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CHD5 è down-regolato attraverso ipermetilazione del promotore in gastrica CHD5 cancer

è down-regolato attraverso ipermetilazione del promotore nel carcinoma gastrico
Abstract
sfondo
proteine ​​non istoniche cromosomiche di concerto con gli istoni svolgere un ruolo importante nella replicazione e riparazione del DNA e nella regolazione dell'espressione genica. La liberalizzazione di queste proteine ​​può contribuire allo sviluppo di una varietà di malattie come il cancro. Come una proteina non istoniche cromosomico, legame al DNA elicasi chromodomain proteine ​​5 (CHD5) è stato recentemente identificato come il prodotto di un gene soppressore del tumore romanzo (STG), promuovendo la trascrizione di p19 INK4a
e p16 arf
. L'inattivazione di CHD5 è stato raggiunto in parte attraverso l'eliminazione genetica dato che si trova in 1p36, una regione spesso eliminata nei tumori umani. In questo studio, ci proponiamo di studiare il coinvolgimento di CHD5 nel carcinoma gastrico, il secondo tumore più comune in tutto il mondo.
Metodi
espressione CHD5 in un pannello di cellule di cancro gastrico sono stati determinati dai RT-PCR quantitativa. La metilazione del CHD5 stata valutata mediante metilazione specifica PCR e bisolfito sequenziamento del genoma. L'effetto di CHD5 sulla crescita delle cellule di cancro gastrico è stato testato mediante test formazione di colonie.
Risultati
espressione CHD5 è stato down-regolato in tutte le linee di cellule di cancro gastrico utilizzato (100%, 7/7) e significativamente ripristinate dopo demetilazione farmacologica. La metilazione del promotore CHD5 stato rilevato in tutti sette linee di cellule di cancro gastrico e nella maggior parte dei tessuti di carcinoma gastrico primarie esaminato (73%, 11/15). Infine, l'espressione ectopica di CHD5 in cellule di cancro gastrico portato ad una inibizione della crescita significativa.
Conclusione
CHD5 era un TSG epigeneticamente down-regolato nel carcinoma gastrico.
Sfondo
Tutti gli organismi eucarioti hanno sviluppato modi elaborati di imballaggio DNA nella cromatina attraverso le interazioni dinamiche di varie proteine ​​DNA-associata. Tale confezione è importante non solo per la conservazione di informazioni genetiche con alta fedeltà ed integrità, ma anche il trasferimento delle informazioni genetiche dal DNA RNA in modo controllato. Le proteine ​​che si legano al DNA per formare la cromatina sono tradizionalmente divisi in due classi generali: istoni e proteine ​​cromosomiche non istoniche. Gli istoni sono un gruppo di legame del DNA proteine ​​altamente conservate e le loro varie modificazioni post-traslazionali costituiscono il 'codice istonico' che guida il confezionamento di DNA o di rimodellamento della cromatina. Viene avviato il codice degli istoni, mantenuto e interpretato in gran parte dalle proteine ​​cromosomiche non istoniche [1-4]. Ad esempio, l'acetilazione di residui di lisina sulle code degli istoni di istone acetiltransferasi (HAT) neutralizza la loro carica e diminuisce l'affinità degli istoni con DNA, rendendo DNA accessibile per fattori trascrizionali per iniziare la trascrizione genica. Al contrario, la deacetilazione di questi residui di istone deacetilasi (HDAC) ripristina questa affinità e può prelevare il DNA dai macchinari trascrizionale [5]. Oltre a acetilazione, fosforilazione e metilazione di code istoni sono importanti per l'associazione dinamica di DNA con macchina di trascrizione e altre proteine ​​cromosomiche [6-8]. proteine ​​cromosomiche non istoniche svolgono un ruolo importante nell'interpretazione di codice degli istoni formando complessi di rimodellamento della cromatina. Entrambi gli istoni e proteine ​​cromosomiche non istoniche sono importanti per la regolazione dell'espressione genica, replicazione del DNA e la riparazione del DNA. Le liberalizzazioni nel espressione e l'attività di queste proteine ​​potrebbe portare allo sviluppo di una varietà di malattie come il cancro [9-13].
