con FoxM1 atterramento utilizzando oligonucleotidi siRNA in cellule NCI-N87 (Figura S3A-S3B). Come risultato, il siRNA salvato cellule dall'effetto proliferativo Twist 1 sovraespressione (Figura S3C). Coerentemente, le funzioni di Twist 1 sui livelli di espressione di regolatori del ciclo cellulare sono stati invertiti anche da oligonucleotidi FoxM1 siRNA (Figura S3D), suggerendo che FoxM1 è necessario per i ruoli di Twist 1 in cellule di cancro gastrico.

Come un fattore trascrizionale, Twist 1 può reclutare coattivatori nella regolazione dell'espressione genica bersaglio. Studi precedenti hanno dimostrato che p300 potrebbe agire come un co-attivatore per molti fattori di trascrizione. Abbiamo quindi esaminato se p300 potrebbe essere un co-attivatore per Twist 1 regolazione dell'espressione FoxM1. Come mostrato nella Figura 7D, Twist 1 potrebbe interagire con p300 di coimmunoprecipitation. L'attività trascrizionale di FoxM1 promotore è stato ulteriormente upregulated dal co-trasfezione di p300 e Twist 1 (Figura 7E). Inoltre, abbiamo abolito ulteriore espressione p300 utilizzando oligonucleotidi siRNA in cellule NCI-N87 (figura 7F). Come previsto, Twist 1-indotta espressione FoxM1 era significativamente attenuato dal silenzio di p300 (Figura 7G-7H). I dati di cui sopra hanno dimostrato che Twist 1 upregulated espressione FoxM1 attraverso un reclutamento di complessi trascrizionali coactivator, tra cui p300.

Discussione

Nel corso di studio, i nostri risultati implicano Twist 1 come un regolatore critico della gastrico la progressione del cancro. Ciò è suggerito da diverse linee di prove. Innanzitutto, Twist 1 sovraespressione promuove mentre la sua carenza inibisce la proliferazione cellulare, come dimostrato da BrdU e l'analisi del ciclo cellulare. In secondo luogo, Twist 1 colpisce geni espressione di modulatori del ciclo cellulare, inclusi gli inibitori CDK p21Cip1, p27Kip1, il regolatore di CDK ciclina B1, ciclina D1, D2 e ​​Cyclin ciclina E. In terzo luogo, Twist 1 upregulates direttamente espressione FoxM1 a livello trascrizionale, attraverso reclutamento di P300. Inoltre, l'abbattimento di espressione FoxM1 endogena attenua l'effetto proliferativo di Twist 1, suggerendo che FoxM1 è essenziale per i ruoli di Twist 1 in cellule di cancro gastrico.

Negli adulti, Twist 1 è espressa prevalentemente in cellule precursori compresi i osteoblastiche, miogenico, lignaggi odontoblastic e mielomonocitica, mantenendo il loro stato indifferenziato [17]. Inoltre, TWIST1 è anche un importante regolatore di molti altri processi biologici, tra cui lo sviluppo mesenchimali e il metabolismo dei grassi marrone. Per esempio, TWIST1 è creduto di inibire la differenziazione degli osteoblasti regolando negativamente Runx2 [17]. Inoltre, Twist-1 è selettivamente espresso nel tessuto adiposo, interagisce con PGC-1α, per sopprimere il metabolismo mitocondriale e lo sgancio. Come risultato, i topi transgenici che sovraesprimono Twist-1 nel tessuto adiposo sono inclini a alto contenuto di grassi-obesità indotta dalla dieta, mentre i suoi topi knockout eterozigoti sono resistenti all'obesità [18]. Inoltre, Twist 1 espressione nucleare è stata osservata anche in epitelio non noncancerous, suggerendo che Twist 1 può avere un ruolo fisiologico nelle cellule normali [19]. Studi successivi hanno dimostrato che l'espressione Twist 1 è correlato con l'invasività potente e cattiva prognosi nel cancro epiteliale. Nel cancro gastrico, un recente rapporto ha mostrato la sovraespressione del gene Twist 1 è più frequente in diffuso tipo i tessuti di carcinoma con l'espressione del gene alta N-caderina [20]. Twist Tuttavia, non ha prodotto risultati definitivi hanno indicato favorisce la proliferazione del cancro gastrico. I nostri risultati Twist suggerite probabilmente promossi gastrica proliferazione delle cellule tumorali, utilizzando i saggi di incorporazione BrdU. Inoltre, FoxM1 primo luogo è stato identificato come un bersaglio trascrizionale romanzo di Twist 1.

