PLoS ONE: HIF-1α Induce la resistenza ai farmaci in cellule cancro gastrico inducendo miR-27a

Estratto

Questo studio ha lo scopo di determinare la correlazione tra HIF-1α e l'espressione di miR-27a e per valutare l'effetto di l'inibizione dell'espressione di HIF-1α sull'espressione miR-27a e la resistenza ai farmaci a cancro gastrico (GC). Nel presente studio, real time-PCR e Western blot sono stati eseguiti per rilevare l'espressione di HIF-1α nei tessuti GC e linee cellulari. Poi, le cellule OCUM-2MD3 /L-lucidi sono state trasfettate con HIF-1α-siRNA, una mimica miR-27a o pcDNA-HIF-1α, e la sopravvivenza delle cellule è stata determinata attraverso il saggio MTT. L'espressione di HIF-1α, miR-27a, e geni MDR-correlate è stata misurata mediante real time-PCR e Western Blot. Chip e dual saggi di attività luciferasi sono stati eseguiti per valutare la regolazione trascrizionale di HIF-1α e miR-27a. I risultati hanno rivelato che trasfezione con HIF-1α-siRNA notevolmente diminuito i livelli di miR-27a, con conseguente notevolmente migliorata l'inibizione del tasso di proliferazione delle cellule OCUM-2MD3 /L-lucidi. Rispetto alle cellule non transfettate, il tasso di sopravvivenza è risultata significativamente ridotta nelle cellule trasfettate con HIF-1α-siRNA dopo il trattamento con L-OHP. Il tasso di sopravvivenza delle cellule è risultato significativamente aumentato nel OCUM-2MD3 /L-OHP cellule trasfettate con la mimica miR-27a, mentre HIF-1α sovraespressione non ha comportato alcuna variazione evidente nella sopravvivenza delle cellule. I risultati del saggio duplice attività luciferasi dimostrato che HIF-1α aumenta l'attività trascrizionale del promotore miR27a in cellule transfettate con un plasmide giornalista contenente la regione del promotore a monte del miR27a insieme con pcDNA-HIF-1α. analisi ChIP ha suggerito che HIF-1α si lega direttamente alla regione del promotore del miR27a. L'inibizione di HIF-1α o l'espressione miR27a diminuito MDR1 /P-gp, LRP, e l'espressione di Bcl-2 nelle cellule L-lucidi OCUM-2MD3 /. Così, abbiamo scoperto che HIF-1α è strettamente associata con la MDR in GC e che HIF-1α può sopprimere MDR1 /P-gp, LRP e l'espressione di Bcl-2 inibendo l'espressione di miR-27a

Visto:. Zhao Q, Y Li, Tan Bb, Fan Lq, Yang Pg, Tian Y (2015) HIF-1α Induce la resistenza ai farmaci in cellule cancro gastrico inducendo Mir-27a. PLoS ONE 10 (8): e0132746. doi: 10.1371 /journal.pone.0132746

Editor: Jin Cheng D., H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Stati Uniti |

Ricevuto: 5 Gennaio 2015; Accettato: 17 Giugno 2015; Pubblicato: 20 Agosto 2015

Copyright: © 2015 Zhao et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

disponibilità dei dati: Tutti i dati rilevanti sono all'interno del suoi file informazioni di supporto carta e

Finanziamento:. Questo lavoro è stato sostenuto dalla seguente concessione:. la Fondazione Provinciale Scienza naturale di provincia di Hebei (n H2013206311 a Qun Zhao)

competere interessi:. gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

cancro gastrico (GC) è tra le neoplasie più comuni, causando gravi danni in tutto il mondo [1, 2] Dopo anni di progressi tecnologici nella diagnosi e nel trattamento di GC, la sua incidenza e la mortalità sono diminuiti in tutto il mondo, ma rimane alta nei paesi asiatici [3, 4]. Attualmente, la resezione gastrica è l'unico metodo disponibile per la cura di GC. Tuttavia, è difficile ottenere una completa guarigione nonostante la rimozione chirurgica del tumore perché la maggior parte dei pazienti affetti da GC advanced momento della diagnosi [5, 6]. Pertanto, la chemioterapia svolge un ruolo estremamente importante nel trattamento completo di GC. Sebbene la chemioterapia notevolmente progredito rispetto al trattamento di GC advanced, [7, 8] la prognosi di GC rimane inadeguata, con un tasso di sopravvivenza a 5 anni inferiore al 30% [9]. Questa prognosi è dovuto principalmente al multidrug resistance (MDR) di cellule GC. MDR in GC spesso porta al fallimento della chemioterapia [10-12]. Pertanto, non vi è un urgente bisogno di sviluppare nuove strategie terapeutiche promettenti per ridurre efficacemente MDR in GC.