In un recente studio, chromodomain DNA elicasi legame con le proteine ​​5 (CHD5) è stato identificato come un nuovo gene soppressore del tumore (STG) nel neuroblastoma [14]. CHD5 appartiene ad una superfamiglia di ATPases SWI2 /SNF2-correlati, un importante gruppo di proteine ​​cromosomiche non istoniche. CHD5 codifica una combinazione unica di domini funzionali costituiti da due chromodomains N-terminale, seguito da un /SNF2 simile ATPasi dominio SWI2 /elicasi e un dominio di legame al DNA [14]. Regolando la struttura della cromatina, CHD5 può promuovere l'espressione di p19 ARF che funziona per stabilizzare p53, il soppressore del tumore inattivato in più della metà dei tumori umani [15]. CHD5 è presente in un locus genico (1p36.31) soppresso in circa il 35% del neuroblastoma [16]. CHD5 stato precedentemente pensato per essere specificamente espressi nel sistema nervoso, ma il suo ruolo nel cancro in altri tessuti sta iniziando ad emergere [17]. CHD5 gene è stato trovato significativamente cancellato in glioma [18]. Oltre al gene delezione, CHD5 può essere soppressa da altri meccanismi. In alcuni casi di neuroblastoma, vi sono prove che espressione CHD5 è epigeneticamente soppresso da ipermetilazione del promotore [19], anche se questa osservazione non è stato confermato da un altro studio [20]. Recentemente, il promotore CHD5 è stato trovato per essere metilato in piccoli sottoinsiemi di seno (4,4%), colon (10%), ovarico (15%) e glioma (17%) tumori [17, 20], suggerendo silenziamento epigenetico CHD5 dalla metilazione possono svolgere un ruolo parziale nella tumorigenesi in questi tessuti. Qui abbiamo trovato che, a differenza di altri tipi di cancro segnalati finora, CHD5 stato spesso hypermethylated nel cancro gastrico (73% dei tumori e 100 linee cellulari%). L'espressione ectopica di CHD5 in cellule di cancro gastrico ha portato ad una inibizione della crescita significativa. Questo sorprendente correlazione della soppressione epigenetica di CHD5 e cancro gastrico suggerisce un rapporto finora sconosciuto tra questo TSG e tumorigenesi gastrica.
Metodi
cultura del tessuto e RNA /estrazione del DNA
Tutte le linee di cellule di cancro gastrico (AGS, Kato III, MKN28, MKN45, SNU1, SNU16 e NCI-N87) sono stati ottenuti da Riken Gene Bank (Tsukuba, Ibaraki, Giappone) e American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Tutte le linee di cellule di cancro sono state stabilite da carcinomi delle cellule epiteliali gastriche. A meno che non espressamente indicato, le cellule sono state coltivate in RPMI 1640 medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplementato con 10% di siero fetale bovino a 37 ° C con 5% di CO 2, e 95% di umidità. Per demetilazione farmacologica, le cellule sono state trattate con 5 micron 5-aza-2'-deossicitidina (Aza) (Sigma, St Louis, MO, USA) per tre giorni consecutivi [21]. Aza è stato rifornito ogni 24 ore. Una concentrazione equivalente del veicolo (DMSO) è stato utilizzato come controllo. Per i tessuti primari, i tessuti gastriche normali sono stati definiti come tessuti non-infiammazione e non tumorali. Tutti i tessuti carcinoma gastrico sono tessuti adenocarcinoma. L'RNA totale e il DNA genomico è stato estratto usando il reagente Trizol (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore.
