PLoS ONE: Paclitaxel Superior antitumorale Attività di nanoparticelle legate da albumina in Sperimentale gastrico Cancer

Estratto

cancro gastrico è la seconda causa più comune di morte per cancro in tutto il mondo legati e manca di un trattamento altamente efficace per la malattia avanzata. Nab-paclitaxel è un nuovo agente citotossico microtubuli inibitorio che non è stato testato in cancro gastrico a partire da ancora. In questo studio, gastrici linee cellulari tumorali umane AGS, NCI-N87 e SNU16 sono stati studiati. Nab-paclitaxel ha inibito la proliferazione delle cellule con un IC50 di 5 Nm in SNU16, 23 Nm in AGS e 49 nM nelle cellule NCI-N87 dopo il trattamento di 72 ore, che era inferiore a quella di oxaliplatino (1,05 micron a 1,51 micron) e epirubicina ( 0,12 micron a 0,25 micron). trattamento nab-paclitaxel aumentata espressione del mitotico mandrino associata fosfo-stathmin a prescindere del totale della linea di base o livello stathmin fosforilata, e induceva morte cellulare mitotico come confermato attraverso una maggiore espressione di spaccati-PARP e caspasi-3. Dopo due settimane di nab-paclitaxel, oxaliplatino o epirubicina trattamento, la media in vivo tasso di inibizione della crescita tumorale locale era 77, 17,2 e 21,4 per cento, rispettivamente (p = 0,002). Effetti della terapia su indici proliferativi e apoptotici tumorali corrispondevano con i dati di inibizione della crescita tumorale, mentre l'espressione di fosfo-stathmin è aumentata anche nei tessuti. C'è stato un aumento della sopravvivenza degli animali mediana dopo il trattamento nab-paclitaxel (93 giorni) rispetto ai controlli (31 giorni, p = 0,0007), oxaliplatino (40 giorni, p = 0,0007) o alla terapia con docetaxel (81 giorni, p = 0,0416) . La forte attività antitumorale di nab-paclitaxel nel carcinoma gastrico sperimentale supporta tale strategia microtubuli inibitorio per l'applicazione clinica. Nab-paclitaxel benefici sono stati osservati indipendente dalla espressione stathmin fosforilata al basale, mettendo in discussione la considerazione di utilizzo nab-paclitaxel nel carcinoma gastrico sulla base di questo biomarcatore putativo

Visto:. Zhang C, Awasthi N, Schwarz MA, Hinz S, Schwarz RE (2013) Superior antitumorale Attività di nanoparticelle di Paclitaxel legato all'albumina in Sperimentale cancro gastrico. PLoS ONE 8 (2): e58037. doi: 10.1371 /journal.pone.0058037

Editor: Lu-Gang Yu, Università di Liverpool, Regno Unito

Ricevuto: 20 novembre 2012; Accettato: 29 Gennaio 2013; Pubblicato: 27 feb 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Gli autori non hanno alcun sostegno o finanziamento di riferire

Conflitto di interessi:. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

cancro gastrico (GC) è la quarta più diffusa. il cancro e la seconda causa più comune di morte per cancro in tutto il mondo [1] - [3]. Molti pazienti hanno avanzato o metastasi al momento della diagnosi [4], [5]. La combinazione di oxaliplatino e 5-fluorouracile, con e senza epirubicina, è diventato il regime più usato nella chemioterapia di prima linea per il cancro gastrico avanzato [6], [7]. Tuttavia, questo trattamento di combinazione ha il potenziale per notevoli effetti collaterali e porta ancora limitata efficacia, mentre la prognosi dei pazienti rimane triste con una sopravvivenza mediana di circa 10 mesi [8] - [11]. Nel tentativo di migliorare la sopravvivenza e diminuire la tossicità, la terapia molecolarmente mirata viene attivamente studiata per il trattamento del cancro gastrico [12].

