vincolanti EBNA1 e regolazione epigenetica di gastrokine tumorali geni soppressori in gastrica carcinoma cells

vincolante EBNA1 e regolazione epigenetica di gastrokine tumorali geni soppressori in cellule di carcinoma gastrico
Abstract
sfondo
Epstein-Barr Virus (EBV) infetta latentemente ~ 10 % dei carcinomi gastrici (GC). Epstein-Barr Nuclear Antigen 1 (EBNA1) è espresso in GC EBV-associata, e può legare il DNA ospite, dove si può avere un impatto regolazione genica cellulare. Qui, dimostriamo che EBNA1 si lega direttamente al DNA a monte dei geni oncosoppressori specifici GC divergente trascritte gastrokine 1 (GKN1) e gastrokine 2 (GKN2).
Metodi
Usiamo ChIP-Seq, Chip-qPCR, e l'EMSA a dimostrare che EBNA1 si lega direttamente al GKN1 e GKN2 promotore locus. Noi generiamo AGS-EBV, e linee di cellule AGS-EBNA1 per studiare gli effetti di EBNA1 sull'espressione GKN1 e GKN2 mRNA con o senza 5 'azacitidina trattamento.
Risultati
Abbiamo dimostrato che i geni gastrokine sono trascrizionalmente messi a tacere dalla metilazione del DNA . Mostriamo anche che l'infezione da EBV latente riduce ulteriormente espressione GKN1 e GKN2 nelle cellule di carcinoma gastrico AGS, e che la deplezione di siRNA EBNA1 allevia in parte questa repressione. Tuttavia, l'espressione ectopica di EBNA1 è leggermente aumentato i livelli di GKN1 e GKN2 basale mRNA, ma ridotto la loro capacità di risposta al agente demethylating.
Conclusioni
Questi risultati dimostrano che EBNA1 si lega al promotore divergenti dei geni GKN1 e GKN2 nelle cellule GC, e suggeriscono che EBNA1 contribuisce al complesso trascrizionale epigenetica e la deregolamentazione dei geni oncosoppressori GKN1 e GKN2 in EBV GC positivo.
Parole
EBV EBNA1 gastrica carcinoma Gastrokine ChIP-Seq epigenetica Introduzione
Epstein-Barr virus ( EBV) è un gammaherpesvirus umano trovato in una vasta gamma di linfoide e tumori di cellule epiteliali, tra cui il linfoma di Burkitt, il morbo di Hodgkin, carcinoma nasofaringeo (NPC), e la malattia linfoproliferativa post-trapianto (recensione in [1, 2]). Più di recente, EBV è stato trovato in ~ 10% di tutti i casi di carcinoma gastrico (GC) in tutto il mondo [3, 4]. È stato dimostrato EBV-associata GC essere una conseguenza monoclonale di cellule epiteliali gastriche infettate da EBV ed è considerato un sottotipo distinto di GC [5, 6]. Poiché l'incidenza di GC è vicino a 900.000 persone all'anno [7], GC EBV-associata può essere tra i tumori EBV-associati più diffuse.
In EBV cellule positive carcinoma gastrico, EBV stabilisce una variante di tipo I latenza, dove trascrizione EBV è limitata al tipo canonica I geni EBNA1, Ebers, famiglia BART non codificante RNA e miRNA, ma con qualche ulteriore espressione di LMP2A [6, 8-11]. Tra questi geni di latenza, EBNA1 è l'unica proteina nucleare virale che viene rilevato in GC EBV-associati. EBNA1 è necessario per l'istituzione dell'infezione episomiale latente e per la sopravvivenza a lungo termine delle cellule latentemente infette [12-15]. EBNA1 è una proteina che lega il DNA che si lega ad entrambi i siti cromosomiche virali e di accoglienza. I siti di legame del genoma virale sono stati caratterizzati per le funzioni essenziali nella replicazione e controllo trascrizionale dell'espressione genica virale. Tuttavia, la funzione di legame al cromosoma ospite EBNA1 sequenza-specifico è meno ben compreso. Mentre EBNA1 può legarsi alle regioni promotrici di diversi geni ospitanti, non è chiaro se questi geni sono soggetti a regolamentazione EBNA1 [12, 16, 17]. La sovraespressione del dominio di legame EBNA1 DNA, che funge da dominante negativo in cellule infette EBV, possono inibire la vitalità cellulare in cellule non infette, suggerendo che EBNA1 lega e regola geni cellulari importanti per la sopravvivenza delle cellule [18]. espressione ectopica di EBNA1 è stato indicato per effettuare l'espressione di mRNA della cellula ospite [19], ma non è chiaro se questi effetti sono direttamente o indirettamente legati a specifici siti di legame EBNA1 nel genoma cellulare.
