PLoS ONE: Funzioni MicroRNA-219-2-3p come soppressore tumorale nel cancro gastrico ed è regolata da DNA Methylation

Estratto

Fondo e & Obiettivi

cancro gastrico è il tumore gastrointestinale più frequente negli adulti ed è la forma più letale di cancro umano. Nonostante i miglioramenti nei trattamenti, il meccanismo alla base della carcinogenesi gastrica non è ben nota. Per definire nuovi modulatori che regolano la suscettibilità alla tumorgenesis, ci siamo concentrati sul miR-219-2-3p.

Metodi

RT-PCR quantitativa è stato impiegato per indagare il livello di miR-219-2 -3p a cancro gastrico (GC) tessuti (n = 113) e le loro corrispondenti tessuti normali adiacenti (n = 113). Nella proliferazione in vitro delle cellule, saggi di apoptosi, la migrazione delle cellule, e saggi di invasione sono stati eseguiti per chiarire gli effetti biologici di miR-219-2-3p. Dal momento che il silenziamento di miRNA dal promotore CpG isola metilazione può essere un importante meccanismo tumorgenesis, cellule GC sono stati trattati con 5-aza-2'-deossicitidina e Tricostatina A, e cambiamenti di espressione di miR-219-2-3p sono stati successivamente esaminati da quantitativa RT-PCR. Infine, lo stato di metilazione dell'isola CpG a monte del miR-219-2-3p è stata analizzata mediante metilazione-specifica PCR nei tessuti GC (n = 22).

Risultati

miR-219- 2-3P era down-regolato in linee GC e cellulari. Inoltre, gli esperimenti documentati espressione inferiore del miR-219-2-3p in campioni GC con grado superiore e tumori fase successiva. Nel frattempo, miR-219-2-3p esercitata antiproliferativa, proapoptotica e ruoli antimetastatici e ridotti livelli di p-ERK1 /2 in cellule di GC. Inoltre, 5-aza-2'-deossicitidina e Tricostatina Un aumentato l'espressione (~2 volte) di miR-219-2-3p nelle cellule GC. By PCR metilazione-specifica, la metilazione del DNA nella regione a monte del miR-219-2-3p stata riscontrata sia tessuti normali e tessuti tumorali adiacenti. Come previsto, il livello di metilazione era notevolmente più elevato nel miR-219-2-3p down-regolato gruppo rispetto al gruppo up-regolati.

Conclusioni

miR-219-2-3p è potenzialmente coinvolti nella progressione del cancro gastrico e la metastasi regolando i percorsi di segnale ERK1 /2-correlate, che possono fornire una nuova strategia terapeutica per il trattamento del cancro gastrico. meccanismo di metilazione può essere coinvolto nel modulare il livello di espressione di miR-219-2-3p nel carcinoma gastrico

Visto:. Lei H, Zou D, Li Z, Luo M, L Dong, Wang B, et al . Funzioni (2013) microRNA-219-2-3p come soppressore tumorale nel cancro gastrico ed è regolata da DNA metilazione. PLoS ONE 8 (4): e60369. doi: 10.1371 /journal.pone.0060369

Editor: Arun Rishi, Wayne State University, Stati Uniti d'America

Ricevuto: 14 dicembre 2012; Accettato: 26 Febbraio 2013; Pubblicato: 23 apr 2013

Copyright: © 2013 Lei et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Science Foundation naturale della Cina [2012, 91.129.716, per JY] e il Comune di Pechino Scienza & Della Tecnologia della Commissione [2010B071, a JY]. I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

cancro gastrico (GC) è il 4 ^{th più comune di cancro e la seconda causa di morte di cancro in tutto il mondo. Al giorno d'oggi, i pazienti con fase tardo-GC sono con una sopravvivenza globale a 5 anni di circa il 20% [1]. Cancer sviluppa come risultato di un accumulo di varie cause endogene ed esogene. Abitudini alimentari e un aumento Helicobacter pyloriinfection sono importanti cause esogene per GC [2], mentre genetiche, nonché dietetico, livelli di ormone gastrina [3], ed altri fattori infiammazione causano gastriche croniche sono trovati per essere associato con predisposizione allo sviluppo del cancro. alterazioni del gene svolgono un ruolo importante in GC, e le alterazioni in un gran numero di oncogeni e geni oncosoppressori sono già stati segnalati in GC.}

Alcuni biomarcatori tumorali prognostici in GC, come fattore di crescita epidermico umano del recettore 2 (HER2 ), fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF), fattore di crescita epidermico (EGFR), sono stati associati con caratteristiche della malattia e può quindi essere utilizzato per informare la gestione del paziente. Ad esempio, i pazienti con tumori che test positivo per HER2 possono essere trattate con trastuzumab più chemioterapia [4], e pazienti con tumori che test positivo per il VEGF possono essere trattati con bevacizumab più chemioterapia [5]. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo di GC rimangono una sfida, in tal modo sono urgentemente necessari biomarcatori inoltre informativi.