I microtubuli sono da tempo considerati un bersaglio di interesse per alcuni farmaci antitumorali causa di loro ruolo universale in cellule proliferanti e il loro ruolo essenziale nella mitosi [13] - [15]. Paclitaxel e docetaxel sono inibitori microtubuli classici che esercitano la loro attività attraverso la promozione di tubulina polimerizzazione e la stabilizzazione dei microtubuli con conseguente arresto di fase G2-M e la morte cellulare mitotico [15]. morte cellulare mitotico è una modalità di morte cellulare che si verifica in particolare durante le fasi di mitosi indotta da DNA dannoso agenti e veleni del fuso mitotico /inibitori [16], [17]; è soprattutto caspasi dipendente, ma in rare circostanze può anche essere caspasi indipendente [18]. Paclitaxel è stato testato per i tumori gastrici avanzati e ricorrenti con un tasso di risposta del 43% in combinazione con 5-fluorouracile e acido folinico [9], [19]. Rispetto al tasso di risposta del 38~45% dato da una combinazione di oxaliplatino con 5-fluorouracile e acido folinico, paclitaxel non ha comportato la sopravvivenza superiore, ma ha causato più effetti collaterali, in particolare nei pazienti anziani [9], [20] - [ ,,,0],22]. Paclitaxel richiesto emulsionamento con solventi per permettere la somministrazione per via endovenosa, che ha provocato reazioni di ipersensibilità e gli effetti collaterali potenzialmente drammatici nei pazienti [23], [24]. Nanoparticelle legate da albumina (nab) paclitaxel albumina è un stabilizzato, la formulazione di nanoparticelle e solubile in acqua priva di Cremophor romanzo di paclitaxel. E 'ben tollerato, senza reazioni di ipersensibilità dopo l'infusione endovenosa [25]. Studi clinici e sperimentali hanno dimostrato che, rispetto a paclitaxel a base solvente, nab-paclitaxel ha avuto ritegno superiore del tumore, minore tossicità [23], [26] e gli effetti antitumorali più potenti sul cancro al seno, non carcinoma polmonare a piccole cellule (NSCLC), del pancreas il cancro, il melanoma, e testa e del collo cancro [27] - [31]. Tuttavia, il ruolo potenziale di nab-paclitaxel in cellule di cancro gastrico non è testato come ancora

Stathmin, una fosfoproteina microtubuli destabilizzante, è un importante regolatore di microtubuli polimerizzazione e dinamiche [32] - [34]. , ed è stato trovato essere correlato alla resistenza taxano, in alcuni tipi di tumore attraverso alterando droga vincolante e ritardando G2-M fase di transizione [33], [35]. inibizione Stathmin aveva una sinergica attività antiangiogenica e antitumorale con taxolo [36]. espressione Stathmin è stato trovato per essere presenti in un'ampia varietà di tumori umani tra cui il cancro gastrico, e quindi possono rappresentare un bersaglio attraente per la terapia del cancro [34], [37], [38]. Jeon et al. ha scoperto che stathmin potrebbe servire come marcatore prognostico e un potenziale bersaglio terapeutico per il cancro gastrico [37]. La fosforilazione di stathmin riduce i suoi effetti destabilizzanti microtubuli, un fenomeno che è stato anche attribuito a un'attività taxano [34].

Questo studio ha valutato l'attività antitumorale di nab-paclitaxel in cellule di cancro gastrico umano in vitro e in vivo. Abbiamo confrontato l'efficacia antitumorale di nab-paclitaxel ad altri agenti citotossici sulla crescita locale del tumore e la sopravvivenza degli animali. Abbiamo anche misurato l'espressione di totale stathmin e fosfo-stathmin in vitro e in vivo per valutare il loro ruolo come marcatori predittivi della risposta antitumorale nab-paclitaxel.

Materiali e Metodi

coltura cellulare e reagenti

Gli umani di cellule di cancro gastrico linee AGS, NCI-N87 e SNU16 sono stati ottenuti dalla American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) e coltivate in RPMI 1640 medium (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO ) supplementato con siero fetale bovino 10% (FBS) a 37 ° C in un umidificata al 5% CO _{2 atmosfere. Nab-paclitaxel è stato acquistato da Abraxis BioScience (Los Angeles, CA). Oxaliplatino è stato acquistato da Sanofi Aventis (Bridgewater, NJ). Docetaxel, epirubicina e 5-fluorouracile sono stati ottenuti da una farmacia locale. La cella proliferazione reagente WST-1 è stato acquistato da Roche Diagnostic Corporation (Indianapolis, IN).}

La vitalità cellulare saggio

La vitalità cellulare è stata valutata dal WST-1 saggio colorimetrico. La misura si basa sulla capacità delle cellule vitali per fendere il sale di tetrazolio solfonato WST-1 (4- [3- (4-iodofenil) -2- (4-nitrofenil) -2H-5-tetrazolio] -1, 3- benzene disolfonato) da deidrogenasi mitocondriali [39]. cellule di cancro gastrico (5.000 cellule per pozzetto) sono state seminate in una piastra da 96 pozzetti in terreno di crescita regolare e sono stati trattati con nab-paclitaxel, 5-fluorouracile, epirubicina e oxaliplatino dopo 16 ore di incubazione. La gamma di concentrazioni utilizzate (1 nM a 10 micron) era paragonabile alle loro concentrazioni clinicamente ottenibili. Dopo ulteriore incubazione di 72 ore, 10 microlitri WST-1 reagenti è stato aggiunto in ciascun pozzetto seguita da incubazione per 2 ore. L'assorbanza a 450 nm è stata misurata utilizzando un lettore di micropiastre.