In uno studio precedente, abbiamo usato metodi chIP-seq per analizzare i siti di arricchimento genoma di EBNA1 in cellule di linfoma di Burkitt raji latentemente infette e identificati numerosi siti cellulari legati da EBNA1 [17]. Tra questi EBNA1 siti di arricchimento cellulare abbiamo identificato un significativo picco vincolante EBNA1 situato al gastrokine 1 (GKN1) e gastrokine 2 (GKN2, noto anche come fattore di trifoglio interagenti proteine ​​(TFIZ1)) cluster di geni. GKN1 e GKN2 sono stati identificati in base alla loro frequente perdita di espressione in cellule di carcinoma epiteliali gastriche neoplastiche, rispetto al tessuto normale gastrica [20-22] (recensito in [23]). Diversi studi recenti hanno descritto anti-proliferativo e anti-invasiva per GKN1 in cellule epiteliali gastriche, che, insieme alla sua perdita espressione frequente nel cancro, suggerisce funziona come soppressore tumorale specifico all'epitelio gastrico [21, 24-28]. GKN1 può inibire la migrazione delle cellule e l'invasione nella guarigione delle ferite, transwell e il dosaggio Matrigel, così come marcatori di cellule alter associati con la transizione epitelio-mesenchimale [26]. GKN1 e GKN2 geni si trovano nelle immediate vicinanze e trascritte in direzioni opposte, suggerendo che essi probabilmente condividono un promotore bidirezionale, e sono soggette a coordinare la regolamentazione da fattori di regolazione della trascrizione condivisa (recensito in [23]). In questo
studio, abbiamo dimostrato il legame diretto tra EBNA1 e GKN1-GKN2 loci e indagato GKN1 e GKN2 modulazione dell'espressione genica da infezione da EBV e proteine ​​EBNA1. I nostri risultati suggeriscono che l'infezione da EBV può inibire ulteriormente l'espressione GKN1 e GKN2, e che la perdita di EBNA1 può facilitare epigenetica de-repressione della GKN2 trascrizione. Abbiamo anche osservato livelli elevati metilazione del DNA in GKN1 e GKN2 regioni promotrici, e un ruolo potenziale per EBNA1 nella deregolamentazione e la repressione epigenetica di questo tumore soppressore locus.
Risultati
Identificazione di un sito di legame con GKN1 EBNA1 alta occupazione locus -GKN2 da chip-Seq
precedentemente pubblicati dati chip-Seq da cellule raji BL ha rivelato un numero limitato di EBNA1 altamente arricchito siti di legame sulla base di punteggi di punta e leggere i numeri [17]. Ulteriori ispezione ha rivelato un forte EBNA1 sito di legame a monte dei siti di inizio per i geni GKN1 e GKN2 divergente trascritte (Figura 1A, guida superiore). Un simile picco vincolante EBNA1 è stata osservata in un esperimento di ChIP-Seq separata eseguita in EBV nasofaringeo linea di cellule di carcinoma positivo C666-1 (dati completi chip-ss da pubblicare altrove), indicando che questo legame si verifica in entrambi epiteliali, così come linfoide tipi di cellule (Figura 1A, pista inferiore). Il centro del picco si trovava ~ 5 kb da GKN2 e ~ 15 KB dai siti di inizio GKN1 di trascrizione. ChIP-qPCR è stato utilizzato per convalidare il legame alla regione del promotore GKN1-GKN2 sia Raji e cellule C666-1 (Figura 1B e C) EBNA1. qPCR ha indicato che EBNA1 legata al sito GKN1-2 con efficienza simile a un sito EBNA1 di legame precedentemente convalidato presso il promotore PITPNB. qPCR ha anche indicato che il legame di GKN1-GKN2 EBNA1 era specifico in quanto non vi era alcuna EBNA1 rilevabile vincolante sia il locus GAPDH cellulare o regioni di controllo EBV OriLyt, come previsto (Figura 1B e C). Il EBNA1 sito di legame putativo a GKN1-GKN2 locus è stato identificato da allineamento con un sito di legame consenso nella famiglia EBV di ripetizioni (FR) regione, e questa sequenza è stato poi testato per legame diretto EBNA1 da EMSA (Figura 1D). Purificata ricombinante EBNA1 proteine ​​DBD è stato analizzato per il legame con sonde contenenti il ​​sito GKN1-GKN2 (GKN1 /2), FR, o una sequenza di controllo negativo manca un sito di legame di consenso EBNA1. Abbiamo trovato che EBNA1 DBD vincolata efficacemente al sito GKN1-GKN2, nonché alla FR consenso, ma non lega alla sequenza di controllo. Questi risultati suggeriscono che EBNA1 interagisce con la regione promotore GKN1-GKN2 attraverso diretta DNA-binding con il EBNA1 DBD. Figura 1 EBNA1 si lega al GKN1 e GKN2 promotore locus. (A) Il browser genoma UCSC è stato utilizzato per mappare EBNA1 picco vincolante generato da Raji e C666-1 ChIP-Seq al GKN1 e GKN2 loci genici. RefSeq annotato trascrizioni sono indicati al di sotto del picco di ChIP-Seq. (BC) convalida in tempo reale-PCR dei dati del chip-Seq per EBNA1 sito di legame con la regione del promotore GKN1 /2 comune: EBNA1 (barre rosse) o controllare IgG (blu bar) sono stati dosati con chip Raji (B) o C666-1 cellule (C) per il DNA di legame al /2 sito GKN1, PITPNB promotore, GAPDH, o EBV Ori-Lyt. analisi (D) EMSA di 32P etichettato sonde contenenti controllo, GKN1 /2 sito, o EBV FR. Variando quantità di proteine ​​EBNA1 DBD è stato usato nella reazione (0, 100, 300, 900 ng) vincolante. Punte di freccia rappresentano complessi legati specifiche EBNA1 o sonda libero come indicato. La sequenza della sonda di GKN1 /2 sito e FR è indicato con la sequenza omologhi (lettere rosse) tra GKN1 /2 e FR. La sequenza di controllo negativo (Ctrl) è anche indicato. Le barre di errore indicano la deviazione standard dalla media (SDM) per n = 3.
