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PLoS Genetics: oncogenici Pathway Combinazioni predire la prognosi clinica in cancro gastrico

Astratto

Molti tumori solidi sono noti per mostrare un elevato grado di eterogeneità nella loro deregolamentazione dei diversi percorsi oncogenici. Abbiamo cercato di individuare le principali vie oncogeno nel cancro gastrico (GC) con relazioni significative per la sopravvivenza del paziente. Uso di firme di espressione genica, abbiamo ideato un in silico strategia
per mappare i modelli di attivazione della via oncogenica in 301 tumori gastrici primarie, la seconda causa di mortalità per cancro globale. Abbiamo identificato tre percorsi oncogenici (/Stem Cell proliferazione, NF-kB, e Wnt /β-catenina) deregolamentato nella maggioranza (> 70%) dei tumori gastrici. Abbiamo funzionalmente convalidato queste previsioni percorso in un pannello di linee di cellule di cancro gastrico. stratificazione dei pazienti con combinazioni pathway oncogenici ha mostrato differenze di sopravvivenza riproducibili e significativi in ​​più coorti, il che suggerisce che le interazioni pathway possono svolgere un ruolo importante nell'influenzare il comportamento della malattia. GC individuali possono essere taxonomized con successo da attività oncogenica percorso in biologicamente e clinicamente rilevanti sottogruppi. Predire l'attività percorso attraverso le firme di espressione consente quindi lo studio di molteplici percorsi correlati al cancro che interagiscono simultaneamente in tumori primari, ad una scala non sono attualmente ottenibili con altre piattaforme.

Autore Sommario

cancro gastrico è il seconda causa di mortalità per cancro globale. Con i trattamenti attuali, meno di un quarto dei pazienti sopravvive più di cinque anni dopo l'intervento chirurgico. I singoli tumori gastrici sono altamente disparate nelle loro caratteristiche cellulari e le risposte ai farmaci chemioterapici standard rendendo cancro gastrico una malattia complessa. approcci Pathway base, piuttosto che studi singolo gene, possono aiutare a svelare questa complessità. Qui, ci avvaliamo di un approccio computazionale per identificare collegamenti tra percorsi molecolari e profili di cancro. In uno studio su larga scala di più di 300 pazienti, abbiamo identificato i sottogruppi di tumori gastrici distinguibili dai loro modelli di guidare percorsi molecolari. Abbiamo dimostrato che questi sottogruppi individuati sono clinicamente rilevanti nel predire la durata della sopravvivenza e possono rivelarsi utili nel guidare la scelta delle terapie mirate per interferire con queste vie molecolari. Abbiamo anche individuato specifiche linee di cellule di cancro gastrico mirroring questi sottogruppi percorso, che dovrebbe facilitare la valutazione pre-clinica delle risposte alle terapie mirate in ogni sottogruppo

Visto:. Ooi CH, Ivanova T, Wu J, Lee M, Tan IB, Tao J, et al. (2009) oncogenici Pathway Combinazioni predire la prognosi clinica in cancro gastrico. PLoS Genet 5 (10): e1000676. doi: 10.1371 /journal.pgen.1000676

Editor: Jason G. Mezey, Cornell University, Stati Uniti d'America

Ricevuto: 22 aprile 2009; Accettato: 3 settembre 2009; Pubblicato: 2 ottobre 2009

Copyright: © 2009 Ooi et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a PT da BMRC 05/1/31/19/423, Singapore Cancer Syndicate SCS-BS0001, NMRC concedere TCR /001/2007, e un nucleo borsa di Duke-NUS. I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

cancro gastrico (GC) è la seconda causa di mortalità per cancro globale [1]. Particolarmente diffuso in Asia, la maggior parte dei pazienti GC sono diagnosticati con malattia in stadio avanzato [2]. La deregolamentazione dei percorsi canonici oncogenici, come E2F, K-RAS, p53 e Wnt segnalazione /β-catenina sono notoriamente presenti con diversi frequenze in GC [3] - [6], indicando che GC è una malattia eterogenea molecolarmente. Studi precedenti descrivono diversità GC nei tumori primari sono tipicamente concentrati sulle vie singoli, solo una misura o qualche biomarker per esperimento [4], [6], [7]. Al contrario, evidenze sperimentali indicano che la maggior parte dei fenotipi tumorali (crescita incontrollata, resistenza all'apoptosi, ecc) sono in gran parte governati non solo da percorsi singoli, ma complesse interazioni tra pro multipla e circuiti di segnalazione anti-oncogeni [8]. Restringendo questo divario tra le arene cliniche e sperimentali richiederanno strategie in grado di misurare e relativi modelli di attività di molteplici percorsi oncogeni contemporaneamente in tumori primari.