ciclo cellulare analisi

L'analisi del ciclo cellulare è stata effettuata mediante citometria di flusso con fluorescente ioduro di propidio (PI) colorazione. Le cellule sono state coltivate e trattati con nab-paclitaxel, oxaliplatino, epirubicina e docetaxel per 8 a 24 ore. Le cellule sono state quindi raccolte e fissate in 75% di etanolo-PBS notte a -20 ° C. Le cellule sono state centrifugate per 5 minuti a 2000 xg. Il pellet cellulare è stato risospeso e incubato a 0,05 mg /ml PI, 0,1% Triton X-100, e 1 mg /ml RNasi A in PBS per 45 minuti a temperatura ambiente. La sospensione è stata quindi analizzata su un Becton Dickinson FACScan. Il rapporto tra cellule nel sub-G1, G1, S e G2-M fasi del ciclo cellulare è stata determinata dal loro contenuto di DNA.

Immunocytochemical analisi

cellule di cancro gastrico (1 × 10 ^{5 cellule per camera) sono stati placcati in una diapositiva a 4 camere nel mezzo di crescita regolare. Dopo 24 ore le cellule sono state trattate con nab-paclitaxel per 16 ore e poi fissati in paraformaldeide al 4%. Le cellule sono state incubate con CAS tampone bloccante seguita da incubazione di 1 ora con anticorpi fosfo-stathmin (1:100) e 40 minuti di incubazione con Cy3 (1:200 diluizione) anticorpo secondario. I vetrini sono stati montati utilizzando la soluzione di montaggio contenente 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Microscopia a fluorescenza è stata utilizzata per rilevare i segnali fluorescenti utilizzando il microscopio IX81 Olympus dotato di una fotocamera digitale Hamamatsu Orca (Hamamatsu Corporation, Bridgewater, NJ).}

analisi Western Blot

monostrati sub-confluenti di cellule sono stati trattati con nab-paclitaxel, oxaliplatino e epirubicina. I lisati cellulari e lisati tumorali sono stati ottenuti come descritto in precedenza [40]. I surnatanti sono stati recuperati mediante centrifugazione a 13000 rpm, concentrazioni di proteine ​​sono state misurate e uguali quantità di proteine ​​totali sono state separate mediante SDS-PAGE. Le proteine ​​sono state trasferite su membrane PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA) e le membrane sono state bloccate per 1 ora in TBS-T. Le membrane sono state incubate overnight a 4 ° C con i seguenti anticorpi: stathmin totale, fosfo-stathmin (ser38), poli spaccati (ADP-ribosio) polimerasi-1 (PARP-1), spaccati caspasi-3 (il tutto da Cell Signaling Tecnologia , Beverly, MA), α-tubulina e β-actina (sia da Sigma, St. Louis, MO). Le membrane sono state incubate con i corrispondenti anticorpi secondari HRP-coniugato (Pierce Biotechnologies, Santa Cruz, CA) per un'ora. bande specifiche sono state rilevate utilizzando il reagente potenziato chemoilluminescence (ECL, Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA) su pellicola autoradiografica.

la crescita del tumore sottocutaneo studio

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità le linee guida e protocolli approvati della University of Texas Southwestern Medical center (Dallas, TX) Institutional Animal Care e del Comitato Usa (permesso Numero 2.012-0.081). Gli animali sono stati monitorati giornalmente tutto l'esperimento per qualsiasi segno di sofferenza. topi SCID femminile (6 a 8 settimane) sono stati utilizzati per la modellazione comparativa della crescita del tumore per via sottocutanea. cellule di cancro gastrico (10 × 10 ^{6 NCI-N87 o 20 × 10 6 SNU16 cellule) sono stati via sottocutanea iniettato in ogni mouse. I topi sono stati pesati due volte a settimana. Quattordici giorni dopo l'iniezione delle cellule tumorali, tutti i topi avevano tumore misurabile (una dimensione media del tumore di 100 a 150 mm 3). I topi sono stati poi raggruppati in modo casuale (n = 6~8 per gruppo) e trattati per via intraperitoneale con PBS (controllo), nab-paclitaxel (10 mg /kg a 100 l PBS, 2 volte a settimana), oxaliplatino (5 mg /kg a 100 l di PBS, 2 volte a settimana), e epirubicina (1 mg /kg a 100 l di PBS, 2 volte a settimana) per 14 giorni. La dimensione del tumore è stata misurata due volte alla settimana con pinza, e il volume del tumore (V) è stato calcolato usando la formula V = ½ [L × (W) 2], L = lunghezza e W = larghezza. volume tumorale relativa (RTV) è stata determinata secondo la formula RTV = V _{n /V 0 dove V 0 e V 1 rappresentano volume tumorale al giorno 0 e il successivo giorno di misurazione, rispettivamente. Il tasso di inibizione della crescita tumorale è stato calcolato utilizzando la formula (1-RTVT /RTVC) × 100% dove t e C rappresentano trattamento e il controllo del gruppo. Dopo il completamento del trattamento, tutti i topi sono stati sacrificati con CO2, i tumori sono stati rimossi, pesati, sezionato e trattati per istologica, immunoistochimica e analisi Western Blot.}}

