risposta trascrizionale globale per la carenza di anidrasi carbonica IX nel topo stomach

risposta trascrizionale globale per la carenza di anidrasi carbonica IX nel topo stomaco
Abstract
sfondo
anidrasi carboniche (CA) sono una famiglia di enzimi che regolano l'omeostasi del pH in vari tessuti. CA IX è un membro eccezionale di questa famiglia perché oltre alla funzione di base CA, è stato implicato in vari altri processi fisiologici e patologici. Funzioni suggerite per CA IX includono ruoli in adesione cellulare e l'invasione delle cellule maligne. Inoltre, CA IX probabile regola la proliferazione e la differenziazione cellulare, che è stato dimostrato in Car9
- /- mice. Questi topi avevano gastrica iperplasia delle cellule fossa e l'esaurimento delle cellule principali; Tuttavia, i meccanismi molecolari specifici dietro i fenotipi osservati rimangono sconosciute. Pertanto, abbiamo deciso di studiare l'effetto della carenza di CA IX sull'espressione genica dell'intero genoma in mucosa gastrica. Ciò è stato fatto usando Illumina Sentrix ®Mouse-6 matrici Espressione BeadChip. L'espressione di diversi geni con valori cambiamento notevole piega è stato confermato dal QRT-PCR.
Risultati
carenza di CA IX causato l'induzione di 86 geni e repressione dei 46 geni nella mucosa gastrica. C'era 92,9% concordanza tra i risultati ottenuti dall'analisi microarray e RT-PCR. I geni differenzialmente espressi compresi coloro che sono coinvolti nei processi di sviluppo e differenziazione cellulare. Inoltre, la carenza di CA IX alterato l'espressione dei geni responsabili della risposta immunitaria e downregulated l'espressione di diversi enzimi digestivi.
Conclusioni
analisi microarray identificati diversi geni potenziali la cui espressione alterata potrebbe spiegare il fenotipo disturbato linea cellulare in Car9
- /- mucosa gastrica. I risultati hanno anche indicato un ruolo nuovo per CA IX nella regolazione dei processi immunologici e la digestione. Questi risultati rafforzano il concetto che il ruolo principale di CA IX non è la regolazione del pH a livello della mucosa dello stomaco. Invece, è necessario per il corretto funzionamento di diversi processi fisiologici
Sfondo
I anidrasi carboniche (CA) sono una famiglia di metalloenzimi contenenti zinco che catalizzano l'idratazione reversibile di anidride carbonica nella reazione: CO. 2 + H 2O ↔ H + + HCO 3 -. Essi partecipano a numerosi processi fisiologici, come l'equilibrio acido-base, CO 2 e HCO 3 - il trasporto, la respirazione, il riassorbimento osseo, ureagenesis, la gluconeogenesi, la lipogenesi, la produzione di fluidi corporei, e la fecondazione [ ,,,0],1, 2]. La famiglia CA compone di 13 isoenzimi attivi nei mammiferi, di cui 12 sono espressi e funzionali nell'uomo [3]. Gli isoenzimi CA hanno diversi pattern di espressione tissutale, caratteristici localizzazioni subcellulari, nonché uniche proprietà cinetiche e inibitorie.
