PLoS ONE: Fas Signaling Promuove gastrico metastasi del cancro attraverso Upregulation STAT3-dipendente di Fascin

Estratto

Sfondo

Fas trasduttori di segnale di segnalazione attivati ​​e attivatori di trascrizione 3 (STAT3) è richiesto per upregulation fascina. Come una proteina actina-bundling, fascina può mediare il cancro gastrico migrazione cellulare (GC).

Metodi

cancro gastrico cellule AGS sono stati trattati con anti-Fas (5 mg /ml) per 2 ore , al fine di stimolare l'attivazione del segnale Fas. Il in vitro
migrazione delle cellule AGS di segnalazione attivate Fas è stata valutata utilizzando camere Transwell. I livelli di fascina e STAT3 fosforilata sono stati rilevati da analisi Western blotting. topi nudi sono state iniettate per via endovenosa con le cellule AGS trattati con anti-Fas o trattati con inibitori STAT3 senza anti-Fas; metastasi polmonari di tumori sono stati misurati. espressione della proteina fascina nei tessuti tumorali è stata rilevata mediante immunoistochimica. I livelli di Fas e fascina di mRNA nei tessuti tumorali di pazienti affetti da CG sono stati misurati mediante real-time PCR e la loro correlazione è stato analizzato.

Risultati

L'attivazione del segnale Fas ha promosso la migrazione delle cellule e ha portato STAT3-dipendente upregulation fascina nelle cellule AGS. STAT3 migliorato i livelli di fascina in vivo
. La fascina è stato il mediatore della migrazione delle cellule AGS segnalazione indotta da Fas in vitro
e in vivo
. Inoltre, vi era una correlazione positiva tra i livelli di Fas e fascina di mRNA nei tessuti tumorali di pazienti CG.

Conclusioni

Fas segnalazione promuove GC metastasi attraverso il STAT3 /via fascina, che può fornire un nuovo bersaglio per la terapia GC

Visto:. Yang Y, Zhao Q, Z Cai, Cheng G, Chen M, Wang J, et al. (2015) Fas segnalazione promuove gastrico metastasi del cancro attraverso Upregulation STAT3-dipendente di fascina. PLoS ONE 10 (5): e0125132. doi: 10.1371 /journal.pone.0125132

Editor Accademico: Jin Cheng D., H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Stati Uniti |

Received: 6 gennaio 2015; Accettato: 11 marzo 2015; Pubblicato: 18 maggio 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

disponibilità dei dati: Tutti i dati rilevanti sono all'interno della carta

Finanziamento:. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation naturale della Cina No. 81.200.014 di JLW (http://www.nsfc.gov.cn/); la Fondazione di Scienze Naturali della Provincia di Zhejiang No. LY14H160011 a YSY; No. LY12C08002 a ZJC e n LY12H13003 di MC (http://www.zjnsf.gov.cn/). I finanziatori avevano alcun ruolo in disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

cancro gastrico (GC) è il quarto cancro più comune e la seconda causa di decessi correlati al cancro in tutto il mondo. Come la maggior parte dei tumori, metastasi è la principale causa di fallimento della terapia clinica di GC. Diagnosticato in una fase iniziale senza metastasi, GC può essere sradicata da un intervento chirurgico. Una volta che si verifica metastasi, la prognosi di GC è significativamente peggiore. Nei pazienti con ampie metastasi, l'esito di un intervento chirurgico in combinazione con la chemioterapia e l'immunoterapia è tutt'altro che ottimale, con un tasso complessivo di sopravvivenza a 5 anni essendo solo il 24% [1,2]. Pertanto, vi è una necessità urgente di una migliore comprensione del meccanismo della GC metastasi al fine di sviluppare una migliore strategia terapeutica.

