PLoS ONE: Reg IV è un obiettivo diretto di intestinale trascrizionale Factor CDX2 nel cancro gastrico

Astratto

REG4
, che codifica per la proteina Reg IV, è un membro della lectina calcio-dipendente superfamiglia e potente attivatore del recettore del fattore di crescita epidermico /Akt /attivatore della proteina-1 percorso di segnalazione. Diversi tumori umani overexpress Reg IV, e l'espressione Reg IV è associata con la differenziazione fenotipo intestinale. Tuttavia, la regolamentazione del REG4
trascrizione rimane poco chiaro. In questo studio, abbiamo studiato se CDX2 regola l'espressione Reg IV nel cellule di cancro gastrico (GC). Espressione del Reg IV e CDX2 è stato analizzato mediante Western blot e reazione a catena quantitativa inversa trascrizione-polimerasi in 9 linee cellulari GC e linee cellulari di cancro del colon 2. La funzione della regione 5'-flanking del REG4
gene è stato caratterizzato da saggio luciferasi. In 9 linee di cellule GC, endogena Reg IV e di espressione CDX2 erano ben correlati. L'utilizzo di un modulo di recettore estrogeno-regolata CDX2, rapida induzione di espressione Reg IV è stata osservata in HT-29 cellule. saggi Reporter gene rivelarono un ruolo importante nella trascrizione per consenso CDX2 DNA binding elementi della regione 5'-flanking del REG4
gene. immunoprecipitazione della cromatina hanno mostrato che CDX2 si lega direttamente alla regione 5'-flanking del REG4
. Questi risultati indicano che la proteina CDX2 regola direttamente l'espressione Reg IV

Visto:. Naito Y, Oue N, Hinoi T, Sakamoto N, K Sentani, Ohdan H, et al. (2012) Reg IV è un obiettivo diretto di intestinale trascrizionale Factor CDX2 nel cancro gastrico. PLoS ONE 7 (11): e47545. doi: 10.1371 /journal.pone.0047545

Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Stati Uniti d'America

Ricevuto: 24 maggio 2012; Accettato: 12 settembre 2012; Pubblicato: 2 novembre 2012

Copyright: © 2012 Naito et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Questo lavoro stata sostenuta da sovvenzioni-in-Aid per la ricerca da parte del Ministero della Pubblica Istruzione, Cultura, Scienza, Sport e Tecnologia del Giappone, e, in parte, da una sovvenzione-in-Aid per la strategia di 10 anni Terzo completa per il controllo del cancro e per la ricerca sul Cancro del Ministero della Salute, del lavoro e del Welfare del Giappone, e per l'Istituto nazionale di Biomedical Innovation (Programma per la promozione degli studi fondamentali in Scienze della Salute). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

cancro gastrico (GC) è uno dei tumori umani più comuni nel mondo. Cancer sviluppa come risultato di molteplici alterazioni genetiche ed epigenetiche [1]. Abbiamo già effettuato l'analisi di serie dell'espressione genica (SAGE) di quattro primaria GC e identificato diversi geni specifici del GC [2]. Di questi geni, rigenerante isolotto di derivazione membro della famiglia 4
( REG4
, che codifica per la proteina Reg IV) è un gene candidato per l'espressione cancro-specifica [3]. REG4
è un membro del REG
famiglia di geni, che appartiene alla superfamiglia lectina calcio-dipendente. REG4
è stato originariamente identificato da high-throughput analisi della sequenza di una grande biblioteca infiammatoria cronica dell'intestino cDNA [4]. Reg IV è un potente attivatore del fattore di crescita epidermico (EGFR) /Akt /attivatore protein-1 (AP-1) via di segnalazione nelle cellule tumorali del colon e aumenta l'espressione di Bcl-2, Bcl-XL e survivina, che sono proteine associati con l'inibizione dell'apoptosi [5]. L'amplificazione del REG4
gene è stato riportato nel cancro del pancreas [6]. Reg IV è stato identificato come uno dei geni up-regolati in cellule tumorali-avvio [7]. Abbiamo già esaminato l'effetto di espressione forzata del Reg IV nella linea cellulare GC. Abbiamo dimostrato che Reg IV inibisce 5-fluorouracile (5-FU) l'apoptosi indotta attraverso l'attivazione di EGFR in cellule di GC [8]. Al contrario, le cellule Reg IV-overexpressing non hanno mostrato differenze significative nella proliferazione e l'attività invasione rispetto alle cellule trasfettate con vettore vuoto [8]. Questi risultati supportano l'idea che la proteina Reg IV partecipa nella carcinogenesi gastrica

