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Caratterizzazione dei profili di espressione genica per i diversi tipi di mastociti raccolti da sub-regioni del mouse allo stomaco da una caratterizzazione di RNA di amplificazione method

di profili di espressione genica per i diversi tipi di mastociti raccolti da sub-regioni del mouse di stomaco con un metodo di amplificazione RNA
Abstract
Background cellule
Mast (MCS) giocano un ruolo cardine in allergia e l'immunità innata e sono costituiti da sottoclassi eterogenei. Tuttavia, le basi molecolari per determinare le diverse caratteristiche di queste molteplici sottoclassi MC rimane poco chiaro
. Risultati
per avvicinarsi a questo, abbiamo sviluppato un metodo di estrazione di RNA /amplificazione per intatti in vivo
MCs in pool da sezioni di tessuto congelato , che ha permesso di ottenere il pattern di espressione genica globale di MCs pool appartenenti alla stessa sottoclasse. MC sono stati isolati dalla sottomucosa (SMC) e mucosa (MMC) delle sezioni del mouse stomaco, rispettivamente, di 15 cellule sono state messe in comune, e la loro RNA è stato estratto, amplificato e sottoposto ad analisi di microarray. i geni marcatori noti specifici per MMC e SMC mostrato attesi tendenze di espressione, che indica l'accuratezza dell'analisi.
Abbiamo identificato 1.272 geni che mostrano significativamente diversi livelli di espressione tra SMC e MMC, e classificati in gruppi in base alla somiglianza delle loro profili di espressione a fronte di osso MCs derivate dal midollo, che sono le MCs coltivate con i cosiddetti proprietà "immaturi". Tra questi, abbiamo scoperto che diversi geni chiave come Notch4
avevano espressione SMC-parziale e Ptgr1
aveva espressione MMC-polarizzati. Inoltre, vi è una differenza nella espressione di diversi geni inclusi i componenti della matrice extracellulare di proteine, molecole di adesione, e proteine ​​citoscheletriche tra le due sottoclassi MC, che può riflettere adeguamento funzionale di ogni MC all'ambiente mucose o sottomucosa nello stomaco.
Conclusione
usando il metodo di amplificazione di RNA da MCs intatte pool, abbiamo caratterizzato i diversi profili di espressione genica di SMC e MMC nello stomaco del mouse. I nostri risultati offrono informazioni dettagliate su eventuali proprietà non identificati specifici per ogni sottoclasse MC.
Sfondo
mastociti (MCS) sono derivati ​​da cellule staminali ematopoietiche e giocare un ruolo importante nelle risposte allergiche, l'immunità innata e la difesa contro le infezioni parassitarie. A differenza di altre cellule del sangue, MCs migrano nei tessuti periferici come progenitori immaturi e si differenziano in mastociti maturi. Una delle caratteristiche uniche di MCs è che essi mostrano una varietà di fenotipi seconda della diversa microambiente tissutale della loro maturazione [1]. In MCs, varie serina proteasi MC-specifici sono memorizzati nei granuli secretori, e loro geni e proteine ​​espressioni sono drasticamente modificati quando il loro ambiente cellulare è alterata. Ad esempio, Reynolds et al.
Hanno dimostrato che almeno sei membri distinti di topo MC-specifici serina proteasi sono espressi in diverse combinazioni in differenti popolazioni di mastociti [2]. Inoltre, recenti studi hanno dimostrato che la MCS maturi variano in termini di ciò che la superficie recettori e mediatori lipidici esprimono [3, 4]. Poiché ogni popolazione di mastociti in vivo
deve svolgere un ruolo specifico nel corpo, è importante determinare il carattere di ogni popolazione di MCS.