carenza di ossigeno è prevalente nei tumori solidi ed è associata con una varietà di funzioni biologiche. Attualmente, il fattore ipossia-inducibile (HIF) -1α è considerato strettamente associata con ipossia. HIF-1α è fortemente espresso in una varietà di tumori maligni [13, 14] e agisce come un fattore essenziale per regolare l'adattamento delle cellule tumorali di ipossia [15]. HIF-1α è stato suggerito di essere strettamente associato con GC MDR [16, 17]. Tuttavia, non è chiaro quale percorso media il ruolo di HIF-1α in GC MDR.

Negli ultimi anni, il ruolo dei microRNA (miRNA) nel cancro è diventato un meccanismo ampiamente indagato di iniziazione del tumore e il trattamento. miR-27a, un membro della famiglia di miRNA, ha mostrato di influenzare la MDR di GC [18]. Inoltre, l'espressione di miR-27a viene aumentata in un ambiente ipossico [19]. Questi risultati suggeriscono che HIF-1α può regolare l'espressione di miR-27a e influenzare GC MDR. Tuttavia, i meccanismi normativi specifici devono ancora essere chiariti. Il presente studio ha mostrato che l'espressione di HIF-1α e miR-27a erano significativamente up-regolata nei tessuti GC e linee cellulari, in particolare in linee cellulari resistenti.

trasfezione con una specifica piccoli RNA interferenti per bloccare HIF endogena -1α ha comportato una riduzione di espressione di miR-27a e l'alleviamento della MDR in linee cellulari GC. Questi nuovi risultati suggeriscono che l'inibizione dell'espressione di HIF-1α sopprime la trascrizione dei geni MDR-legati MDR1 /P-gp, LRP, e Bcl-2 per attenuare MDR di cellule GC per reprimere l'espressione di miR-27a.

Materiali e Metodi

1.1 Materiali

linea di cellule gastriche OCUM-2MD3 era dal professor Masakazu Yashiro in Chirurgia Giappone Oita medica [20]. La linea stabile farmaco-resistente cellule OCUM-2MD3 /L-OHP2 è stata ottenuta tramite coltura e selezione da parte del nostro gruppo di ricerca. La linea cellulare GSE-1 è stato acquistato da Cell Resource Center presso Istituti di Shanghai per Scienze Biologiche dell'Accademia Cinese delle Scienze. RPMI 1640 terreno di coltura e tripsina sono stati acquistati da Gibco Società; Trizol reagente e Lipofectamine 2000 reagente di trasfezione sono stati acquistati da Invitrogen. I kit di trascrizione e di fluorescenza PCR quantitativa reagenti inversa sono stati ottenuti da Promega Corporation. primer PCR e piccoli RNA interferenti sono stati sintetizzati da Shanghai Biological Engineering Company. Il kit di estrazione di proteine ​​è stato ottenuto da Beyotime Company, la Cina. Gli anticorpi primari contro HIF-1α, MDR1 /P-gp, GST-π, LRP, Bcl-2, TS o GAPDH sono stati acquistati da Santa Cruz. MTT è stata ottenuta da Sigma. Il nostro studio è stato approvato dal comitato etico della quarta Ospedale Affiliato di Hebei Medical University.

1.2 preparazione del campione clinico

sono stati selezionati tutti i 65 pazienti con GC dopo resezione gastrica e la conferma patologica nella Quarta Ospedale di Hebei Medical University, di cui 42 maschi e 23 femmine di età compresa tra 60.5 ± 8.1 anni che non avevano ricevuto radioterapia preoperatoria o chemioterapia. Cancro e para-carcinoma tessuti (circa 1,0 cm x 0,5 cm x 0,5 cm) sono state prese da ogni paziente, e gli esemplari sono stati rapidamente congelati in azoto liquido e successivamente trasferiti a -80 ℃ conservazione. Tutti i partecipanti hanno firmato il consenso informato.