CA IX è una proteina dimerica associata alla membrana cellulare [4, 5]. Nella sua forma matura, CA IX è composto di un dominio N-terminale proteoglicano (PG), un dominio catalitico CA, una regione transmembrana, e una breve coda intracitoplasmatica al C-terminale [6]. CA IX è l'unico membro della famiglia CA contenente un dominio PG in aggiunta al dominio CA. Di conseguenza, CA IX è stato suggerito di partecipare ai processi di adesione cellulare. Infatti, utilizzando MDCK (Madin-Darby rene canino) cellule epiteliali, è stato dimostrato che CA IX riduce l'adesione cellula-cellula E-caderina-mediata interagendo con β-catenina [7]
. IX CA è espresso in solo alcuni tessuti normali con l'espressione di essere più forte in umano, ratto, e topo mucosa gastrica, dove è presente dai box gastriche alle ghiandole gastriche profonde [8, 9]. CA IX è limitata alla superficie basolaterale delle cellule epiteliali ed è prodotto da tutti i principali tipi di cellule dell'epitelio gastrico [8]. CA IX è un membro della famiglia eccezionale CA perché espressa in diversi tumori che nascono da CA IX tessuti negativi compresi renale, polmone, della cervice, dell'ovaio, dell'esofago, e carcinomi della mammella [6]. Tuttavia, le lesioni precancerose e del cancro gastrico hanno dimostrato diminuita espressione di CA IX [10]. Nei tessuti tumorali, CA IX è collegata con il fenotipo ipossico mediata dal fattore di trascrizione inducibili 1 (HIF-1), che si lega all'elemento sensibile ipossia, HRE, del CA9
promotore [11]. In condizioni di ipossia, le cellule tumorali dipendono principalmente sul metabolismo anaerobico nella loro produzione di energia. Questo metabolismo anaerobico tumore genera eccessi di prodotti acidi, come l'acido lattico e H + che devono essere estruso dall'interno delle cellule. E 'stato dimostrato che CA IX può contribuire alla acidificazione del mezzo extracellulare ipossico, contribuendo così cellule tumorali per neutralizzare il pH intracellulare [12]. Di conseguenza, CA IX sovraespressione indica spesso cattiva prognosi e la resistenza alla radio-classica e chemioterapie [13]. Tuttavia, CA IX non è solo confinato alle regioni ipossiche dei tumori, che indica che ci potrebbero essere alcuni altri percorsi che ne regolano l'espressione. Infatti, l'espressione di CA IX può essere indotta in condizioni normossia di elevata densità cellulare, e questo regolazione è mediata da fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K) di segnalazione [14]. Inoltre, il mitogeno-activated protein chinasi (MAPK) è coinvolto nella regolazione dell'espressione IX CA tramite il controllo del CA9
promotore per entrambi i segnali HIF-1-dipendente e -indipendenti [15]. Questo percorso è anche correlata con il percorso PI3K e la SP1 (specificità proteina 1) fattore di trascrizione
La generazione di Car9
-. /- Topi ha rivelato che oltre alla regolazione del pH e l'adesione delle cellule, CA IX possiede altri ruoli funzionali [16]. Questi Car9
knockout mice non mostrava anormalità nella crescita, potenziale riproduttivo, e la durata. Tuttavia, la carenza CA IX provocato iperplasia della mucosa gastrica. La mucosa iperplastico conteneva un aumento del numero e della proporzione delle cellule pit producono muco, mentre il numero e la percentuale di cellule principali è stato ridotto. Il numero totale di cellule parietali rimasto invariato, e di conseguenza, CA topi IX-deficienti avuto normale pH gastrico, secrezione acida, e livelli di gastrina siero. Così, questi risultati dimostrano che CA IX contribuisce al controllo della differenziazione e proliferazione di linee cellulari epiteliali della mucosa gastrica. Un precedente studio ha esaminato se gli effetti della carenza di CA IX possono essere modificati da una dieta ad alto contenuto di sale, un noto fattore di co-cancerogenesi [17]. Questi risultati hanno mostrato che la dieta ad alto contenuto di sale leggermente aumentato l'atrofia ghiandolare del corpo mucosa Car9
- /- topi C57BL /6, che tale effetto non è stato osservato nei topi BALB /c. Tuttavia, non metaplastiche o displasiche anomalie sono state osservate a livello dell'epitelio gastrointestinale di CA IX-deficienti C57BL 6 topi /. Così, queste osservazioni suggeriscono che CA IX sola carenza non può essere un fattore cancerogeno significativo, ma potrebbe avviare un processo cancerogeno influenzando la proliferazione cellulare e /o differenziazione nella mucosa gastrica.
Questo studio è stato progettato per comprendere meglio il fenotipo iperplastica di la mucosa dello stomaco di Car9
- /- mice perché i meccanismi molecolari alla base di esso sono attualmente sconosciute. Inoltre, abbiamo voluto chiarire più precisamente i ruoli funzionali di CA IX, in quanto vi è un crescente corpo di prove che dimostrano che si estendono ben oltre la regolazione del pH. A questo scopo, una analisi dell'espressione tutto il genoma è stata eseguita. l'analisi dei dati microarray rivelato diversi geni la cui espressione è stato cambiato a causa di Car9
distruzione genica nella mucosa gastrica.