Completa analisi di espressione genica è un approccio efficace per comprendere la caratterizzazione dei vari MC sottopopolazioni. Fino ad oggi, sono stati condotti diversi studi su microarray analisi di MC [5-7], ma la maggior parte di loro affrontato MCs coltivate in vitro
. In alternativa, profili di espressione genica di MCs isolati dalla pelle e dei polmoni sono stati analizzati [3, 8-10]. Tuttavia, i numeri di MC analizzati come un campione erano relativamente elevati e sono stati esposti a forze fisiche, enzimi e l'anticorpo anti-Kit per la depurazione, durante i quali possono essere state colpite le proprietà originali del MC.
Nel gastrointestinale tratto, ci sono MCs che sono classificati principalmente in due sottoclassi; mucosa MCs (MMC) e MCs sottomucosa (CML) sulla base della loro posizione, la morfologia (dimensione e forma) e contenuto dei granuli [11, 12]. MMC si trovano principalmente nella mucosa del sistema gastrointestinale, avendo condroitina granuli solfato contenenti, che sono colorate con blu di toluidina ma non safranin, e la loro attivazione avviene durante un'infezione parassita [13], mentre SMCs sono localizzati nella sottomucosa del tratto gastrointestinale tratto e le loro granuli sono ricchi di eparina e macchiato sia con blu di toluidina e safranina [1, 11]. Tuttavia, le basi molecolari determinare le differenze nelle proprietà biochimiche di questi due sottoclassi MC rimane incerta, parzialmente dovuto alla difficoltà del loro isolamento.
Per superare questi problemi, qui abbiamo stabilito un metodo di amplificazione di RNA da MCs intatte isolati da congelati sezioni di tessuto, che ci permette di ottenere facilmente il pattern di espressione genica globale della MCS in vari tessuti. Per validare questo metodo, in primo luogo abbiamo determinato il numero minimo di cellule necessario per raggiungere l'amplificazione di RNA riproducibile. Abbiamo quindi confrontato i profili di espressione genica ottenuti da un piccolo numero di MMC e SMC nello stomaco del mouse, e trovato diversi geni chiave per essere specificamente espresse in una sottoclasse di MC, che può riflettere alcuni aspetti delle proprietà distinte tra le due sottoclassi MC in i risultati del tratto gastrointestinale.
e discussione
sviluppo di un protocollo di RNA di amplificazione per ottenere profili di espressione genica da una piccola quantità di RNA
al fine di conoscere le differenze funzionali tra le diverse sottoclassi di MC, abbiamo impiegato tre giri del metodo di amplificazione dell'RNA T7-based. Sulla base di esperimenti preliminari con MCs peritoneale e MC derivate dal midollo osseo (BMMCs), abbiamo stimato che un singolo MC produce 2 pg di RNA. Prima abbiamo effettuato un'analisi comparata dei MCs da diversi tessuti, in primo luogo abbiamo valutato l'accuratezza e la riproducibilità dei tre giri del metodo di amplificazione dell'RNA T7-based, a partire con la quantità di RNA che può essere ottenuto da un unico MC. Per valutare questo, in primo luogo abbiamo confrontato i risultati di microarray ottenuti da 5 mg di BMMC RNA preparato dal protocollo standard con quelli ottenuti dalla stessa RNA diluito 10 5 o 10 6 volte (30 pg, 10 pg e 2 pg) e sottoposto a tre cicli di amplificazione T7-base (Figura 1a-c). Sebbene tre turni di amplificazione produssero quantità sufficiente di RNA per l'analisi microarray (& gt; 20 mg) anche nel caso di 2 RNA pg, analisi della dispersione ha rivelato che le qualità dei risultati ottenuti sono stati molto diversa tra i campioni da 5 mg e 2 pg RNA. I geni giudicate 'Presence' sia 