1.3 coltura cellulare e trasfezione

Il OCUM-2MD3, OCUM-2MD3 /L-OHP e GSE-1 linee di cellule sono state coltivate in RPMI 1640 medium integrati con siero 10% bovino fetale (FBS), 100U /ml di penicillina e 100 mg /ml di streptomicina. In particolare, il mezzo delle cellule OCUM-2MD3 /L-OHP è stato trattato con L-OHP ad una concentrazione di 75 mcg /mL di mantenere il loro fenotipo farmaco-resistenza, una settimana prima dell'intervento interrompere il trattamento. Le cellule sono state incubate in un umidificata al 5% di CO _{2 atmosfera a 37 ° C}

Tre sequenze di HIF-1α-siRNA sono stati progettati utilizzando BLOCK-iT RNAi Designer (sequenza 1:. GAGGAAACUUCUGGAUGCUGGUGAUtt; sequenza 2: GGAUGCUGGUGAUUUGGAUAUUGAAtt; sequenza 3: CAGGACAGUACAGGAUGCUUGCCAAtt), ciascuno dei quali è stato ricotto con la loro sequenza complementare e trasfettato rispettivamente nelle cellule /L-OHP GC OCUM-2 MD3. Una sequenza siRNA non specifico (NS-siRNA: GAGUGGGUCUGGGUCUUCCCGUAGAtt) è stato utilizzato come controllo negativo. La sequenza mimetica miR27a era 5'-UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC-3 '. full-length HIF-1α sequenza Coden umano è stato clonato in pcDNA3.1 vettoriale. pGL3-miR27a-Luc, plasmidi pcDNA-HIF-1α, pGL3-Basic e prl-TK sono state costruite e conservate nel nostro laboratorio.

Le cellule GC sono state seminate in 6 pozzetti per 24 ore prima di trasfezione a una densità di 4 × 10 ^{5 cellule /ml. I vettori plasmidici, siRNA o miR27a mimica sono stati trasfettati nelle cellule GC o cellule resistenti ai farmaci che utilizzano il trasfezione reagente Lipofectamine seguendo le istruzioni del produttore. Poi, le cellule sono state lavate con antibiotici RPMI 1640 privo di siero carente. L'efficienza di trasfezione è stata misurata 24 ore dopo, seguita dagli esperimenti successivi.}

1.4 MTT assay

tessuti GC e normale tessuto para-carcinoma stata omogeneizzata per preparare sospensioni di cellule singole filtrando attraverso un 300 griglia di rame a maglie. Le cellule GC digerito con 0,02% EDTA 0,25% tripsina sono state seminate ad una densità di 5 × 10 ^{4 cellule /ml in piastre da 96 pozzetti. Una volta che le cellule hanno raggiunto circa il 60% di confluenza, HIF-1α-siRNA è stato trasfettate o è stato applicato un farmaco chemioterapico (150 mg /ml di L-OHP). Ogni gruppo era composto da sei pozzi. Poi, 20μl di 5 mg /ml MTT è stato aggiunto per 4 ore prima della fine dell'esperimento. Le cellule sono state coltivate per 4 h, quindi, il terreno di coltura è stato scartato. Successivamente, 150μl di DMSO è stato aggiunto a ciascun pozzetto, ei valori di OD sono state misurate a 490 nm usando un lettore di micropiastre dopo l'agitazione la piastra per 15 min a temperatura ambiente. Gli esperimenti sono stati ripetuti tre volte.}