GC può essere suddiviso in quattro fenotipi secondo l'espressione mucina:. Fenotipo gastrica o foveolare; fenotipo intestinale; fenotipo misto intestinale e gastrica; e né fenotipo gastrico né intestinale [9]. Distinct cambiamenti genetici sembrano essere associati con GC fenotipo gastrica e intestinale [10]. Nelle nostre osservazioni precedenti, Reg IV è stato espresso nel 30% dei casi e GC è stata correlata con fenotipo intestinale [11]. Un certo numero di analisi immunoistochimica di Reg IV sono stati segnalati in tumori umani [11] - [20]. In generale, queste analisi riferito che Reg IV è espressa nelle cellule di adenocarcinoma visualizzano un fenotipo intestinale. E 'stato riportato che l'espressione Reg IV è indotta da Gli1, che è un fattore di trascrizione chiave nella via di Hedgehog [21], o da fattori di crescita come EGF, fattore di crescita trasformante-α (TGF-α), fattore di crescita degli epatociti (HGF), o fattore fondamentale di crescita dei fibroblasti (bFGF) [22]. Tuttavia, queste molecole sono improbabili per spiegare l'associazione tra espressione Reg IV e la differenziazione fenotipo intestinale.

Abbiamo già scoperto che l'espressione di Reg IV è stata correlata con l'espressione di CDX2 [11]. CDX2 è un fattore di trascrizione mammiferi intestinale caudale legati e importante per il mantenimento delle cellule epiteliali intestinali [23], [24]. Diverse linee di prove suggeriscono che la metaplasia intestinale dello stomaco e dell'intestino GC fenotipo sono associati con l'espressione ectopica CDX2 [9], [25]. In questo studio, abbiamo studiato se CDX2 regola l'espressione Reg IV nel GC verificando che CDX2 si lega direttamente alla regione 5'-flanking del REG4
gene e migliora l'attività del promotore.

Risultati

Reg IV e CDX2 espressione sono correlati in cellule di GC

in primo luogo abbiamo indagato l'induzione di espressione Reg IV da CDX2 in linee cellulari GC. Analisi Western Blot di CDX2 in 9 linee di cellule GC ha rivelato che nessuna espressione o basso livello di CDX2 è stato rilevato in MKN-7, TMK-1, HSC-44PE e KATO-III (Fig. 1A). Per determinare se CDX2 e di espressione Reg IV erano strettamente correlate nelle cellule GC, Western Blot e la reazione a catena della polimerasi di trascrizione inversa-quantitativa (qRT-PCR) analisi del Reg IV sono state eseguite su linee cellulari 9 GC. Come mostrato in Fig. 1A, espressione della proteina Reg IV è stato rilevato solo nelle 3 linee cellulari con elevati livelli di REG4
trascrizioni misurati con qRT-PCR. Delle linee cellulari 5 GC con l'espressione della proteina CDX2, 2 linee cellulari (MKN-1 e MKN-28) mancava espressione rilevabile di REG4
trascrizioni e proteine. Le linee cellulari con l'espressione della proteina rilevabile CDX2 (MKN-7, TMK-1, HSC-44PE e KATO-III) non hanno mostrato REG4
trascrizioni o proteina (Fig. 1A).