30 pg e 5 mg di RNA erano 8.149 geni, che corrispondeva al 72% dei geni giudicati 'Presence' nel 5 mg di RNA (11.344 geni; Figura 1a), mentre solo 4.116 geni sono stati giudicati come 'presenza' sia 2 pg e 5 mg di RNA, che corrispondeva al solo il 36% dei geni giudicati 'Presence' in 5 ug di RNA (Figura 1c). La diminuzione del numero di geni giudicati 'Presence' nei campioni diluiti (30 pg, 10 pg e 2 pg) può essere dovuta alla perdita di bassa copia specie Numero di RNA durante l'amplificazione. Figura 1 confronti dei tre prodotti round-amplificata che iniziano con piccolissime quantità di RNA. (A-c) pregiudizi amplificazione nei prodotti a partire da una piccola quantità di RNA. grafici a dispersione di intensità del segnale ottenuti da 5 mg di BMMC RNA preparato dal protocollo standard e dal 30 pg (
a), 10 pg (b
) e 2 pg (c
) di BMMC RNA preparato da sono mostrati tre turni di amplificazione. (D, e) Riproducibilità dell'amplificazione tre round di una piccola quantità di RNA. grafici a dispersione di intensità del segnale tra due prodotti indipendenti di 30 pg di BMMC RNA (BMMC 30 pg-1 e BMMC 30 pg-2) (d
) o da 2 pg di RNA BMMC (BMMC 2 pg-1 e 2 BMMC pg-2) (e
), sono mostrate. I puntini rossi indicano probe set giudicati come "Presenza", e punti gialli rappresentano set di sonde giudicati come "Assenza" in entrambi gli array. I puntini blu mostrano probe set giudicati come "presenza" solo in uno dei due array. I coefficienti di correlazione (r) sono presentate. Gli stessi, soglie induzione e soppressione quadruplo sono indicati come linee diagonali. Geni giudicati come "Presenza" sono collocati in gruppi corrispondenti a due a due sovrapposizioni mostrati nei diagrammi di Venn di accompagnamento.
Abbiamo poi esaminato la riproducibilità dei risultati di microarray ottenuti da due serie di 30 pg campioni BMMC di RNA (30 pg-1 e 30 pg-2) o due serie di campioni 2 pg (2 pg-1 e 2 pg-2) (Figura 1d e 1d). Nei campioni di RNA pg 30, 7537 (30 pg-1) e 8.777 (30 pg-2) geni sono stati giudicati come 'presenza'. Tuttavia, solo 4.324 (2 pg-1) e 4.460 (2 pg-2) geni sono stati giudicati come 'Presence' in ogni campione di RNA 2 pg, suggerendo ancora la perdita di low copy number RNA durante l'amplificazione da una piccola quantità di RNA. Per quanto riguarda la riproducibilità, l'86% dei geni della 'presenza' del 30 pg-1 e il 74% dei geni 'presenza' del pg-2 campione di 30 sono state giudicate 'presenza' in entrambi i campioni di RNA 30 pg, mentre solo il 57 % dei geni 'presenza' in 2 pg-1 e il 55% dei geni 'presenza' del pg-2 campione 2 sono state giudicate 'presenza' in entrambi i campioni 2 pg di RNA. Questi risultati suggeriscono che i prodotti amplificati dal RNA da una singola MC (circa 2 pg) dal metodo corrente possono includere notevoli artefatti amplificazione causando problemi nella precisione e riproducibilità. D'altra parte, a causa della riproducibilità superiore (& gt; 74%), abbiamo concluso che l'amplificazione di RNA 30 pg raccolti da 15 MCs sarebbe adatto per l'analisi pratica del tessuto MCs. Sulla base di questi risultati, abbiamo fissato il nostro obiettivo in questo studio per acquisire profili di espressione genica di MCs raccolti da diverse regioni. Per ridurre al minimo l'influenza delle variazioni cellula-cellula all'interno degli stessi manufatti classe e potenziale di amplificazione, abbiamo preparato tre set di 15 MCs per ogni regione e geni rispetto significativamente diversa espressione tra MCs da diverse regioni (Figura 2b). Abbiamo scelto stomaco come l'organo fonte, dal momento che siamo in grado di isolare i due tipi di MCs dalla mucosa (MMC) e sottomucosa (SMC) regioni delle stesse sezioni, e MMC e SMC sono stati sospettati di essere diversi in diverse proprietà MC quali proteasi profilo di espressione e la sensibilità alle macchie safranina [1, 11]. Figura 2 profili di espressione genica di SMC e MMC da tessuto dello stomaco. (A) L'isolamento di toluidina MCs blu-macchiata nella sottomucosa (SMC; pannelli superiori