Risultati
risposta trascrizionale alla carenza Car9 nella parete dello stomaco
RNA stomaco da 6 Car9
- /- mice e 6 topi wild-type è stato analizzato mediante microarray. L'analisi ha rivelato 86 geni upregulated e 46 geni inibiti e utilizzando un fold change cut-off di ± 1.4 per monte ea downregulated rispettivamente espressione, (vedi file aggiuntivo 1: Elenco dei geni differenzialmente espressi nello stomaco di Car9
- /- mice). Questo valore di cut-off è stata proposta come un adeguato livello sopra il quale vi è una forte correlazione tra microarray ei dati QRT-PCR, indipendentemente da altri fattori come l'intensità posto e ciclo soglia [18]. I cambiamenti piega variavano da 10,46 a -12,14. Qui, viene visualizzato un elenco di geni con un valore di cut-off di ± 2,5 volte (tabelle 1 e 2). Quando si utilizzano questi criteri, tutti i geni con significativamente (p < 0,05) vengono visualizzati espressione alterata, cioè, 14 geni con espressione indotta e 21 geni con espressione repressa. L'elenco di tutti i geni regolati è stato funzionalmente annotati (vedi file aggiuntivo 2: l'annotazione funzionale dei geni regolati nello stomaco di Car9
topi knockout), che mostrano un arricchimento di attività idrolasi, i processi di sviluppo, la differenziazione delle cellule, la proteolisi, l'attività peptidasi, attività strutturale molecola e processo di sistema immunitario, tra gli altri. Le categorie annotazione funzionale e numeri di geni in ogni categoria sono riportati nella tabella 1 3.Table geni con espressione upregulated usando un valore di cut-off di 2,5 volte.
simbolo Gene
Descrizione
GenBank number

FC

QRT-PCR

Cym
chymosin
NM_001111143
10.46
19.66
Slc9a3
solute carrier famiglia 9 (sodio /scambiatore di idrogeno), membro 3
NM_001081060
8.07
10.72
U46068
sequenza di cDNA U46068, variante di trascrizione 2
NM_153418
5.95
Dmbt1
cancellato nei tumori maligni al cervello 1
NM_007769
5.68
5.29
Il1rl1
interleuchina 1 receptor-like 1, variante di trascrizione 2
NM_010743
5.38
8.95
Tm4sf5
transmembrana 4 membro superfamiglia 5
NM_029360
4.26
9130204L05Rik
RIKEN cDNA 9130204L05 gene
NM_001101461
4.19
Sftpd
surfattante proteina associata D
NM_009160
4.11
3.69
Nccrp1
non specifica proteina recettore delle cellule citotossiche 1 omologo (pesce zebra)
NM_001081115
3.81
Pkp4
plakophilin 4, trascrizione variante 1
NM_026361
3.54
1.09
Sprr2d
piccola proteina ricca di prolina 2D
NM_011470
3.46
Gm14446
predetto gene 14446, trascrizione variante 2
NM_001101605
3.45
Sprr3
piccolo ricco di prolina proteine ​​3
NM_011478
3.39
Sprr2i
piccola ricchi di proteine ​​prolina 2I
NM_011475
3.31
Sprr1a
piccola proteina 1A ricchi di prolina
NM_009264
3.30
IVL
involucrin
NM_008412
3.08
Serpinb12
serina (o cisteina) inibitore peptidasi , clade B (ovoalbumina), membro 12
NM_027971
3.02
KRT10
cheratina 10
NM_010660
3.01
Gm94
predetto gene 94
NM_001033280
2.94
Krt13
cheratina 13
NM_010662
2.94
Gsdmc2
gasdermin C2, variante di trascrizione 2
NM_177912
2.88
Lor
loricrin
NM_008508
2.84
Dmkn
dermokine, trascrizione variante 2
NM_172899
2.78
Ly6d
linfociti antigene 6 complesso, locus D
NM_010742
2.69
KRT1
cheratina 1
NM_008473
2,52
Tabella 2 geni con espressione inibiti con un valore di cut-off di -2.5 volte.