Fas via di segnalazione è uno dei meccanismi classici di indurre apoptosi [3]. Dopo ligazione con il suo ligando naturale, FasL, recettore Fas forma la morte induce complesso segnalazione, provocando l'attivazione della caspasi-8, che a sua volta attiva i caspasi a valle, con conseguente apoptosi [4]. E 'stato riportato che l'uccisione delle cellule Fas-mediata è responsabile per la funzione di anti-cancro del Fas percorso di segnalazione nel cancro della prostata [5]. Tuttavia, nella maggior parte dei tumori, invece di indurre apoptosi, Fas attivazione segnalazione promuove la progressione tumorale [6,7]. Le cellule tumorali spesso rispondono alla stimolazione Fas con una maggiore proliferazione [8,9]. Diversi studi hanno anche dimostrato che Fas segnalazione può promuovere la migrazione delle cellule tumorali e l'invasione [10-12]. In un recente studio, elevata espressione Fas in cellule GC è stato dimostrato per correlare con la presenza di metastasi ai linfonodi regionali [13], il che suggerisce che la segnalazione Fas promuove la metastasi del cancro gastrico.

fascina, una actina -bundling proteine, è stato identificato come una molecola chiave in metastasi tumorali [14]. Fascina svolge un ruolo importante nella migrazione delle cellule tumorali e l'espressione di fascina è aumentata in diversi tipi di tumori, tra GC [15,16]. Fascina è un gene bersaglio diretta STAT3 in risposta a IL-6 sia nel topo e cellule di cancro al seno umano [17]. segnalazione Fas è stato segnalato per essere coinvolti nella attivazione di STAT3 [18-20]. Pertanto, ipotizziamo che Fas segnalazione promuove la migrazione delle cellule GC e conseguente metastasi tumorali attraverso l'up-regolazione STAT3-dipendente di fascina.

Il presente studio è stato progettato per dimostrare il coinvolgimento di Fas nella regolazione dell'espressione fascina attraverso l'attivazione di STAT3 nelle cellule AGS. Abbiamo cercato di collegare il livello fascina migliorato con la motilità delle cellule e metastasi delle cellule AGS in vivo
. Abbiamo anche analizzato la correlazione tra i livelli di Fas e fascina di mRNA nei tessuti tumorali di pazienti affetti da GC. Si sperava che i nostri risultati sarebbero rivelare un nuovo meccanismo per GC metastasi, fornendo una base per il futuro sviluppo della strategia terapeutica Fas-based per GC avanzata.

Materiali e Metodi

campioni di tessuto umano

campioni di tessuto umano GC sono stati raccolti da 23 pazienti (14 con metastasi e 9 senza metastasi) sottoposti a chirurgia prima della chemioterapia nel Zhejiang Cancer Hospital (Hangzhou, Cina) tra il 2012 e il 2014. le caratteristiche cliniche dei pazienti con GC sono riassunti nella Tabella 1. lo studio rispettato le norme del Ministero della sanità della Cina e le linee guida internazionali dell'Organizzazione mondiale della sanità Etica Research Review Committee per la ricerca che coinvolge soggetti umani e la Dichiarazione di Helsinki sui principi etici per la ricerca medica che coinvolge soggetti umani. Il protocollo di studio è stato esaminato e approvato dal Institutional Review Board di Zhejiang Cancer Hospital. Consenso informato scritto è stato ottenuto da ciascuno dei pazienti prima di studiare inizio.

Reagenti

Mouse anti-umana Fas (2R2) anticorpo monoclonale è stato acquistato da eBioscience (San Diego, CA, USA) . Topo Fas (CH11) anticorpo monoclonale inibitore e STAT3 anti-umano S3I-201 sono stati acquistati da Merck Millipore (Billerica, MA, USA). Il coniglio STAT3 anti-umano (79D7) e STAT3 fosforilato anti-umano (D3A7) anticorpi monoclonali sono stati acquistati da Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Il mouse fascina (D-10) anticorpo monoclonale anti-umano, umano fascina siRNA, STAT3 siRNA, controllo negativo siRNA (NC siRNA), e l'inibitore STAT3, Stattic, sono stati acquistati da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Il kit di proliferazione delle cellule CCK8 è stato acquistato da Dojindo molecolari Technologies (Kumamoto, Giappone). Il kit di rilevamento apoptosi annessina V-FITC è stato acquistato da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Le camere Transwell (8 micron di dimensione dei pori) sono stati acquistati da Costar (Cambridge, MA, USA).

Animali

Sei settimane di età topi nudi atimici sono stati ottenuti da SIPPR-BK Sperimentale Animal Co. (Shanghai, Cina). I topi sono stati alloggiati in una struttura priva di agenti patogeni. I protocolli sperimentali sono stati esaminati e approvati dal Comitato di cura e l'uso di animali di Zhejiang Cancer Hospital.