Gli studi precedenti hanno proposto di utilizzare le firme di espressione genica per predire l'attività delle vie oncogeni in tumori [9] - qui, abbiamo ipotizzato che i modelli di attivazione della via oncogenica potrebbero essere utilizzati per sviluppare una tassonomia genomica di GC. È importante sottolineare che questa strategia di percorso-centric si differenzia sostanzialmente da studi di microarray precedenti che descrivono i cambiamenti di espressione associati con differenze tipo morfologico e del tessuto in GC [10], [11], come le firme pathway (piuttosto che i singoli geni) sono utilizzati come base per la classificazione il cancro . Abbiamo sviluppato un in silico
metodo per mappare i livelli di attivazione di percorsi diversi in coorti di profili tumore primario complessi e convalidato questo approccio di classificazione percorso diretto utilizzando esempi proof-of-concept di cancro al seno. Abbiamo quindi applicato questo metodo per GC per valutare i percorsi oncogeni undici precedentemente implicati nella carcinogenesi gastrica [3] - [7], [12] - [17]. In totale, sono stati analizzati più di 300 CV primarie derivate da tre coorti di pazienti indipendenti, eseguendo al meglio delle nostre conoscenze il più grande analisi genomica di GC ad oggi. Abbiamo identificato tre percorsi oncogeni (fattore-kB nucleare (NF-kB), Wnt /β-catenina, e la proliferazione /cellule staminali) che sono stati deregolamentati nella stragrande maggioranza (> 70%) di GC, e funzionalmente convalidato le previsioni pathway in vitro
utilizzando un pannello di linee cellulari GC. Anche se la stratificazione dei pazienti a livello di percorsi individuali non è riuscito a dimostrare costantemente differenze significative nei risultati clinici, stratificazione dei pazienti di combinazioni pathway oncogenici (ad esempio alto di proliferazione /alta NF-kB vs. basso proliferazione /basso NF-kB) ha mostrato differenze di sopravvivenza riproducibili e significativi in più coorti di pazienti indipendenti, suggerendo un ruolo critico per le combinazioni pathway nell'influenzare il comportamento clinico GC. I nostri risultati dimostrano quindi che GC possono essere taxonomized con successo utilizzando l'attività oncogenica percorso in vista biologico, funzionale, e clinicamente rilevanti sottotipi.

Risultati

Previsione Pathway attivazione in Cancer Gene Expression Profiles

La nostra strategia per prevedere i livelli di attivazione della via oncogenica nei tumori prevede quattro fasi (Figura 1A). In primo luogo, abbiamo definito 'firme' pathway - set di geni che presentano espressione alterata dopo la perturbazione funzionale di un percorso specifico in un vitro
o in vivo
sistema ben definito nel sperimentale. In secondo luogo, abbiamo mappato le firme pathway sui profili di espressione genica da una serie eterogenea di tumori. In terzo luogo, utilizzando una procedura pattern matching rango-based non parametrico, i punteggi di attivazione sono stati assegnati ai singoli tipi di cancro basati sulla forza di associazione alla firma percorso. Infine, i singoli tipi di cancro sono stati ordinati in base alla loro punteggi attivazione della via.