simbolo Gene
Descrizione
numero GenBank
FC
QRT-PCR
Try4
tripsina 4
NM_011646
-12,14
PRSS1
proteasi, serina, 1 (tripsina 1)
NM_053243
-10,57
Amy2a5
amilasi 2A5, pancreatica
NM_001042711
-9,85
Cela2a
chimotripsina-simile elastasi famiglia, membro 2A
NM_007919
-7,59
-16,23
Gm12888
gene predetto 12888
NM_001033791
- 7.12
Gdf9
crescita fattore di differenziazione 9
NM_008110
-7,04
Blm
Bloom sindrome omologo (umana), variante di trascrizione 1
NM_007550
-6,27
Pnlip
lipasi pancreatica
NM_026925
-6,23
-23,88
Cfd
complemento fattore D (Adipsin)
NM_013459
-5.35
-27,45
Ctrb1
chymotrypsinogen B1
NM_025583
-5.00
Mug1
murinoglobulin 1
NM_008645
-4,30
Sostdc1
sclerostina dominio contenente 1
NM_025312
-4,17
Tmed6
transmembrana emp24 trasporto dominio proteina contenente 6
NM_025458
-4.07
CPA1
carbossipeptidasi A1
NM_025350
-3.95
Slc27a2
famiglia vettore soluto 27 (acido grasso trasportatore), membro 2
NM_011978
-3.80
Adipoq
adiponectina, C1Q e il dominio di collagene contenente
NM_009605
-3,74 -20,51

car3
carbonica 3
NM_007606
-3,72
-15,39
Egf
fattore di crescita epidermico
NM_010113
-3,68 -3,71

Abpg
androgeni gamma binding protein
NM_178308
-3.67
Slc38a5
famiglia vettore soluto 38, membro 5
NM_172479
-3,64
Chia
chitinasi,
acido NM_023186
-3,52
LOC638418
predetto: simile alla proteina Ela3
XM_914439
-3,48
LOC100043836
predetto: simile a lacrimale delta proteina androgeno-binding, variante trascrizione 1
XM_001481113
-3,41
EG640530
predetto: gene predetto, EG640530
XM_917532
-3,37
Nrn1
neuritina 1
NM_153529
-3.36
Cela3b
chimotripsina-simile elastasi famiglia, membro 3B
NM_026419
-3,32
-75,74
Spink3
inibitore della serina peptidasi, Kazal tipo 3
NM_009258
-3,32
scd1
stearoil-coenzima A desaturasi 1
NM_009127
-3,27
Ctrl
chimotripsina-simile
NM_023182
-3,19
Gper
G protein-coupled recettore degli estrogeni 1
NM_029771
-2,96
sycn
syncollin
NM_026716
-2,91
Bhlha15
elica-ansa-elica famiglia, membro a15
NM_010800
-2,77
Cpb1
carboxypeptidase B1 (tessuto)
NM_029706
-2,73
-18,22
Slc5a8
famiglia vettore soluto 5 (ioduro trasportatore), membro 8
NM_145423
-2,68
CYP2E1 del citocromo P450
, famiglia 2, sottofamiglia e, polipeptide 1
NM_021282
-2.65
Zg16
zimogeno granulo proteine ​​16
NM_026918
-2,57
Tabella 3 le categorie di annotazione funzionali per i geni regolati da carenza di CA IX.
categoria funzionale

Totale geni regolati
geni upregulated
geni inibiti
i processi di sviluppo *
20
13 7
cheratinizzazione e la differenziazione dei cheratinociti
8 Pagina 8
0
strutturale attività molecola
13
13
0
impianto dell'embrione, gravidanza femminile, e il ciclo mestruale 3
3
0
processo ritmico 4
3
1 processo multi-organismo
5
5
0
differenziazione cellulare
16
12 4
serina-tipo di attività endopeptidasi, serina attività di idrolasi, e serina-tipo di attività peptidasi
9 3
6
proteolisi
15
6
9 attività
Peptidase
14
5
9 attività
endopeptidasi 10
4
6
tripsina e l'attività chimotripsina
4
1 3
attività Hydrolase
22 Pagina 8
14
costituente strutturale del citoscheletro
5
5
0
cellulare comunicazione
4 4
0
attività Metallocarboxypeptidase, l'attività carbossipeptidasi, e l'attività metalloexopeptidase 3
0 3
serina-tipo di attività inibitore endopeptidasi, endopeptidasi attività inibitore, e inibitore della proteasi attività 4
2 2
taxi e chemiotassi 4
3
1 Response to stimolo esterno
7 4
3 processo di sistema immunitario

risposta 10
5
5
Difesa 7
5 2
regolazione positiva della differenziazione cellulare 3
2
1 PPAR via di segnalazione 3
0 3
leucociti migrazione 3
2
1 * Una categoria rappresentante per la seguente categorie si sovrappongono. morfogenesi epidermide, la morfogenesi dei tessuti, di sviluppo dell'epidermide, lo sviluppo ectoderma, lo sviluppo dei tessuti, lo sviluppo degli organi, di sviluppo struttura anatomica, struttura anatomica morfogenesi, processo di sviluppo cellulare, sviluppo organismal multicellulare, e differenziazione delle cellule epidermiche
Conferma dei risultati di microarray per QRT-PCR