Avanti, abbiamo generato una popolazione policlonale di MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, e le cellule KATO-III che esprimono alti livelli di CDX2 da infezione delle cellule con retrovirus replica-difettose che trasportano un full-length CDX2 umano cDNA perché assenza o un basso livello di espressione di CDX2 è stato rilevato in queste linee cellulari. Tuttavia, l'iperespressione di CDX2 non è riuscito ad attivare Reg IV espressione da Western Blot (dati non riportati). Poiché è possibile che CDX2 da sola non è sufficiente per attivare l'espressione Reg IV, espressione di CDH17
(codifica la proteina LI-caderina), che è uno degli obiettivi di CDX2 [24], è stato anche indagato. Tuttavia, l'attivazione di espressione LI-caderina non è stato trovato in MKN-7, TMK-1, HSC-44PE e KATO-III cellule che esprimono alti livelli di CDX2 (dati non riportati). Perché abbiamo dimostrato di attivazione di espressione LI-caderina dal CDX2 nel colon cancro linea di cellule HT-29 [24], l'induzione di espressione Reg IV è stato studiato nella stessa linea cellulare. Come mostrato in Fig. 1B, induzione dell'espressione Reg IV è stato rilevato nelle HT-29 cellule infettate con retrovirus che trasportano un full-length CDX2 umano cDNA. Abbiamo anche generato una popolazione policlonale di SW480 (colon linea di cellule di cancro) cellule che esprimono alti livelli di CDX2 da infezione delle cellule con retrovirus replica-difettose che trasportano un full-length CDX2 umano cDNA. Come mostrato in Fig. 1B, induzione dell'espressione Reg IV è stato trovato nelle cellule SW480 infettate con retrovirus che trasportano un full-length CDX2 umano cDNA. Questi risultati suggeriscono che l'espressione Reg IV può essere indotta da CDX2 in linee cellulari derivate da cancro al colon. Perché in metaplasia intestinale dello stomaco, CDX2 e di espressione Reg IV sono ben correlati [11], l'uso di una linea di cellule di cancro del colon potrebbe essere adatto per il modello di metaplasia intestinale.

Per valutare meglio il rapporto tra CDX2 e di espressione Reg IV, abbiamo studiato l'espressione Reg IV in una linea di HT-29 di derivazione con l'attività CDX2 strettamente regolata. Abbiamo utilizzato una linea cellulare policlonale HT-29 che erano state trasdotte con il vettore pCDX2-ER. Il vettore pCDX2-ER codifica per una proteina chimerica, in cui le sequenze CDX2 full-length sono fusi a monte di un recettore per gli estrogeni mutato (ER) ligand-legame dominio. La ER ligand-legame dominio mutato non si lega estrogeni, ma mantiene la capacità di legare tamoxifene. Trattamento della linea cellulare /CDX2-ER-29 HT con 4 hydroxytamoxifen (4-OHT) provocato forte induzione dell'espressione della proteina Reg IV entro 48 ore (Fig. 1C). Questi risultati indicano che Reg IV è un gene diretta o primaria bersaglio regolato da CDX2. Tuttavia, CDX2 sola non è sufficiente per attivare l'espressione Reg IV.

L'inibizione della CDX2 da RNA interferenza (RNAi) Risultati nel down-regolazione del Reg IV in cellule di GC

Per stabilire se CDX2 è necessaria per l'espressione Reg IV in cellule di GC, abbiamo analizzato l'effetto di inibire l'espressione CDX2 dalla RNAi nel livello di espressione Reg IV in HSC-39 linea cellulare perché alta CDX2 endogena ed espressione Reg IV è stata rilevata in HSC-39 linea cellulare. piccoli RNA specifico per CDX2 interferenti (siRNA) l'espressione della proteina CDX2 ha soppresso significativamente 3 giorni dopo la transfezione, e l'espressione del Reg IV trascritto era down-regolato circa il 50% entro il CDX2 siRNA in HSC-39 rispetto ai suoi livelli nelle cellule siRNA-trattati di controllo ( Fig. 1D). Questi risultati indicano che CDX2 è coinvolta nel mantenimento della espressione genica Reg IV.

caratterizzazione funzionale il 5'-flanking Regione di REG4
Gene da Luciferase Assay

per identificare potenziali CDX2 -di legame siti nel caudale REG4
regione del promotore, una ricerca delle sequenze genomiche immediatamente 5 'al sito di inizio trascrizione presuntiva è stata eseguita, con un consenso elemento vincolante per il pollo CDXA
omologo (5'-a, a /T, T, a /T, a, T, a /G-3 ') [26] e un algoritmo di ricerca precedentemente descritto [27]. Abbiamo trovato quattro siti di legame putativi CDX2-in 2 kilobase (KB) 5'-fiancheggiante regione del REG4
gene (Fig. 2A). Questi erano: il sito A (5'-AATAATA-3 ', -1.828--1.834), sito B (5'-CTTTACAG-3', da -901 a -908), sito C (5'-TTTTATGG-3 ', da -114 a -121), sito D (5'-AATAATA -3', da -90 a -96). Per valutare il ruolo di questi siti di legame CDX2-presuntivi nella regolazione REG4
trascrizione, diversi costrutti genici giornalista sono stati generati. Come mostrato in Fig. 2B, costrutti genici giornalista contenenti 2,1, 1,2 o 0,6 kb di 5'-fiancheggiante sequenza dal REG4
genica ha mostrato una forte attività nelle cellule HSC-39, che mostrano una forte espressione endogena di REG4
trascrizioni e proteine. In confronto, le cellule MKN-1 hanno poco endogeno REG4
trascrizione e visualizzati poca o nessuna attività trascrizionale indotta dai 2.1, 1.2 o 0.6 kb REG4
costrutti genici giornalista (dati non riportati) . L'attività di REG4
costrutti genici giornalista che contengono paia di basi -116 a +58 e -87 a +58 avevano ridotto nelle cellule HSC-39 (Fig 2B.), Indicando che le sequenze tra base coppie di -634 e - 116 svolgono un ruolo chiave nell'attivazione di REG4
trascrizione. Inoltre, abbiamo analizzato le mutazioni singole e multiple nei siti CDX2 vincolante presuntivi nella regione 5'-flanking del REG4
gene utilizzando HSC-39 cellule (Fig. 2C). Come previsto, presunto sito CDX2 vincolante C, che si trova tra coppie di basi -634 e -116, gioca un ruolo cruciale nell'attivazione di REG4
trascrizione.

