La valutazione del passaggio di Lactobacillus gasseri K7 e bifidobatteri dallo stomaco al intestino utilizzando un'unica valutazione del reattore model

del passaggio di Lactobacillus gasseri
K7 e bifidobatteri dallo stomaco al intestino utilizzando un unico modello di reattore
Abstract
sfondo
batteri probiotici si pensa di svolgere un ruolo importante nel sistema digestivo e quindi devono sopravvivere al passaggio da stomaco per l'intestino. Recentemente, un nuovo approccio per simulare il passaggio dallo stomaco all'intestino in un singolo bioreattore è stato sviluppato. Il vantaggio di questo sistema di reattori automatizzato era la capacità di testare l'influenza di acido, sali biliari e pancreatina.
Lactobacillus gasseri
K7 è un ceppo isolato dalle feci infantili con proprietà rendendo il ceppo interessante per la produzione di formaggio. In questo studio, un unico sistema di reattore è stato utilizzato per valutare la sopravvivenza di L. gasseri
K7 e selezionati bifidobatteri della nostra collezione attraverso il passaggio stomaco-intestino.
Risultati
screening iniziale per la resistenza agli acidi nella cultura acidificato i media hanno mostrato una bassa tolleranza di Bifidobacterium dentium
per questa condizione che indica bassa sopravvivenza nel passaggio. Risultati simili sono stati ottenuti con B. longum
subsp. infantis
mentre B. animalis
subsp. lactis
aveva un alto sopravvivenza.
Questi primi risultati sono stati confermati nel modello bioreattore del passaggio stomaco-intestino. B. animalis
subsp. lactis
ha avuto il più alto tasso di sopravvivenza (10%) raggiungendo circa il 5 × 10 6 cfu ml -1 rispetto agli altri ceppi di bifidobatteri testate che sono state ridotte di un fattore fino a 10 6 . Lactobacillus gasseri
K7 era meno resistente B. animalis
subsp. lactis
ma è sopravvissuto a concentrazioni di cellule di circa 1000 volte superiore a quella di altri bifidobatteri.
Conclusione
In questo studio, siamo stati in grado di dimostrare che L. gasseri
K7 ha avuto un elevato tasso di sopravvivenza nel stomach- passaggio intestino. Confrontando i risultati con uno studio precedente in suinetti potremmo confermare l'affidabilità della nostra simulazione. Dei ceppi di bifidobatteri testati, solo B. animalis
subsp. lactis
ha mostrato la sopravvivenza accettabile per un passaggio di successo nel sistema di simulazione.
Sfondo
probiotici, batteri dell'acido lattico in particolare avere effetti benefici sulla salute dei consumatori, come suggerito nel 1907 [1]. Si credeva che i batteri infezioni causate da patogeni enterici e toxoaemia regolamentato, migliorando così la salute e che influenzano la mortalità controllati principalmente. Nel frattempo è noto che alcuni degli effetti positivi sulla salute dei consumatori sono il miglioramento del saldo microflora nell'intestino, la stimolazione del sistema immunitario, e aiutare l'organismo a combattere microrganismi patogeni [2]. Gran parte di interesse è concentrato sull'uso di ceppi di generi Lactobacillus e Bifidobacterium

, anche se vi sono anche altri batteri con effetti probiotici, ad esempio alcuni propionibatteri.
Le proprietà di cui sopra sono anche la base per un microrganismo di essere etichettato probiotico. Ci sono definizioni diverse in tutto il mondo, ma sono simili nel contenuto. Uno dei criteri per un ceppo probiotico è la sua resistenza alla acidità e soluzioni gastrici nel tratto gastrointestinale umano [3]. È quindi importante, per valutare la resistenza di un potenziale ceppo probiotico all'ambiente acido gastrico e nell'intestino.