L'analisi immunoistochimica

campioni di tessuto tumorale sono stati fissati 4% paraformaldeide e inclusi in paraffina. proliferazione intratumorale è stata misurata con Ki67 antigene nucleare colorazione secondo il protocollo del produttore (Abcam, Cambridge, MA). sezioni di tessuto incluse in paraffina sono stati tagliati (5 micron), deparaffinate, reidratate e l'antigene recuperati. Le sezioni di tessuto sono state incubate con CAS tampone bloccante seguita da incubazione di 1 ora con 1:200 diluizione primaria Ki67 o anticorpi fosfo-stathmin (1:200) e 40 minuti di incubazione con Cy3 (1:200 diluizione) anticorpo secondario. I vetrini sono stati montati utilizzando la soluzione di montaggio contenente 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Invitrogen). Intratumorale proliferativa Attività di indicizzazione e stathmin stata valutata calcolando le cellule positive da cinque diversi campi ad alta potenza (HPF) in modo cieco. l'attività apoptotica intratumorale è stata valutata mediante colorazione sezioni di tessuto con "Apoptag Apoptosis Detection Kit", secondo (Millipore) le istruzioni del produttore. Microscopia a fluorescenza è stata utilizzata per rilevare i segnali fluorescenti utilizzando il microscopio IX81 Olympus dotato di una fotocamera digitale Hamamatsu Orca (Hamamatsu Corporation, Bridgewater, NJ) ed una unità di filatura confocale DSU utilizzando il software Slidebook (Innovations Intelligent Imaging, Philadelphia, PA).

sopravvivenza degli animali analisi

studi di sopravvivenza animali sono stati eseguiti utilizzando da 6 a 8 settimane di età topi SCID femmine [41]. I topi sono stati iniettati per via intraperitoneale con SNU16 (40 × 10 ^{6) cellule e il peso corporeo è stato misurato due volte a settimana. Tre settimane dopo i topi iniezione delle cellule tumorali sono stati raggruppati in modo casuale (n = 6 a 8 per gruppo).}

Nel primo studio di sopravvivenza, i topi sono stati trattati per via intraperitoneale con PBS (controllo), nab-paclitaxel (10 mg /kg in 100 ml di PBS, 2 volte a settimana) e oxaliplatino (5 mg /kg a 100 l di PBS, 2 volte a settimana) per 2 settimane. Nel secondo studio la sopravvivenza, i topi sono stati trattati per via intraperitoneale con PBS (controllo), nab-paclitaxel (10 mg /kg a 100 l PBS, 2 volte a settimana), docetaxel (3 mg /kg a 100 l di PBS, 2 volte a settimana ) o oxaliplatino (5 mg /kg a 100 l di PBS, 2 volte a settimana) per 2 settimane. la sofferenza degli animali è stato ridotto di eutanasia quando si gira moribonda secondo criteri predefiniti, tra cui rapida perdita di peso o di guadagno (> 15%), la mancata mangiare o bere, letargia, incapacità di rimanere in posizione verticale e mancanza di forza. la sopravvivenza degli animali è stata valutata dal primo giorno di trattamento fino alla morte.

Analisi statistica
analisi

​​La sopravvivenza è stata valutata con GraphPad Prism 5 Software (GraphPad Software, San Diego, CA). Nella cella vitro dati di proliferazione sono espressi come media ± deviazione standard. L'analisi statistica è stata effettuata mediante ANOVA per il confronto gruppo multiplo e test t per il confronto gruppo individuale. La sopravvivenza confronto gruppo è stata effettuata tramite log-rank test all'interno di una analisi di tipo Kaplan-Meier. I valori di p < 0,05 sono stati considerati per rappresentare le differenze di gruppo statisticamente significative

Risultati

espressione Stathmin in cellule di cancro gastrico

L'analisi delle cellule tumorali gastriche AGS umani, NCI-. N87 e SNU16 rivelato che tutte le tre linee espresse stathmin. Nessuna differenza di espressione totale stathmin è stato trovato tra queste tre linee di cellule. L'espressione di fosfo-stathmin variato tra linee cellulari, nel seguente ordine: SNU16 > AGS > NCI-N87 cellule (Figura 1A).