Prima di applicare questo approccio per GC, abbiamo ritenuto importante convalidare questa in silico
strategia in una serie di proof-of esperimenti -principle. Abbiamo scelto l'esempio del cancro al seno, un tumore maligno per il quale vi è ampia evidenza di percorso eterogeneità e 'sottotipi molecolari' discreti [18]. Per eseguire questa convalida, in primo luogo abbiamo chiesto se le firme pathway descritte precedentemente associati con segnalazione degli estrogeni compromessa potrebbero essere utilizzati per identificare le linee di cellule di cancro al seno che presentano alti livelli di recettori per gli estrogeni (ER) l'attività. Abbiamo analizzato un pannello di espressione genica di linee di cellule di cancro al seno 51 originariamente descritti in Neve at al. [18] con un 11-gene 'tamoxifene sensibilità' firma percorso derivato da una lista di geni differenzialmente espressi tra MACA 3366, un mammarie umane di carcinoma xenotrapianto tamoxifene sensibili, e Maca 3366 /TAM, una linea d'azione tamoxifene-resistenti dello stesso xenotrapianto [19]. Abbiamo scoperto che le linee di cellule di cancro al seno positivamente associati con la firma sensibilità tamoxifene esposto significativamente più alti livelli di espressione di ESR1
, il recettore degli estrogeni e bersaglio molecolare di tamoxifene, rispetto alle linee che mostrano punteggi attivazione della via negativi (p = 2.12 × 10 -7, Accuratezza 84,3%, 100% di sensibilità, specificità 75%) (Figura 1B e S1).

In secondo luogo, abbiamo testato se una firma percorso associato con gli estrogeni segnalazione, ma derivata dalla mancata tessuto mammario potrebbe anche essere utilizzato per stratificare stesso pannello di linee cellulari di cancro al seno. Abbiamo chiesto il pannello linea di cellule di cancro al seno con un 41-gene 'estrogeno risposta' firma derivato da una lista di geni upregulated da estradiolo nelle cellule di osteosarcoma umano U2OS [20]. Nonostante la firma proveniente da un diverso tipo di tessuto (ad es osteosarcoma), abbiamo trovato ancora una volta che, quando ordinate in base alla loro predetto estrogeni reattività, linee di cellule di cancro al seno raggruppati insieme dal loro livello di ESR1
(recettore degli estrogeni) espressione (p = 0,0035, Accuratezza 62,7%, 94,7% Sensibilità, Specificità 43,8%) (Figura 1C e Tabella S1). Questi risultati dimostrano che è davvero fattibile per prevedere i modelli di attivazione della via in un particolare tipo di cancro di interesse (cancro gastrico nei nostri casi) con le firme di espressione ottenuti da differenti condizioni sperimentali e tipi di tessuto anche diversi.

Modelli di oncogenici attivazione della via in GC

Dopo la convalida questo approccio previsione sentiero, si è proceduto ad applicare la strategia di GC primaria. Piuttosto che testare ogni possibile percorso, abbiamo selezionato undici percorsi soppressori oncogenici e tumorali precedentemente implicati nella carcinogenesi gastrica, usando nei nostri RAS di analisi [4], p53 [5], BRCA1 [12], p21 [13], Wnt /β-catenina [6], [3] E2F, SRC [14], MYC [15], NF-kB [21], istone deacetilazione (HDAC) [16], e di cellule staminali firme relative [17]. Quando possibile, abbiamo cercato di selezionare più firme per ciascun percorso, preferibilmente da studi pubblicati indipendenti. Ad esempio, le due firme attivazione E2F utilizzati nel nostro approccio, una firma è stata ottenuta inducendo attività E2F1 in cellule di ratto fibroblasti [22], mentre l'altra firma è stata ottenuta utilizzando una linea cellulare di osteosarcoma derivato contenente una proteina di fusione ER-E2F1 inducibile [23]. previsioni via finale per ulteriori analisi sono stati in genere ottenuti dalla combinazione di firme singoli appartenenti ad uno stesso percorso (vedi Materiali e Metodi).

Abbiamo calcolato i punteggi di attivazione per le vie undici rappresentati da 20 firme pathway in tre coorti indipendenti di primaria GC derivato da Australia (Cohort 1-70 tumori), Singapore (Cohort 2-200 tumori), e il Regno Unito (coorte 3-31 tumori). Per visualizzare i modelli di attivazione della via, abbiamo rappresentato ciascuna coorte come heatmap, dove il colore heatmap rappresenta la forza prevista di attivazione per ciascun percorso nell'individuo GC. Abbiamo osservato una notevole eterogeneità di attivazione della via tra i singoli pazienti GC (Figura 2A-2C). Tuttavia, le firme derivate da studi indipendenti che rappresentano percorsi simili hanno prodotto spesso modelli di previsione simili (ad esempio, NF-kB (pelle) e NF-kB (cervice)), e un test chi-quadro hanno confermato un livello significativo di somiglianza nei modelli complessivi di percorso attivazione tra le coorti Australia e Singapore (p = 0,00038), e tra le coorti Australia e Regno Unito (p = 0,00,051 mila, vedi Tabella S2) suggerendo che le previsioni GC pathway non sono legati ad una specifica coorte di pazienti. Abbiamo identificato due principali gruppi di percorsi di co-attivazione, che sono stati completamente conservati in coorti 1 e 2 (Figura 2A e 2B) e in gran parte conservati nella coorte 3 (Figura 2C). Tra questi (i) una 'proliferazione /cellule staminali' grappolo percorso (barra verticale marrone in figura 2) che comprende percorsi associati a vari regolatori del ciclo cellulare (ad es MYC, E2F, p21) e stelo firme di cellule; e (ii) una 'segnalazione oncogenico' grappolo percorso (barra verticale grigia nella figura 2) contenente molte vie oncogeniche differenti (BRCA1, NF-kB, p53, Wnt /β-catenina, percorsi SRC, RAS, e HDAC).