Causa dei costi elevati e etiche e norme di sicurezza per studi clinici, lo screening sopravvivenza è facile simulare in vitro
. Un semplice test è quello di incubare le cellule batteriche in soluzioni saline acide o bile per un periodo definito e contare il numero di cellule sopravvissute. In una ulteriore fase, la simulazione viene effettuata in recipienti agitati, combinando acidità e soluzioni gastrici seguite da una stima di cellule sopravvissute sull'intera simulazione. Questa è una replica più realistico delle condizioni nell'intestino [4]. Un altro sistema, il simulatore della umana intestinale microbica Ecosystem (SHIME), è costituito da 5 a 6 bioreattori pH controllato collegati in serie [5-7]. L'installazione è piuttosto complesso e richiede condizioni anaerobiche assoluti. Inoltre, l'assorbimento di metaboliti e acqua non è simulato. Questo è stato superato utilizzando membrane di dialisi come descritto da Marteau et al
. [8].
Recentemente, un nuovo sistema che utilizza un singolo bioreattore è stato sviluppato per studiare il passaggio stomaco nell'intestino [9]. Il sistema ha consentito il pH a essere modificato all'interno di un unico reattore ed è stato adattato ai tempi di ritenzione nelle diverse regioni del passaggio stomaco-intestino.
Lactobacillus gasseri
K7 è stato recentemente isolato dalle feci infantile [10]. Produce un batteriocina che è attivo contro il Clostridium
sp. e le loro spore. L. gasseri
appartiene al cosiddetto -Gruppo "acidophilus" e diversi studi indipendenti di questi ceppi come abitanti della pelle e dell'intestino [11-13]. In precedenti esperimenti, è già stato dimostrato in vitro
che L. gasseri
K7 sopravvissuto in un ambiente acido e con 0,3% di sali biliari [10]. Questi risultati rendono il ceppo interessante come possibile probiotico.
In questo studio, un sistema di bioreattore unico basato sul lavoro di Sumeri et al
. [9] è stato utilizzato per valutare la sopravvivenza di Lactobacillus gasseri
K7 e otto Bifidobacterium
ceppi della nostra collezione. Siamo stati in grado di confrontare i risultati per L. gasseri
K7 con uno studio condotto in suinetti [14] che ha permesso la valutazione di una correlazione tra lo studio in vitro
con risultati da in-vivo
esperimenti .
tempi di ritenzione e di pH utilizzati in questo studio si sono basate sui dati della letteratura. Esistono diversi metodi per misurare il pH nell'intestino [15]. La tabella 1 mostra i valori di pH nelle diverse parti dell'intestino come misurato dalla capsula Heidelberg [16, 17]. I tempi di ritenzione possono essere calcolati mediante l'utilizzo di marcatori (chimiche) o via radio capsule di telemetria, come Heidelberg
capsula [18]. Tuttavia, le capsule di solito hanno tempi di ritenzione più lunghi rispetto marcatori chimici. Tabella 2 elenca alcuni dei tempi di ritenzione in letteratura [4, 5, 19-24] .table 1 valori di pH nel tratto intestinale umano, misurati con la Heidelberg
capsula.

Stomaco
duodeno
Digiuno
Ileum
prossimale
mediale distale

pH
1.4 **
6.22 *
6,4 **
7.1 ** **
7.4
* Fallingborg et al
. 1994 [16]
** Fallingborg et al
. 1998 [17]
Tabella 2 I tempi di ritenzione nel piccolo intestino citato in letteratura.
Tempo di conservazione
Fonte
Osservazioni

1-4 h
Huang e Adams 2004 [21]
4,25 h
Van Den Driessche et al
. 2000 [24]
stomaco e dell'intestino tenue
4 h
Mojaverian 1996 [22]
6 h
Picot e Lacroix 2004 [4]
Selected tempo massimo della simulazione
7,5 h
Fallingborg et al
. 1990 [20]
Bambini
8 h
Fallingborg et al
. 1989 [19]
8 h
Alander et al
. 1998 [5]
simulazione nel SHIME reattore
6-10 h
Thews et al
. 1991 [23] commercio basato sui dati presenti in letteratura e l'opera di Sumeri et al
. [9] il processo di fermentazione è stato impostato come descritto in Materiali e Metodi ed è illustrato in Figura 1. Figura 1 Parametri della simulazione di passaggio stomaco-intestinale oltre 7 ore.