1,5 RNA isolamento e RT-PCR quantitativa

L'RNA totale è stato estratto utilizzando Trizol metodo one-step, e RNA 2μg è stato utilizzato per la trascrizione inversa template per generare cDNA. I relativi livelli di mRNA sono stati determinati mediante PCR quantitativa, GAPDH servito come un gene di riferimento interno. I parametri di PCR erano come segue: 95 ° C per 5 min seguita da 45 cicli di denaturazione a 94 ° C per 30 s e ricottura a 60 ° C per 30 s. Le sequenze di primer sono stati progettati utilizzando Primer 5.0 e sono stati cercati per la specificità. Le sequenze dei primer sono le seguenti: HIF-1α (93 bp): (F) 5'-GACAGCCTCACCAAACAGAG-3 'e (R) 5'-CTCAAAGCGACAGATAACACG-3'; MDR1 (126 bp): (F) 5'-GAATGTTCAGTGGCTCCGAG-3 'e (R) 5'-ACAATCTCTTCCTGTGACACC-3'; GST-π (151 bp): (F) 5'-ATACCATCCTGCGTCACCTG-3 'e (R) 5'-TCCTTGCCCGCCTCATAGTT-3'; Bcl-2 (98 bp): (F) 5'-TGTGTGGAGAGCGTCAACC-3 'e (R) 5'-TGGATCCAGGTGTGCAGGT-3'; LRP (129 bp): (F) 5'-TTTCTGACGGCAACTTCAAC-3 'e (R) 5'-AGTCCAATGTCCAGCCCAT -3'; TS (129 bp): (F) 5'-TTTCTGACGGCAACTTCAAC-3 'e (R) 5'-AGTCCAATGTCCAGCCCAT -3'; e GAPDH (138bp): (F) 5'-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3 'e (R) 5'-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3'. I risultati quantitativi PCR sono stati calcolati utilizzando il 2 ^{-ΔΔCt metodo}

1.6 Western Blot

I campioni di tessuti e cellule sono state lisate con RIPA lisi buffer:. 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 8,0, 0,2 mM Na3VO4, 0,2 mM phenylmethylsulfonyl fluoro, e 0,5% NP-40. La stessa quantità di campioni di proteine ​​sono stati separati su gel SDS poliacrilammide 10% (SDS-PAGE) e sono state elettrotrasferite ad un fluoruro di polivinile (PVDF) membrana (Amersham Pharmacia Biotech). Le membrane sono state bloccate con 5% BSA per 2 h ed incubate con l'anticorpo primario overnight a 4 ° C. Le membrane sono state incubate per 2 ore in un anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano. Le bande di destinazione sono stati rilevati utilizzando un chemiluminescenza (ECL) kit di rilevamento (Santa Cruz, Stati Uniti d'America). β-actina è stata usata come gene controllo endogeno. L'esperimento è stato replicato per tre volte.

1.7 immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) test

saggi ChIP sono stati eseguiti secondo il metodo da Wang et al. [21]. Cellule con diverso trattamento sono stati fissati con 1% di formaldeide per 15 min a temperatura ambiente, e terminano con una concentrazione finale di 0,125 M glicina. Quindi le cellule sono state lisate usando un tampone di lisi 300μl (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Nonidet inibitori P-40, 0,5% desossicolato, e proteasi). I lisati cellulari sono stati sonicato in bagno di acqua ghiacciata per produrre frammenti di cromatina circa 600 bp, come valutato mediante elettroforesi su gel di agarosio. Dopo centrifugazione a 13.000 rpm per 10 min, i sovranatanti sono stati prelevati e pre-cancellati per 15 min a 4 ° C tramite incubazione con 30μl di proteina A-Sepharose perline e tosati salmone DNA degli spermatozoi. Dopo centrifugazione a 13.000 rpm per 5 min, i sovranatanti sono stati divisi in tre parti uguali: uno per l'ingresso, gli altri due per immunoprecipitazione con o senza anticorpi HIF-1α. Il giorno dopo, i complessi immuni sono stati precipitato con proteina A-Sepharose perline e tosato salmone DNA dello sperma, poi le perle sono stati raccolti dopo lavati due volte con il tampone di lavaggio I (20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, e 2 mM EDTA), seguita da tampone di lavaggio II (20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 500 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, e 2 mM EDTA) e tampone di lavaggio III (10 mM Tris-HCl, pH 8,1, 0,25 M LiCl, 1% Nonidet P-40, 1% desossicolato, e 1 mM EDTA), e il tampone di lavaggio finale IV (10 mM Tris-HCl, pH 8.1 e 1 mM EDTA). Gli immunoprecipitati sono stati eluiti 200μl tampone di eluizione (1% SDS e 0,1 M NaHCO _{3), seguita da incubazione a 65 ° C durante la notte. Il giorno dopo, il DNA di ogni campione è stato isolato, e la PCR è stata eseguita per amplificare i segmenti promotore contenenti un sito di legame HIF-1α.}

1,8 saggi di luciferasi

cellule coltivate al 70% di confluenza e poi sono state trasfettate in triplice copia con pGL3-miR-27a-luc, pcDNA-HIF-1α o pGL3-base, insieme con prl-TK. Dopo 48 ore di trasfezione, le cellule sono state raccolte e l'attività della luciferasi è stata misurata utilizzando il Dual-reporter luciferasi Assay System (Promega, Madison, WI) secondo il protocollo del produttore. Le attività luciferasi della prolattina-TK sono stati serviti come controllo interno.