Nab-paclitaxel inibisce la proliferazione delle cellule tumorali gastriche

Nab-paclitaxel inibito gastrica proliferazione delle cellule tumorali in modo dose-dipendente, e l'inibizione della proliferazione cellulare è apparso a seguire lo stesso ordine come espressione di fosfo-stathmin (Figura 1B). A 100 nM di inibizione concentrazione nella proliferazione cellulare era 94,5, 66,7 e 41,8 per cento in SNU16, AGS e le cellule NCI-N87, rispettivamente. Nab-paclitaxel ha mostrato la più alta potenza antiproliferativa con un dosaggio efficace basso trovato in tutte e 3 le linee cellulari testate rispetto al 5-fluouracil, oxaliplatino e epirubicina. L'IC _{50 di nab-paclitaxel è stato di 5 nM in SNU16, 23 Nm in AGS e 49 nM nelle cellule NCI-N87, che era meno di 5-fluouracil (6.46 micron di SNU16, > 10 micron di AGS e 10.2 micron di cellule NCI-N87), oxaliplatino (1,51 micron di SNU16, 1,64 micron di AGS e 1,05 micron di cellule NCI-N87) o epirubicina (0,12 micron di SNU16, 0,16 micron di AGS e 0,25 micron di cellule NCI-N87) ( Figura 1C).}

Nab-paclitaxel induce arresto G2 e la morte cellulare mitotico in vitro

Per valutare il meccanismo alla base di inibizione della crescita da nab-paclitaxel, il profilo del ciclo cellulare è stato analizzato. Come mostrato in Figura 2A, nab-paclitaxel (100 nM) ha comportato G2-M arresto del ciclo cellulare in cellule SNU16. La percentuale di cellule positive ioduro di propidio in fase G2-M è aumentato 35,6-71,6 dopo 100 nM trattamento nab-paclitaxel per 12 ore. Cambiamenti simili si sono verificati nelle cellule AGS e NCI-N87 con nab-paclitaxel e docetaxel trattamento, ma non con oxaliplatino e il trattamento epirubicina (figure S1 e S2).

Effetto di nab-paclitaxel morte cellulare mitotico, espressione di fosfo -stathmin e proteine ​​apoptosi correlati è stata misurata da immunocystochemistry e Western blot. trattamento nab-paclitaxel ha causato disagi e microtubuli arresti mitotiche in cellule di cancro gastrico come osservato dalla frammentazione nucleo e karyopyknosis (Figura 2B). L'espressione di fosfo-stathmin è stato aumentato dopo il trattamento nab-paclitaxel, e più alta espressione di fosfo-stathmin è stato associato con un maggior grado di arresti mitotico, nucleo di frammentazione o karyopyknosis, e la morte cellulare (Figura 2b e 2c). frammentazione nucleare e karyopyknosis si è verificato nel 16,7% delle cellule con bassa espressione di fosfo-stathmin ma nel 95,7% delle cellule con elevata espressione di fosfo-stathmin (r = 0,672, p < 0,001). C'era anche la prova per un tempo maggiore espressione dipendente di fosfo-stathmin dal trattamento nab-paclitaxel (Figura 2D).

Abbiamo esaminato se la morte cellulare indotta da mitotico nab-paclitaxel potrebbe in parte essere correlata con l'induzione di apoptosi . Valutazione della PARP-1 scissione e caspasi-3 clivaggio come marcatori di induzione dell'apoptosi rivelato che in cellule di cancro gastrico nab-paclitaxel, oxaliplatino e epirubicina trattamento ha causato un aumento nell'espressione di entrambi spaccati PARP-1 e caspasi-3. Questa espressione di proteine ​​apoptosi legati apparso più alto dopo il trattamento nab-paclitaxel rispetto con oxaliplatino o trattamenti epirubicina (Figura 2E).