Risultati
Resistenza agli acidi di screening
Il obiettivo di una prima serie di test era quello di ottenere una panoramica della resistenza agli acidi di otto ceppi di bifidobatteri. Le figure 2, 3 e 4 mostrano la sopravvivenza di questi ceppi utilizzando grafici di contorno realizzati con SigmaPlot. Bifidobacterium dentium
(figura 3) ha mostrato minore resistenza acida. Tra pH 4,0 e pH 2,0 non vi era alcuna differenza nella sopravvivenza e la concentrazione di cellule diminuito di oltre 7 log entro 40 minuti. Bifidobacterium animalis
subsp. lactis
era più resistente fino a 40 min a pH 2.0, ma poi è diminuita di circa il 3 registro quando incubati per 120 minuti (Figura 4). Ad un pH compreso tra 2.5 e 3.0 la diminuzione è stata inferiore a 1 log dopo 120 minuti. Figura 2 Resistenza agli acidi di tre ceppi longum Bifidobacterium. Asse X: tempo (min); Y: pH; log CFU sono mostrati a colori (scala a destra dei grafici). I numeri in nomi batterici sono i numeri di deformazione della FAM-banca dati di ALP.
Figura 3 Resistenza agli acidi di Bifidobacterium dentium, B. longum subsp. infantis e B. adolescentis. Asse X: tempo (min); Y: pH; log CFU sono mostrati a colori (scala a destra dei grafici). I numeri in nomi batterici sono i numeri di deformazione della FAM-banca dati di ALP.
Figura 4 Resistenza agli acidi di Bifidobacterium breve e B. animalis subsp. lactis. Asse X: tempo (min); Y: pH; log CFU sono mostrati a colori (scala a destra dei grafici). I numeri in nomi batterici sono i numeri di deformazione della FAM-banca dati di ALP.
Tutti gli altri Bifidobacterium
ceppi testati (B. longum, B. breve, B. longum
subsp. Infantis e B. adolescentis
) ha mostrato un andamento simile, ma diverso da B. animalis
subsp. lactis
(figure 2, 3 e 4). Essi avevano un breve tempo di sopravvivenza di sotto di pH 2,5 e sopravvissero in numero maggiore di sopra di pH 3,5.
Con l'obiettivo di sviluppare un metodo per simulare la GI nel bioreattore, un ulteriore test è stato fatto con un ceppo. Per osservare l'influenza di una matrice alimentare, concentrato B. longum
subsp. infantis
è stato risospeso in latte scremato prima di inoculare in soluzioni acide. Come mostrato nella colonna di destra della figura 5, il latte ha un effetto diretto sulla sopravvivenza del ceppo. Tra pH 3,0 e 3,5 i batteri sopravvissuti per 120 min con una riduzione di log 2. Sotto pH 3,0 il tasso di sopravvivenza diminuire a circa log 5. La diminuzione della sopravvivenza di sotto di pH 3,0 era rapida ma regolare nel tempo. A pH 3,5 e sopra, il ceppo era resistente per almeno 120 minuti. Figura 5 Confronto di resistenza agli acidi di Bifidobacterium longum subsp. infantis 14390 sospeso in NaCl o latte scremato. A sinistra: bifidobatteri risospese in NaCl, a destra: bifidobatteri risospeso nel latte. Asse X: tempo (min); Y: pH; log CFU sono mostrati a colori (scala a destra dei grafici). I numeri in nomi batterici sono i numeri di deformazione della FAM-banca dati di ALP.
La colonna di sinistra della figura 5 mostra lo stesso ceppo, senza aggiunta di latte scremato. Ad un pH superiore a 3,5, non vi era alcuna influenza sulla sopravvivenza dei batteri. Tuttavia, al di sotto di pH 3,5 la sopravvivenza diminuita a seconda della durata dell'incubazione. Tra pH 3.0 e 3.5 la tensione era già diminuita di log su 5. Dopo 30 minuti di incubazione, non c'era quasi una diminuzione lineare della sopravvivenza con la diminuzione del pH 3,0-2,5.