) e la mucosa (MMC; pannelli inferiori
) delle sezioni di stomaco. Un SMC (freccia
) e MMC (punta di freccia
) che è stato metachromatically macchiato di blu di toluidina prima microdissezione (pannelli a sinistra
) sono scomparsi dopo microdissezione con una pipetta di patch (pannelli a destra
). Bar
, 10 micron. (B) Schema della strategia sperimentale. (C) etichettati e RNA antisenso frammentati di tre singoli campioni SMC, tre campioni individuali MMC e dei campioni di cellule 'non' sono stati ibridati ad un array murini. grafici a dispersione per 'nessuna cella' (asse x) e SMC1 (asse y) (
in alto a sinistra), 'nessuna cella' (asse x) e MMC1 (asse y) (in basso a sinistra
), SMC1 (x asse) e SMC2 (asse y) (in alto a centro
), MMC1 (asse x) e mMC2 (asse y) (inferiore centrale
), SMC1 (asse x) e MMC1 (asse y) (in alto a destra
) sono mostrate. I coefficienti di correlazione (r) per il confronto all'interno sMC1-3, all'interno mMC1-3 e tra SMC e MMC sono presentati come media ± S.D. I puntini rossi indicano probe set giudicati come "Presenza", e punti gialli rappresentano set di sonde giudicati come "Assenza" in entrambi gli array. I puntini blu mostrano probe set giudicati come "presenza" solo in uno dei due array. Gli stessi, soglie di induzione e di soppressione di due-fold sono indicati come linee diagonali. Profili di espressione genica di sottomucosa e MCs della mucosa dello stomaco
Per visualizzare due tipi di MCs nello stomaco senza causare degradazione dell'RNA, le sezioni sono state fissato con fissativo di Carnoy e metachromatically colorato con blu di toluidina per alcuni secondi. SMC e MMC sono stati microdissezionate con una pipetta di patch (Figura 2a e 2b). Abbiamo preparato tre serie di 15 MCs per ogni regione, estratto loro RNA e amplificato individualmente (SMC 1, SMC 2, SMC 3, e MMC 1, MMC 2, MMC 3). Per migliorare il recupero dell'estrazione di appena 30 pg di RNA, abbiamo usato 'poly G' come un vettore, che non interferisce con la seguente amplificazione RNA o ibridizzazione del prodotto amplificato alla matrice (dati non mostrati). Per esaminare gli effetti dei prodotti artefatto non specifico amplificati, abbiamo eseguito la procedura di estrazione di RNA /amplificazione senza l'aggiunta di cellule microdissezione ( "nessuna cella") come controllo negativo (descritto nella sezione "Materiali e metodi
"). Gli RNA amplificati di SMC, MMC ed il controllo "nessuna cella" sono stati ibridati separatamente ad un microarray murino. I valori dei segnali nel campione "nessuna cella" erano bassi in generale e simili ai livelli di fondo (figura 2c). I grafici a dispersione dei campioni preparati in modo indipendente all'interno dello stesso gruppo (per esempio SMC 1 vs SMC 2) ha mostrato un modello di espressione simile; il coefficiente medio di correlazione per tutte le sonde-set era 0,945 ± rispettivamente 0.004 e 0.893 ± 0.019 in SMC e MMC, (n
= 3). Al contrario, il coefficiente medio correlazione tra SMC e MMC era 0,752 ± 0,034 (n
= 3), che era molto più basso rispetto a quelle all'interno dello stesso gruppo, suggerendo che i loro modelli di espressione genica sono diversi.