FoxM1 lega regioni promotrici, con una preferenza per un consenso [TAAACA] sequenza di riconoscimento, anche se con minore affinità rispetto ad altre proteine ​​forkhead [21]. La sua espressione è limitata a cellule proliferanti, ed escluso dalle cellule quiescenti e terminalmente differenziate. Si controlla l'espressione di geni necessari sia per G1 /S e G2 transizione /M ed è essenziale per l'ingresso e la progressione mitotica, garantendo il mantenimento della stabilità dei cromosomi [22,23]. Amplificazioni di FoxM1 gene è stato riportato in numerosi tumori come carcinomi del pancreas, cancro al seno e il carcinoma epatocellulare [24-27]. Nel cancro gastrico, espressione FoxM1 è up-regolata e la sua inibizione porta alla senescenza cellulare, che è almeno in parte, dipendente da p27 kip1 [28,29]. Oltre al suo ruolo positivo sulla proliferazione cellulare, FoxM1 ha dimostrato di giocare ruoli in altri processi correlati al cancro, come invasione e metastasi [30]. I suoi livelli di espressione correlano con prognosi infausta e metastasi in diversi tumori compresi carcinoma gastrico [31], suggerendo la possibilità di utilizzare FoxM1 come prognosi e /o marcatore diagnosi. Nel loro insieme, FoxM1 è un bersaglio promettente e attraente per la terapia del cancro. Pertanto, è fondamentale per capire come FoxM1 è regolata in modo da progettare migliori approcci terapeutici.

espressione FoxM1 è strettamente regolata sia a livello di mRNA e di proteine. Aumenta la sua abbondanza all'entrata della fase S, picchi durante G2 ed M, e viene degradato durante l'uscita mitosi. Allo stesso modo, la sua attività trascrizionale è regolata saldamente durante il ciclo cellulare mediante fosforilazione multisite da diverse chinasi e fosfatasi sue di contrasto, raggiungendo la sua attività massima nella fase G2 del ciclo cellulare [32]. Recentemente, è stato riportato che l'espressione FoxM1 può essere modulata da microRNAs. FoxM1 è stata identificata come un bersaglio diretto di miR-134, i cui livelli sono inversamente correlato con il potenziale invasivo di alcune cellule NSCLC [33]. Inoltre, FoxM1 è anche repressa da miR-370 in cellule di cancro gastrico [29], il che suggerisce che ulteriori studi sono necessari per verificare se Twist 1 potrebbe cooperare questi percorsi normativi.

In conclusione, noi qui mostrano che Twist 1 sovraespressione porta ad un significativo up-regulation di FoxM1, che svolge un ruolo chiave nella progressione del ciclo cellulare in cellule di cancro gastrico. Al contrario, l'abbattimento di Twist 1 riduce l'espressione FoxM1, suggerendo che FoxM1 potrebbe essere un bersaglio trascrizionale diretta di Twist 1. riveliamo inoltre che Twist 1 potrebbe legarsi alla regione del promotore di FoxM1, e, successivamente, reclutiamo p300 per indurre FoxM1 mRNA trascrizione. Pertanto, i nostri risultati scoprire un precedente Twist sconosciuta 1 /FoxM1 percorso normativo, che può aiutare a comprendere i meccanismi di proliferazione cancro gastrico.

Informazioni di supporto
Figura S1.
(AB) mRNA e livelli di proteina di E-caderina in NCI-N87 (A) e AGS (B), le cellule trasfettate con adenovirus che esprimono vettore vuoto (EV) o Twist 1.
doi: 10.1371 /journal.pone .0077625.s001
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Figura S2.
(A-B) La cella potenziale proliferativo (BrdU) è stata determinata in NCI-N87 (A) o AGS (B), le cellule senza o con trasfezione di vettore vuoto (EV) o GFP siRNA. (C) endogeno Twist 1 espressione è stata determinata da Western Blot in quattro cellule di cancro gastrico (NCI-N87, AGS, HGC-27 e MGC80-3). La curva di crescita di quattro linee di cellule è stata misurata
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Figura S3.

(A-B) mRNA (A) e di proteine ​​(B) i livelli di FoxM1 nelle cellule NCI-N87 trasfettate con oligonucleotidi siRNA contro NCI-N87 o il controllo negativo (Ctrl). (C) l'attività delle cellule di proliferazione è stata misurata mediante saggi BrdU nelle cellule NCI-N87. Le cellule sono state pre-trasfettate con oligonucleotidi siRNA per 24 ore e poi trasfettate con vettore vuoto (EV) o Twist 1 per altre 24 ore. Livelli
(D) mRNA di p21, p27, ciclina B1, ciclina D1, D2 e ​​Cyclin ciclina E sono stati determinati mediante real-time PCR nelle cellule NCI-N87. Le cellule sono state pre-trasfettate con oligonucleotidi siRNA per 24 ore, e poi trasfettate con vettore vuoto (EV) o Twist 1 per altre 24 ore
doi:. 10.1371 /journal.pone.0077625.s003
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