Simulazione nel bioreattore
maggior parte dei sistemi descritti in letteratura consiste di diverse navi di reazione, ad esempio la SHIME [6]. Altri studi hanno utilizzato cellule immobilizzate con tre reattori [25] o un sistema di dialisi [8]. Sulla base del lavoro di Sumeri et al
. [9] ei dati raccolti delle condizioni del transito intestinale siamo stati in grado di limitare la simulazione a una nave. Insieme con i dati screening resistenza agli acidi, la selezione di un possibile iniziare pH e brodo composizione simulatore potrebbe essere scelto. I parametri di simulazione risultanti sono mostrati nella figura 1 e descritto nella sezione Materiali e Metodi. Durante la fase sperimentale di questo studio, Sumeri et al
. [9] sviluppato un sistema simile per valutare Lactobacillus
sp. in una simulazione stomaco nell'intestino passaggio.
Il pacchetto software "Lucullus" era un ottimo strumento per controllare il pH e il procedimento secondo la simulazione sviluppato. La scelta del mezzo nel bioreattore è stato semplificato scegliendo il mezzo di crescita corrispondente per i ceppi, integrato con latte scremato, funzionante come matrice alimentare simulato. Successivamente, si acidifica a pH iniziale e integrato con soluzioni di enzimi come descritto in Materiali e Metodi. Le simulazioni sono state eseguite in serie, una al giorno. I risultati sono mostrati in Figura 6. I ceppi utilizzati per la simulazione sono elencati nella tabella 3 (solo Bifidobacterium dentium
stata esclusa) e sono stati standardizzati ad un OD 650 di 1,5 prima dell'inoculo. Figura 6 Sviluppo di 7 ceppi Bifidobacterium durante la simulazione passaggio stomaco-intestinale per 7 ore. La linea tratteggiata mostra il tempo di aggiunta di sali biliari e succo pancreatico. I numeri in nomi batterici sono i numeri di deformazione della FAM-banca dati di ALP.
Tabella 3 ceppi testati nella simulazione.
Nome
numero di identificazione della raccolta ceppo ALP
Bifidobacterium adolescentis
FAM-14377
Bifidobacterium breve
FAM-14398
Bifidobacterium longum
subsp. infantis
FAM-14390
Bifidobacterium animalis
subsp. Lactis
FAM-14403
Bifidobacterium dentium
FAM-14396
Bifidobacterium longum
FAM-14382, -14.383, -14.406
Lactobacillus gasseri
K7
FAM-14459
Bifidobacterium adolescentis
è stato inoculato come descritto sopra ad una concentrazione iniziale di 10 7 CFU ml -1 e una diminuzione quasi linearmente al di sotto di 10 4 ufc ml -1 dopo 5 ore. B. breve
e B. longum
ceppi avevano una concentrazione iniziale tra 10 7 e 10 8 cfu ml -1 e diminuita al di sotto di 10 2 cfu ml -1 entro i primi 30 minuti. B. animalis
subsp. lactis
14403 sopravvissuti a circa il 15% della media cfu iniziale di 5 × 10 8 cfu ml -1. C'era una rapida diminuzione della sopravvivenza di B. longum
subsp. infantis
rispetto al primo 30 min. Successivamente la sopravvivenza è diminuito solo lentamente dal 10 5 a 10 4 cfu ml -1.
In una fase successiva, Lactobacillus gasseri
K7 è stato incluso nello studio da diversi progetti sono stati in esecuzione in questo momento presso il nostro istituto con questo ceppo. Lactobacillus gasseri
K7 è stato inoculato al 2,2 × 10 7 CFU ml -1 e dopo 7 ore di simulazione una concentrazione di 10 5 cfu ml -1 cellule viventi era ancora presente nel Terreni di coltura (Figura 7, curva per 250 ml pre-cultura). La massima riduzione della sopravvivenza era entro le prime 2 ore e inizia immediatamente dopo l'aggiunta di sali biliari e succhi gastrici. Entro questo tempo, c'è stata una riduzione delle cellule di log 2. vivente Durante il resto del tempo di simulazione, vi era solo una riduzione log 1 delle cellule viventi. Figura 7 Confronto dell'influenza di 100 ml pre-coltura di Lactobacillus gasseri K7 con 250 ml di pre-coltura. La pre-coltura è stato raccolto per centrifugazione e risospese in soluzione fisiologica di cloruro di sodio per ottenere una OD600 di 1,5. La simulazione passaggio stomaco-intestinale è stata incubata utilizzando la soluzione impostata e incubate per 7 ore. La linea tratteggiata mostra l'aggiunta di sali biliari e succo pancreatico. Curve sono la media di esperimenti duplicati.