GKN1 e GKN2 mRNA sono altamente espressi in tessuto dello stomaco primaria
Abbiamo poi misurato i livelli GKN1 o GKN2 mRNA in varie gastrici linee cellulari di carcinoma e primaria tessuto gastrico normale qRT-PCR (Figura 2). Abbiamo trovato che GKN1 e GKN2 sono espressi a livelli molto più elevati (~ 3 × 10 4 volte) in tessuto dello stomaco primaria che in qualsiasi delle linee cellulari testate (Figura 2A). Anche se a livelli molto più bassi rispetto tessuto dello stomaco primaria, GKN1 e GKN2 sono stati entrambi espressi a livelli misurabili in linee cellulari di carcinoma gastrico AGS, con GKN2 espresso a livelli più alti di tutte le altre linee di cellule GC, o EBV positivo a cellule B o linee cellulari NPC ( Figura 2B). Molto bassi livelli di GKN1 o GKN2 potrebbe essere rilevato nel tessuto epiteliale orale primaria, inoltre indicando che questi geni sono specifici per gastrica-tessuto primario. Figura 2 GKN1 e GKN2 mRNA sono altamente espressi in tessuto dello stomaco primaria. RT-PCR è stata effettuata per analizzare il livello di mRNA di GKN1 (blu bar) o GKN2 (barre rosse) in diverse linee cellulari, tra cui GC-derivato GTL, MKN28, MKN74, SNU638, AGS, BL-derivato Raji, EBV immortalato LCL, EBV linea NPC positivo C666-1, o cellule epiteliali della bocca primaria confronto con (A) o senza (B) tessuto dello stomaco primaria. Le barre di errore indicano la deviazione standard dalla media (SDM) per n = 3. latenza
EBV riduce espressione GKN1 e GKN2 mRNA nelle linee di cellule GC
Per testare l'effetto di EBV infezione latente sull'espressione GKN1 e GKN2, abbiamo generato una linea cellulare AGS contenente EBV B95.8 bacmid. La linea cellulare AGS è stato selezionato per la resistenza igromicina e GFP positività per assicurare che conteneva componenti bacmid. Per caratterizzare la linea cellulare AGS-EBV, abbiamo prima analizzato il pattern di espressione genica EBV (Figura 3). Abbiamo scoperto che le cellule AGS-EBV esprimono livelli di mRNA rilevabili di EBNA1, BARF0, e LMP2A, ma non LMP1, EBNA2, o EBNA3C (Figura 3). Anche se EBV B95.8 bacmid manca la BART miRNA, questi risultati sono in linea con le cellule AGS-EBV adottando un tipo di variante che la latenza programma di espressione genica con qualche espressione di LMP2A, simile a quella osservata in EBV tessuto gastrico carcinoma tumore positivo [8, 10 ]. Per caratterizzare ulteriormente le cellule AGS-EBV, abbiamo analizzato l'espressione della proteina EBNA1 da Western Blot (Figura 4A) e EBV DNA copiare numero per qPCR (Figura 4B). EBNA1 è stato rilevato come una singola specie a bassa abbondanza alla massa molecolare atteso (Figura 4A). numero EBV copia è stata misurata confrontando EBV Ori-Lyt DNA per GAPDH cellulare (Figura 4B). Abbiamo scoperto che AGS-EBV contiene circa il 50% in meno copie del genoma virale rispetto al EBV LCLs positivi. Per determinare se EBNA1 ha mantenuto la sua attività legame al DNA in AGS-EBV, abbiamo effettuato test ChIP convenzionali (Figura 4C). Abbiamo trovato che EBNA1 legato al DNA EBV Dyad Symmetry (DS), nonché per il sito di legame GKN1-GKN2 in cellule AGS-EBV. Abbiamo poi chiesto se i livelli GKN1 o GKN2 mRNA sono state colpite da EBV infezione latente nelle cellule AGS confrontando i livelli di espressione RT-qPCR in AGS rispetto alle cellule AGS-EBV (Figura 4D). Abbiamo scoperto che GKN1 e GKN2 sono stati repressi ~ 3-8 volte AGS-EBV rispetto alle cellule AGS, il che suggerisce che la latenza EBV promuove o stabilizza la repressione trascrizionale di GKN1 e GKN2. Figura 3 Caratterizzazione di EBV espressione genica in linee cellulari AGS-EBV. AGS, AGS-EBV positivi e EBV-LCL sono stati analizzati per l'espressione di mRNA da qRT-PCR con primer per EBNA1, BARF0, LMP2A, LMP1, EBNA2 o EBNA3C, come indicato. Le barre di errore indicano la deviazione standard dalla media (SDM) per n = 3.