in vitro
convalida di pathway previsioni

analizzando la mappa termica GC percorso in figura 2, abbiamo selezionato tre percorsi oncogeni (NF-kB, Wnt /β-catenina, e la proliferazione /cellule staminali) che sono stati attivati ​​individualmente in una percentuale significativa di GC (≥35%), e in combinazione ha fornito la copertura della maggioranza (> 70%) del GC. /staminali percorsi proliferazione cellulare sono stati attivati ​​nel 40% dei GC in ogni coorte (range: 38-43%), percorsi di Wnt /β-catenina sono stati attivati ​​nel 46% dei GC (range: da 43 a 48%), e la NF kB percorso è stato attivato nel 39% dei GC (range: da 35 a 41%) (barre di colore sotto ogni heatmap in figura 2). Queste frequenze e altri percorsi spesso non regolamentati (ad esempio P53) sono elencati nella tabella S3.

Per convalidare sperimentalmente queste previsioni GC primaria pathway, abbiamo applicato l'algoritmo di predizione via ad un pannello di linee cellulari 25 GC (GCCLs) ( Figura 3). Simile a GC primaria, 'la proliferazione /cellule staminali' e cluster pathway di segnalazione 'oncogeni' sono stati osservati anche nei GCCLs. Inoltre, le firme che rappresentano la stessa via, ma ottenuti da diversi studi, come ad esempio le due firme MYC-derivato indipendenti [9], [24] cluster anche insieme nelle linee di cellule GC dopo senza supervisione di clustering gerarchico (parentesi viola in figura 3). Guidati dalle previsioni pathway, abbiamo identificato le linee cellulari GC specifici che presentano modelli di attività via oncogenica mirroring GC primaria. La fiducia nella selezione di linee cellulari specifici come in vitro
modelli è stato raggiunto anche ripetendo la procedura di previsione sette volte utilizzando una varietà di profili di riferimento, che vanno dal profilo GCCL mediano di profili indipendenti come non-maligne normale profili di stomaco (vedi Materiali e Metodi e Tabella S4). confronti a coppie hanno confermato che due profili di riferimento sono stati più probabilità di produrre consentendo previsioni pathway di previsioni contrastanti (Testo S1 e Tabella S4). Alcuni esempi di linee rappresentativi includono AZ521 e MKN28 cellule, che mostra l'attivazione della proliferazione /stelo percorsi di cellule, le cellule YCC3 e AGS per le vie Wnt /β-catenina, e MKN1 e le cellule SNU5 per la via NF-kB.

in primo luogo, abbiamo misurato direttamente i tassi proliferativi di 22 GCCLs e correlato i dati tasso di proliferazione con il punteggio di attivazione media dal firme nella proliferazione /staminali gruppo pathway cellulare. C'è stata una significativa associazione tra i tassi proliferativi sperimentalmente determinati ei punteggi attivazione della via (R = 0,4688, p = 0,0278) (Figura 4A). Sostenere l'idea che le firme pathway oncogenici sono predittori superiori di attività percorso rispetto alla espressione dei singoli geni pathway chiave, associazioni significative sono state osservate sia per MYC o espressione di E2F1 (p = 0,48 e 0,38 per MYC e E2F1, rispettivamente) (Figura S1 ).