Abbiamo inoltre valutato la precisione e la riproducibilità del nostro metodo per altre analisi complete (analisi clustering gerarchico e analisi delle componenti principali [APC]) utilizzando tutti i set di sonde. i dati di microarray ottenuti da SMC, MMC, MCs pelle di derivazione, MC peritoneale, BMMCs e non-MC (macrofagi e fibroblasti) sono stati applicati a queste analisi. Per prima controllato se il processo di amplificazione nel nostro metodo influisce sul profilo di espressione globale a causa di amplificazione non lineare. I risultati dei campioni BMMC utilizzando RNA preparato dal protocollo standard (BMMC-std) o il metodo di amplificazione (BMMC-amp) sono stati sottoposti a queste analisi. Sia l'analisi di clustering gerarchico e PCA ha rivelato che i dati microarray provenienti da BMMC-STD e BMMC-amp sono stati raggruppati nello stesso gruppo (Figura 3a e 3b), suggerendo che la somiglianza globale di profili di espressione genica viene mantenuta durante il processo di amplificazione. Abbiamo poi esaminato la somiglianza dei pattern di espressione in tre campioni indipendenti SMC o MMC. Su analisi di clustering e PCA, Smc 1-3 e MMC 1-3 sono state raggruppate nello stesso gruppo, rispettivamente. APC ha anche mostrato che i profili di espressione di SMC, MMC e BMMCs sono reciprocamente diverse (Figura 3b). Figura 3 genica globale l'analisi di espressione di Smc 1-3 e MMC 1-3. (A) clustering gerarchico dell'espressione genica globale di varie preparazioni di MCS e non-MC. Tre round prodotti amplificati di sMC1-3, mMC1-3, pelle MCS e BMMCs, e prodotti standard di BMMCs, MCs peritoneali, macrofagi e fibroblasti sono stati analizzati. (B) L'analisi delle componenti principali (PCA) rivela diversi profili di espressione genica di sMC1-3, mMC1-3, e due preparazioni di BMMCs. Il quadrato tratteggiata blu indica MMC, la piazza rossa tratteggiata indica SMC, e la piazza nera tratteggiata indica BMMCs.
Abbiamo poi confrontato i MCs stomaco-derivato (SMC e MMC) con MCs pelle di derivazione, MC peritoneali, BMMCs e non -MCs (macrofagi e fibroblasti) di clustering di analisi. L'MCS derivate dal tessuto (stomaco MCs e la pelle MCs) sono stati raggruppati separatamente da MC peritoneale e BMMCs. Questi risultati possono riflettere diverse proprietà tra MCs derivate dal tessuto con ferma adesione alle cellule vicine e MCs galleggianti senza un contatto stretto. Per quanto riguarda la somiglianza della MCS con fibroblasti e macrofagi, è ragionevole che i fibroblasti sono più distanti da MCS e macrofagi sono più vicini a MCS come una famiglia leucociti.