Figura 4 infezione da EBV di cellule AGS sopprime GKN1 e GKN2 trascrizione. (A) Analisi Western Blot di espressione della proteina nelle cellule EBNA1 AGS-EBV rispetto alle cellule AGS EBV-negativi è stata effettuata utilizzando anticorpi per EBNA1 (in alto) o Actina (in basso). numero di (B) copia del DNA è stato analizzato mediante real-time PCR di EBV Ori-Lyt DNA rispetto al livello di GAPDH cellulare in AGS, AGS-EBV, e le cellule EBV-LCL. (C) Chip e analisi in tempo reale PCR di EBNA1 (barre rosse) o controllare IgG (blu bar) per il legame del DNA nei siti EBV tra DS e Ori-Lyt o siti cellulari tra cui GKN1 /2 e GAPDH nel AGS-EBV cellule. (D) RT-PCR è stata effettuata per analizzare il livello di mRNA di GKN1 o GKN2 a AGS (blu bar) o cellule AGS-EBV (barre rosse). ** Indica p < .005. Le barre di errore indicano la deviazione standard dalla media (SDM) per n = 3.
EBV aumenta la metilazione del DNA repressione dipendente di GKN1 e GKN2 mRNA nelle linee di cellule GC
GKN1 e GKN2 possono essere soggetti alla soppressione epigenetica in GC e tessuti linee di cellule cultura. Per esplorare questa possibilità, abbiamo testato se il trattamento con demethylating DNA agente 5 'azacitidina (Aza) o un agente deacetylating (NaB) in combinazione con forbolo estere (TPA) avrebbe attivato GKN1 o GKN2 nelle cellule AGS (Figura 5A). Abbiamo scoperto che il trattamento Aza ha portato ad un aumento di ~ 10 volte GKN2, e ~ 4 volte maggiore in GKN1 trascrizione in AGS trattata cellule. Al contrario, il trattamento NaB /TPA prodotto solo ~ 2 volte di attivazione della trascrizione. Questi risultati suggeriscono che sia GKN1 e GKN1 sono sotto repressione epigenetica attiva attraverso la metilazione del DNA. Per verificare se EBV ha avuto alcun effetto sulla attivazione Aza indotta di GKN1 o GKN2, abbiamo confrontato gli effetti del trattamento Aza su AGS rispetto alle cellule AGS-EBV da qRT-PCR (Figura 5B). Abbiamo trovato che GKN1 e GKN2 stati efficacemente attivate mediante trattamento Aza nelle cellule AGS, ma in misura minore in AGS-EBV. In questi esperimenti, l'attivazione Aza-indotta GKN2 stato completamente eliminato, mentre l'attivazione di GKN1 solo in parte attenuato. Aza-trattamento ha comportato anche la piega aumento ~ 8.4 nei livelli di mRNA EBNA1, il che suggerisce che il trattamento Aza stimola l'espressione genica EBV litica in linee cellulari AGS-EBV. Questi risultati suggeriscono che i prodotti genici EBV prevenire GKN2, e in misura minore di attivazione GKN1 dopo il trattamento Aza. Figura 5 EBV rafforza la repressione di GKN1 e GKN2 espressione genica per metilazione del DNA. (A) cellule AGS sono state trattate con 10 mM Aza, o 1 mM NaB e 20 ng /mL TPA per 48 ore e analizzate mediante RT-PCR per GKN1 o livello di espressione GKN2, rispetto AGS non trattati. (B), le cellule AGS o cellule AGS-EBV sono stati trattati o non trattati con 10 mM Aza per 48 ore, poi analizzati per GKN1, GKN2 mRNA, o livelli di mRNA EBNA1. (C) MeDIP dosaggio di AGS o cellule AGS-EBV trattati o non trattati con 10 mM Aza per 48 ore a diverse regioni del DNA di GKN1 e GKN2 loci. (D) MeDIP saggio di AGS o cellule AGS-EBV trattati o non trattati con 10 mM Aza per 48 ore a regioni cellulari per l'alfa globina-2, GAPDH, Cdc7, FOXP2, HDAC3 o MAP3KIP2. (E) Genome posizione dei primer utilizzati per le analisi GKN1-GKN2 chip e MeDIP. * Indica p < .05, ** Indica p < .005. Le barre di errore SDM per n = 3.