CDX2 si lega direttamente al 5 ' fiancheggiante regione di REG4
Gene

per analizzare se CDX2 si lega direttamente ai siti putativi CDX2 vincolante nel REG4 regione
5'-flanking, abbiamo effettuato immunoprecipitazione della cromatina (chip) saggi usando HSC-39 cellule. Utilizzando 6 primer per il REG4
5'-flanking regione (Fig. 3A), abbiamo recuperato frammenti di DNA contenenti il ​​ REG4
5'-fiancheggiante regione Primer 1, che comprende CDX2- presuntiva sito di legame C (Fig. 3B). frammenti di DNA provenienti dalla regione 5'-flanking del REG4
, che sono stati generati utilizzando primer 2, 3, 4, 5 e 6 in modo tale che essi non contengono siti di legame CDX2 presunti, non sono stati recuperati dal anti- anticorpo CDX2. La specificità del recupero del REG4
regione del promotore seguente chip con anticorpo anti-CDX2 è stato mostrato dal fatto che altri frammenti di DNA irrilevante privo siti CDX2 vincolante (ad esempio, esone 3 del CDX1
gene) non sono stati recuperati (Fig. 3B). Inoltre, immunoprecipitazione finto (IgG di topo) ha prodotto pochi REG4
o CDX1
frammenti di DNA specifico d'(Fig. 3B). Tutti questi risultati suggeriscono che CDX2 attiva REG4
trascrizione direttamente vincolanti per le sequenze nella regione 5'-flanking del gene.

trimethylation dell'istone H3 lisina 27 (H3K27me3) sul REG4
Promoter nel GC linee cellulari

Anche se l'espressione della proteina CDX2 è stato trovato in MKN-1 e linee di cellule MKN-28, queste 2 linee cellulari mancava espressione rilevabile di REG4
trascrizione e proteine. Perché è stato riportato che hypermethylation DNA di isole CpG è associata a silenziamento di diversi geni [28], noi verificare se la metilazione del DNA indotta inattivazione trascrizionale Reg IV in MKN-1 e MKN-28 cellule. Abbiamo trattato queste cellule con un agente demethylating, 5-aza-2'-deossicitidina (Aza-dC) e poi eseguite qRT-PCR. Tuttavia, l'espressione Reg IV non è stato ripristinato in queste linee cellulari (dati non riportati), suggerendo che la metilazione del DNA, non è suscettibile di incidere espressione Reg IV. E 'stato anche riferito che H3K27me3 è stata associata con l'espressione genica repressa [29]. Abbiamo inoltre studiato H3K27me3 in linee cellulari GC. Per determinare l'arricchimento H3K27me3 sul REG4
promotrice nelle linee di cellule GC, sono stati effettuati test di chip. In MKN-1 e MKN-28 linee cellulari, i livelli H3K27me3 sul REG4
regione del promotore erano alte, mentre in HSC-39 linea cellulare, livello H3K27me3 sul REG4
regione del promotore è stata bassa (Fig. 3C). Questi risultati suggeriscono che la struttura della cromatina chiuso di REG4
promotore in grado di inibire l'espressione Reg IV da CDX2.