1.9 Analisi statistica

I risultati sono presentati come i mezzi ± S.D. test di ANOVA e Dunnett di è stata effettuata utilizzando il software SPSS 11.5.

Risultati

1 HIF-1α e miR27a sono espressi in modo differenziale tra gastrica tessuto para-carcinoma e del tessuto GC

Il espressione di HIF-1α nel tessuto GC rispetto al tessuto gastrico para-carcinoma è stata determinata mediante qRT-PCR e Western blot, e la sensibilità delle cellule L-OHP è stata determinata mediante il saggio MTT. HIF-1α (Fig 1A, 1B e 1C, qPCR e Western Blot) e miR27a (Fig 1D, risultati qPCR) sono up-regolati nel tessuto GC rispetto al tessuto gastrico para-carcinoma. Il saggio MTT ha dimostrato che il tasso di sopravvivenza delle cellule è stato maggiore nel tessuto GC che in gastrica para-carcinoma del tessuto quando L-OHP è stata aggiunta alle sospensioni dei tessuti cella singola (Fig 1E, istogramma).

2 HIF -1α e miR27a sono espressi in modo differenziale tra una linea di cellule epiteliali della mucosa gastrica e una cella GC linea

l'espressione di HIF-1α è stato il più alto in cellule OCUM-2MD3 OCUM-2MD3 /L-OHP e, in sequenza, ed è stato il più basso in GES-1 le cellule (Fig 2A, 2B e 2C, qPCR e Western blot). Inoltre, l'espressione della miR27a visualizzata la stessa tendenza, in cui le cellule OCUM-2MD3 /L-lucidi visualizzata la massima espressione, seguita da cellule OCUM-2MD3, e le cellule GSE-1 visualizzata l'espressione più basso di miR-27a (fig 2D, risultati qPCR). Il saggio MTT ha rivelato che quando L-OHP è stata aggiunta alle tre linee di cellule, le cellule OCUM-2MD3 /L-lucidi esposto il più alto tasso di sopravvivenza delle cellule, seguita da cellule OCUM-2MD3, e che le cellule GSE-1 esposto la sopravvivenza delle cellule più basso tasso (Fig 2E, istogramma).

3 HIF-1α-siRNA sopprime l'espressione del miR27a e la resistenza ai farmaci di cellule /L-lucidi OCUM-2MD3

Western blot analisi mostrava che i livelli di mRNA e di proteine ​​di HIF-1α è diminuito in misura diversa nelle cellule L-OHP trasfettate con tre coppie di HIF-1α-siRNA OCUM-2MD3 /, mentre l'espressione di HIF-1α non ha cambiato nelle cellule trasfettate con il controllo-siRNA. HIF-1α espressione sembravano diminuire più ripida, di circa il 90%, con HIF-1α-siRNA-2 (Fig 3A). Come mostrato in figura 3B, espressione di HIF-1α diminuito in queste cellule in modo dose-dipendente, in cui l'espressione di HIF-1α è diminuito di oltre il 95% in cellule trasfettate con 80 Nm HIF-1α-siRNA-2, quando HIF- 1α-siRNA-2 è stato transfettate ulteriormente ad una dose di 20 nm, 40 nm o 80 nm. Inoltre, l'effetto inibitorio massimo è stato rilevato 48 ore dopo la trasfezione (Fig 3C).

espressione miR27a era significativamente diminuita dopo trasfezione delle cellule MD3 /L-OHP OCUM-2 con HIF-1α-siRNA-2 (Fig 3D). Il saggio MTT ha indicato che il tasso di sopravvivenza delle cellule è risultata significativamente ridotta in seguito al trattamento di HIF-1α-siRNA-2-trasfettate OCUM-2 MD3 /cellule L-lucidi con L-lavagna luminosa rispetto alle cellule non transfettate (Fig 3E).