Nab-paclitaxel inibisce la crescita di xenotrapianti cancro gastrico

In vivo antitumorale effetti di nab-paclitaxel sono stati valutati in un modello murino di xenotrapianto utilizzando SNU16 cellule. Nab-paclitaxel terapia a 10 mg /kg due volte alla settimana per due settimane è stato ben tollerato, senza evidenti segni di tossicità secondo il giudizio di peso del mouse e valutazione giornaliera. Dopo un trattamento di due settimane, nab-paclitaxel terapia determinato statisticamente significativa inibizione della crescita tumorale (p = 0,0004) che era maggiore di quelli dell'oxaliplatino (p = 0,0361) e epirubicina (p = 0,032) rispetto al controllo del veicolo, rispettivamente (Figura 3A). Il tasso di inibizione della crescita del tumore dopo un trattamento di 2 settimane con nab-paclitaxel, oxaliplatino e epirubicina era 77, 17,2 e il 21,4 per cento (p = 0.002), rispettivamente. Solo il trattamento nab-paclitaxel ha creato una riduzione delle dimensioni delle lesioni sottocutanee rispetto alle loro dimensioni del tumore prestabilito. Il peso medio del tumore era significativamente diminuita del trattamento nab-paclitaxel (0.154 ± 0.075 g vs 0,756 ± 0,232 g, p = 0.037), ma non con oxaliplatino (0,408 ± 0,12 g) o epirubicina (0,46 ± 0,172 g) trattamento rispetto al veicolo il controllo, rispettivamente (Figura 3A). Abbiamo anche valutato gli effetti antitumorali di nab-paclitaxel NCI-N87 xenotrapianto topo tumori locali. Dopo due settimane di trattamento, la terapia nab-paclitaxel ha determinato una significativa inibizione volume tumorale (p = 0,0023) (Figura 3B) e il tasso di inibizione della crescita tumorale era 72,8 per cento. Il peso medio del tumore nel gruppo di trattamento nab-paclitaxel era significativamente inferiore a quella nel gruppo veicolo (0,093 ± 0,026 g vs 0,288 ± 0,02 g, p = 0,0054) (Figura 3B). Nessuna variazione significativa del peso corporeo del mouse è stata osservata in nessuno dei gruppi nab-paclitaxel, oxaliplatino o terapia epirubicina.

Nab-paclitaxel induce la morte delle cellule in vivo mitotico

I meccanismi di in vivo l'attività antitumorale di nab-paclitaxel sono stati ulteriormente esaminati nei tessuti tumorali ottenute da SNU16 e NCI-N87 xenotrapianti. Un aumento significativo l'espressione di fosfo-stathmin è stata osservata in SNU16 (figura 4A) e NCI-N87 (Figura 4B) tumori xenotrapianto con il trattamento di nab-paclitaxel sia da Blot immunoistologiche e occidentale analisi.

Tumore tessuto da topi trattati nab-paclitaxel visualizzato un tasso di proliferazione delle cellule tumorali diminuito. Un indice proliferativo intratumorale Ki67 espressione basati diminuito del 90,7% (p = 0,001) rispetto ai controlli nel gruppo nab-paclitaxel trattata, rispetto al 72,6% (p = 0,004) nel gruppo trattato oxaliplatino e 67,7% (p = 0,003 ) nel gruppo trattato epirubicina (Figura 5A). Nab-paclitaxel ha causato un effetto di inibizione più forte sulla proliferazione delle cellule tumorali di oxaliplatino e epirubicina.

L'esame di apoptosi nei tessuti tumorali ha rivelato che l'induzione di indice apoptotico è stato 7.9 volte nel gruppo nab-paclitaxel (p = 0,013 ), 5,7 volte in animali trattati oxaliplatino (p = 0,024), e 5,2 volte nel gruppo epirubicina trattati (p = 0,042) rispetto alla linea di base all'interno del gruppo di controllo (Figura 5B).

Nab-paclitaxel aumenta la sopravvivenza degli animali

Nel primo studio di sopravvivenza, la sopravvivenza mediana di topi SCID-NOD è stato di 24 giorni nel gruppo di controllo. Ciò ha aumentato a 86 giorni dopo il trattamento nab-paclitaxel (p = 0,0004 rispetto al gruppo di controllo, p = 0,0005 vs gruppo oxaliplatino) e di 37,5 giorni dopo il trattamento con oxaliplatino (p = 0,0004 rispetto al gruppo di controllo). La gamma gruppo di sopravvivenza è stato anche superiore dopo il trattamento nab-paclitaxel (range: 75 a 95 giorni) rispetto al trattamento oxaliplatino. (Range: 34 a 41 giorni) (Figura 6A)

Nel secondo studio di sopravvivenza, mediana sopravvivenza dei topi SCID-NOD era 31 giorni nel gruppo di controllo. Ciò ha aumentato a 93 giorni dopo il trattamento nab-paclitaxel (p = 0,0007 contro il controllo e il gruppo oxaliplatino, e p = 0,0416 vs gruppo docetaxel), a 81 giorni dopo il trattamento con docetaxel (p = 0.0007 vs controlli) e di 40 giorni per trattamento oxaliplatino (gruppo di controllo p = 0,038 vs). La gamma gruppo sopravvivenza era 75 a 96 giorni dopo il trattamento nab-paclitaxel rispetto al trattamento con docetaxel (range: 74 a 93 giorni) e il trattamento oxaliplatino (range: da 35 a 45 giorni). (Figura 6B)