Cellule e colture cellulari

La cella GC linee AGS umani e MNK-45 sono stati ottenuti dalla American Type culture Collection (Manassas, VA, USA) e mantenuto nel 1640 un terreno di coltura contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) a 37 ° C con 5% di CO _2.

Western blot analisi

Un totale di 20 mg proteine ​​grezze estratte da lisati cellulari è stato separato dal 10% sodio dodecil solfato SDS-PAGE e trasferite su membrane di difluoruro di polivinilidene (Millipore, Billerica, MA). Le membrane sono state bloccate con 5% BSA in soluzione salina tamponata con Tris più 0,05% Tween-20 e poi incubate con corrispondenti anticorpi primari a 4 ° C durante la notte. Dopo il lavaggio con soluzione salina tamponata con Tris più 0,05% Tween-20, le membrane sono state incubate con corrispondenti anticorpi secondari HRP-coniugati. Le proteine ​​sono state visualizzate utilizzando SuperSignal occidentale Femto massima (Thermo, IL, USA).

Il rilevamento di apoptosi delle cellule

cellule AGS (2 × 10 ^{5 /ml) sono stati trattati con 1 o 5 ug /ml di anticorpi anti Fas-anticorpo monoclonale (anti-Fas) o isotipo (ISO) per 24 h, le cellule apoptotiche sono state colorate con annessina V-FITC e ioduro di propidio per 5 minuti a 4 ° C al buio e poi analizzati mediante citometria di flusso con un FACSCalibur citofluorimetro (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).}

Cancer test migrazione delle cellule in vitro

cellule AGS (1 × 10 ^{6 /ml) sono stati trattati con 5 mg /ml di anti-Fas o ISO per 2 ore a 37 ° C. Poi 2 × 10 5 cellule tumorali AGS sono stati trasferiti in 100 ml di mezzi privi di siero e seminate su alla camera superiore delle camere Transwell (8 micron di dimensione dei pori). La camera inferiore è stato riempito con 800 ml di 1640 coltura contenente 20% FBS. Dopo 48 h di incubazione a 37 ° C, le cellule sono state fissate con metanolo per 20 minuti, e successivamente lavate con PBS tre volte, ogni 20 min. Le cellule fissate sono state colorate con 10 mg /ml di DAPI per 30 minuti e lavate con PBS. Le cellule marcate sono state esaminate al microscopio fluorescenza. Per determinare gli effetti di STAT3 sulla migrazione cellulare, 10 pM di Stattic è stato aggiunto al mezzo di coltura. Per determinare il ruolo della fascina nella migrazione delle cellule, prima della stimolazione anti-Fas, per un totale di 40 duplex nM fascina siRNA sono state trasfettate in cellule AGS (2 × 10 5 /pozzetto) utilizzando 3 ml di INTERFERin siRNA reagente di trasfezione ( PolyPlus, NY, CA, USA) su un 24-pozzetti. L'efficienza di fascina silenziamento transiente è stata confermata mediante Western blotting.}

La proliferazione cellulare dosaggio

cellule AGS sono stati trattati con 5 mg /ml di anti-Fas o ISO per 24, 48, o 72 h, e 20 ml di CCK8 è stato aggiunto a ciascun pozzetto e le cellule sono state incubate per altre 4 h. L'assorbanza di ciascun pozzetto è stata letta a 450 nm. La proliferazione cellulare è stato calcolato dividendo ODS delle cellule trattate con l'ODS delle cellule di controllo.

Real-time PCR

L'RNA totale è stato estratto con il reagente TRIzol e cDNA è stato sintetizzato con un PrimeScript RT kit di reagenti (Takara Bio Inc. Otsu, Shiga, in Giappone). Le seguenti condizioni di PCR sono stati usati: 1 ciclo a 95 ° C per 30 s, quindi 40 cicli di 5 s a 95 ° C e 34 s a 60 ° C. Real-time PCR è stata eseguita su un 7500 PCR in tempo reale del sistema Applied Biosystems (Foster City, CA, USA). I risultati sono stati normalizzati contro RNA β-actina. Le sequenze di primer PCR utilizzati sono i seguenti: senso, 5'-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3 'e anti-senso, 5'-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3' per β-actina; senso, 5'-GTGAGGGAAGCGGTTTACGA-3 'e anti-senso, 5'- AGATGCCCAGCATGGTTGTT-3' per il Fas; senso, 5'-TGTCTGCCAATCAGGACGAG-3 'e anti-senso, 5'-CACGCCACTCGATGTCAAAG-3' per la fascina.