I microRNA (miRNA) sono una classe di piccole molecole di RNA coinvolti nella regolazione della traduzione e la degradazione di mRNA [6 ]. MiRNA si legano a sequenze complementari a regioni non tradotte al 3 '(UTR) del loro mRNA bersaglio e inducono la degradazione dell'mRNA o repressione traslazionale [7]. funzioni più conosciute di miRNA sono legati alla regolazione dei geni negativo: l'espressione genica miRNA silenzio, di solito interferendo con la stabilità mRNA o la traduzione della proteina. Negli ultimi anni, si credeva miRNA di agire come oncogene o gene soppressore del tumore, e di contribuire alla iniziazione e progressione del cancro regolando l'espressione genica [8]. La scoperta del cancro-specifica regione a monte ipermetilazione di numerosi miRNA ha dimostrato un meccanismo epigenetico per miRNA aberrante [9], [10].

Nel umana e topi, ci sono due loci genomici (miR-219- 1 e miR-219-2), che codificano miR-219 trascrizioni precursori. miR-219-1 è localizzato sul cromosoma 6 (MI0000296) e mir-219-2 è localizzato sul cromosoma 9 (MI0000740) [11] (Fig. 1A). L'elaborazione dei precursori trascrizioni di dicer genera tre miRNA maturi: miR-219-5p dal 5 'estremità di entrambi i precursori, e miR-219-1-3p e miR-219-2-3p dal 3' fine del pre- miR-219-1 e, pre-miR-219-2, rispettivamente. Dal momento che la regione seme di questi tre prodotti maturi è unico, ogni miRNA è previsto per regolare gli obiettivi unici. Anche se miR-219-5p è noto per essere down-regolato nel cancro multipla come astrocitoma maligno [12] e il carcinoma epatocellulare [13], l'espressione di miR-219-1-3p e miR-219-2-3p non ha stato studiato. È interessante notare che, miR-199B e miR-219-2-3p geni si trovano a prossimità di un segmento del cromosoma 9q34.11 (Fig. 1A). Uno studio precedente dimostrato che miR-199B-5p è stato down-regolato nel medulloblastoma dalla metilazione di un'isola CpG 3 kb a monte del 5'-sito di promotore di miR-199B-5p [14]. Dal momento che la metilazione del DNA può interessare grandi regioni della cromatina e regolare la trascrizione dei geni lontani, è necessario verificare se miR-219-2-3p è down-regolata e disciplinata dalla metilazione come miR-199B-5p nel cancro. In questo studio, abbiamo scoperto che miR-219-2-3p è stato down-regolato nei tessuti GC e associata a fenotipi progressivi di GC. Inoltre, la reintroduzione di miR-219-2-3p ha ridotto la vitalità delle cellule GC e l'apoptosi cellulare indotta, suggerendo che miR-219-2-3p era un soppressore del tumore candidato in GC. Ulteriori analisi della metilazione del promotore di miR-219-2-3p ha indicato che la sua espressione è stata regolata dalla metilazione del correlate isole CpG in una certa misura. Infine, abbiamo scoperto che miR-219-2-3p ha agito come un soppressore del tumore attraverso inibendo l'attività di ERK1 /2 pathway di segnale nelle cellule GC.

Risultati

miR-219-2- 3p è stato espresso in modo differenziale GC e GC linee cellulari

Per valutare l'espressione di miR-219-2-3p in GC, analisi TaqMan RT-PCR è stato condotto in 113 coppie di tessuti GC e abbinati normali campioni di tessuto adiacenti . Rispetto alle normali campioni di tessuto, più della metà dei tumori primari esposti bassi livelli di miR-219-2-3p (58%, 65 113, Fig. 1B). Inoltre, quattro pazienti la cui espressione di miR-219-2-3p sono stati significativi down-regolato furono scelti (Fig. 1D). L'espressione di miR-219-2-3p in quei pazienti e quattro linee di cellule GC (MGC-803, HGC-27, MKN-45, SGC-7901) è stato analizzato per rivelare che miR-219-2-3p è stato anche il basso regolata in cellule di GC (Fig. 1E). Questi risultati suggeriscono che down-regolato miR-219-2-3p è stato un evento frequente in GC umana e potrebbero essere coinvolti nella carcinogenesi gastrica. A causa della universale down-regolazione di miR-219-2-3p in linee cellulari GC testate, MGC-803 e HGC-27 sono stati scelti in modo casuale per ulteriori studi.