Discussione

cancro gastrico avanzato è pericolosa per la vita e rappresenta una sfida formidabile trattamento. Tradizionali regimi di doppie o triple chemioterapia citotossica hanno effetti limitati e possono causare effetti collaterali e chemioresistenza [42] - [44]. Il presente studio dimostra chiaramente che nab-paclitaxel ha effetti significativamente più forti antitumorali su linee di cellule di cancro gastrico di agenti citotossici attualmente utilizzati oxaliplatino e epirubicina in vitro e in vivo, misurati da effetti antiproliferativi, l'apoptosi, la morte cellulare mitotico, di risposta antitumorale localizzato e di sopravvivenza relativa a carico tumorale.

in vitro studio ha dimostrato che nab-paclitaxel è molto potente nell'inibire la proliferazione delle cellule di linee di cellule gastriche umane di oxaliplatino e epirubicina. cellule SNU16 sono più sensibili al nab-paclitaxel rispetto alle cellule NCI-N87. Alcuni studi hanno trovato che stathmin era correlata con la resistenza taxano e stathmin atterramento può aumentare la sensibilità al taxano [33], [36]. Abbiamo testato l'espressione di stathmin e abbiamo trovato alcuna differenza tra queste tre linee di cellule. È interessante notare che, quando abbiamo esaminato l'espressione di fosfo-stathmin abbiamo scoperto che la capacità di nab-paclitaxel per inibire la proliferazione delle cellule in vitro è stato nello stesso ordine rango come l'espressione di fosfo-stathmin in queste tre cellule di cancro gastrico: SNU16 > AGS > NCI-N87. E 'quindi apparso inizialmente che l'espressione di fosfo-stathmin è stata correlata con l'efficacia nab-paclitaxel, dando un po' di supporto ad una ipotesi che fosfo-stathmin può servire come un potenziale biomarcatore per predire la risposta antitumorale nab-paclitaxel nel trattamento del cancro gastrico.

Abbiamo eseguito uno studio di xenotrapianto NCI-N87 per valutare l'effetto antitumorale di nab-paclitaxel. Piuttosto inaspettatamente, nab-paclitaxel significativamente inibito NCI-N87 crescita xenotrapianto del tumore rispetto al gruppo di controllo. Questi risultati alquanto discordanti sembrano suggerire che in vivo effetto antitumorale di nab-paclitaxel nel carcinoma gastrico può essere indipendente dalla espressione basale di fosfo-stathmin o stathmin totale. Dal momento che solo tre linee cellulari sono stati testati, non possiamo fare una conclusione definitiva sul rapporto tra stathmin o fosfo-stathmin e l'efficacia nab-paclitaxel nel carcinoma gastrico. Ulteriori ricerche con stathmin knock-out dovrebbe essere utile per affrontare la questione e indagare il ruolo di stathmin come biomarker per l'efficacia nab-paclitaxel.

In questo studio, abbiamo poi confrontato gli effetti antitumorali di paclitaxel NAB con oxaliplatino e epirubicina sui tumori locali SNU16 xenotrapianto. Nab-paclitaxel ha dimostrato l'efficacia antitumorale più forte di oxaliplatino e epirubicina che era coerente con in vitro di proliferazione cellulare risultati e la proliferazione delle cellule del tessuto tumorale e dati apoptosi. Anche se 5-fluouracil è la più consolidata della droga come agente singolo in chemioterapico cura del cancro gastrico, la risposta tumorale 5-fluoruracile è segnalato per essere previsto in modo inadeguato nei modelli SCID mouse fino al punto in cui sono stati osservati anche effetti antitumorali [45]. Cisplatino e oxaliplatino, più potenti induttori di apoptosi e anche frequentemente utilizzati nel trattamento del cancro gastrico chemioterapico, sono stati scelti più spesso come agenti a scopo di confronto con i nuovi agenti che sono da testare [22], [45]. paclitaxel solvente ha più effetti collaterali e non ha aggiunto benefici di sopravvivenza rispetto a oxaliplatino nel trattamento clinico di cancro gastrico [22]. Nei nostri studi, oxaliplatino non differiva statisticamente da epirubicina. Abbiamo quindi scelto oxaliplatino come agente di riferimento per lo studio della sopravvivenza degli animali e ha scoperto che nab-paclitaxel aumentata sopravvivenza mediana del mouse per circa 40 giorni su oxaliplatino, un effetto più del doppio di quello raggiunto da oxaliplatino. Docetaxel sembra essere il taxano più attivo, con più rapida diffusione cellulare e più ritenzione intracellulare rispetto a paclitaxel solvente [46]. Abbiamo effettuato un altro studio di sopravvivenza per confrontare gli effetti antitumorali di nab-paclitaxel con docetaxel e abbiamo trovato che il tempo mediano di sopravvivenza era leggermente ampliato dopo il trattamento nab-paclitaxel (93 giorni contro 81 giorni, p = 0,0416). I nostri risultati sono coerenti con i risultati di un recente studio di Fase II di cancro al seno che ha dimostrato che 100 mg /m ^{2 nab-paclitaxel ha avuto un aumento della sopravvivenza mediana complessiva (hazard ratio 0,575, p = 0,008) rispetto a docetaxel [47]. Sulla base dei nostri risultati, nab-paclitaxel ha dimostrato più forte efficacia antitumorale nel tumore gastrico sperimentale e sembra rappresentare un ragionevolmente potente nuovo agente chemioterapico per il trattamento clinico del cancro gastrico.}