4 Effetti della miR27a sulla MDR delle cellule /L-lucidi OCUM-2MD3

l'espressione di miR27a era up-regolata nelle cellule OCUM-2MD3 /L-lucidi quando il miR27a mimica era co trasfettate in queste cellule GC resistenti ai farmaci che erano state trasfettate con HIF-1α-siRNA (Fig 4A). Tuttavia, nessuna differenza significativa nella espressione di HIF-1α è stata rilevata nelle cellule OCUM-2MD3 /L-OHP dopo trasfezione (Fig 4B e 4C, qPCR e Western Blot).

Il saggio MTT ha dimostrato che la sopravvivenza tasso di cellule /L-lucidi OCUM-2MD3 era chiaramente aumentata dopo trasfezione con il miR27a mimica (Fig 4D, istogramma).

5 HIF-1α induce la trascrizione di miR27a nelle cellule OCUM-2MD3

l'espressione di HIF-1α è risultato significativamente aumentato nelle cellule OCUM-2MD3 trasfettate con il plasmide di espressione eucariotica pcDNA-HIF-1α per 48 ore (Fig 5A). Inoltre, l'espressione miR27a era chiaramente up-regolati (Fig 5B). Così, questi risultati suggeriscono che HIF-1α è un fattore critico che influenza la trascrizione di miR27a. Pertanto, abbiamo stabilito un luciferasi plasmide reporter gene che porta una sequenza di 2 kb a monte della regione del promotore del miR27a, che è stato co-trasfettate con pcDNA-HIF-1α nelle cellule. I dati hanno mostrato che DLA HIF-1α migliorato l'attività del promotore di miR27a seguito co-trasfezione (Fig 5C). analisi ChIP inoltre confermato che HIF-1α direttamente legato alla regione del promotore di miR27a (Fig 5D). I risultati hanno indicato che HIF-1α può promuovere la trascrizione di miR27a nelle cellule OCUM-2MD3 da direttamente vincolanti per la regione del promotore del miR27a.

6 L'inibizione di HIF-1α utilizzando siRNA sopprime l'espressione di farmaco resistenza-related geni

Come mostrato in figura 6, l'inibizione di HIF-1α notevolmente soppressa l'espressione di MDR1 /P-gp, LRP, e Bcl-2 nelle cellule OCUM-2MD3 /L-OHP ma non significativamente alterato l'espressione di GST-π o TS. (Fig 6).

7 Inibizione di miR27a riduce di farmaco resistenza legati espressione genica nelle cellule /L-lucidi OCUM-2MD3

miR27a fu repressa nel farmaco-resistente GC OCUM-2MD3 /cellule L-OHP trasfettate con la sequenza anti-miR27a (Fig 7A). Inoltre, a seguito di questo trasfezione, l'espressione di MDR1 /P-gp, LRP e Bcl-2 era significativamente diminuito, mentre nessuna differenza significativa è stata rilevata nel espressione di GST-π o TS (Fig 7B, 7C e 7D, qPCR e occidentale macchia). (Fig 7)

Discussione

Anche se il tasso di incidenza a livello mondiale di GC sembra essere diminuito negli ultimi anni, una elevata incidenza di GC persiste, mettendo in serio pericolo la salute delle persone in Asia [22] . La MDR di cellule GC contribuisce alla cattiva prognosi di GC, in cui carenza di ossigeno gioca un ruolo fondamentale. Nel presente studio, abbiamo stabilito la linea stabile di cellule OCUM-2MD3 /L-OHP che è resistente alla L-OHP. I nostri dati indicano che i tessuti GC e linee cellulari mostrano forte resistenza ai farmaci rispetto ai normali tessuti epiteliali gastriche e linee cellulari. Abbiamo anche trovato che le cellule resistenti ai farmaci si sviluppano molto più forte MDR. I nostri risultati hanno mostrato un aumento dell'espressione di HIF-1α nei tessuti GC e linee cellulari, e la più alta espressione di HIF-1α è stato rilevato in una linea cellulare resistente ai farmaci. Pertanto, suggeriamo che HIF-1α contribuisce allo sviluppo di MDR nelle cellule GC.