Rapporto tra i fattori clinico-patologici e miR-219- espressione 2-3P in GC

Questo studio ha incluso 113 pazienti GC. Per valutare la correlazione tra l'espressione di miR-219-2-3p e le caratteristiche clinico-patologici, i pazienti sono stati divisi in gruppi con down-regulation e up-regulation. Come mostrato nella tabella 1 e Fig.1C, è stata osservata un'associazione statisticamente significativa tra l'espressione di miR-219-2-3p e stadio clinico GC. I pazienti con bassi livelli di espressione di miR-219-2-3p sembravano essere associati con alta qualità e in fase avanzata tumori (p = 0,047, t per campioni indipendenti di prova). Questi dati suggeriscono che le alterazioni di miR-219-2-3p potrebbero essere coinvolti nella progressione del GC.

sovraespressione di miR-219-2-3p nelle cellule GC inibisce la proliferazione cellulare e la sopravvivenza delle cellule

la notevole riduzione di espressione di miR-219-2-3p in campioni GC noi promosso per esplorare il possibile significato biologico di miR-219-2-3p in tumorgenesis. Dato che miR-219-2-3p ha giocato un ruolo nella regolazione della proliferazione cellulare [15], MGC-803 e HGC-27 cellule sono state trasfettate con miR-imita 219-2-3p e strapazzate e analizzato per la crescita cellulare, delle cellule rispettivamente, l'apoptosi e la progressione del ciclo cellulare. Prima di tutto, RT-PCR è stato utilizzato per misurare il livello di miR-219-2-3p dopo esperimenti iperespressione. Abbiamo scoperto che miR-219-2-3p aumentato di oltre il 100 pieghe in miRNA trasfettate MGC-803 e HGC-27 cellule (Fig.2a). Inoltre, il saggio di proliferazione CCK-8 mostrato che il tasso di crescita delle cellule è stato ridotto in miR-219-2-3p imita-trasfettate MGC-803 e HGC-27 celle rispetto alle cellule scramble transfettate o cellule non trattate (Fig. 2b). Dopo trasfezione, il rapporto di inibizione è stata del 26% (48 h) e il 28% (96 h) nelle cellule MGC-803 e il 13% (72 h) e il 14% (96 h) in HGC-27 cellule. Questi risultati suggeriscono che miR-219-2-3p è stato effettivamente coinvolto nella regolazione negativa della crescita cellulare. Tuttavia, non vi è stato alcun effetto significativo sulla arresto del ciclo cellulare nelle cellule trattate GC miR-219-2-3p (Fig. S1). Per affrontare se up-regolazione di miR-219-2-3p sarebbe indurre l'apoptosi delle cellule GC e la morte cellulare, il numero di primi apoptotico MGC-803 e HGC-27 cellule in seguito al trattamento con imita miR-219-2-3p è stata esaminata. Come previsto, poche cellule precoce di apoptosi (10% in MGC-803 o 2,9% in HGC-27) sono stati rilevati nelle cellule trattate con scramble, mentre il trattamento imita miR-219-2-3p aumentato la percentuale delle prime cellule apoptotiche (17,5 % in MGC-803 o 8.3 in HGC-27), come giudicato da annessina V colorazione (Fig. 2C). Pertanto, abbiamo concluso che miR-219-2-3p potrebbe influenzare la sopravvivenza delle cellule in cellule di GC.

sovraespressione di miR-219-2-3p nelle cellule GC inibisce la migrazione cellulare e dell'invasione

Per inoltre rilevare se miR-219-2-3p è associata a progressione della GC, la guarigione delle ferite e il dosaggio transwell sono state eseguite per analizzare l'effetto di espressione di miR-219-2-3p sul comportamento migratorio e invasivo di MGC-803 e HGC- 27 cellule. Abbiamo trovato che l'introduzione di miR-219-2-3p in MGC-803 e HGC-27 cellule comportato una riduzione significativa della migrazione cellulare durante la chiusura di una ferita artificiale creato su un monostrato confluente (Fig. 3A). Queste cellule sono state mantenute in terreno privo di siero nel corso di guarigione della ferita per garantire che qualsiasi comportamento migratorio aumentata non può essere influenzata da proliferazione cellulare alterato. Inoltre, il ripristino di miR-219-2-3p notevolmente inibito normalmente forte capacità invasiva di MGC-803 e HGC-27 cellule, che ha effettuato basso livello endogena di miR-219-2-3p (Fig. 3B). Questi risultati hanno indicato che la sovraespressione miR-219-2-3p contribuisce alla regolazione della motilità cellulare e la progressione GC in vitro.