cambiamenti nei livelli di espressione di geni selezionati sono stati confermati, ed i risultati sono stati convalidati da microarray QRT-PCR usando gli stessi campioni di RNA come quelli utilizzati per il microarray. Quattordici geni con valori fold change notevoli sono stati selezionati per convalida sulla base dei risultati di annotazione funzionale. I geni selezionati coinvolti i rappresentanti di diverse categorie funzionali. Tredici (92,9%) su 14 geni ha mostrato risultati concordanti tra analisi di microarray e QRT-PCR (Tabelle 1 e 2, Figura 1). L'unico risultato è stato discrepanti
Pkp4, che è stato upregulated secondo il microarray e non è cambiato secondo il QRT-PCR (1,09 volte). Figura 1 Verifica dei dati di microarray da Car9 - /- mice by QRT-PCR. L'espressione di vari trascritti in 6 Car9
- /- mice è stata paragonata a quella in 6 controlli wild-type. Vengono visualizzati i valori normalizzati di esperimenti in triplo. Un'analisi, QRT-PCR di 6 geni con espressione indotta. valutazione B, QRT-PCR di 8 geni con espressione repressa. differenze statisticamente significative rispetto ai topi wild-type sono stati determinati. * P < 0,05; ** P < . 0.01
Discussione
Uno studio precedente ha mostrato un fenotipo iperplastico della mucosa gastrica corpo in Car9
- /- mice [16]. carenza di CA IX ha portato alla sovrapproduzione di cellule pit gastrici e riduzione delle cellule principali. Abbastanza sorprendentemente, il pH gastrico di CA topi IX-deficienti è rimasto inalterato. Sulla base di queste osservazioni, si può concludere che il ruolo principale di CA IX nella mucosa dello stomaco non è legato alla regolazione del pH ma è necessario per la normale morfogenesi gastrica e omeostasi all'interno della mucosa gastrica. In questo lavoro, si segnala alterazioni nell'espressione di mRNA che possono contribuire ai cambiamenti fenotipici riportati nello stomaco di Car9
topi -carente. Tuttavia, si deve prendere in considerazione che alcuni di questi cambiamenti possono semplicemente riflettono differenze nelle proporzioni relative di vari tipi di cellule all'interno della mucosa gastrica
Come previsto, il Car9
-. /- Fenotipo cambiato l'espressione di geni coinvolti nei processi di sviluppo e differenziazione cellulare. L'esaurimento delle cellule principali in Car9
- /- mucosa gastrica può essere spiegato dal significativo down-regulation della base famiglia elica-ansa-elica, membro A15 /Mist1
(Bhlha15
) gene, che è un fattore di trascrizione di base di classe B elica-ansa-elica (bHLH) che presenta specifiche cellule acinose espressione [19]. Mist1 espressione genica si osserva in una vasta gamma di tessuti con secrezione di tipo sieroso compresi il pancreas, ghiandole salivari, cellule principali dello stomaco, cellule Paneth del piccolo intestino, vescicole seminali, ghiandole lacrimali e [20]. La cancellazione di Mist1
blocchi normale ridifferenziazione mucosa delle cellule del collo nelle cellule principali zymogenic come tutte le cellule zimogeno secernenti basali in Mist1
- /-. Topi mostrano molteplici difetti strutturali [21] Un altro candidato interessante
per quanto riguarda la linea cellulare di disturbo a livello dell'epitelio gastrico di CA topi IX-deficienti è fattore di crescita epidermico
(EGF
), che ha un'espressione che è stato significativamente ridotto rispetto ai topi wild-type. Tra i fattori di crescita, la famiglia EGF comprende agenti importanti per la mucosa gastrica. EGF è un polipeptide a catena singola di residui di acido 53 amminoacidi, che si trova principalmente nelle ghiandole sottomandibolari e le ghiandole del tratto gastrointestinale [22] di Brunner. EGF si lega ed attiva il recettore del fattore di crescita epidermico con conseguente proliferazione cellulare, differenziamento e la sopravvivenza [23]. È interessante notare, alcuni ricercatori hanno riportato che i recettori EGF sono arricchite in cellule principali roditori [24, 25], suggerendo l'importanza della funzione EGF in queste cellule. Pertanto alterazioni nell'espressione di EGF ligandi o, in questo caso, EGF potrebbe contribuire alla differenziazione e la funzione delle cellule principali.