Il gene HIF-1α codifica per una proteina che si compone di 826 aminoacidi con un peso molecolare di 120 kDa [23]. Molti studi hanno confermato che un aumento dell'espressione di HIF-1α è fortemente associato con l'insorgenza e lo sviluppo di tumori [24-28]. Altri studi hanno suggerito che l'eccesso di espressione di HIF-1α esalta le proprietà farmaco-resistenti di una varietà di cellule tumorali [29-32]. Inoltre, il nostro studio ha dimostrato che i tessuti GC e linee cellulari presentano maggiore resistenza ai farmaci chemioterapici rispetto gastrici tessuti para-carcinoma e linee cellulari mucosa gastrica. Abbiamo inoltre rilevato il più potente farmaco-resistenza in cellule GC. Tuttavia, i meccanismi con cui HIF-1α regola l'MDR devono ancora essere chiaramente identificate nelle cellule GC. Pertanto, abbiamo studiato ulteriormente gli effetti di HIF-1α sulle proprietà delle cellule MDR GC via interferenza genica e tecniche di clonazione. RNA interference (RNAi) ha mostrato vantaggi in specificità, l'efficienza e la durata nel tempo per la regolazione dell'espressione genica bersaglio [33]. I nostri dati indicano che l'inibizione di HIF-1α ha ridotto significativamente la resistenza ai farmaci nelle cellule OCUM-2MD3 /L-lucidi. Inoltre, abbiamo dimostrato che la resistenza ai farmaci è stata notevolmente aumentata quando pcDNA-HIF-1α, che è stato utilizzato per iperespressione di HIF-1α, è stato trasfettato in linee cellulari GC non resistenti ai farmaci. I nostri risultati indicano che HIF-1α svolge un ruolo essenziale nello sviluppo della MDR in GC.

Gli studi recenti hanno indicato che MDR è strettamente correlata con miRNA nei tumori [34-36]. Hu ha riferito che l'inattivazione miR-27a può invertire le proprietà delle cellule MDR GC [18]. Inoltre, è stato riportato che miR-21, miR-27a, miR-210 e miR-181b sono up-regolati attraverso la via HIF nell'ambiente ipossico basato su un saggio gene-chip [19]. In accordo con i nostri risultati, HIF-1α era positivamente associata con l'espressione di miR-27a nei tessuti GC e linee cellulari, e l'inibizione di HIF-1α diminuita miR-27a. Al contrario, un eccesso di espressione di HIF-1α indotta l'espressione di miR-27a. Questi risultati hanno indicato che HIF-1α regola l'espressione di miR-27a. Inoltre, il nostro studio ha dimostrato che imita miR-27a in salvo le proprietà farmaco-resistenza delle cellule HIF-1α-knockdown. Ancora più importante, HIF-1α si lega direttamente alla e promuove miR27a trascrizione, indicando che HIF-1α regola la MDR di GC tramite miR-27a.

Abbiamo caratterizzato l'espressione di geni che sono strettamente associati con MDR, tra cui MDR1 /P-gp, GST-π, LRP, Bcl-2 e TS, prima e dopo la modulazione dell'espressione di HIF-1α nelle cellule GC per chiarire il meccanismo attraverso il quale la via HIF-1α-miR-27a regola la MDR di GC . Abbiamo dimostrato che l'inibizione dell'espressione di HIF-1α ha ridotto l'espressione di MDR1 /P-gp, LRP e Bcl-2. I livelli di espressione di questi geni erano significativamente aumentati quando le cellule sono state trasfettate con il miR-27a mimica, mentre i livelli di espressione di GST-π e TS non sono stati significativamente modificati. In accordo con questa scoperta, sovra-espressione di HIF-1α potentemente up-regolata l'espressione di MDR1 /P-gp, LRP, e Bcl-2 nella linea di cellule GC OCUM-2MD3. Pertanto, i nostri dati dimostrano che la via HIF-1α-miR-27a media proprietà MDR in GC inducendo MDR1 /P-gp, LRP e l'espressione di Bcl-2.

I nostri studi dimostrano che HIF-1α e miR -27a sono up-regolati nei tessuti GC e linee cellulari. HIF-1α agisce come un regolatore a monte del miR-27a. segnalazione HIF-1α-miR-27a migliora le proprietà di MDR inducendo l'espressione di MDR1 /P-gp, LRP e Bcl-2 in GC. Questi risultati suggeriscono che la via HIF-1α-miR-27a gioca un ruolo cruciale l'avvio di MDR in GC umana, che può servire come un nuovo bersaglio terapeutico per la MDR in GC.

informazioni di supporto
File S1. I dati di MTT e occidentale
doi:. 10.1371 /journal.pone.0132746.s001
(ZIP)

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