MIR-219-2-3p espressione è epigeneticamente
regolamentato

In base alla conclusioni di cui sopra, possiamo concludere che miR-219-2-3p era un importante regolatore in GC. Tuttavia, i meccanismi di regolazione dell'espressione miR-219-2-3p erano ancora sconosciuti. Dal momento che molti miRNA sono stati identificati come bersagli di regolamentazione metilazione, come miR-9, miR-34b /c e miR-148a nei carcinomi metastatici [16], e miR-137 e miR-193a nel cancro orale [17], retrovisori 193B e miR-145 nel cancro della prostata [18], [19], abbiamo deciso di analizzare il meccanismo di regolazione dell'espressione miR-219-2-3p dalla sua metilazione genomica. Dopo aver analizzato la regione genomica che attraversa il gene miR-219-2-3p, abbiamo identificato una grande isola CpG (Fig. 4A). Per verificare se miR-219-2-3p stato epigeneticamente regolata in GC, MGC-803, HGC-27 cellule sono state trattate con l'inibitore demethyltransferase, 5-aza-2'-deossicitidina (5-AZA-CdR) e l'istone deacetilasi- inibitore tricostatina A (TSA). Poi l'espressione di miR-219-2-3p mediante RT-PCR è stato analizzato (Fig. 4B). I risultati dimostrato che l'espressione di miR-219-2-3p era up-regolato in due situazioni: per il trattamento 5-Aza-CdR, l'espressione di miR-219-2-3p era up-regolati in MGC-803 ( 5-AZA-CdR 1.5 micromol /L; 2.14 volte) e HGC-27 (5-AZA-CdR 0,5 mmol /L; 3.07 volte) rispetto al gruppo di controllo trattati DMSO; per il trattamento di combinazione 5-Aza-CdR e TSA, l'espressione di miR-219-2-3p era molto più alto in MGC-803 (5-AZA-CdR 1.5 micromol /L; 1.98 volte) e HGC-27 (5 -Aza-CdR 1.5 micromol /L; 1,28 volte) rispetto al gruppo di controllo TSA. Questi risultati hanno indicato che i fattori epigenetici potrebbero influenzare l'espressione di miR-219-2-3p in GC. Sinergia di demetilazione e istone deacetilasi inibizione ha portato alla ri-espressione di miR-219-2-3p in GC. Per rilevare ulteriormente se miR-219-2-3p è stato associato con la metilazione di GC, abbiamo esaminato lo stato di metilazione della regione monte miR-219-2-3p tramite metilazione-specifica PCR (MSP; Fig. 4C). 22 paia di tessuti (tumori primari e dei loro tessuti sani adiacenti abbinate) nei 113 coppie sono state scelte, tra cui 11 pazienti che possedevano più bassi livelli di miR-219-2-3p (down-regulation gruppo) e 11 pazienti che hanno posseduto superiore miR-219 livelli -2-3p (gruppo up-regulation). Abbiamo scoperto che la metilazione del DNA nelle regioni a monte di miR-219-2-3p esisteva sia in tessuti normali e tessuti tumorali adiacenti. Tuttavia, il rapporto ipermetilazione della regione a monte del gene miR-219-2-3p nel gruppo down-regulation era 63,6% (7 del 11), che era più alto rispetto al gruppo di up-regulation (36,3%, 4 del 11 ). Questi risultati suggeriscono che il livello di metilazione della regione monte CpG di miR-219-2-3p è stata maggiore nel miR-219-2-3p down-regolato gruppo che nel up-regolati uno.

sovraespressione di miR-219-2-3p smorza percorso ERK1 /2 segnalazione

l'attivazione di ERK1 /2 pathway è stato ben documentato in vari tipi di tumore, come la GC [20], il cancro del pancreas [21] e il cancro al seno [ ,,,0],22]. Studi precedenti hanno dimostrato l'importanza di ERK1 /2 via di segnalazione nella regolazione della migrazione, invasione e metastasi di linee cellulari di cancro [23]. Per verificare se miR-219-2-3p colpisce le attività cellulari attraverso ERK1 2 pathway /, il livello di fosforilazione di ERK1 /2 in MGC-803 e HGC-27 cellule è stata esaminata dopo sovraespressione miR-219-2-3p. livelli cellulari di p-ERK1 /2 significativamente diminuita in miR-219-2-3p cellule imita-trasfettate rispetto alle cellule scramble-trasfettate o non trattati. Tuttavia, nessuna differenza evidente è stata osservata in totale 2 livello /ERK1 (Fig. 5A). Questi risultati hanno suggerito che la crescita delle cellule GC accelerata potrebbe essere in parte dovuto alla attivati ​​ERK1 /2 vie.