Discussione

Anche se è stato riportato che l'espressione Reg IV è indotta da Gli1 [21] o EGF [22], queste molecole è improbabile per spiegare l'associazione tra Reg IV e differenziazione intestinale. Nel presente studio, abbiamo dimostrato che CDX2 endogena e l'espressione Reg IV erano ben correlati in linee cellulari GC. Inoltre, utilizzando un modulo ER-regolata CDX2, abbiamo scoperto che c'era una rapida induzione dell'espressione Reg IV dopo il trattamento a 4-OHT. saggi di gene Reporter ha rivelato un ruolo importante per il consenso CDX2 legame al DNA elementi del REG4
regione del promotore nella sua trascrizione. saggi ChIP successivi hanno mostrato che CDX2 si lega direttamente al REG4
promotore. Abbiamo precedentemente dimostrato che nel tessuto GC primaria e metaplasia intestinale dello stomaco, CDX2 e di espressione Reg IV sono stati ben correlata [11]. Questi risultati indicano che la proteina CDX2 regola direttamente l'espressione Reg IV in GC e metaplasia intestinale dello stomaco.

CDX2 è sovraespresso in intestinale GC fenotipo e in metaplasia intestinale dello stomaco [9], [25]. Al contrario, la perdita di espressione CDX2 è stata osservata in un sottogruppo di tumori colorettali primari, di solito in poco differenziati tumori colorettali [30]. Il significato di alterazione dell'espressione CDX2 nei tumori umani è chiaro, e pertanto è importante definire i geni bersaglio che sono a valle del CDX2. Abbiamo identificato diversi geni CDX2-regolati come CDH17
(che codifica LI-caderina) [24], HEPH
(che codifica hephaestin) [31], ABCB1
(che codifica multidrug resistance 1) [32], e DSC2
(che codifica desmocollin 2) [33]. Tra questi geni, ABCB1
è stato originariamente identificato come un gene overexpressed e amplificato in più celle farmaco-resistenti, e il suo prodotto, P-glicoproteina, sembra giocare un ruolo critico nella resistenza ai farmaci [34]. In precedenza, abbiamo riportato che l'espressione forzata del Reg IV nelle cellule GC inibito l'apoptosi 5-FU-indotta attraverso l'induzione di Bcl-2 e diidropirimidina deidrogenasi [8]. Presi insieme, è possibile che in intestinale GC fenotipo, espressione (o l'espressione ectopica) di CDX2 induce Reg IV e multidrug resistenza 1 espressione, con un conseguente aumento della farmaco-resistenza. In realtà, è stato segnalato che la chemioterapia post-operatoria non è vantaggioso per i pazienti con fenotipo intestinale CG [35].

Anche se i nostri dati supportano l'idea che CDX2 gioca un ruolo nella regolazione REG4
trascrizione tramite legame con la regione del promotore, diversi risultati indicano che CDX2 da sola non è sufficiente per l'attivazione di REG4
espressione. Nel presente studio, abbiamo generato una popolazione policlonale di MKN-7, TMK-1, le cellule HSC-44PE e KATO-III che esprimono alti livelli di CDX2 da infezione con retrovirus che trasportano un full-length CDX2 umano cDNA. Tuttavia, l'iperespressione di CDX2 non è riuscito ad attivare l'espressione Reg IV. In linee cellulari GC, nessuna delle linee cellulari con l'espressione della proteina CDX2 non rilevabile aveva rilevabili REG4
trascrizioni e proteine. Pertanto, CDX2 è necessaria per l'espressione Reg IV, ma CDX2 sola non è sufficiente per attivare l'espressione Reg IV. Nel presente studio, nove linee di cellule GC sono stati studiati. Le origini delle linee cellulari sono state le seguenti. Le linee di cellule MKN-74 MKN-7, MKN-28, e sono state stabilite dal tipo GC intestinale. Le linee di cellule TMK-1 e MKN-45 sono state stabilite dal tipo GC diffuso. Il KATO-III, HSC-39, e HSC-44PE linee cellulari sono state stabilite da carcinoma a cellule anello con sigillo. La linea di cellule MKN-1 è stata fondata da carcinoma a cellule adenosquamoso. Perché in metaplasia intestinale dello stomaco, CDX2 e Reg IV espressione sono ben correlati, linee di cellule GC stabilite dal tipo GC diffusa o carcinoma a cellule anello con sigillo può non essere adatto per l'analisi di Reg IV induzione CDX2. Infatti, espressione Reg IV può essere indotta da CDX2 in linee cellulari derivate da cancro al colon nel presente studio. Inoltre, abbiamo dimostrato che i livelli di H3K27me3 sul REG4
regione del promotore sono stati elevati nelle linee di cellule MKN-1 e MKN-28 GC. Queste 2 linee cellulari mancava espressione rilevabile di è stato trovato REG4
anche se l'espressione della proteina CDX2. Pertanto, i livelli di H3K27me3 sul REG4
regione del promotore possono essere ad alto contenuto di MKN-7, TMK-1, le cellule HSC-44PE e KATO-III, in cui la sovraespressione di CDX2 non sono riusciti ad attivare l'espressione Reg IV.