Per comprendere meglio il meccanismo di GKN1 e GKN2 repressione epigenetica indicati, abbiamo esaminato i livelli di metilazione del DNA utilizzando test metil-specific citosina anticorpo diretto DNA immunoprecipitazione (MeDIP). Abbiamo saggiato l'arricchimento di DNA metilato nella regione di controllo GKN1-GKN2 in cellule AGS e AGS-EBV con o senza trattamento Aza (Figura 5C). Abbiamo osservato un arricchimento relativo di metilato CpG in una regione tra il sito di legame EBNA1 e il sito di inizio della trascrizione GKN2 (GKN2_A). trattamento Aza ha portato ad una diminuzione del segnale MeDIP nella maggior parte delle regioni in cui è stato rilevato un segnale, il che suggerisce che il trattamento Aza ha portato ad una generale riduzione metilazione del DNA. perdita simile di CpG metilazione è stata osservata il gene alfa-globina (che non legano EBNA1), e in diversi vincolante EBNA1 siti, tra cui HDAC3 e MAP3K7IP (Figura 5D). Abbiamo anche notato che i segnali MeDIP erano generalmente superiori a EBV-AGS che in cellule AGS, suggerendo che l'infezione latente da EBV può promuovere o stabilizzare la metilazione del DNA in tutto il genoma dell'ospite.
Esaurimento EBNA1 attiva espressione GNK1 e GKN2 mRNA in cellule epiteliali EBV positive
per determinare se EBNA1 contribuito alla repressione trascrizionale di GKN1 e GKN2, in primo luogo abbiamo cercato di esaurire EBNA1 nelle cellule AGS-EBV utilizzando siRNA (Figura 6). Abbiamo generato un siRNA mira il 3 'non codificante UTR di EBNA1 mRNA, che ha parzialmente impoverito proteina EBNA1 nelle cellule AGS-EBV (figura 6b). L'esaurimento delle EBNA1 ha comportato un ~ 5 volte attivazione di GKN2, con poco di attivazione rilevabile di GKN1 (figura 6A). Questi risultati suggeriscono che EBNA1 può funzionare come un repressore trascrizionale di GKN2 nelle cellule AGS-EBV. Figura 6 esaurimento siRNA di EBNA1 provoca de-repressione della GKN1 e GKN2 nelle cellule AGS-EBV. siCtrl o siEBNA1 transfettate cellule AGS-EBV sono stati analizzati mediante RT-PCR per GKN1 o GKN2 mRNA livello relativo al GAPDH cellulare (A). Le cellule sono state raccolte in 72 ore dopo la trasfezione con siRNA. Western Blot mostrando EBNA1 (pannello superiore) e il controllo di carico actina (pannello inferiore) nelle cellule AGS-EBV (B). Le barre di errore indicano la deviazione standard dalla media (SDM) per n = 3.