approccio bioinformatica per la ricerca di potenziali obiettivi di
miR-219-2-3p

microRNA modulano gene espressione interagendo con i loro mRNA bersaglio con conseguente degradazione dell'mRNA o la repressione traslazionale. Per studiare ulteriormente il meccanismo di miR-219-2-3p in GC, abbiamo bioinformatically (TargetScan versione 5.2 e miRDB) e funzionalmente implicati miR-219-2-3p in GC, e ha trovato i geni di mira da miR-219-2- 3p (Tabella S2). Tra i 371 bersagli predetti di miR-219-2-3p, 31 delle quali mostrate alto potenziale dal momento che sono stati previsti da entrambi i programmi, mentre altri sono stati previsti solo da uno dei programmi. Di questi 31 geni, ERBB3, MAPK8, SCL7A11, YOD1, TBK1, SOX4 sono risultati essere i geni oncogeni o apoptosi legati da articoli pubblicati precedenti. (Fig. 5B e 5C).

Discussione

Negli ultimi anni, l'evidenza accumulata ha portato oncologi a speculare che i fattori molecolari non rivelati, in particolare non codificante RNA precedentemente classificati come "spazzatura", gioco ruoli importanti nella tumorigenesi e nella progressione tumorale. A seconda delle loro obiettivi mRNA, miRNA può funzionare come soppressori tumorali o promotori di oncogenesi. Tuttavia, i meccanismi che deregolazione miRNA non sono stati ampiamente studiati, tra cui aberranti biogenesi di miRNA e trascrizione [24], [25], l'alterazione epigenetica [26], [27], e l'amplificazione o la perdita di regioni genomiche che codificano miRNA [28] .

Come illustrato nella presente relazione, abbiamo analizzato l'espressione di miR-219-2-3p in 113 pazienti GC e abbiamo trovato che i livelli sembrano essere inferiori a GC. Anche se miR-219-2-3p è stato segnalato per essere strettamente correlata alla retinopatia diabetica [29], oligodendrociti [15], MALATTIA DI ALZHEIMER [30] e il glioblastoma [12], la sua funzione in GC Resta da stabilire. Inoltre, abbiamo dimostrato che ri-espressione di miR-219-2-3p in cellule di GC portato alla induzione di apoptosi cellulare e ridotta vitalità cellulare. Questi risultati ci hanno permesso di ipotizzare che la down-regolazione di miR-219-2-3p potrebbe fornire un vantaggio di sopravvivenza per le cellule GC. Tuttavia, il meccanismo responsabile di miR-219-2-3p down-regulation in GC è ancora sconosciuta. Poiché la perdita a 9q34.11, dove si trova miR-219-2-3p, è raramente rilevata in GC [31], è improbabile che la perdita allelica è responsabile della sua down-regulation. D'altra parte, abbiamo scoperto che miR-219-2-3p era decisamente up-regolata quando le cellule GC, MGC-803 e HGC-27, sono stati trattati sia con 5-Aza-CdR e TSA. Inoltre, l'analisi computazionale rivela che miR-219-2-3p si trova in un'isola CpG sul cromosoma 9q34.11. Pertanto, sembra possibile che la metilazione del DNA e degli istoni deacetylation possono essere associati con regolazione miR-219-2-3p. Con MSP, le frequenze campioni di metilazione rilevati nella regione a monte del miR-219-2-3p era più alta nel gruppo di miR-219-2-3p down-regolato rispetto al gruppo di up-regolati. Questa specificità fornito l'ipotesi di una relazione tra l'espressione di miR-219-2-3p e metilazione del DNA. Nel complesso, i risultati hanno indicato che la metilazione è un meccanismo importante per miR-219-2-3p down-regulation in GC.

eseguite previsione di programmi TargetScan e miRDB e ha scoperto che 6 geni potrebbero essere potenziali obiettivi di miR -219-2-3p. Tra gli obiettivi di candidati di miR-219-2-3p, la tirosina chinasi del recettore ERBB3 (epidermal growth factor receptor famiglia) ha attirato la nostra attenzione. Alti livelli di ERBB3 è fortemente associato con la progressione del tumore e la scarsa prognosi dei pazienti con CG [32] - [34] e gli inibitori di EGFR chinasi gefitinib potrebbe prevenire EGFR e ERBB2 attivazione di ERBB3. Nel frattempo, l'espressione ERBB3 serve anche come un predittore efficace di sensibilità a gefitinib [35]. E 'noto che repressa trascrizione ERBB3 inibisce la segnalazione cascate da ERK1 /2 vie [36]. Tuttavia, i geni bersaglio previsti devono essere ulteriormente sperimentalmente validati. Inoltre, miRNA può funzionare secondo un modello circuiti combinatoria, in cui un singolo miRNA può rivolgersi a più mRNA, e diversi miRNA coespressi può indirizzare un singolo mRNA. Recenti studi hanno suggerito che il concetto biologico di 'uno degli obiettivi di successo Multiplo' potrebbe essere utilizzato nelle terapie cliniche [37]. E 'probabile che uno specifico miRNA può funzionare tramite cooperativa down-regolazione di molteplici obiettivi e miRNA funzione anche sopprimendo la traduzione dei loro geni bersaglio. Per esplorare il pieno impatto di un miRNA, studi di proteomica genoma dovrebbe essere fatto.