La preparazione dell'inoculo di L. gasseri
K7 in un volume coltura 100 ml è stata anche valutata. I risultati degli esperimenti sono mostrati nella Figura 7. Con 250 ml cultura della diminuzione delle cellule viventi era circa log 2 mentre la diminuzione con una cultura 100 ml è stato log solo 1 su tutto il tempo di incubazione. Tuttavia, 2 h dopo l'aggiunta di sali biliari e succo pancreatico, la diminuzione del numero di cellule era simile per entrambi i volumi.
Discussione
Quando raccolta una coltura dopo un determinato tempo di incubazione, la fase di crescita di ogni ceppo batterico può essere diverso dal momento che tutti hanno diverse dinamiche di crescita. Per ottenere cellule approssimativamente alla stessa fase di crescita, esperimenti preliminari sono stati condotti (dati non mostrati). Un tempo di incubazione di 15 h per la pre-coltura era adatto per tutti i ceppi testati tranne Bifidobacterium longum
subsp. infantis
che doveva essere incubato per soli 12 h.
La tolleranza acida di screening (figure 2, 3 e 4) è stata eseguita per valutare l'effetto del pH indipendentemente da altre condizioni. Bifidobacterium dentium
era altamente sensibile all'acido e quindi non sarebbe forse sopravvivere al passaggio attraverso lo stomaco. Il ceppo non è stato pertanto incluso negli esperimenti di simulazione. Il B. longum
ceppi (Figura 2) non producono risultati molto migliori rispetto a B. dentium
(Figura 3). Tuttavia, vicino a pH 4 erano più resistente di B. dentium
.
B. longum
subsp. infantis
è una delle prime specie per popolare l'intestino umano poco dopo la nascita [26]. Sulla base degli esperimenti in questo studio, tuttavia, il B. longum
subsp testato. infantis
ceppo sarebbe solo in grado di passare allo stomaco bambino in numero elevato, se il tempo di transizione nello stomaco acido è stato molto breve. La sopravvivenza del ceppo selezionato nell'ambiente testato era troppo basso per il passaggio di successo in numero elevato. Quando il ceppo è stato risospeso in latte scremato, la sopravvivenza aumentata (Figura 5). Questo potrebbe essere un'indicazione che il latte umano aiuta B. longum
subsp. Infantis
ceppi per passare il passaggio di stomaco-intestino con un tasso di sopravvivenza più alto.
Gli effetti protettivi di proteine ​​del latte nel sistema digestivo sono già state descritte in letteratura [27]. Protezione con proteine ​​del latte è stato anche dimostrato in questo studio (Figura 5). Con la matrice appropriata o anche un vettore, batteri probiotici potrebbero passare in modo sicuro attraverso lo stomaco per l'intestino per raggiungere il loro sito di azione.
B. adolescentis
ceppi che popolano l'intestino umano in età più avanzata, ha avuto la resistenza leggermente superiore B. longum
subsp. infantis
che può spiegare la riduzione di quest'ultimo durante l'avanzamento del neonato umano all'età adulta [26].
Il ceppo più interessante era B. animalis
subsp. lactis
, che era il ceppo meno sensibile nel nostro studio. Questo ceppo pH resistente ha un grande potenziale per l'uso in alimenti come integratore probiotico poiché un maggior numero di cellule batteriche potrebbe sopravvivere al passaggio. Tuttavia, per utilizzare questo ceppo probiotico, ulteriori studi devono essere eseguiti per raggiungere lo stato probiotico secondo la definizione di Klaenhammer [3].