EBNA1 inibisce GKN1 e GKN2 trascrizione dopo demetilazione del DNA
Per esplorare ulteriormente il contributo di EBNA1 a GKN1 e GKN2 regolazione della trascrizione, abbiamo testato l'effetto di espressione ectopica di sola EBNA1 sui livelli di Aza-indotti di GKN1 o GKN2 trascrizione nelle cellule GC. cellule AGS sono state trasdotte con un lentivirus EBNA1 che esprime. Stabile AGS-EBNA1 (PLU-EBNA1) o linee cellulari di controllo AGS- vettore (PLU-Vec) sono stati selezionati e analizzati per i livelli GKN1 e GKN2 mRNA. Abbiamo osservato che le cellule AGS-EBNA1 avevano un ~ 2-3 volte più alto livello basale di GKN1 e GKN2 mRNA relativi alle cellule AGS parentali (Figura 7a). livelli di mRNA Tuttavia, Aza-indotti di GKN1 e GKN2 sono stati attenuati in AGS-EBNA1 rispetto alle cellule AGS (Figura 7B). trattamento Aza anche portato a un forte aumento dei livelli di mRNA EBNA1 (Figura 7c). Per determinare se gli effetti della EBNA1 su GKN1 e GKN2 erano specifici per le cellule AGS, abbiamo trasdotte un'altra EBV negativo linea di cellule GC MKN74 con EBNA1 lentivirus (Figura 7D-F). Simile a cellule AGS, abbiamo scoperto che EBNA1 aumento dei livelli basali di GKN1 e GKN2, ma ha inibito la capacità di Aza di indurre ulteriormente i livelli GKN1 e GKN2 mRNA (Figura 7D ed E). Abbiamo confermato che Aza-trattamento è stato efficace per la misurazione dei livelli di mRNA EBNA1, che ha aumentato ~ 7 volte (figura 7F). Questi risultati suggeriscono che l'espressione ectopica di EBNA1 può aumentare basale, ma inibire i livelli di Aza-indotti di GKN1 e GKN2 trascrizione in linee cellulari GC EBV-negativi. Figura 7 EBNA1 inibisce GKN1 e GKN2 trascrizione dopo demetilazione del DNA nelle cellule GC. (A) cellule AGS sono state trasdotte con PLU-vettore (Vec) o PLU-EBNA1 e quindi non trattata (untr) o trattati con 10 mM 5'-azacitidina (Aza) per 48 ore. GKN1 e GKN2 mRNA sono stati quantificati da qRT-PCR rispetto al GAPDH. (B) Piegare induzione di GKN1 e GKN2 mRNA da Aza sono stati quantificati da pannello A. (C) qRT-PCR analisi dei livelli di mRNA EBNA1 nelle cellule AGS. (D) Come in A, tranne che per i MKN74 piuttosto che cellule AGS. (E) Piegare induzione di GKN1 e GKN2 mRNA quantificate dal pannello di analisi D. (F) qRT-PCR dei livelli di mRNA nelle cellule EBNA1 MKN74. * Indica p < .05, ** Indica p < .005. Le barre di errore SDM indicati per n = 3.
Discussione
In questo studio, abbiamo identificato un sito di legame ad alta occupazione EBNA1 in 5 'regione di controllo promotore dei geni GKN1 e GKN2 divergente trascritte. siti di legame EBNA1 sono stati osservati in due insiemi di dati Chip-Seq indipendenti da EBV positivi linfoidi cellule BL Raji e EBV positivo epiteliali cellule di carcinoma nasofaringeo C666-1 (Figura 1A). Abbiamo confermato questi siti di legame di convenzionale ChIP-qPCR in entrambe le linee cellulari (Figura 1B e C). EBNA1 stato anche dimostrato di legarsi direttamente a questi siti da parte EMSA con purificata EBNA1 ricombinante DBD proteine ​​(Figura 1D). Abbiamo dimostrato che i livelli GKN1 e GKN2 mRNA sono altamente repressi nella maggior parte delle linee cellulari relativi al tessuto gastrico primaria (Figura 2). Per studiare il ruolo potenziale di EBV e EBNA1 nel controllo trascrizionale di GKN1 e GKN2, abbiamo generato una linea di cellule di carcinoma EBV positivo AGS gastrica. Si dimostra che EBV adotta un tipo variant I latenza pattern in cellule AGS (figura 3), e che EBNA1 può legarsi al promotore regione GKN1 /GKN2 nel cromosoma cellulare (Figura 4C). Abbiamo anche trovato che GKN1 e GKN2 mRNA sono stati ulteriormente soppressi in EBV cellule AGS positivi relativi al controllo EBV cellule AGS negativi (Figura 4D). Abbiamo poi dimostrato che Aza-trattamento ha portato all'aumento espressione di GKN1 e GKN2 (Figura 5A), e che EBV infezione latente inibisce Aza attivazione GKN2 (Figura 5B). Abbiamo trovato che siRNA esaurimento delle EBNA1 in EBV cellule AGS positivi porta all'attivazione trascrizione GKN2 (Figura 6). Mostriamo anche che EBNA1 espressione ectopica aumenta moderatamente basale, ma inibisce i livelli Aza-indotti GKN1 e GKN2 trascrizione (Figura 7). Presi insieme, questi risultati indicano che EBNA1 si lega alla regione di controllo promotore GKN1-GKN2 in diversi tipi di cellule, e sollevano la possibilità che EBNA1 contribuisce alla repressione trascrizionale e epigenetica delle GKN1 e GKN2 geni oncosoppressori in EBV GC positivo.
infezione latente EBV è noto per aumentare il fenotipo tumorigenico di cellule di carcinoma gastrico [29-31]. GKN1 e GKN2 sono segnalati per funzionare come inibitori della crescita delle cellule e soppressori tumorali in GC [20, 21, 23, 25-27]. I nostri dati di espressione dell'mRNA che mostrano l'espressione di mRNA di alto livello solo in tessuto gastrico normale primaria sono coerenti con il ruolo di GKN1 e GKN2 come un soppressore del tumore. Tuttavia, siamo stati in grado di dimostrare che l'eccesso di espressione di uno o di entrambi GKN1 o GKN2 in AGS o AGS-EBV causare un arresto del ciclo cellulare o ridurre la vitalità (dati non riportati). Questo suggerisce che la funzione GKN1 e GKN2 nelle prime fasi dell'evoluzione delle cellule tumorali, o in microambienti tumorali più complesse. Abbiamo ipotizzare che EBNA1 può avere un effetto più pronunciato sulla GKN1 e GKN2 espressione in situazioni in cui EBV può infettare cellule gastriche primarie dove l'espressione basale di GKN1 e GKN2 sono alti e importante per la soppressione del tumore.