In conclusione, la nostra espressione e studi funzionali suggerito che miR-219-2-3p stato differenziale espressa dal meccanismo di metilazione e aveva un funzione di soppressione tumorale regolando i percorsi di segnale ERK1 /2-correlati in GC. Nel frattempo, l'espressione inferiore del miR-219-2-3p in campioni GC era correlata con una maggiore grado e fase successiva. Reintrodurre espressione di miR-219-2-3p sulle cellule GC soppresse la proliferazione cellulare, la migrazione, l'invasione e l'apoptosi indotta indicato che modello terapeutico a base di miRNA potrebbe servire come base per lo sviluppo di nuove potenziali terapie nel cancro gastrico.

Materiali e metodi

Tissue campioni

tumori gastrici ed i loro tessuti morfologicamente normali (che si trova > 3 cm di distanza dal tumore) sono stati ottenuti tra novembre 2009 e novembre 2011 dalle 113 pazienti sottoposti a GC chirurgia presso Cancer Hospital della Accademia Cinese delle scienze mediche (CICAMS, n = 21), ospedale Chinese PLA Generale (301 ospedale, n = 31), e il primo ospedale affiliato di Shanxi Medical University (n = 61). L'uso dei campioni di tessuto per tutti gli esperimenti è stato approvato dal consiglio etico dell'Istituto di scienze mediche di base, Accademia cinese delle scienze mediche. Tutti i partecipanti hanno fornito il loro consenso informato verbale per partecipare a questo studio, ed i loro consensi verbali informati sono state svalutate. Questo processo di consenso è stata approvata anche dal Consiglio di etica. I campioni di tessuto sono stati tagliati in due parti, una è stata fissata con formalina al 10% per la diagnosi istopatologica, e l'altro è stato immediatamente snap-congelati in azoto liquido e conservato a -196 ° C in azoto liquido fino estrazione di RNA. Questo gruppo era composto da 95 maschi, 17 femmine e uno senza informazioni genere con un'età media di 58 anni (range 31-82 anni) .Formalin-fissati blocchi di tessuto incluse in paraffina di GC sono stati raccolti dal Cancer Hospital della Accademia Cinese delle Medical Sciences (CICAMS, n = 4) tra il 2009 e il 2011. a causa di differenze individuali tra i pazienti, ci mancavano le informazioni di alcuni dati clinico-patologiche. L'uso dei campioni di tessuto per tutti gli esperimenti è stato approvato da tutti i pazienti e dal Comitato Etico dell'istituzione. Le caratteristiche dei pazienti sono descritti nella tabella 1.

colture cellulari e Transfection

Un totale di 4 linee cellulari umane GC MGC-803 (cancro gastrico mucinoso, scarsamente differenziato), HGC-27 ( linfonodo metastatico, carcinoma indifferenziato), MKN-45 (carcinoma anello con sigillo scarsamente differenziato), SGC-7901 (adenocarcinoma moderatamente differenziato) sono stati esaminati in questo studio. Il MGC-803 HGC-27, MKN-45, linea di cellule SGC-7901 è stato acquistato dal cellulare Resource Center dell'Istituto di scienze mediche di base, Accademia cinese delle scienze mediche e Pechino Unione Medical College (Pechino, Cina). MGC-803 è stato propagato nel mezzo di Dulbecco modificato Eagle (Gibco; Invitrogen, Life Technologies, Germania), supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS, PAA, Pasching, Austria) e streptomicina (100 mg /ml), la penicillina (100 U /ml). La HGC-27, MKN-45, SGC-7901 sono stati mantenuti in RPMI 1640 medium (PAA) supplementato con 10% FBS (PAA). Le linee di cellule umane GC MGC-803, HGC-27 sono state trasfettate con miR-imita 219-2-3p e imita il controllo miRNA negativi (GenePharma, Shanghai, Cina, Tabella S1) ad una concentrazione finale di 10 nmol /L utilizzando Dharmafect 1 (Thermo Fisher, iL, USA) secondo le istruzioni del produttore