Lung test metastasi in vivo

cellule AGS ( 5 × 10 ^{6 per topo) pre-trattati con anti-Fas o ISO per 2 h sono state iniettate in 6-wk-vecchi topi nudi con una vena della coda. Per determinare gli effetti di STAT3 sulla metastasi tumorali e di espressione fascina in vivo
, le cellule tumorali AGS (5 × 10 6 per il mouse) sono stati iniettati per via endovenosa in 6-wk-vecchi topi nudi e 24 ore più tardi , i topi ha ricevuto l'iniezione endovenosa di S3I-201 (5 mg /kg, ogni 2 giorni per un totale di 3 volte). Tre settimane dopo l'iniezione delle cellule, i topi sono stati anestetizzati da inalazione di cloralio idrato e si sono sacrificati, ei polmoni sono stati rimossi e il numero di focolai tumorali polmonari sono state contate al microscopio da dissezione.}

L'immunoistochimica

Il foci tumorali dai polmoni sono stati fissati in formalina al 10%, disidratati in etanolo, e inclusi in paraffina. Le sezioni di tessuto sono stati tagliati a 4 micron, montate su vetrini ed essiccato a 60 ° C per 4 ore. Dopo breve digestione proteolitica e un blocco perossidasi delle diapositive tessuto utilizzando perossido di idrogeno 2,5% in metanolo per 30 min a temperatura ambiente, i vetrini sono stati incubati con l'anticorpo anti-fascina notte a 4 ° C. Dopo il lavaggio, i vetrini sono stati incubati con polimero marcato con perossidasi e il substrato cromogeno. Infine, i campioni sono stati incubati in tampone fosfato salino contenente diaminobenzidina per 5 min. Un microscopio Olympus è stato impiegato per visualizzare la colorazione dei tessuti tumorali.

Analisi statistica

I risultati sono stati confrontati con ANOVA. Il test di correlazione di Spearman graduatoria è stata utilizzata per esaminare le correlazioni tra i livelli di Fas e fascina mRNA nei tessuti tumorali di pazienti GC. Un valore di p < 0.05 è stato considerato statisticamente significativo

Risultati

Attivazione di segnalazione Fas promuove la migrazione delle cellule AGS

In primo luogo, abbiamo confermato l'espressione di. recettore Fas in AGS e MNK-45 cellule mediante real-time PCR e Western blotting analisi e trovato MNK-45 cellule hanno espresso maggiore Fas recettore delle cellule AGS ha fatto (Fig 1A). Entrambe le linee cellulari anche mostrato un alto livello di espressione FasL (dati non mostrati). Abbiamo poi esaminato se la legatura del recettore Fas potrebbe indurre apoptosi in AGS e MNK-45 cellule. Dopo stimolazione con anti-Fas o ISO ad una concentrazione di 1 mg /ml o 5 mg /ml, è stato MNK-45, ma non le cellule AGS mostrato enhancement concentrazione-dipendente di apoptosi (Fig 1B). Pertanto, abbiamo studiato se l'attivazione del segnale Fas potrebbe causare altri effetti sulle cellule AGS invece di induzione di apoptosi nelle seguenti esperimenti. Il test di migrazione delle cellule AGS è stata eseguita in vitro
e abbiamo trovato la migrazione delle cellule AGS è risultata significativamente aumentata dopo stimolazione con 5 mg /ml di anti-Fas (Fig 1C). Per escludere la possibilità che l'aumento migrazione delle cellule AGS è stato causato da loro proliferazione elevata dopo stimolazione anti-Fas, abbiamo esaminato la proliferazione delle cellule ACS e abbiamo trovato alcuna differenza evidente tra le cellule trattate con o senza anti-Fas (Fig 1D), suggerendo che l'aumento nella migrazione cellulare non era un risultato delle proprietà proliferative dopo la stimolazione anti-Fas. Presi insieme, questi risultati indicano che Fas segnalazione può aumentare la motilità delle cellule GC in vitro.