Validazione dei risultati di microarray di analisi in tempo reale RT-PCR
Noi prossimo hanno esaminato se i segnali di ibridazione di noti geni marcatori specifici per SMC e MMC hanno mostrato le tendenze di espressione attesi [12, 14]. I geni specifici-MMC, proteasi mastociti 1 (Mcpt1
) e 2 (Mcpt2
) hanno mostrato valori più elevati in MMC, mentre l'SMC-specifici geni marcatori, proteasi mastociti 4 (Mcpt4
) e chimasi 2 (CMA2
), hanno mostrato valori di segnale più elevati in SMC (Tabella 1 e Figura 4a) [15-29]. D'altra parte, i marcatori MC-comuni come Kit oncogene (Kit
) e del recettore Fcε (Fcer1a
) hanno mostrato valori dei segnali significativi, senza pregiudizi tra MMC e SMC. Per valutare ulteriormente i risultati, abbiamo misurato i livelli di espressione di questi geni marcatori di real-time RT-PCR utilizzando RNA dagli MCs isolati in modo indipendente (Figura 4b). Inoltre, abbiamo selezionato in modo casuale tre geni che mostrano l'espressione 'MMC-biased' e altri tre geni che mostrano 'SMC-polarizzati' espressione; espressione di questi geni nella MCS non è stato riportato in precedenza (figura 4a). Non ci sono state differenze significative nei livelli di espressione di Kit
e Fcer1a
tra MMC e SMC. Al contrario, i marcatori specifici MMC Mcpt1
e Mcpt2
e il 'MMC-biased' geni, Anxa10, CTSE
, e Fos
ha mostrato una maggiore espressione in MMC, e il SMC-specifici marcatori Mcpt4
e CMA2
e dei geni SMC-polarizzati ', CNN1, Ces3
, e Cpe
ha mostrato l'espressione più alta in SMC. Questi risultati indicano che i risultati microarray sono affidabili e riflettono i profili di espressione genica di SMC intatte e MMC nello stomaco. Figura 4 Validazione dei geni espressi in modo differenziale tra SMC e MMC. (A) SMC-specifici (CMA2
, Mcpt4
), MMC-specifico (Mcpt1
, Mcpt2
) e MC-comuni marcatori (Fcer1a
e Kit
) (sinistra pannello
) e sei geni selezionati in modo casuale (Ces3
, CNN1
, CPE
, Anxa10
, CTSE
e Fos
) (a destra del pannello
) sono indicati nella correlazione rappresentante dispersione grafici di tra SMC1 e MMC1. Gli stessi, soglie induzione e soppressione duplici sono indicati come una linea gialla, blu e rosso, rispettivamente. (B) I livelli di espressione dei geni in (a) sono stati verificati mediante real-time RT-PCR. I valori rappresentano il rapporto tra relativi livelli di espressione di MMC a SMC, e sono mostrati come media ± S.D. (N = 3). La specificità del prodotto di PCR è stata confermata mediante elettroforesi su gel e analisi della temperatura di fusione. Il livello di espressione di ogni gene è stata normalizzata per 28S RNA ribosomiale.
Tabella 1 Riassunto dei geni esaminati dalla real-time PCR.
Gene simbolo

Gene Nome
RefSeq Trascrizione ID
Riferimento
Kit
Kit oncogene
NM_021099
15
Fcer1a

Fc frammento di IgE, ad alta affinità io, il recettore per α polipeptide
NM_010184
16
Mcpt1
mast cellule proteasi 1
NM_008570
17, 18
Mcpt2
mast cellule proteasi 2
NM_008571
19
Mcpt4
mast cellule proteasi 4
NM_010779
2, 20
CMA2

chimasi 2, mastociti (mastociti proteasi 10)
NM_001024714
14 *
Anxa10
annexin A10
NM_011922
21
CTSE

catepsina E
NM_007799
22
Fos
FBJ osteosarcoma oncogene
NM_010234
23
Ptgr1
prostaglandina reduttasi 1 (leucotrieni B4 12-hydroxydehydrogenase)
NM_025968
24 (suina)
CNN1
calponin 1
NM_009922
25
Ces3
carbossilesterasi 3
NM_053200
26
Cpe
carbossipeptidasi E
NM_013494
27 (bovina)
Notch4
Notch gene omologo 4
NM_010929
28
28S rRNA
28S RNA ribosomiale
NR_003279
29
*, la sequenza codificante presentato in questo articolo è il-terminale N-forma troncata di CMA2
, mentre il RefSeq " NM_001024714 "è la sequenza completa di CMA2
.