Uno dei geni più fortemente upregulated di questo studio è stato eliminato in tumori cerebrali maligni 1
(Dmbt1
), che appartiene al ricco-cisteina (SRCR) superfamiglia dei recettori scavenger di proteine. Si tratta di una superfamiglia di proteine ​​secrete e di membrana con domini SRCR che sono altamente conservati fino a spugne [26, 27]. L'espressione del DMBT1 è il più alto in epiteli e di solito è osservata sulla superficie cellulare apicale o nelle secrezioni esocrine luminali. Nei topi, DMBT1 è più fortemente espressa nel sistema gastrointestinale [28]. DMBT1 si propone di essere un soppressore tumorale [26, 29, 30] e /o un regolatore di differenziazione epiteliale [31], oltre ad avere ruoli in difesa immunitaria innata e dell'infiammazione [32, 33]. DMBT1 si trova nelle cellule cripta dei uomo, topo, coniglio e intestino tenue [31, 34, 35] e la regione del collo della normale mucosa gastrica umana [36], che sono prevalentemente composti da cellule staminali /progenitrici. Così, questo gene è potenzialmente coinvolto nel processo di ringiovanimento fisiologico epiteli gastrointestinale. Un ruolo per DMBT1 in innata difesa immunitaria è stata dimostrata in diversi studi. Il DMBT1 glicoproteina umana, espressa in ghiandole salivari, le vie aeree, e del tratto genitale, si lega i vari batteri patogeni e virus [37-40]. Inoltre, l'espressione di DMBT1 topo nel tratto gastrointestinale è regolata da batteri [41, 42], e la sua espressione è aumentata durante l'infezione [43]. E 'stato anche dimostrato che esiste un'associazione di un Dmbt1
allele variante con la malattia di Crohn e non vi è una correlazione tra i livelli di espressione di Dmbt1
con la gravità della malattia infiammatoria intestinale [44].
Inoltre, si lega DMBT1 proteine ​​tensioattivi SP-D e SP-A. Questi sono collagen- contenente, (tipo C) lectine calcio-dipendenti chiamati collectins che interagiscono con glicoconiugati e lipidi sulla superficie dei microrganismi principalmente attraverso i loro domini di riconoscimento dei carboidrati (CRD) [45]. SP-D e SP-A sono coinvolti in una serie di funzioni del sistema immunitario, tra cui virale di neutralizzazione, l'aggregazione e l'uccisione di batteri e funghi, e la clearance di cellule apoptotiche e necrotiche. In polmoni immunologicamente naive, che downregulate reazioni infiammatorie, ma quando provocati con LPS o apoptosi delle cellule che inducono la fagocitosi da parte dei macrofagi, la produzione di citochine pro-infiammatorie, e la valorizzazione delle risposte immunitarie adattive [46]. E 'interessante il fatto che nel presente studio, oltre a Dmbt1
, l'espressione di (Sftpd o SP-D
) tensioattivo proteina associata D
era altamente indotta in Car9
- /- topi. Così, l'up-regulation di entrambi Dmbt1
e Sftpd
suggeriscono che la carenza di CA IX indotto un sistema immunitario della mucosa gastrica. Va inoltre rilevato che CA IX è stato suggerito di legarsi alle cellule dendritiche in modo mediato dal recettore e recettori scavenger sembrano svolgere un ruolo importante in questo processo [47]. Inoltre, CA IX sembra attivare una risposta immunitaria da una caratteristica meccanismo per riscaldare shock proteins. Così, CA IX potrebbe interagire direttamente con DMBT1 tramite un recettore scavenger.