Attivazione della segnalazione Fas upregulated espressione fascina in cellule AGS attraverso l'attivazione di STAT3

E 'stato riportato che la segnalazione Fas è coinvolto nell'attivazione di STAT3 [18-20]. Nel presente studio, abbiamo esaminato se l'attivazione del segnale Fas causerebbe attivazione di STAT3 in cellule AGS. Come mostrato in figura 2A, dopo stimolazione con anti-Fas per un breve periodo, la STAT3 fosforilato era significativamente aumentata nelle cellule AGS. È stato anche documentato che fascina può aumentare la motilità delle cellule tumorali ed è un gene bersaglio diretto di STAT3 [17]. Così, abbiamo rilevato l'espressione di fascina nelle cellule AGS dopo stimolazione con anti-Fas. Come mostrato in figura 2B, i livelli di mRNA di fascina sono stati aumentati in modo dipendente dal tempo e culminano dopo 12 h di stimolazione anti-Fas nelle cellule AGS. Per confermare ulteriormente la upregulation di fascina, abbiamo rilevato il livello di proteine ​​di fascina e abbiamo trovato aumentando i livelli di proteina fascina in anti-Fas, ma non ISO trattati cellule AGS (Fig 2C). Per dimostrare la relazione tra STAT3 e fascina in cellule AGS dopo Fas attivazione di segnalazione, abbiamo trattato le cellule AGS con Stattic, un inibitore specifico di STAT3, prima della stimolazione anti-Fas e abbiamo trovato che l'aumento anti-Fas-indotta di proteine ​​fascina è stato completamente abrogato in presenza di Stattic (Fig 2D). Si potrebbe anche rilevare l'attivazione di STAT3 in cellule AGS dopo la stimolazione anti-Fas per 24 ore, ma la misura attivata è stato leggermente inferiore a quello ricevuto 2h di stimolazione anti-Fas (fig 2C e 2D). Ad ulteriore conferma che STAT3 è stato coinvolto nella regolazione dell'espressione fascina dopo stimolazione anti-Fas, abbiamo abbattuto l'espressione di STAT3 utilizzando STAT3 specifici siRNA prima della stimolazione anti-Fas e rilevato l'efficacia STAT3-atterramento da analisi Western Blotting. Come mostrato in figura 2E, STAT3 siRNA ma non NC siRNA transfection marcatamente inibito l'espressione di STAT3 in cellule AGS. Come previsto, la proteina fascina non è stata indotta nelle cellule AGS STAT3-knockdown dopo stimolazione anti-fascina (Fig 2F). Questi risultati suggeriscono che STAT3 attivata è necessario per l'up-regolazione dell'espressione fascina causata dall'attivazione di segnalazione nelle cellule Fas AGS.

la migrazione delle cellule di segnalazione-promosso Fas dipende STAT3 /via fascina

E 'stato dimostrato che fascina media delle cellule tumorali migrazione [17]. Nel presente studio, abbiamo esaminato se atterramento di fascina inibirebbe la migrazione delle cellule di segnalazione indotta da Fas in vitro
. Abbiamo scoperto che una diminuzione della proteina fascina potrebbe essere rilevato nelle cellule AGS trasfettate con siRNA fascina, ma non il NC siRNA (Fig 3A). Poi, abbiamo effettuato i test di migrazione delle cellule tumorali per rilevare la motilità delle cellule AGS fascina-knockdown dopo stimolazione anti-Fas. Come mostrato in figura 3B, quando la stimolazione anti-Fas notevolmente promosso la migrazione delle cellule AGS, questo effetto era ovviamente inibita in cellule trattate con fascina siRNA, ma non NC siRNA. Dal momento che STAT3 è necessaria per il Fas segnalazione indotta espressione fascina in cellule AGS, abbiamo accanto analizzato gli effetti di STAT3 sul Fas segnalazione mediata migrazione delle cellule in cellule AGS. Come mostrato in Figura 3C, dopo aver trattato con Stattic, la migrazione delle cellule Fas segnalazione avanzata era completamente abolita. Coerentemente con questo risultato, STAT3 siRNA anche significativamente inibito la migrazione delle cellule AGS segnalazione avanzata Fas (Fig 3D). Questi risultati indicano che la segnalazione Fas ha promosso la migrazione delle cellule e dipende l'attivazione di STAT3 /via fascina.