Real time RT-PCR quantitativa
inversa reazione di trascrizione è stata eseguita utilizzando 1 mg di RNA totale con la trascrizione inversa System (Promega, Madison , WI, USA). I livelli di espressione di mRNA del CHD5 sono state determinate mediante real-time RT-PCR Kit SYBR Green Master Mix quantitativa (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Gliceraldeide-3-phosohate deidrogenasi (GAPDH) è stato utilizzato come controllo interno di integrità dell'RNA. Primer utilizzati per CHD5 RT-PCR erano CHD5-F: 5'-AGTTCCGTGTGAGGATGAAC e CHD5-R:. 5'-TCAAGGCTGACGTGTTCAAG
metilazione specifica PCR (MSP)
stato di metilazione di CHD5 è stato determinato da MSP utilizzando bisolfato modificato genomica DNA come modello. Il DNA genomico è stato bisolfito trattati con Zymo DNA Modification Kit (Zymo Research, Orange, CA, USA) secondo il protocollo previsto. MSP è stato effettuato per 40 cicli con temperatura di annealing a 62 ° C, come precedentemente descritto [22]. primer metilazione-specifica sono state: CHD5M-F: 5'-GTTCGGGGTTTAGCGTTTTC (da -525 a -506 rispetto al sito di inizio della trascrizione) e CHD5M-R: 5'-GAAACTTAACGAACCCGAACG (da -438 a -418), e specifici unmethylation primer sono stati: CHD5U-F: 5'-GGGTTTGGGGTTTAGTGTTTTT e CHD5U-R: 5'-TCAAAACTTAACAAACCCAAACA. Tutti i primer sono stati confermati in precedenza per non amplificare qualsiasi DNA unbisulfited
bisolfito di sequenziamento del genoma (BGS)
bisolfito trattati DNA è stato amplificato utilizzando primer BGS, CHD5-BF:. 5'-GTTGTAAATTAGATTTATAGTTTT (da -724 a -701) e CHD5-BR: 5'-GCAAATTAAAAAACTAATCCTAAA (da -324 a -301). I prodotti di PCR sono stati purificati con Illustra GFX ™ PCR e kit di purificazione banda gel (GE Healthcare scienze della vita, Uppsala, Svezia) e clonati in pCR4-TOPO vettore per il sequenziamento (Invitrogen). Almeno 6 colonie sono stati scelti in modo casuale per l'estrazione plasmide e analisi di sequenziamento.
Edilizia di CHD5 plasmidi di espressione
Il plasmide di espressione CHD5 è stato costruito dalla clonazione del full-length CHD5 open reading frame in mammiferi vettore di espressione pcDNA3.1. La griglia di lettura aperta CHD5 è stato amplificato dal normale cDNA stomaco con alta fedeltà Pfu DNA polimerasi (Invitrogen) e clonato in pcDNA-TOPO4 (Invitrogen). Dopo la convalida il sequenziamento, l'inserto è stato subclonato in pcDNA3.1 con gli enzimi di restrizione Hind III e Xba I.
saggio di formazione di colonie
trasfettate cellule AGS con pcDNA3.1 vuoto o pcDNA3.1-CHD5 sono stati utilizzati per il monostrato saggio di formazione di colonie. Le cellule sono state coltivate durante la notte in un 12-pozzetti (1,0 × 10 5 /pozzetto) e trasfettate con pcDNA3.1 o il vettore CHD5 esprimono usando Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen). 48 ore più tardi, i trasfettanti sono stati ri-piastrate in triplicato e coltivate per 10-15 giorni in terreno RPMI1640 completa contenente G418 (400 mcg /ml). colonie sopravvissute sono state colorate con Gentian Violet dopo fissazione metanolo e le colonie che superano determinate dimensioni (≥ 50 cellule) sono state contate. Gli esperimenti sono stati ripetuti tre volte.
Risultati
down-regolazione dell'espressione CHD5 in linee cellulari di cancro gastrico
L'espressione di CHD5 in linee cellulari di cancro gastrico è stato determinato dalla RT-PCR quantitativa. Mentre CHD5 era altamente espresso in tessuti normali gastrici, le sue espressioni sono stati down-regolato in tutte le 7 linee di cellule di cancro gastrico (AGS, Kato III, MKN28, MKN45 e NCI-N87 SNU1 e SNU16) (Fig. 1). Figura 1 CHD5 è down-regolato in linee cellulari di cancro gastrico. L'espressione di CHD5 in linee cellulari di cancro gastrico è stata determinata mediante RT-PCR. GAPDH è stato utilizzato per normalizzare l'espressione CHD5. Il normale tessuto dello stomaco (stomaco) è stato utilizzato come riferimento. I risultati di quantitative real-time RT-PCR è stato mostrato nel pannello superiore e il risultato di convenzionale RT-PCR è stato mostrato nel pannello inferiore.