e 'stato riportato che em <> REG4
espressione di mRNA è stato arricchito da una stimolazione con TGF-α, EGF, HGF, o bFGF attraverso l'attivazione della proteina chinasi mitogeno-attivata (MAPK) [22] . Così, si può ipotizzare che Reg IV è anche regolata da fattori trascrizionali valle di MAPK. Abbiamo eseguito in silico
analisi del REG4
gene regione 5'-flanking, e si trovano almeno un presuntivi AP-1 sequenze consenso (a -883 paia di basi di REG4
gene regione), che è un fattore di trascrizione valle di segnalazione MAPK 5'-flanking. Nel presente studio, HSC-39 cellule hanno mostrato simile attività trascrizionale di costrutti genici giornalista contenenti 1.2 kb e 0,6 kb di REG4
5'-fiancheggiante sequenza. Dato che l'effetto di EGF o TGF-α su REG4
trascrizione non è stato indagato in questo studio, sono necessarie ulteriori indagini per chiarire i meccanismi di segnalazione che inducono regolazione del REG4
trascrizione.

In conclusione, i nostri dati attuali mostrano che la proteina CDX2 regola direttamente l'espressione Reg IV. Reg IV attiva il percorso di segnalazione EGFR /Akt /AP-1. Come intestinale fenotipo GC esprime frequentemente EGFR [36], si suggerisce che questo percorso Reg IV-attivato svolge un ruolo importante in questo sottotipo di GC. Perché CDX2 induce anche l'espressione del gene di resistenza ai farmaci, ABCB1
, terapia anti-EGFR, ma non la chemioterapia può essere di beneficio per i pazienti con intestinale GC fenotipo.

Materiali e Metodi

I plasmidi

il CDX2 cDNA è stato inserito nel sito di clonazione multiplo della espressione vettore retrovirale PPG-CMV-Cite-neo, come descritto in precedenza [24]. Il full-length, wild-type CDX2 cDNA è stato anche subclonato nel vettore retrovirale pBabe-Puro ER come descritto in precedenza per generare pCDX2-ER [24]. Il vettore pCDX2-ER codifica una proteina chimerica in cui sequenze CDX2 integrali sono fusi a monte di un ER ligand-legame dominio mutato. La ER ligand-legame dominio mutato non si lega estrogeni, ma mantiene la capacità di legare tamoxifene. sequenze di DNA genomico da regione 5'-flanking del umana REG4
gene sono stati amplificati mediante PCR utilizzando DNA genomico purificato da HSC-39 cellule come un modello e subclonato nel [luc2] vettore pGL4.10 (Promega , Madison, WI). approcci basati sulla PCR sono stati utilizzati per introdurre mutazioni nei presunti siti CDX2 vincolante nel costrutto pGL4.10-REG4 gene reporter utilizzando QuikChange mutagenesi sito-diretta kit (Stratagene, La Jolla, CA). Quattro siti CDX2 legame putativi sono stati cambiati. Tutti i frammenti generati mediante PCR sono stati verificati mediante sequenziamento automatico. Il plasmide pGL4.74 [hRluc /TK] vettore (Promega) è stato utilizzato come controllo per l'efficienza trasfezione in saggi Reporter.