Fas segnalazione promuove le metastasi delle cellule in vivo attraverso l'attivazione di STAT3 /fascina percorso

Per dimostrare ulteriormente la rapporto tra la segnalazione Fas e GC metastasi, abbiamo trasferito le cellule AGS anti-Fas-stimolato per via endovenosa in topi nudi e rilevato il foci del tumore nei polmoni. Abbiamo trovato un aumento di foci tumorali nei polmoni dei topi trasferiti con cellule pre-trattate con anti-Fas ma non ISO (Fig 4A). Per chiarire la relazione tra fascina e Fas segnalazione mediata metastasi tumorali, abbiamo effettuato la rilevazione immunoistochimica di fascina nei tessuti tumorali. Abbiamo osservato un'espressione fascina maggiore nei tessuti tumorali da topi trattati con cellule AGS anti-Fas-stimolati rispetto a quella dei topi trattati con ISO o cellule AGS non-stimolata (Fig 4B). Dal momento che STAT3 è necessario per l'up-regolazione anti-Fas-indotta di fascina e aumento della motilità delle cellule AGS, abbiamo studiato gli effetti di STAT3 in metastasi delle cellule AGS in vivo
. Dopo il trattamento con S3I-201, un inibitore della sonda chimica di attività STAT3 [21], i fuochi del tumore nei polmoni significativamente diminuito (Fig 4C). Inoltre, l'espressione fascina nei tessuti tumorali da S3I-201 topi trattati è stato anche inibito (Fig 4D), che suggerisce il controllo della fascina da STAT3 in vivo
. Presi insieme, questi risultati indicano che Fas segnalazione può promuovere la metastasi delle cellule in vivo
, dipende l'attivazione di STAT3 /via fascina.

espressione fascina è correlata con l'espressione di Fas nei tessuti tumorali da pazienti con CG

dal Fas segnalazione promuove l'espressione fascina, abbiamo determinato se ci fosse una correlazione tra Fas e l'espressione fascina nei tessuti tumorali di pazienti GC. Abbiamo analizzato i livelli di mRNA di Fas e fascina nei tessuti tumorali di pazienti GC. Come mostrato in figura 5, i livelli di mRNA di Fas e fascina mostrato una correlazione positiva. Questo risultato fornisce la prova per l'idea che Fas segnalazione promuove l'espressione fascina in GC.

Discussione

In generale, a seguito di trimerizzazione Fas dopo la legatura con FasL, viene avviata l'apoptosi. grappolo Fas recluta la proteina adattatrice FADD e forma il complesso segnalazione morte induce, provocando l'attivazione della caspasi-8. Caspase-8, a sua volta, attiva le caspasi a valle, come la caspasi-3, che si conclude con l'apoptosi [4]. Oltre a indurre la morte delle cellule, Fas trasmette anche segnali di proliferazione e attivazione delle cellule tumorali [22]. E 'stato riportato che Fas mediare Astric la proliferazione delle cellule della mucosa è ERK dipendente [23], ma l'attivazione della via di segnalazione ERK non può indurre la proliferazione delle cellule di melanoma murino B16 [24]. Pertanto, Fas può indurre la proliferazione di alcuni, ma non tutte le cellule tumorali e il meccanismo in questione è ancora in gran parte sconosciuta. Qui, abbiamo trovato Fas non era valido per indurre la proliferazione delle cellule AGS. segnalazione Fas è stato anche dimostrato per indurre motilità delle cellule tumorali apoptosi-resistenti con urochinasi attivatore del plasminogeno [10]. Nel presente studio, abbiamo svelato un nuovo meccanismo di Fas-mediare la motilità delle cellule tumorali, che dipendeva dal upregulation di fascina attraverso l'attivazione di STAT3.

Si ritiene generalmente che per sfuggire apoptosi causata da FasL-positivo T cellule, le cellule tumorali hanno sviluppato diversi modi di resistere agli effetti di uccisione delle cellule FasL-indotta. Le cellule tumorali hanno dimostrato di downregulate o addirittura perdere Fas espressione del recettore [25] o abrogare il percorso di segnalazione intracellulare Fas attraverso mutazione nel Fas [26]. Le cellule tumorali possono anche upregulate enzima proteina-inibitrice cellulari FADD come IL-1β-convertirli oppure fosforilare caspasi-8 per inibire l'attivazione della caspasi-8 e bloccare il percorso di segnalazione a valle del Fas [27,28]. Nel presente studio, abbiamo trovato l'attivazione di STAT3 in cellule AGS dopo stimolazione anti-Fas. L'attivazione di STAT3 ha dimostrato di proteggere le cellule tumorali di stimoli apoptotici provenienti dal recettore Fas [29]. Il pre-trattamento di inibitore STAT3 non poteva iniziare l'apoptosi delle cellule AGS dopo Fas segnalazione di attivazione (dati non mostrati), suggerendo che l'attivazione di STAT3 non è coinvolta nella prevenzione cellule AGS da apoptosi Fas-indotta.