Hypermethylation Promotore di CHD5 in linee cellulari di cancro gastrico e tessuti di carcinoma gastrico primarie
Un tipico CpG Island (CGI) è stato trovato intorno CHD5 esone 1 utilizzando i seguenti criteri: contenuto GC > 55%, ObsCpG /ExpCpG > 0,65, e la lunghezza > 500 bp (Fig. 2a). Lo stato di metilazione di questo CGI in cellule di cancro gastrico è stato determinato mediante metilazione specifica PCR (MSP). Come mostrato in Fig. 2B, metilazione totale o parziale è stata rilevata in tutte le 7 linee di cellule di cancro gastrico che abbiamo esaminato. In linea con i dati sulle linee cellulari gastrici, il promotore CHD5 stato anche metilato nella maggior parte dei tessuti gastrici primaria carcinoma testate (73%, 11/15) (Fig. 2C). È importante sottolineare che la metilazione del promotore CHD5 era o non rilevato o debolmente rilevabile nei tessuti normali adiacenti ai tumori degli stessi pazienti e nei tessuti gastrici di soggetti normali. Inoltre, la metilazione del promotore CHD5 in linee cellulari di cancro gastrico e tessuti carcinoma gastrico è stata confermata da bisolfito sequenziamento del genoma (BGS) (Fig. 2D). Nel loro insieme, CHD5 è stata prevalentemente a tacere nel cancro gastrico e promotore hypermethylation sembrava essere il principale meccanismo di silenziamento CHD5 nella tumorigenesi di questo tessuto. Figura 2 promotore CHD5 è hypermethylated nel cancro gastrico. A, CHD5 ha una tipica isola CpG (CGI) attorno al suo esone 1. CGI è stata tracciata dal programma di GeneTool. Le posizioni di BGS e MSP primer sono stati indicati come frecce. B, Lo stato di metilazione del promotore CHD5 in cellule di cancro gastrico è stato determinato dalla metilazione specifica PCR. M: metilazione; U: unmethylation. C, Lo stato di metilazione del promotore CHD5 nei tessuti di cancro gastrico primaria è stata determinata dalla metilazione specifica PCR come in B. tessuti gastrici normali e tessuti non tumorali adiacenti sono stati utilizzati come controlli. N1 e N2 sono normali tessuti gastrici. T1 e T2 indicano tessuti carcinoma gastrico mentre A1 e A2 rappresentano tessuti non tumorali adiacenti. sono stati mostrati i risultati rappresentati. D, La metilazione del promotore CHD5 in linee cellulari di cancro gastrico e tessuti carcinoma gastrico primaria è stata confermata da BGS. Ogni cerchio indica un sito CPG e cerchi pieni in nero rappresentano metilato siti CpG. Una fila di cerchi rappresenta una singola colonia.
Up-regolazione dell'espressione CHD5 dopo il trattamento Aza
Per confermare ulteriormente il promotore CGI hypermethylation mediata CHD5 silenziamento in linee cellulari di cancro gastrico, espressioni CHD5 in AGS e Kato III prima e dopo il reagente demetilazione trattamento Aza sono stati analizzati. Entrambe le linee cellulari presentano completa metilazione del promotore CHD5. espressione CHD5 in queste due linee cellulari sono risultati significativamente aumentati dopo demetilazione Aza-indotta di CHD5 promotore (Fig. 3A e 3B), dimostrando che CHD5 è infatti epigeneticamente tacere nel cancro gastrico. Figura 3 demetilazione farmacologica riattiva espressione CHD5 in linee cellulari di cancro gastrico. A, espressioni CHD5 relativa prima e dopo il trattamento Aza sono stati determinati mediante RT-PCR come in Fig. 1. GAPDH è stato utilizzato per normalizzare la quantità template. B, demetilazione del CHD5 promotore nelle cellule AGS dopo il trattamento Aza è stata confermata da BGS come in Fig. 2D.
Funzione di crescita inibitoria di CHD5
La proprietà soppressione del tumore del CHD5 in cellule di cancro gastrico è stata studiata da una strategia di guadagno-di-funzione. Full frame di lettura aperta (ORF) di CHD5 è stato clonato in vettore di espressione di mammifero pcDNA3.1. L'effetto di espressione CHD5 ectopica sulla crescita delle cellule di cancro gastrico AGS è stata determinata con test di formazione monostrato colonia. L'espressione forzata di CHD5 in cellule AGS è stata confermata mediante RT-PCR (Fig. 4A). Il numero di colonie formate sulla piastra da cellule che sovra-esprimono CHD5 era significativamente ridotto (p
< 0.01) (Fig 4B e 4C.), Indicando che CHD5 può sopprimere la crescita delle cellule di cancro gastrico. Figura 4 CHD5 inibisce la crescita di cellule di cancro gastrico linea di AGS. L'effetto di espressione CHD5 ectopica sulla crescita delle cellule tumorali è stata studiata dal saggio di formazione monostrato colonia. A, espressione CHD5 in cellule AGS dopo trasfezione è stata determinata mediante RT-PCR. La fotografia di colonie formate da cellule AGS trasfettate con pcDNA3.1 (vettore) o pcDNA3.1-CHD5 (CHD5) è stato mostrato in B. C, quantitativa analisi dei numeri di colonie sono indicati come valori di media ± deviazione standard. P
valori sono stati calcolati usando test t. L'asterisco indica differenza statisticamente significativa (p
< 0,01).