analisi clustering dei profili di espressione genica e la categorizzazione funzionale tra SMC e MMC la rosa della ~ 12.000 geni rappresentati sulla matrice oligonucleotide, abbiamo selezionato 1.272 geni la cui livelli di espressione tra SMC 1-3 e MMC 1-3 erano significativamente differenti (p
& lt; 0.05, t
test di limma). Il livello di espressione di ciascun gene è stata normalizzata dal suo livello in BMMCs, che sono MCs coltivate con i cosiddetti proprieta 'immature', ed i geni selezionati sono stati classificati in sette gruppi utilizzando il k -Mezzi
algoritmo di clustering (CL1-7 , la figura 5a e sui file 1). Abbiamo inoltre classificati i geni in categorie funzionali, ed i geni rappresentativi sono elencati (figura 5b). Tra questi, 666 geni (52,4%) hanno mostrato l'espressione SMC-biased (CL1-3
); nel 78% (519 geni) di ricchi di Smc geni, i livelli di espressione sono stati relativamente bassi in BMMCs e aumentata in SMC (CL1 & amp; 2
). Ad esempio, il livello di espressione di Mcpt4
era relativamente basso in BMMCs, e se il profilo di espressione dei BMMCs riflette le proprietà immaturi di progenitori MC, Mcpt4
può concludere essere indotto durante la maturazione finale in SMC. È interessante notare che, SMC geni marcatori Mcpt5
e Mcpt6
sono stati classificati in CL2 /3
, il che suggerisce che questi geni sono stati espressi in una certa misura in 'immatura' BMMCs, ma la loro espressione è stata soppressa durante la maturazione in MMC. D'altra parte, 606 geni (47,6%) hanno mostrato espressione MMC-biased (
CL4-7); nel 51% (334 geni) dei geni ricchi-MMC, i loro livelli di espressione in BMMCs erano bassi, ma sono stati aumentati in MMC (CL4 & amp; 5
). Ad esempio, l'espressione di Mcpt1
era basso in 'immaturo' BMMCs ma è stato drasticamente indotta durante la maturazione in MMC. Figura 5 analisi Clustering dei profili di espressione genica tra SMC e MMC. (A) la rappresentanza dei livelli di espressione di mRNA di sMC1-3 e mMC1-3 rispetto al BMMCs. Il colore delle barre rappresenta il rapporto di intensità di segnale tra i campioni indipendenti e BMMCs, secondo la scala mostrata in alto
destra. I geni con significativamente diversa espressione tra SMC e MMC (p
& lt; 0,05, di limma t
test) sono stati selezionati (1.272 geni) e classificati in 7 gruppi che utilizzano il k
-Mezzi algoritmo (CL1-7
). (B) categorizzazione funzionale dei geni rappresentativi da (a). Espressione
proteine ​​di Notch4 in SMC e Ptgr1 in MMC in tessuto dello stomaco
Tra i geni che mostrano espressione differenziale (figura 5b), abbiamo ulteriormente focalizzata sulla espressione di Notch4
in SMC e Ptgr1
in MMC, entrambi i quali non sono mai stati in precedenza caratterizzato MCs. Il Notch4
prodotto del gene è un membro della famiglia di Notch, costituita da recettori transmembrana che vengono attivati ​​da ligandi di superficie delle cellule in cellule adiacenti. Recenti studi hanno suggerito che la segnalazione Notch è coinvolta in linfociti e mast differenziazione cellulare [30, 31]. In primo luogo abbiamo confermato che Notch4
espressione è significativamente più alta nei SMCS pool separatamente rispetto MMC di real-time RT-PCR (dati non riportati). Abbiamo poi studiato se la proteina Notch4 è esclusivamente presente in SMC da immunocolorazione del tessuto dello stomaco (Figura 6a). segnali Notch4 sono stati rilevati nelle strutture nucleo-simile di SMC ma non in quelli di MMC. Inoltre, i segnali Notch4 sono stati trovati anche nelle MCs della pelle, che sono stati raggruppati in adiacenza con SMC (Figura 3a). Questi risultati dimostrano che Notch4 è presente in SMC, ma non in MMC, e suggeriscono che Notch4 