linee cellulari, Retrovirus Infezioni, and Drug trattamento

Il amphotropic Phoenix linea cellulare di confezionamento è stata fornita da G. Nolan (Stanford University, Stanford, CA) [37]. Nove linee cellulari derivate da GC umano e 2 linee cellulari derivate da cancro del colon umano sono stati utilizzati. La linea cellulare TMK-1 è stato istituito nel nostro laboratorio [38]. Le linee di cellule HSC-39 e HSC-44PE sono stati stabiliti da uno degli autori (Kazuyoshi Yanagihara) [39], [40]. Cinque linee cellulari GC della serie MKN sono stati gentilmente forniti dal Dr. Toshimitsu Suzuki [41], [42]. La linea cellulare KATO-III è stato gentilmente fornito dal Dr. Morimasa Sekiguchi [43]. Le linee di cellule di cancro al colon HT-29 e SW480 sono stati ottenuti dalla American Type Culture Collection. Le cellule sono state conservate in azoto liquido sino all'inizio di questo studio. Dopo lo scongelamento a magazzino congelato, le cellule sono state mantenute a passaggio basso durante lo studio. morfologia cellulare Coerentemente è stato monitorato per confronto di immagini microscopiche. Le cellule di packaging Phoenix sono state trasfettate con costrutti retrovirali di espressione (PPG-CDX2, PPG-neo, e pCDX2-ER) e il surnatante contenente nonreplicating virus amphotropic è stato raccolto come descritto in precedenza [24]. In HT-29 cellule che esprimono la proteina di fusione CDX2-ER (HT-29 /CDX2-ER), funzione CDX2 è stato attivato mediante aggiunta di 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) (Sigma Chemical, St. Louis, MO) alla crescita mezzo ad una concentrazione finale di 500 nmol. Per verificare se la metilazione del DNA indotta inattivazione trascrizionale di Reg IV, le cellule sono state trattate con una concentrazione finale di 1 mM Aza-dC (Sigma Chemical) per 5 giorni prima di essere state raccolte per l'estrazione di RNA.

Analisi Western Blot

Per l'analisi Western blot, le cellule sono state lisate come precedentemente descritto [44]. Le concentrazioni di proteine ​​sono state determinate mediante Metodo di Bradford (BioRad, Richmond, CA) con BSA utilizzata come standard. I lisati (20 ug) sono stati solubilizzati in tampone di Laemmli mediante ebollizione e poi sottoposte al 12% elettroforesi su gel di SDS-poliacrilammide seguita da elettro-trasferimento su un filtro di nitrocellulosa. Il filtro è stato incubato per 1 ora a temperatura ambiente con un anticorpo anti-Reg IV (anticorpo policlonale di coniglio sviluppato nel nostro laboratorio, Rif. 10) o anticorpo anti-CDX2 (BioGenex, San Ramon, CA). Perossidasi-coniugato anti-coniglio o anti-topo IgG è stato utilizzato nella reazione secondaria. Immunocomplessi sono stati visualizzati con un vantaggio Western Blot Detection System ECL (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). β-actina (Sigma Chemical) è stato anche rilevato come un controllo di carico.

qRT-PCR Analisi

L'RNA totale è stato estratto con un RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA), e 1 mg di RNA totale è stato convertito in cDNA con un kit First Strand cDNA Synthesis (Amersham Biosciences). La quantificazione di REG4
livelli di mRNA è stata eseguita dal rilevamento della fluorescenza in tempo reale, come descritto in precedenza [45]. PCR è stata eseguita con un kit di SYBR Green PCR core reagenti (Applied Biosystems, Foster City, CA). la rilevazione in tempo reale della intensità di emissione di SYBR verde legato a doppia elica del DNA è stata eseguita con un ABI PRISM 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems), come descritto in precedenza [46]. ACTB
prodotti di PCR specifico d'sono stati amplificati dagli stessi campioni di RNA e servito come controllo interno. Sequenze di primer per REG4
qRT-PCR sono mostrati nella Tabella 1. qRT-PCR sono stati eseguiti in triplicato per ogni set di campioni di primer, e la media e la deviazione standard (SD) dei tre esperimenti è stato calcolato come la valore di quantificazione relativa. Alla fine di 40 cicli di PCR, i prodotti di reazione sono stati separati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide 8% non denaturante per la conferma visiva dei prodotti di PCR.

RNAi

per abbattere il CDX2 endogena, RNAi stata eseguita . Due duplex siRNA di targeting CDX2 (5'-AACCAGGACGAAAGACAAAUA-3 ', CDX2 siRNA1 e 5'-AAGCCUCAGUGUCUGGCUCUG-3', CDX2 siRNA2) e un siRNA duplex nonsilencing (5'-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3 ') sono stati sintetizzati (Qiagen). Trasfezione è stata effettuata utilizzando Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) secondo il protocollo del produttore. Brevemente, 60 pmol di siRNA e 10 ml di Lipofectamine RNAiMAX sono stati mescolati in 1 ml di terreno RPMI (10 nmol /L concentrazione siRNA finale). Dopo 20 min di incubazione, la miscela è stata aggiunta alle cellule e questi sono stati placcati su piatti per ciascun saggio. Tre giorni dopo la transfezione, le cellule sono state analizzate per tutti gli esperimenti.