Infatti, la rottura di Car9
gene causato disregolazione di diversi geni che sono coinvolti nei processi immunitari. Questo corrobora i risultati di uno studio precedente in cui è stato rilevato gastrica infiammazione sottomucosa nella regione corpo in una maggioranza di C57BL /6 Car9
- /- mice [17]. Nel presente studio, Il1rl1 /ST2
variante trascrizione 2 mRNA era altamente indotta a causa di carenza di CA IX. Il Il1rl1 /ST2
gene è un membro della interleuchina-1 (IL-1) del recettore famiglia e produce una forma solubile secreta (sst2) e una forma transmembrana (ST2L), codificati da trascrizione varianti 2 e 1 rispettivamente. La forma legata alla membrana è espresso principalmente dalle cellule ematopoietiche e la forma solubile è prevalentemente espresso da fibroblasti [48]. In particolare, ST2L è preferenzialmente espresso in cellule Th2 murine e umane e può essere usato come marcatore specifico di cellule Th2 in vitro
esperimenti [49-52]. Pertanto, la funzione di ST2L è stato suggerito per correlare con risposte immunologiche mediate da cellule Th2 e IL-33, un membro recente scoperta della citochina famiglia IL-1, è stato segnalato come un ligando specifico per ST2L [53]. È interessante notare, diversi studi hanno dimostrato che il livello di solubili ST2 nel siero è elevata nella malattia asmatica [54, 55]. Pertanto, è stato suggerito che ST2 solubile può anche svolgere un ruolo fondamentale nelle malattie cellulo-mediata Th2. Infatti, è stato dimostrato che solubile ST2 agisce come un recettore antagonista richiamo per IL-33 utilizzando una linea cellulare murina timoma, EL-4, che esprime stabilmente ST2L, e un modello murino di asma [56]. Questo suggerisce che solubile ST2 modula negativamente la produzione di citochine Th2 attraverso IL-33 segnalazione infiammazione allergica delle vie aeree. È interessante notare che nel presente studio, il livello di mRNA di IL-33 è stato anche elevato ~ 2 volte, anche se questo cambiamento non era statisticamente significativa. Quindi, sembra plausibile che CA IX è in qualche modo coinvolto nella regolazione della risposta Th2.
CA IX potrebbe anche contribuire allo sviluppo del sistema immunitario, come la carenza di CA IX downregulated in modo significativo l'omologo sindrome di Bloom (umana)
gene (BLM
), che codifica per una DNA elicasi ATP-dipendente che appartiene a una famiglia evolutivamente conservata di elicasi RecQ [57]. La mutazione di Blm
provoca un autosomica recessiva umana malattia rara chiamata sindrome di Bloom (BS), che è caratterizzata da una marcata instabilità genomica. BS è associata a ritardo di crescita, una profonda sensibilità per la maggior parte dei tipi di cancro, e da immunodeficienza [58], con le ultime due caratteristiche che rappresentano la morte precoce [59]. Le funzioni di BLM sono state solo in parte caratterizzati. Tuttavia, è stato dimostrato che BLM ha un ruolo nella proliferazione e sopravvivenza di entrambe linfociti T di sviluppo e mature, e la sua eliminazione comporta difettosi immunità delle cellule T [60]. cellulare-dipendente Inoltre, il ko condizionale della Blm
contribuito a compromettere lo sviluppo e il mantenimento delle cellule B, fortemente compromessa T e risposte anticorpali -indipendenti dopo la vaccinazione, e una propensione per sviluppo linfomi a cellule B [61]. Pertanto, è ipotizzabile che Car9
- /- mice hanno compromesso le risposte immunità acquisita
Un risultato inaspettato è stato che diverse piccole proteine ​​ricche di prolina
(Sprr
) sono stati in particolare upregulated compreso. Sprr1a
, Sprr2d
, Sprr2e
, Sprr2i
, e Sprr3
. Tuttavia, solo l'induzione di Sprr1a
era statisticamente significativa. proteine ​​SPRR sono stati inizialmente identificati come marcatori per la differenziazione delle cellule squamose terminale in cui sono precursori della busta corneo [62]. Inoltre, le proteine ​​SPRR sono espressi in vari tessuti non squamose, e la loro funzione biologica non è limitato alle proteine ​​strutturali dell'involucro corneo [63]. E 'stato dimostrato che le proteine ​​SPRR partecipano alla risposta a diverse sollecitazioni in molti tessuti senza un epitelio stratificato. Nel tratto biliare, membri SPRR2 sembrano contribuire alla modifica della barriera biliare in condizioni di stress [64]. Allo stesso modo, SPRR1A è stato identificato come un romanzo di mediatore a valle dello stress-inducibile di citochine gp130 in cardiomiociti, con un effetto cardioprotettivo contro lo stress ischemico [65]. Inoltre, nei topi, la proteina SPRR2A è stato segnalato per essere altamente indotta nella mucosa gastrica infettati da Helicobacter heilmannii
[66]. Inoltre, è stato suggerito che SPRR1A è una proteina di rigenerazione associata perché la sua induzione danno neuronale correlato con capacità rigenerativa, con quasi tutti feriti neuroni radice dorsale gangliari esprimere SPRR1A una settimana dopo lesione del nervo sciatico [67]. Pertanto, i geni SPRR sono presumibilmente indotti in risposta a diverse condizioni di stress e contribuiscono alla protezione cellulare, rimodellamento tissutale, e /o la rigenerazione tissutale. Alla luce di questi risultati, sembra plausibile che la carenza di CA IX crea una condizione di stress nella mucosa gastrica, che porta ad upregulation di alcuni fattori protettivi.