TaqMan RT-PCR per miRNA espressione

l'RNA totale è stato estratto dalle cellule e tessuti con il reagente Trizol (Invitrogen, Calsbad. , CA, USA). MiRNA sono stati quantificati mediante real-time PCR utilizzando TaqMan MicroRNA saggio (Invitrogen, USA). DNA complementare sintesi First-strand (cDNA) è stata effettuata da 1 mg di RNA totale in 12 ml di volume finale contenente 2 M stem-loop di primer, 10 mM dNTP Mix (Invitrogen, USA). La miscela era piastra a 65 ° C per 5 minuti, e poi mescolato con 5 × RT buffer 0.1 M DTT, 200 U /ml MultiScribe transcriptasi inversa e 40 U inibitore RNasi microlitri /(Invitrogen, USA). La miscela era piastra a 37 ° C per 55 min, 70 ° C per 15 min e poi mantenuto a -20 ° C. Real-time PCR è stata effettuata utilizzando un protocollo standard TaqMan PCR. Le 20 reazioni PCR microlitri inclusi 1 ml di prodotto RT, 1 × universale TaqMan Master Mix e 1 × sonda TaqMan /miscela di primer (Invitrogen, Stati Uniti d'America, Tabella S1). Tutte le reazioni RT tra cui non-template controlli sono stati eseguiti in triplicato. Tutti i dati mRNA quantificazione è stato normalizzato a U6. La quantità relativa di trascrizione è stato calcolato utilizzando il metodo comparativo Ct.

5-Aza-CdR e Trichostatin Un trattamento di linee cellulari

linee di cellule GC MGC-803 sono stati trattati con 5-Azatioprina 2'-deossicitidina (5-AZA-CdR, Sigma-Aldrich, stati Uniti d'America) a 0.7 mmol /l, 1.5 mmol /l, 3 mmol /L e HGC-27 sono stati trattati con 5-Aza-CdR a 0,5 mmol /L, 1 mmol /L, 1.5 micromol /L per 3 giorni o 300 nmol /L tricostatina a (TSA, Sigma-Aldrich, Stati Uniti d'America) per 24 ore. Per il trattamento di combinazione, le cellule sono state trattate con 5-Aza-CdR per 48 ore in primo luogo. Poi TSA (300 nmol /L) è stato aggiunto, e le cellule sono stati trattati per ulteriori 24 ore. Il terreno di coltura contenente il farmaco è stato sostituito ogni 24 ore. RNA di linee cellulari è stato purificato con TRIzol reagente seguendo le istruzioni del produttore. sintesi del cDNA è stata effettuata come descritto in precedenza, e 1 ml di cDNA diluito per ciascun campione è stato amplificato mediante RT-PCR utilizzando il protocollo precedentemente descritto.

isolamento del DNA e bisolfito modifica

DNA genomico è stato ottenuto da -196 ° C nei tumori primari di azoto liquido, e la loro abbinati tessuti sani adiacenti (n = 22, comprendono 11 pazienti che espressione di miR-219-2-3p sono stati down-regolato e gli altri sono stati up-regolati) e Usato Biomed DNA Kit (Biomed, Pechino, Cina) secondo le istruzioni del produttore. trattamento e recupero di campioni bisolfito sono state effettuate con il kit Epitect bisolfito (Qiagen, Hilden, Germania). Genomic DNA (2 mg) in 20 microlitri di acqua utilizzato per ciascuna reazione e mescolato con 85 microlitri della miscela bisolfito e 35 microlitri DNA proteggere buffer. conversione bisolfito è stata eseguita su un termociclatore come segue: 99 ° C per 5 min, 60 ° C per 25 min, 99 ° C per 5 min, 60 ° C per 85 min, 99 ° C per 5 min, 60 ° C per 175 min e 20 ° C indefinitamente. Il bisolfito trattati con DNA è stato recuperato da Epitect Spin Column e successivamente sequenziato per confermare l'efficienza della conversione bisolfito.

La metilazione analisi

MSP è stato utilizzato per analizzare la metilazione di miR-219-2-3p regione upstream in linee cellulari e tessuti. Methprimer è stato utilizzato per progettare MSP Primer (Tabella S1). Le reazioni MSP sui nuovi primer sono stati ottimizzati utilizzando il controllo metilato positivo (M-DNA), che con una normale DNA dei linfociti periferici umane trattate in vitro con SSS I metiltransferasi (New England Biolabs, Beverly, MA). Il DNA di due normali linfociti periferici umani stato utilizzato come controllo normale. Touchdown PCR consisteva di due fasi: Fase 1 comprendeva una denaturazione iniziale di 95 ° C per 5 minuti, seguito da 45 cicli di denaturazione a 95 ° C per 30 s, annealing a temperature variabili per 30 s, e estensione a 72 ° C per anni 40. Nel primo ciclo, la temperatura di ricottura è stata impostata a 58 ° C e, in ciascuno dei 10 cicli successivi, la temperatura di ricottura è diminuita di 0,6 ° C. Fase 2 consisteva di 35 cicli di 95 ° C per 30 s, 52 ° C per 30 s, e 72 ° C per 40 s. MSP prodotti sono stati analizzati il ​​3% gel di poliacrilammide