Stathmin è un importante microtubuli microtubuli destabilizzare fosfoproteina. Quando stathmin viene fosforilata, la sua attività ai microtubuli destabilizzare diminuito [32], [34] e questo può migliorare la sensibilità di taxano. Stathmin è fosforilata principalmente sulla ciclina-dipendente proteina chinasi (CDK) sito di legame Ser38 in mitosi [32], così abbiamo concentrato la nostra espressione analisi sul residuo ser38. Abbiamo trovato che il trattamento con nab-paclitaxel aumento dell'espressione fosfo-stathmin in vitro e in vivo e è stata correlata con arresti mitosi, la frammentazione nucleare, karyopyknosis e morte cellulare mitotico. morte cellulare mitotico si è verificato in quelle cellule con elevata espressione di fosfo-stathmin. Zhou et al. [33] trovarono che espressione stathmin down-regolato dopo STMN1 silenziamento genico in cellule di carcinoma epatico aggiunto 7,7 volte la sensibilità di nab-paclitaxel e la sensibilità di 2,7 volte paclitaxel al solvente a base ma nessuna sensibilità alla doxorubicina. La natura molecolare che innesca la morte delle cellule durante l'arresto mitotico prolungato rimane poco definito [17], [32]. posti di blocco di assemblaggio del mandrino sono stati a lungo pensato di giocare un ruolo critico nel corso di questo processo [48]. In questo studio, nab-paclitaxel fosforilazione indotta stathmin in cellule di cancro gastrico, che dovrebbe stabilizzarsi l'apparato microtubuli, che a sua volta può causare arresti mitosi e la morte delle cellule di attivazione. Anche se questi sono i primi e preliminari, qualche supporto per attività antitumorale nab-paclitaxel è stato osservato e merita di essere ulteriormente valutata fosfo-stathmin regolazione.

In conclusione, questo studio dimostra che come agente singolo nab-paclitaxel avuto forte attività antitumorale nel carcinoma gastrico sperimentale rispetto agli attuali standard di agenti chemioterapici oxaliplatino e epirubicina, e sembrava essere il taxano superiore rispetto a docetaxel. Questa forte attività antitumorale supporta il razionale per la valutazione clinica di nab-paclitaxel come promettente agente microtubuli inibitorio nel carcinoma gastrico.

informazioni di supporto
Figura S1.
Nab-paclitaxel porta alla fase di arresto G2-M in cellule di cancro gastrico. (A) Gli istogrammi mostrano profili del ciclo cellulare delle cellule AGS e NCI-N87 in tempi diversi dopo il trattamento nab-paclitaxel. cellule di cancro gastrico sono state coltivate per 24 ore e quindi trattata con 100 nM nab-paclitaxel per 12 ore o 24 ore. L'analisi del ciclo cellulare è stata effettuata mediante citometria di flusso. I risultati mostrati sono rappresentativi di due esperimenti indipendenti. (B) la distribuzione del ciclo cellulare per le cellule di cancro gastrico trattate con 100 nM nab-paclitaxel. . Simbolo * condizioni marchi con cui le cellule avevano disintegrato
doi: 10.1371 /journal.pone.0058037.s001
(TIF)
Figura S2.
progressione del ciclo cellulare delle cellule di cancro gastrico trattati con oxaliplatino, epirubicina e docetaxel. (A) Gli istogrammi mostrano profili del ciclo cellulare delle cellule SNU16 e AGS dopo oxaliplatino, l'epirubicina e trattamento con docetaxel. cellule di cancro gastrico sono state coltivate per 24 ore e poi trattati con 10 mM nab-paclitaxel, oxaliplatino, epirubicina e docetaxel per 8 ore. Il ciclo cellulare è stata eseguita mediante citometria di flusso. I risultati mostrati sono rappresentativi di due esperimenti indipendenti.

• PLoS ONE: Restauro del miR-1228 * Espressione Sopprime transizione epitelio-mesenchimali nel cancro gastrico
• PLoS ONE: MDM2 SNP309 rs2279744 polimorfismo e cancro gastrico rischio: una meta-Analysis