Precedenti studi pubblicati hanno dimostrato che GKN1 e GKN2 trascrizione è soggetta alla soppressione epigenetica da metilazione del DNA in tutte le forme di GC [21]. I nostri studi sono coerenti con il ruolo di metilazione del DNA nella soppressione epigenetica di GKN1 e GKN2 nelle cellule AGS. Il trattamento con Aza comportato l'4-10 volte maggiore espressione GKN1 e GKN2 mRNA (Figura 5A), e MeDIP rivelato arricchimento di DNA metilato le regioni del promotore (Figura 5C). cellule AGS-EBV fatto mostrano un aumento della metilazione del DNA in diversi siti cellulari, comprese le regioni circostanti i siti di regione GKN1 promotore (Figura 5C) vincolante EBNA1, e le HDAC3 e MAP3K7IP2 geni (Figura 5D). Tuttavia, la presenza di EBNA1 nelle cellule AGS-EBV non ha impedito Aza-indotta demetilazione in tali siti. Ciò suggerisce che EBNA1 può reprimere la trascrizione da parte di alcuni promotori, come GKN2, attraverso un meccanismo diverso da metilazione del DNA. Tuttavia, l'espressione ectopica di EBNA1 solo prodotto un fenotipo più complicato, provocando un piccolo aumento dell'espressione basale, ma limitare gli effetti della demetilazione Aza-indotta (Figura 7). Questo può suggerire che tale EBNA1 può funzionare diversamente quando espresso ectopica, rispetto a quando espresse nel contesto del genoma virale. Tuttavia, i nostri risultati suggeriscono che EBNA1 perturba la regolazione trascrizionale normale dei geni GKN1 e GKN2.
La precisa funzione di EBNA1 nella regolazione della trascrizione rimane poco chiaro. EBNA1 è stato implicato nella attivazione trascrizionale e la repressione di entrambi i geni virali e cellulari [32, 33]. EBNA1 può reprimere la propria espressione di mRNA dal EBV Qp nel tipo III latenza, dove la repressione è stata collegata ad interferenze sterico con l'RNA polimerasi II legame al sito inizio della trascrizione [34]. D'altra parte, EBNA1 può attivare Cp e LMP1 promotori in caratteri latenza III dove può funzionare come un fattore enhancer simile [35-37]. EBNA1 è stato implicato in attivazione della trascrizione di alcuni geni cellulari, tra cui il gene Nox2 coinvolta nella formazione di specie reattive dell'ossigeno [19]. EBNA1 può anche influenzare la trascrizione host-cellulare attraverso un rimodellamento globale del cromosoma host [38]. Così, EBNA1 può alterare la trascrizione cellulare attraverso molteplici meccanismi diretti e indiretti.
Modificazioni epigenetiche sono noti per svolgere un ruolo importante nel carcinoma gastrico EBV-associati [39]. È interessante notare che le cellule che trasportano AGS genoma EBV bacmid avevano livelli più elevati di DNA metilato in molti siti testati (Figura 5D). Questo è coerente con il ruolo proposto EBV nella metilazione del tumore ospitante soppressore geni [40]. Questo è anche coerente con i risultati che EBV GC positivo ha elevato la metilazione del DNA in regioni promotrici di diversi soppressori tumorali GC chiave, tra cui i geni gastrokine [39, 41-45]. Mentre EBNA1 legato vicino regioni del DNA metilato del GKN2, siamo stati in grado di dimostrare che EBNA1 modula metilazione del DNA nei siti GKN1 e GKN2 (dati non riportati). Tuttavia, è possibile che EBNA1 in associazione con un altro fattore codificata o indotta virale può stabilizzare GKN1 e GKN2 trascrizionale repressione attraverso un meccanismo cromatina-dipendente e strutturale che rinforza la metilazione del DNA. È anche possibile che EBNA1 può disciplinare GKN1 o GNK2 solo in microambienti tessuti o tumorali che non sono prontamente ricapitolato in coltura cellulare. Mentre la funzione di legare per ospitare siti cromosomiche delle cellule EBNA1 rimane un'importante area di ricerca, modelli di infezione più sofisticati possono essere necessari per chiarire il suo ruolo potenziale nel modificare l'espressione genica della cellula ospite e carcinogenesi.