La proliferazione cellulare, apoptosi e ciclo cellulare saggio

Le cellule sono state incubate a 10% CCK-8. (Dojindo, Kumamoto, Giappone) diluito in normale terreno di coltura a 37 ° C fino a quando la conversione del colore visivo si è verificato. tassi di proliferazione sono stati determinati a 0, 24, 48, 72, 96 ore dopo la trasfezione. L'assorbanza di ciascun pozzetto è stata misurata con un lettore di micropiastre impostato a 450 nM e 630 nM. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in quadruplicato. Il saggio apoptosi è stato eseguito su linee cellulari HGC-27 MGC-803 e 72 ore dopo la trasfezione utilizzando il kit PE annessina V Apoptosis Detection I (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) e analizzati da cellule di fluorescenza-attivato (FACS) . L'analisi del ciclo cellulare è stato eseguito su linee cellulari HGC-27 MGC-803 e 48 ore dopo la trasfezione con imita miR-219-2-3p e scramble rispettivamente. Le cellule sono state raccolte, lavate due volte con PBS freddo, fissato ghiacciata etanolo al 70%, e incubate con ioduro di propidio (PI) e RNasi A, poi analizzati per FACS. Ogni campione è stato analizzato in triplicato.
Test

migrazione cellulare e dell'invasione

MGC-803 e HGC-27 cellule sono state coltivate a confluenza in 12 pozzetti piatti di plastica e trattati con scramble o miR-219 imita -2-3p. 24 ore dopo la trasfezione, le ferite e vinci lineare (in triplice copia) sono stati creati sulle monostrati cellulari confluenti utilizzando una punta della pipetta 200 microlitri. Per rimuovere le cellule dal ciclo cellulare prima della ferita, le cellule sono state mantenute in terreno privo di siero. Per visualizzare le cellule migrate e la guarigione delle ferite, le immagini sono state scattate a 0, 12, 24, 36, 48, 60 e 72 ore ore. Un totale di dieci aree sono stati selezionati in modo casuale da ogni pozzetto e le cellule in tre pozzi di ogni gruppo sono stati quantificati. Per i saggi di invasione, dopo 24 ore di trasfezione, 1 × 10 ^{5 cellule in mezzi privi di siero sono stati seminate su camere di migrazione transwell (8 micron dimensione dei pori, Millipore, Svizzera) che sono stati rivestiti con Matrigel (Sigma-Aldrich; St Louis, MO, USA) sulla camera superiore. Supporti contenenti il ​​20% FBS è stato aggiunto alla camera inferiore. Dopo 24 ore, le cellule non invadono stati rimossi con cotone idrofilo, cellule invasive situate sulla superficie inferiore della camera sono state colorate con May-Grunwald-Giemsa (Sigma Diagnostics, St Louis, Missouri, USA) e contate con un microscopio (Olympus, Tokyo, Giappone). Gli esperimenti sono stati ripetuti in modo indipendente per tre volte.}

isolamento delle proteine ​​e occidentale
blotting

Ai tempi indicati, MGC-803 cellule e HGC-27 cellule sono state raccolte in PBS freddo e lisate sul ghiaccio in la preparazione a freddo di tampone radioimmunoprecipitazione modificato integrato con inibitori della proteasi. la concentrazione delle proteine ​​è stato determinato dal BCA Protein Assay Kit (Bio-Rad, Milano, Italia) e la stessa quantità di proteine ​​sono stati analizzati mediante SDS-PAGE (10% acrilammide). I gel sono stati electroblotted su membrane di nitrocellulosa (Millipore, Bedford, MA, USA). Per gli esperimenti di immunoblot, membrane sono state bloccate per 2 h con 5% di latte secco non grasso in soluzione salina tamponata con Tris contenente 0,1% Tween-20, e incubate a 4 ° C durante la notte con l'anticorpo primario. Rilevamento è stato eseguito da anticorpi secondari perossidasi-coniugato utilizzando il sistema chemiluminescenza potenziata. Gli anticorpi primari utilizzati sono stati: GAPDH da Zhong-Shan Jinqiao (Pechino, Cina); ERK1 /2 (coniglio anti-ERK1 /2, New England Biolab, NEB) e fosfo-ERK1 /2 (coniglio anti-fosfo-ERK1 /2, New England Biolab, NEB)

Istologia
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• PLoS ONE: alta espressione di shock termico Protein 90 è associato con il tumore aggressività e prognosi infausta in pazienti con cancro gastrico avanzato
• PLoS ONE: visualizzazione non invasiva di MicroRNA-16 nella chemioresistenza del cancro gastrico Utilizzando un sistema Dual gene reporter Imaging