in secondo luogo, al fine di convalidare le previsioni Wnt /β-catenina, abbiamo analizzato l'espressione di vari componenti del pathway Wnt (β-catenina, TCF4) e relativi livelli di TCF /LEF trascrizionale attività in GC linee cellulari previsto per essere Wnt /β-catenin- attivato o Wnt /β-catenina-non attivato. Di sette linee cellulari selezionate per la loro trattabilità sperimentale (ad esempio la facilità di trasfezione e condizioni di crescita convenienti), abbiamo scoperto che entrambi β-catenina e il fattore di trascrizione TCF /LEF TCF4 (noto anche come TCF7L2), i principali componenti della via di segnalazione Wnt, sono stati espressi in linee cellulari GC previsti dalla attivazione della via analisi per avere alta attività /β-catenina Wnt (AGS, YCC3, Kato III, e NCI-N87), ma non è espresso in due su tre linee (SNU1 e SNU5) associati con punteggi incoerenti o bassi di attivazione Wnt /beta-catenina (Figura 4B). Inoltre, al fine di saggiare direttamente l'attività pathway Wnt, abbiamo determinato TCF /LEF trascrizionale attività nelle linee di cellule GC utilizzando Topflash, un luciferasi esprimendo plasmide contenente multimerized siti di legame TCF. Il saggio Topflash confermato alta TCF /LEF trascrizionale attività in tre su quattro linee di cellule GC prevede di avere una elevata attività Wnt /β-catenina (AGS, YCC3, e Kato III), ma minima o nessuna attività Topflash in linee cellulari GC associata a /β-catenina punteggi attivazione incoerenti o basse Wnt (SNU1, SNU5, e SNU16). Inoltre, i punteggi di attivazione β-catenina erano significativamente più alti in GCCLs con più di due volte TCF /LEF trascrizionale attività (AGS, YCC3, Kato III, e NCI-N87) rispetto a GCCLs con minore TCF /LEF trascrizionale attività (p = 0,007, Figura 4B). Quando confrontato con singoli geni, associazioni superiori a TCF /LEF trascrizionale attività sono stati ancora una volta osservò con il punteggio di attivazione media da Wnt firme /β-catenina, rispetto a uno β-catenina o TCF4 (aka TCF7L2) espressione da solo (p = 0.038 per le firme vs p = 0.31 e 0.58 per la β-catenina e TCF4, rispettivamente) (Figura S1).

in terzo luogo, per convalidare le previsioni pathway NF-kB, abbiamo selezionato 11 GCCLs costantemente predetto sia come NF-κB- attivato ( 'NF-kB /on', sei GCCLs) o di NF-kB-non attivato ( 'NF-kB /off', cinque GCCLs) (Figura S2). l'espressione genica L'aumento di p50 e p65, le subunità eterodimero NF-kB, sono stati osservati in NF-kB /su linee cellulari GC rispetto alla NF-kB /off linee cellulari GC (p = 0.0002 per p50, p = 0.046 per la p65, Figura 4C) e l'espressione della proteina p65 livello è stata osservata prevalentemente nel NF-kB /sulle linee (Figura 4C). Utilizzando immunocitochimica su fissati in formalina paraffina linee cellulari GC, espressione della proteina p65 è stata più frequentemente osservata in NF-kB /su linee cellulari GC rispetto a NF-kB /off linee di cellule GC in termini di sublocalization nucleari, le percentuali di cellule con colorazione (sia intensità nucleare o citoplasmatica), e la colorazione (Tabella S5, Figura S3). Per determinare se NF-kB /su linee cellulari GC anche esposte espressione differenziale dei geni p65-regolate rispetto a /off linee di cellule GC NF-kB, abbiamo unito l'elenco dei geni direttamente legati per il fattore p65 la trascrizione [25] con gli elenchi dei geni regolati a livello di mRNA dal TNF-α [26], un induttore noto di attivazione di NF-kB. Utilizzando Gene Set Analysis arricchimento (dell'ECGS, [27]), abbiamo scoperto che i geni bersaglio p65 upregulated dal trattamento TNF-α erano significativamente sovraespresso in NF-kB /su linee cellulari GC rispetto a /off linee di cellule GC NF-kB (arricchimento normalizzata punteggio, NES = 1.86; false discovery rate, FDR < 0,001, in basso la maggior parte del pannello, figura 4C). Al contrario, i geni bersaglio p65 ha diminuito l'dal TNF-α erano significativamente underexpressed in NF-kB /su linee cellulari GC rispetto a /off linee di cellule GC NF-kB (NES = -1.56, FDR = 0,019, in basso la maggior parte del pannello, figura 4C). Infine, per confermare direttamente la presenza di elevata attività di NF-kB, abbiamo trasfettato tre NF-kB /su linee cellulari GC e /off linee cellulari GC due NF-kB con un reporter luciferasi contenente un gene reporter NF-kB. Come mostrato in figura 4D, i tre NF-kB /su linee cellulari GC esposto elevata attività trascrizionale NF-kB rispetto alle /off linee cellulari GC due NF-kB (p = 0,0084).