Nel nostro studio, l'ingestione di una matrice alimentare è stato simulato in un primo ambiente di latte acidificato e mezzo di crescita. La soluzione gastrico simulato aggiunto e ossigeno durante la fase di stomaco aumentato lo stress. Durante il passaggio simulato all'intestino tenue l'ossigeno è stato sostituito con azoto ed il mezzo è stato neutralizzato a pH 6.3. L'aggiunta dei sali biliari e pancreatici soluzione completato il passaggio nell'intestino tenue. Questo vitro in-
sistema non ha tenuto conto del fatto che la digestione in vivo
, gli enzimi sono attivati ​​e sostanze inattivati ​​e altri, per esempio sali biliari vengono riassorbiti. Sumeri et al
. [9] trovato una soluzione parziale per evitare questo problema. Essi diluito il contenuto del reattore con un mezzo di diluizione appositamente progettato. Un'altra possibilità sarebbe quella di precipitare i sali biliari al termine della simulazione del piccolo intestino per imitare il circuito enteroepatica. Ciò può essere eseguito con ioni calcio [28-30]. La rimozione dei sali biliari sarebbe meglio simulare l'ambiente del colon e potrebbe anche consentire bifidobatteri a proliferare.
Nel nostro studio, i sali biliari rimanenti e succo pancreatico nella simulazione portato ad un ulteriore stress sui batteri che probabilmente alterato le vere caratteristiche dei ceppi in vivo
.
la cfu a partire dalla simulazione variato entro un cfu registro anche se l'adeguamento del OD 650 del inoculo è stato precedentemente testato con i Bifidobacterium animalis
subsp. lactis
e Bifidobacterium longum
subsp. infantis
ceppi. I bifidobatteri utilizzati in questo studio hanno mostrato una tendenza a formare gruppi che possono provocare ridotta cfu (osservazioni visive, i dati non mostrati). In un altro studio, la formazione di cluster potrebbe essere correlato alla diminuzione del pH durante la crescita [31]. Questi gruppi sono generalmente considerate come una colonia su un piatto.
Figura 6 mostra i risultati della simulazione di passaggio stomaco nell'intestino oltre 7 h di sette Bifidobacterium
ceppi testati. La concentrazione di cellule di bifidobatteri viventi diminuiva immediatamente dopo incubazione a causa del basso pH (pH 3.0). Tuttavia, B. animalis
subsp. lactis
è rimasto stabile. Questo conferma i risultati dei precedenti esperimenti discussi sopra (Figura 4). Questa resistenza potrebbe essere esteso a biliari sali e succo pancreatico anche se la conta delle cellule di B. animalis
subsp. lactis
è diminuita di circa il 85% del valore iniziale (Figura 6). Rispetto agli altri ceppi utilizzati in questo studio, tuttavia, questa diminuzione è quasi trascurabile.
Tutti B. longum Comprare e B. Breve
ceppi morto molto rapidamente all'inizio della simulazione ed erano sotto il rilevamento limite del metodo di placcatura entro poche ore (Figura 6) che era da aspettarsi dai risultati dell'esperimento di screening di cui sopra (figure 2 e 4).
d'altra parte, B. longum
subsp. infantis
14390 diminuita rapidamente all'inizio di simulazione, ma dopo l'aggiunta di sali biliari e succo pancreatico e un cambiamento ad un ambiente anaerobico, il tasso di riduzione diminuito. Il nostro studio suggerisce che questo ceppo è ben adattato alle condizioni nell'intestino, ma deve essere ingerito in un numero elevato di sopravvivere alle condizioni nello stomaco (ossigeno, basso pH). Come accennato in precedenza, B. longum
subsp. Infantis
ceppi appartengono al primo gruppo di batteri che popolano l'intestino dei bambini [26].
In contrasto B. longum
subsp. infantis
, B. adolescentis
diminuita quasi linearmente durante la simulazione 7 h. Non c'era alcuna interruzione rilevabile quando le condizioni nel fermentatore cambiati. Sulla base di esperimenti per lo screening tolleranza acida, questo risultato è stato inaspettato.
Tuttavia, questo potrebbe essere correlato alle condizioni di prova in cui il sale di bile e le concentrazioni di succo gastrico è rimasto al livello iniziale, e non sono stati diluiti come lo sarebbero in vivo
. In un futuro esperimento, si debba valutare se il metodo di diluizione sviluppato da Sumeri et al
. [9] sarebbe stabilizzare i conteggi delle cellule di B. adolescentis
durante il periodo di simulazione 6 h nell'intestino.
Nel nostro studio, abbiamo valutato anche il passaggio stomaco-intestino di Lactobacillus gasseri
K7. Il ceppo è già stato valutato per la sopravvivenza in vivo
in suinetti [14]. Pertanto, è stato possibile confrontare i nostri risultati in vitro
con dati provenienti da esperimenti in vivo
.