E 'stato hanno riportato che cellule di carcinoma polmonare di Lewis sono costitutivamente resistenti all'apoptosi Fas-mediata, ma la sovraespressione di Fas su queste cellule permette apoptosi Fas-mediata dopo reticolazione con agonisti anticorpo anti-Fas [30], il che suggerisce che vi è una differenza qualitativa nelle celle di segnalazione attivate ricevere, che determina il loro destino dopo Fas legatura di segnalazione. Il livello di espressione Fas è moderato in cellule AGS e stimolate con alte dosi di anti-Fas (20 ug /ml); abbiamo trovato che le cellule AGS hanno mostrato un lieve aumento dell'apoptosi (dati non riportati). Ciò indica che l'induzione di apoptosi e segnalazione promozione della migrazione possono entrambi essere attivate dopo Fas recettore legatura, che può essere correlato al livello di anti-Fas utilizzata in questi esperimenti. Se alti livelli di Fas segnalazione consegna non può essere raggiunto in condizioni fisiologiche, la segnalazione di promozione della migrazione assumerà dopo Fas recettore legatura e causare un aumento delle metastasi GC.

Per implementare le metastasi a distanza, potente motilità è necessario per le cellule tumorali . Fascina, come una proteina actina-bundling, è importante per il mantenimento e la stabilità dei fasci di actina filamentosi, e quindi coinvolti nella motilità cellulare [31]. Nel presente studio, abbiamo rivelato che la segnalazione Fas è stato coinvolto nella up-regolazione dell'espressione fascina. IL-6 è segnalato per upregulate espressione fascina di cellule GC [32]. La segnalazione Fas è stato anche dimostrato per promuovere la secrezione di IL-6 nelle cellule tumorali [33]. Queste evidenze indicano che Fas segnalazione probabilmente amplifica l'effetto upregulation fascina attraverso IL-6. Abbiamo inoltre dimostrato che le espressioni Fas e fascina sono stati strettamente correlati nei pazienti CG, rafforzando l'importanza dell'asse Fas-fascina nel processo di GC metastasi.

In linea con gli studi precedenti, abbiamo dimostrato che l'attivazione di Fas-indotta STAT3 è stato richiesto per la upregulation di fascina. Nel modello di metastasi polmonari del mouse nudo, l'inibitore STAT3, S3I-201, potrebbe inibire l'espressione fascina nei tessuti tumorali. Murino FasL ricombinante è stato in grado di attivare attivazione STAT3 (dati non riportati), suggerendo che ha attivato segnalazione iniziata da FasL sulle cellule AGS sé è sufficiente a mediare attivazione STAT3 ed a valle upregulation fascina. Oltre a regolare l'espressione fascina, STAT3 è anche coinvolto nella proliferazione e la sopravvivenza cellulare, oncogenesi, e le metastasi del cancro in GC [34-36]. Un inibitore piccola molecola STAT3 biodisponibile per via orale è stato scoperto e potrebbe essere un potenziale agente terapeutico per il cancro umano [37]. Noi ipotizziamo che inibitore STAT3 è un agente promettente che può essere utilizzato nella terapia GC clinica nel prossimo futuro.

In conclusione, abbiamo dimostrato che la segnalazione Fas è coinvolto nella metastasi GC attraverso upregulation STAT3-dipendente di fascina. I nostri risultati suggeriscono anche il Fas /STAT3 /via fascina può essere un bersaglio molecolare per la terapia GC.

Riconoscimenti

Abbiamo apprezzato il Dr. Wang Hua per la fornitura del cDNA estratto dai tessuti tumorali di pazienti GC . Abbiamo anche apprezzato l'editor di Medjaden per la modifica di questo manoscritto.

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