prese collettivamente, questi risultati supportano il concetto che in silico
previsioni pathway utilizzando i profili di espressione genica sono associati con l'attivazione della via in questione in vitro
.

Combinazioni pathway predicono cancro gastrico sopravvivenza del paziente

per valutare la rilevanza clinica dei sottogruppi pathway individuate, abbiamo indagato se i modelli di co-attivazione della via come illustrato nelle mappe termiche delle diverse coorti potrebbe essere correlato alla sopravvivenza del paziente. Abbiamo utilizzato dati di sopravvivenza globale di coorte 1 e Coorte 2 ed i pazienti stratificati per i loro modelli previsti di attivazione della via. Un profilo GC primario era definito come mostrando alto livello di attivazione di un percorso quando il punteggio di attivazione era sopra lo zero - cioè di essere positivamente associato con la firma percorso. Gruppi di pazienti stratificati per uno proliferazione /staminali attivazione della via cellulare segnare da solo o il punteggio di attivazione della via di NF-kB da solo non hanno mostrato differenze significative per quanto riguarda la loro sopravvivenza globale (p > 0,05 per la proliferazione /cellule staminali e NF-kB in entrambe le coorti, Figura 5A e 5B). Tuttavia, quando i punteggi attivazione della via sono stati combinati, i pazienti con livelli elevati di attivazione sia di NF-kB e la proliferazione /stelo percorsi di cellule era significativamente più breve sopravvivenza rispetto ai pazienti con bassi livelli di attivazione di entrambi NF-kB e la proliferazione /stelo percorsi cellulari (p = 0,0399 ep = 0,0109 per le coorti 1 e 2, rispettivamente, Figura 5D).

l'attivazione del pathway /β-catenina Wnt è risultato significativamente associato con la sopravvivenza del paziente a coorte 1, (p = 0,0056, figura 5C) ma non in coorte 2 (p = 0,0693, Figura 5C). Tuttavia, i pazienti in coorti 1 e 2 con livelli elevati di attivazione sia di Wnt /β-catenina e la proliferazione /stelo percorsi cellulari hanno significativamente peggiore sopravvivenza rispetto ai pazienti con livelli di attivazione bassi di entrambi i percorsi (p = 0.0073 ep = 0,0086, Figura 5E ). Per riferimento i contributi delle combinazioni pathway sulla base di criteri istopatologici noti, abbiamo effettuato un'analisi multivariata tra cui le previsioni pathway combinati e stadio tumorale patologico (classificazione TNM: Fasi 1-4), il più importante fattore prognostico nel GC [28]. In entrambe le coorti, l'attivazione combinata della proliferazione /cellule staminali e le vie di NF-kB ha dimostrato di essere un fattore prognostico indipendente dallo stadio del tumore (p = 0,003 e 0,048 per le coorti 1 e 2, rispettivamente) (Tabella S6). Allo stesso modo, l'attivazione combinata di proliferazione /stelo percorsi cellulari e Wnt /β-catenina è stato un fattore prognostico indipendente nel coorte 1 e ha raggiunto significatività borderline nella coorte 2 (p < 0,001 ep = 0,058, Tabella S7). Questi risultati dimostrano che la valutazione dello stato di attivazione della via combinato è clinicamente rilevante e per di più in grado di fornire informazioni prognostiche aggiuntive oltre il gold standard attuale del paziente previsione prognosi, la TNM basato tumore messa in scena.