La nostra analisi ha identificato mRNA da quattro membri della famiglia di proteine ​​carrier soluto da misregulated in il Car9
- /- mice mucosa dello stomaco. Queste proteine ​​di trasporto dei soluti sono coinvolte nel trasporto di membrana di varie molecole. L'espressione di Slc9a3
è stato fortemente indotta, mentre l'espressione di Slc27a2
, Slc38a5
, e Slc5a8
fu repressa. La funzione di base di SLC9A3 o NHE3 è lo scambio di extracellulare Na + per intracellulare H +, provocando sia un aumento del pH intracellulare o, se accoppiato all'azione di altri trasportatori, un aumento del volume cellulare [ ,,,0],68]. Nel tratto gastrointestinale, SLC9A3 si esprime nelle apicali della membrana e di riciclaggio endosomi del ileo, digiuno, del colon e dello stomaco [69]. Ulteriori studi sono necessari per chiarire la possibile interazione tra CA IX e SLC9A3 nella mucosa gastrica.
Sorprendentemente, tra i geni più diminuito l'abbiamo trovato diversi geni coinvolti nella digestione. Tra questi tripsina 1
, amilasi 2A5
, chimotripsina-come la famiglia elastasi membro 2A
, e lipasi pancreatica
con valori di p statisticamente significativi e altri, come chimotripsinogeno B1
, carbossipeptidasi A1
, e carbossipeptidasi B1
con valori di p non significativi. L'implicazione di questo risultato rimane poco chiaro. Una possibile spiegazione potrebbe essere che sottoregolazione di questi enzimi è un evento secondario. Se si suppone che questi enzimi sono prodotti da cellule principali, il ridotto numero di cellule principali nel Car9
- /- mice mucosa gastrica possono anche causare una diminuzione della quantità di enzimi che producono. Tuttavia, l'esatto meccanismo alla base di questo fenomeno rimane da chiarire.
Conclusioni
In conclusione, la carenza CA IX ha mostrato di alterare l'espressione di vari geni nella mucosa gastrica. Il numero di geni interessati e l'entità delle variazioni erano relativamente alte, indicando che CA IX ha un ruolo rilevante nelle funzioni gastriche. analisi microarray ha rivelato diversi geni coinvolti nei processi di sviluppo e differenziazione cellulare, che potrebbe spiegare il disturbo linea cellulare nell'epitelio gastrico di Car9
- /- mice. È interessante notare che alcuni dei geni regolati identificati in questo studio sono coinvolti nella digestione, così come funzioni delle risposte immunitarie e di difesa. Questa scoperta suggerisce che la carenza di CA IX compromette il sistema immunitario a livello dell'epitelio gastrico che implica ancora un altro ruolo per questo enzima multifunzionale.
Metodi
un modello animale e preparazione dei tessuti
Generazione della distruzione mirata della
Car9 gene è stato precedentemente descritto da Ortova Gut et al. [16]. (tissue)
NM_029706
GGTTTCCACGCAAGAGAG
GTTGACCACAGGCAGAACA
Cym
chymosin
NM_001111143
ATGAGCAGGAATGAGCAG
TGACAAGCCACCACTTCACC
Dmbt1
deleted

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