Discussione
Nel corso degli ultimi anni, molti STG sono stati trovati per essere epigeneticamente inattivato nel cancro gastrico, indicando che silenziamento epigenetico di STG è una di importanti alterazioni molecolari nel processo di carcinogenesi gastrica [22-25]. In questo studio, CHD5 è stato identificato come un altro potenziale TSG cui inattivazione epigenetica può contribuire alla carcinogenesi gastrica. E 'stato spesso down-regolato attraverso ipermetilazione del promotore in linee cellulari di cancro gastrico. L'espressione ectopica di CHD5 ha portato alla inibizione della crescita delle cellule di cancro gastrico, indica che le funzioni CHD5 come TSG epigeneticamente tacere nel carcinoma gastrico.
Hypermethylation Promotore di CHD5 nel cancro è stata osservata in altri tipi di tumore [17, 20]. Tuttavia, l'incidenza di CHD5 metilazione del promotore in linee cellulari tumorali e tumori gastrici è stato trovato in questo studio per essere relativamente elevata, rispetto alla frequenza di CHD5 metilazione in altri tumori (generalmente inferiore al 20%) [17, 20]. Naturalmente, più campioni dovrebbero essere usati per confermare questo risultato con gli stessi primer MSP nei seguenti studi. Tuttavia, la nostra scoperta suggerisce che CHD5 inattivazione potrebbe essere mediata da meccanismi diversi in diversi tessuti. Mentre CHD5 è inattivato attraverso numero di copie anomalia in vari tumori [15, 16], ibridazione genomica comparativa (CGH) ha indicato che 1p36, il CHD5 contenente gene locus, non è significativamente sbilanciata nei tumori gastrici [26]. Invece, come mostrato in questo studio, CHD5 sembra essere messo a tacere prevalentemente da ipermetilazione del promotore di cancro gastrico.
È sempre più evidente che ipermetilazione del promotore TSG rappresenta una delle più importanti alterazioni molecolari nello sviluppo del cancro. L'alta incidenza di CHD5 ipermetilazione del promotore di cancro gastrico può essere esplorato non solo come una diagnosi di cancro gastrico, ma anche prognosi previsione. A tal fine, è importante caratterizzare la metilazione CHD5 promotore in associazione con caratteristiche cliniche, come l'età, il sesso, l'infezione da H. pylori, il grado del tumore, la classificazione Lauren e la differenziazione. Dato che l'elevata eterogeneità dei tessuti carcinoma gastrico primarie, metilazione analizza con una risoluzione maggiore, come analisi specifica metilazione quantitativa utilizzando Sequenom o Taqman PCR in tempo reale sarà utile per valutare se CHD5 metilazione del promotore è utile per la diagnosi del cancro gastrico precoce e la prognosi di previsione. Anche se
metilazione del promotore inattiva spesso CHD5 in linee cellulari di cancro gastrico, non possiamo escludere la presenza di altri meccanismi per la funzione perdita di CHD5 nel cancro gastrico. espressione CHD5 è estremamente bassa in MKN28 e SNU16 (Fig. 1), tuttavia, il promotore di CHD5 solo parzialmente metilata in queste due linee cellulari (Fig. 2B), indicando che altri meccanismi possono essere responsabili della silenziamento CHD5 in qualche di linee di cellule di cancro gastrico.
Conclusione
CHD5 era spesso down-regolato attraverso ipermetilazione del promotore in cellule di cancro gastrico. L'espressione ectopica di CHD5 ha portato alla inibizione della crescita delle cellule di cancro gastrico, indica che le funzioni CHD5 come un gene soppressore del tumore epigeneticamente tacere nel carcinoma gastrico.
Dichiarazioni
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dott Hongchuan Jin (Biomedical Research Center, Sir Shaw Ospedale Runrun, Zhejiang University) per la sua preziosa consulenza e sostegno tecnico. Il lavoro descritto in questo documento è stato in parte sostenuto da una sovvenzione da parte del Consiglio assegni di ricerca della Regione ad amministrazione speciale di Hong Kong, Cina (Progetto n CityU 160.508). Fascicoli presentati originali
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Gli autori dichiarano di avere interessi in gioco.