Discussione

In questo studio, abbiamo cercato di suddividere GC in sottogruppi omogenei molecolarmente, come primo passo per individualizzare i trattamenti dei pazienti e migliorare i risultati. È importante sottolineare che, a differenza dei precedenti studi GC microarray relativi modelli di espressione genica di Istologia o di tipo anatomico [10], [11], abbiamo scelto di basare le nostre suddivisioni GC sui modelli di attività via oncogenica. Dopo aver sviluppato e la convalida di questo nuovo approccio di classificazione, siamo stati in grado di descrivere, per la prima volta, una tassonomia genomica di GC sulla base di modelli di attività via oncogenica. Il nostro approccio è particolarmente adatta per microarray di espressione genica, poiché queste piattaforme interrogano migliaia di trascritti di mRNA in ciascun campione, permettendo così la valutazione di percorsi multipli simultaneamente in un singolo esperimento. Al contrario, un tale approccio non è attualmente possibile a livello proteico per mancanza di piattaforme appropriate. Usando questa strategia, abbiamo identificato tre percorsi dominanti mostrano attivazione nella maggioranza (> 70%) di GC: la proliferazione /cellule staminali, Wnt /β-catenina, e segnalazione NF-kB

la capacità di eseguire. come "high-throughput percorso profiling" apre molte strade interessanti. Ad esempio, diversi studi hanno riportato in precedenza risultati inconsistenti per quanto riguarda l'impatto prognostico di differenti vie di oncogeni in GC - le implicazioni prognostiche di antigeni relative alla proliferazione, come Ki-67 in GC non sono saldamente stabiliti [29], e ad alta attivazione di NF-kB in GC è stata associata con il bene e il cattivo risultato GC pazienti in diversi studi [7], [30]. E 'del tutto possibile che alcuni di questa incoerenza potrebbe essere stato dovuto a un focus sulla storica con metodi convenzionali e analizzando sia i percorsi singoli o singoli componenti della via (geni /proteine). La nostra osservazione che le combinazioni pathway sono predittivi di outcome dei pazienti suggerisce che le combinazioni percorso, piuttosto che da soli percorsi singoli, possono svolgere un ruolo fondamentale nell'influenzare il comportamento del tumore.

Un altro vantaggio di high-throughput percorso profiling è la possibilità di definire relazioni di ordine superiore tra percorsi distinti oncogenici. In questo studio, abbiamo costantemente osservato attivazione contemporanea di E2F, MYC, p21 (-repression), e lo stelo percorsi cellulare nei tumori (il '/cellule staminali proliferare' a grappolo percorso). Questo è probabilmente dovuto ad un aumento della proliferazione cellulare nelle cellule tumorali, come E2F è importante nel controllo della proliferazione cellulare e MYC è sia un p21-repressore e induttore di ciclina D2 e ​​ciclina-dipendente legame proteina chinasi CksHs2 [31]. Inoltre, le cellule staminali, in particolare le cellule staminali embrionali (ESC), sono anche noti per esporre alti tassi di proliferazione cellulare [32]. Più intrigante, abbiamo anche osservato associazioni stretti tra apparentemente funzionalmente differenti vie, come ad esempio β-catenina e SRC, così come l'inibizione HDAC e BRCA1. Tali modelli di co-attivazione della via possono suggerire le interazioni funzionali tra queste vie, che meritano di essere studiati ulteriormente. Ad esempio, è possibile che attivato c-SRC possono aumentare l'espressione del pathway Wnt [33]. Esplorando le relazioni tra percorsi che mostrano co-attivazione può quindi fornire informazioni importanti per quanto riguarda la capacità della cellula tumorale di coordinare l'attività dei percorsi multipli.