Bogovic et al
. [14] suinetti alimentati per un periodo di 14 giorni con 5 * 10 10 giorni ufc -1 di L. gasseri
K7. Ciò ha provocato circa. 7 * 10 4 cfu g -1 nelle feci durante il periodo di allattamento. Va tenuto presente che la concentrazione di batteri è stata diluita prima che finalmente arrivato al passaggio dello stomaco-intestino. In prima approssimazione, abbiamo stimato che circa l'1% è arrivato al passaggio. Questo ci ha permesso di confrontare i risultati di questo studio maialino con la fine della nostra simulazione.
Come mostrato in Figura 5, L. gasseri
K7 aveva una concentrazione cellulare di circa 5 * 10 4 cfu ml -1 dopo il periodo di simulazione 7 h (con un pre-colture di 250 ml), che è simile alla concentrazione nelle feci dei maialini. Questo suggerisce che il modello di simulazione utilizzato in questo studio potrebbe essere un utile strumento per valutare gli effetti del passaggio in un modello in vitro
prima utilizzando costosi modelli in vivo
. Il modello potrebbe essere ulteriormente ottimizzato diluendo i sali biliari e succo pancreatico come descritto da Sumeri et al
. [9]. Per simulare l'attivazione e la disattivazione di enzimi un metodo adeguato è ancora da trovare.
Quando solo 100 ml di mezzo è stato utilizzato per l'inoculo di L. gasseri
K7, la cultura è sopravvissuto la simulazione migliore (Figura 7). Entrambi i volumi hanno avuto un simile numero di cellule iniziale. Entrambi i volumi sono stati inoculati da 1 ml. Pertanto, la cultura con 250 volumi ml era in una fase precedente della crescita che la cultura 100 ml. Questi risultati sono stati l'indicazione della dipendenza fase di crescita della cultura per durante lo stress.
Conclusione
In questo studio, siamo stati in grado di dimostrare che il sistema per simulare il passaggio stomaco-intestino sviluppato da Sumeri et al
. [9] era adatto per la valutazione della sopravvivenza di 8 Bifidobacterium e Lactobacillus
ceppi gasseri
K7, anche se non abbiamo simulare la rimozione dei sali biliari e di succo gastrico. Per L. gasseri
K7 siamo stati in grado di confrontare i risultati con uno studio in vivo su
suinetti e ottenuto risultati simili.
Il reattore singolo presentato qui permette un'identificazione più semplice della fase di crescita ideale per qualsiasi eventuale ceppo probiotico che è necessario per passare il passaggio di stomaco-intestino che se dovesse essere eseguito con altri sistemi con una messa a punto difficile.
lo studio ha anche mostrato che tutti i test Bifidobacterium
ceppi, tranne che per B. animalis
subsp. lactis
, richiederebbe agenti protettivi per sopravvivere il passaggio attraverso lo stomaco-intestino in numero elevato. Questo potrebbe essere fatto utilizzando una matrice alimentare appropriato o incapsulamento delle cellule.
Metodi
ceppi batterici
Tutti i ceppi di bifidobatteri sono stati selezionati dalla collezione ceppo di Agroscope Liebefeld-Posieux ALP Stazione di ricerca in Svizzera, isolata da ALP da fonti umane. Lactobacillus gasseri
K7 nasce dalla ZIM Collezione di Microrganismi industriali dell'Università di Ljubljana, Facoltà Biotecnica (ZIM 105) [10] ed è stato anche depositato nella collezione ceppo ALP. I ceppi testati e il loro numero di identificazione della collezione ceppo ALP sono elencati nella tabella 3. Tutti i ceppi di bifidobatteri sono di proprietà di ALP
Media e condizioni di crescita Compra di pre-culture., Conserve 1 ml congelati dei ceppi erano inoculati in 250 ml di Wilkins-Chalgren brodo (WC CM0643, Oxoid, Hampshire, Regno Unito) integrato con 9 gl -1 ulteriore lattosio monoidrato (bifidobatteri) o De Man-Rogosa-Sharpe (MRS, Biolife, Milano, Italia) medio (Lactobacillus gasseri
K7) [32]. Per L
. gasseri K7, una prova con un ml di pre-cultura 100 è stata anche eseguita. Tutti i ceppi, tranne Bifidobacterium longum
subsp. infantis
, sono state incubate a 37 ° C per 15 ore in condizioni anaerobiche. Bifidobacterium longum
subsp. infantis
è stata incubata per 12 ore perché era molto sensibile ai periodi di incubazione prolungati. I pre-colture sono state centrifugate per 15 minuti a 3500 rpm e il pellet risospeso in 10 ml di soluzione di cloruro di sodio fisiologica tamponata con fosfato (PBS).