Metodi
Cells, plasmidi, e l'infezione lentivirus
linfoma delle cellule raji di Burkitt, cellule C666-1 EBV positivo carcinoma nasofaringeo EBV-positivo, e linee cellulari di carcinoma gastrico (un dono del Dr. Antonia R. Sepulveda, Columbia University) tra cui GTL, MKN28, MKN74, SNU638 sono stati mantenuti in RPMI contenente 10% FBS e integrato con antibiotici (penicillina e la streptomicina). cellule di carcinoma gastrico AGS (ATCC No. CRL-1739) sono stati mantenuti in F-12K contenente il 10% FBS. bocca primaria cellule epiteliali sono stati forniti dal Dr. Manjunatha Benakanakere, University of Pennsylvania e coltivate in media cheratinociti-SFM. EBV-LCL è stato istituito con infezione primaria di cellule periferiche mononucleate del sangue (PBMC) con virioni EBV BAC generati dalle cellule 293-EBV stimolati [46, 47]. EBV-LCL contiene un igromicina B EBV resistente bacmid sono state mantenute in RPMI contenente 10% FBS, igromicina B (100 mg /ml), Glutamax (Invitrogen), e gli antibiotici. cellule AGS-EBV sono stati generati dalle cellule AGS co-coltivate con EBV-LCL adattando un precedentemente pubblicati co-coltivazione metodo descritto AGS cellule infezione con rEBV attraverso la cella-a-cella di contatto [48] con alcune modifiche. Brevemente, EBV-LCL è stata indotta da 20 ng /mL 12-O
-tetradecanoylphorbol-13-acetato (TPA) e butirrato di sodio 1 mM (NaB) 24 ore prima della co-coltura. Le cellule EBV-LCL indotte sono state lavate con PBS due volte per rimuovere completamente gli agenti che inducono, risospese con mezzo completo RPMI a 10 6 cellule /ml prima della co-incubazione. cellule AGS sono stati placcati in 6 pozzetti 24 ore prima co-coltivazione, poi 60 - 70% di cellule AGS confluenti in 1 ml completo di media F-12K sono state incubate con 10 6 celle EBV-LCL indotte e lavati in 1 ml RPMI completo. 24 ore più tardi, 2 ml di terreno senza siero F-12K è stato aggiunto a ciascun pozzetto per ridurre la concentrazione FBS al 5% per prevenire la crescita eccessiva di cellule. 3 giorni dopo la co-incubazione, le cellule EBV-LCL sono stati rimossi dalle co-colture e le cellule AGS sono stati accuratamente lavati con PBS almeno 5 volte per rimuovere qualsiasi donatore cellule EBV-LCL. Le cellule AGS infetto è stato poi incubate con terreno fresco F-12K con il 10% FBS e 100 mg /ml Hygromycin B e il mezzo di selezione è stato cambiato ogni 2 o 3 giorni fino a quando le cellule infette AGS formate colonie di selezione Hyg B con l'espressione GFP (di solito 3 a 4 settimane dopo la co-coltivazione). Le colonie di selezione sono stati poi sommati e testati per l'espressione EBNA1 e numero di copie EBV genoma prima oggetto di esperimenti. cellule AGS-EBV sono stati mantenuti in media F-12K con il 10% FBS e 100 mg /ml Hygromycin B.
PLU-EBNA1 Lentivirus vettore di espressione è stato costruito con la PCR amplificazione della EBNA1 con primer (GCGGGATCCTCTGACGAGGGGCCAGGTACAGGACCT e ATCGTCGACTCACTCCTGCCCTTCCTCACCCTCATC) l'introduzione di un 5 ' BamH I e 3 'luogo Sai ho clonato in frame per PLU-CTVM-FMCS-pPURO. cellule AGS o MKN74 sono stati infettati con Lentivirus esprimere PLU-EBNA1 o controllo vettoriale plu generato appena dalle cellule 293T. AGS infette o cellule MKN74 sono stati selezionati con 2,5 mg /ml puromicina per 10 a 14 giorni. Le celle selezionate sono stati combinati e trattati con o senza 5'-azacitidina per 48 ore poi sottoposti a RT-PCR.
SiRNA contro EBNA1 e siRNA controllo (Cat. No. D-001810-01-20) sono stati tutti acquistati da Dharmacon. siRNA diretto contro EBNA1 3'UTR sono stati sintetizzati utilizzando la sequenza bersaglio CGGAGAUGACGGAGAUGAAUU. Transfection di siRNA duplex è stata condotta utilizzando Oligofectamine (Dharmacon), a seguito di specifiche del costruttore.
Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) saggi
saggi ChIP sono state eseguite come descritto in precedenza [49]. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

• RNA non codificante lungo profilo di espressione nel carcinoma gastrico umano e dei suoi significati clinici
• Analisi in silico di gastrico carcinoma analisi in serie di librerie di espressione genica rivela diversi profili connessi con l'etnia