Un terzo vantaggio dell'approccio percorso profiling è che facilita l'identificazione dei principali percorsi correlati alla malattia. Dei percorsi analizzati in questo studio, la constatazione che la segnalazione NF-kB può essere elevato in una percentuale significativa di GC merita una certa attenzione in quanto questo percorso è stato relativamente meno esplorato in GC. È interessante notare che, mentre è stata osservata una differenza significativa in entrambi p50 e p65 (le subunità NF-kB) l'espressione genica tra /off GCCLs NF-kB /on e NF-kB, non abbiamo osservato l'espressione della proteina differenziale p50 palese in queste righe, in contrasto con p65 (Figura 4C). Ciò può essere dovuto ad una combinazione di tre ragioni. Innanzitutto, il campo assoluto dell'espressione genica p65 attraverso le linee di cellule è nettamente maggiore del campo assoluto dell'espressione genica p50 (> 3 ×, Figura S4). In secondo luogo, il test Western blotting utilizzato per eseguire queste misurazioni proteine ​​è noto per essere altamente non-quantitativa, che può mascherare sottili differenze di espressione. In terzo luogo, al di là di espressione genica, espressione p50 è anche soggetto a una serie di meccanismi di regolazione post-trascrizionali, come scissione precursore che potrebbero influenzare il livello finale di proteine ​​p50, p65 mentre non è generata da una proteina precursore [34]. NF-kB ha dimostrato di essere attivato da H. pylori
[35], un noto agente cancerogeno GC, e aberrante di segnalazione NF-kB è stata anche implicata in diversi tipi di cancro infiammazione-linked, come GC [36]. NF-kB è stato suggerito essere costitutivamente attivato al cancro gastrico primarie in alcuni studi [7]. Mirati NF-kB-inibitori sono attualmente in fase attivamente sviluppati in molti programmi di sviluppo di farmaci antitumorali e un sottogruppo di pazienti GC (cioè quelli con elevata attività di NF-kB) possono rappresentare una sottoclasse adatto per valutare l'efficacia di questi composti.

la in silico
metodo utilizzato in questo studio è concettualmente simile al lavoro di Bild et al, che ha utilizzato un modello di regressione binaria per classificare i tumori in base all'attività prevista di cinque vie oncogeniche [9]. A differenza di regressione binaria, il nostro approccio, che fa uso di una connettività metrica rango-based [37], richiede alcun processo di formazione elaborato su ogni firma percorso e anche non richiede la disponibilità di dati di espressione grezzi, facilitando l'uso dei molti disponibili pubblicamente firme Via nella letteratura [27]. Tuttavia, l'approccio basato espressione genica ha limitazioni. In primo luogo, perché le nostre previsioni pathway si basano sull'espressione genica piuttosto che proteine, tali previsioni sono surrogati certamente molecolari di vera e propria attività di segnalazione percorso. In secondo luogo, ci sono attualmente limitati ad analizzare noto percorsi oncogeni precedentemente identificati in letteratura. In terzo luogo, anche se siamo stati in grado di utilizzare le firme pathway da contesti molto diversi tessuti per prevedere lo stato di attivazione via, un esame degli esempi iniziali proof-of-principio di cancro al seno ha rivelato che l'associazione di stato di ER agli estrogeni risposta come previsto utilizzando la firma osteosarcoma , anche se significativa, era notevolmente più debole rispetto alla sezione stato ER alla sensibilità tamoxifene previsto utilizzando una firma derivato dalla medesima tipo di tessuto (cioè mammario). Questo risultato implica che ci possono anche esistere differenze tessuto-specifiche nelle firme percorso che possono influenzare la precisione di previsione. Quarto, rispetto al nostro studio focalizzato sulle vie di nota rilevanza biologica in GC, non è chiaro se questo metodo può essere applicato a malattie cui una conoscenza preventiva di percorsi coinvolti potrebbe non essere disponibili. Tuttavia, va notato che una ricchezza di firme pathway (> 1000) associato a diverse vie biochimiche e segnalazione già esiste in letteratura, a cui si accede da database pubblici quali MSigDB (http://www.broad.mit .edu /GSEA /msigdb /genesets.jsp? raccolta = CGP). Dato che il nostro approccio può essere applicato a qualsiasi insieme di dati malattia per la quale è disponibile le informazioni espressione genica, test ogni firma in maniera high-throughput per la prova di percorso deregulation è sia concepibile e fattibile. In questi casi, percorso espositivo alte frequenze di deregolamentazione rappresenterebbe quindi percorsi candidati coinvolti nella malattia in questione, che possono poi essere preso di mira per l'indagine mirata e sperimentazione. Affrontare questi problemi costituiranno la base per gran parte della ricerca futura
.

In conclusione, abbiamo dimostrato in questo lavoro che i percorsi firme possono essere utilizzati con successo per prevedere lo stato di attivazione delle vie di segnalazione cellulare, anche in entità biologiche come complesso come GC umana. Un'ovvia applicazione immediata di tali tassonomie pathway-based può riguardare l'uso di terapie mirate. prove iniziali valutare il ruolo delle terapie mirate in GC hanno dimostrato risultati modesti [38]; tuttavia, la maggior parte di questi studi sono stati eseguiti senza pazienti pre-stratificazione utilizzando criteri molecolari o istopatologici.

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