gene reporter saggi

HSC-39 e MKN-1 le cellule sono state seminate in 6 pozzetti (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ ). Trasfezione di cellule al 50% -80% di confluenza è stata effettuata con 3 ml di FuGENE6 Transfection Reagent (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), 0,8 mg di pGL4.10 costrutti genici giornalista, e 0,2 mg pGL4.74 [hRluc /TK] vettore (Promega). A 48 ore dopo la trasfezione, le cellule sono state raccolte e risospese in tampone di lisi passiva (Promega). l'attività luciferasi è stata determinata con un sistema di analisi a doppia luciferasi (Glomax 96 Microplate luminometro, Promega).

Chip di saggi

I saggi ChIP sono stati effettuati utilizzando il Immunoprecipitazione della cromatina Kit EZ-Chip (Millipore, Billerica , MA) secondo le istruzioni di fabbricazione. Per analizzare se CDX2 si lega direttamente ai siti putativi CDX2 vincolante nella regione REG4
5'-flanking, abbiamo effettuato analisi ChIP utilizzando HSC-39 cellule. In breve, HSC-39 cellule (1-2 × 10 ^{7) erano reticolato con 1% di formaldeide in tampone fosfato salino (PBS) per 15 minuti a 37 ° C, e glicina è stato aggiunto a spegnere aldeidi reattive. Dopo aver lavato le cellule con PBS freddo, le cellule sono state risospese in SDS Lysis Buffer (1% SDS, 10 mM EDTA e 50 mM Tris pH 8.1) con proteinasi Inhibitor (Roche Diagnostics). Dopo i campioni sono stati sonicato, estratti cromatina contenenti frammenti di DNA (dimensione media, 500 coppie di basi) sono stati immunoprecipitati con 2 mg anticorpo monoclonale anti-CDX2 (Biogenex) o 2 mg IgG mouse (Millipore). Ogni campione di DNA immunoprecipitato è stata quantificata da qPCR utilizzando primer elencati nella tabella 1. Come controllo negativo, un circa 200 coppie di basi frammento di DNA da esone 3 del CDX1
gene è stato amplificato mediante PCR utilizzando primer specifici (Tabella 1 ).}

Per determinare l'arricchimento H3K27me3 sul REG4
promotrice nelle linee di cellule GC, saggi ChIP sono stati eseguiti utilizzando MKN-1, MKN-28, e linee cellulari HSC-39. In breve, cellule di GC (1-2 × 10 ^{7) erano reticolato con 1% di formaldeide in PBS per 15 minuti a 37 ° C, e glicina è stato aggiunto a spegnere aldeidi reattive. Dopo aver lavato le cellule con PBS freddo, le cellule sono state risospese in SDS tampone di lisi con proteinasi Inhibitor (Roche Diagnostics). Dopo i campioni sono stati sonicato, estratti cromatina contenenti frammenti di DNA (dimensione media, 500 paia di basi) sono stati immunoprecipitati con 2 mg policlonale H3K27me3 anti-anticorpi (Abcam, Cambridge, MA) o 2 mg di coniglio IgG (Millipore). Ogni campione di DNA immunoprecipitato è stata quantificata da qPCR utilizzando REG4
Primer 1 (Tabella 1).}

qPCRs sono stati eseguiti in triplicato per ogni set di campioni di primer, e la media e la deviazione standard (SD) di i tre esperimenti è stato calcolato come il valore relativo di quantificazione. Al termine di 40 cicli di PCR, prodotti di reazione sono stati separati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide 8% non denaturanti per la conferma visiva dei prodotti di PCR.

Riconoscimenti

Si ringrazia il sig Shinichi Norimura per un'eccellente assistenza tecnica e consigli. Questo lavoro è stato realizzato con la gentile collaborazione del Centro di Ricerca di Medicina Molecolare, Facoltà di Medicina, Università di Hiroshima. Ringraziamo il centro di analisi di Life Science, Università di Hiroshima, per l'uso delle loro strutture.

• PLoS ONE: RhoC Regola la proliferazione delle cellule cancro gastrico attraverso l'interazione con IQGAP1
• PLoS ONE: Espressione differenziale della fosfolipasi C Epsilon 1 è associato con cronica gastrite atrofica e gastrico Cancer