Determinazione della cella conteggio
Il numero di cellule è stato determinato mediante 10 volte diluizioni seriali della cultura in soluzione salina fisiologica. I due diluizioni più elevate sono state poi piastrate su MRS agar (Biolife, Milano, Italia) utilizzando un Plater spirale (IUL Instruments, Barcellona, ​​Spagna) e valutati da un contatore di colonie automatizzata con il relativo software (IUL Instruments, Barcellona, ​​Spagna).
Screening per resistenza agli acidi
per la resistenza agli acidi screening della sospensione cellulare concentrata dal pre-coltura è stato pipettato in 20 ml di PBS fino a quando un OD 650 di 1.0 è stato raggiunto. 4 ml di questa sospensione cellulare sono stati inoculate in 16 ml di tampone citrato-HCl (tri-Na-Citratex2 H 2O 7,35 g e 250 ml di acqua distillata H 2O, adattato al pH corrispondente con 1 M HCl) a pH di 2.0, 2.5, 3.0, 3.5 e 4.0. L'incubazione è stata effettuata a 37 ° C ei campioni sono stati presi ogni 30 min oltre 120 min. 1 ml di campioni sono stati mescolati con 9 ml 0,25 M tampone fosfato a pH 7,0 al primo passo della serie di diluizioni. Per la prova di resistenza acida in una matrice alimentare, la stessa quantità di pre-coltura, come usato in precedenza (regolato ad un OD 650 di 1.0) è stato pipettato in 20 ml di latte scremato UHT. 4 ml di questa sospensione cellulare nel latte sono stati inoculati in 16 ml di tampone citrato-HCl. Tutti i prodotti chimici sono stati acquistati da Merck (Darmstadt, Germania). I dati per gli esperimenti di screening sono stati visualizzati in grafici di contorno utilizzando il software SigmaPlot 11.0 (Systat Software Inc., Chicago IL, USA).
Simulazione nel bioreattore impara tutte le soluzioni sono state preparate per ogni esperimento. soluzione stomaco simulato era di 50 mg di pepsina suina mucosa gastrica (Sigma-Aldrich P7012, Buchs, Svizzera) in 20 ml di 0,1 M HCl. Per la simulazione del pancreas succo di 2 g pancreatina (Sigma-Aldrich P7545) vengono sciolti in 50 ml di 0,02 M tampone fosfato a pH 7,5. soluzione dei sali biliari simulato era di 7,5 g bovina bile (Sigma-Aldrich B3883) fatta fino a 50 ml con acqua distillata H 2O. Il brodo per la simulazione era o WC o MRS brodo 1 litro con 29.41 g tri-sodio citratex2 H 2O. Durante il test di sopravvivenza in una matrice alimentare, 500 ml di UHT latte scremato sono stati aggiunti ed il pH regolato a 3,0 con HCl 5 M poco prima della simulazione. 1 l medio è stato aggiunto al bioreattore (NewMBR Mini, NewMBR, Svizzera), precedentemente sterilizzati con acqua (121 ° C, 20 min), e riscaldata a 37 ° C. Durante la simulazione dello stomaco, l'aerazione è stato attuato. La fermentazione è stato controllato e registrato utilizzando il software di gestione del processo integrato di Lucullo (Biospectra, Schlieren, Svizzera). La sospensione cellulare concentrata dal pre-coltura è stato pipettato in 40 ml di PBS per un OD 650 1.5. Poco prima della inoculazione di sospensione cellulare 40 ml, 20 ml della soluzione dello stomaco simulato è stato aggiunto al mezzo (1 l) nel bioreattore.

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