partecipa trascrizione SMC-specifica di geni Notch bersaglio, che può essere necessario per alcune funzioni SMC. Nelle cellule ematopoietiche, è stato riportato che costitutivamente attivo Notch4 promuove l'espansione di cellule progenitrici e inibisce il differenziamento mieloide [32]. Poiché ligandi Notch hanno dimostrato di esistere in tessuti connettivi quali derma della pelle [33], sarà interessante per esplorare se Notch4 gioca un ruolo nella differenziazione delle CML e il mantenimento delle funzioni SMC. Figura 6 L'analisi immunoistochimica di Notch4 e Ptgr1 in SMC e MMC in tessuto dello stomaco. (A) Stomaco sottomucosa (SMC; pannelli di sinistra
), mucosa dello stomaco (MMC; pannelli centrali
) e la pelle (MC pelle; pannelli di destra
) sezioni sono state colorate con un anticorpo anti-Notch4 (pannelli inferiori
) e con il blu di toluidina (pannelli superiori
). SMCs colorate con l'anticorpo anti-Notch4 nelle gastriche sottomucosa pelle e derma sono indicati da frecce. Nessuna colorazione è stata osservata in MMC (punte di freccia
) localizzato nella mucosa gastrica. SMC e MMC sono stati metachromatically colorate con blu di toluidina. (B) Stomaco sottomucosa (SMC; pannelli di sinistra
) e mucosa dello stomaco (MMC; pannelli di destra
) sezioni sono state colorate con un anticorpo anti-Ptgr1 (pannelli inferiori
) e con il blu di toluidina (pannelli superiori
). Nessuna colorazione con l'anticorpo anti-Ptgr1 è stato trovato in SMC (freccia
). Piccoli segnali sono stati osservati nei MMC (punte di freccia
). SMC e MMC sono stati metachromatically colorate con blu di toluidina. Bar
, 25 micron (a, b).
Il Ptgr1
prodotto, 15-oxo-prostaglandina 13-riduttasi /leucotrieni (LT) B 4 12-hydroxydehydrogenase è un enzima essenziale per l'inattivazione di eicosanoidi, come prostaglandina e 2 (PGE 2) e LTB 4 [34]. Anche se è stato segnalato che le vie di sintesi degli eicosanoidi differiscono tra le diverse sottoclassi MC [1, 4], i nostri risultati suggeriscono che il sistema inattivazione di eicosanoidi varia anche tra le sottoclassi MC. Ptgr1
espressione è risultata essere significativamente più alto nei MMC pool separatamente mediante real-time RT-PCR (dati non riportati). Abbiamo inoltre esaminato l'espressione Ptgr1 nelle sezioni di stomaco per immunocolorazione. Segnali per la proteina Ptgr1 stati trovati in strutture granulari-come MMC nella mucosa dello stomaco, ma non in SMC (figura 6b), suggerendo che l'enzima Ptgr1 può essere rilasciato da MMC sulla degranulazione. Dal momento che PGE 2 svolge un ruolo critico nel mantenimento del budello omeostasi attraverso la protezione della mucosa e l'inibizione della secrezione acida, è possibile che, quando attivato, MMC regolano negativamente le azioni citoprotettive di PGE 2 attraverso una rapida inattivazione da Ptgr1.
pattern di espressione genica dei componenti della matrice extracellulare, molecole di adesione, e proteine ​​del citoscheletro in SMC e MMC
fenotipi MC hanno dimostrato di dipendere da loro interazioni con le matrici extracellulari circostanti (ECM) e le cellule vicine [1]. Uno dei più notevoli risultati di questo studio è la differenza di espressione genica di componenti ECM proteine, molecole di adesione, e proteine ​​citoscheletriche, che può riflettere adeguamento funzionale di ogni tipo di MC all'ambiente mucose o sottomucosa nello stomaco (Figura 5b) . MMC esprimono geni per proteine ​​ECM specifici mucosa, come MUC1
(Mucin) e TFF1
(fattore di trifoglio), mentre SMC esprimono geni per le proteine ​​ECM convenzionali come Col4a
(procollagene) e LAMA2
(laminina). Inoltre, SMC esprimere geni per molecole di adesione, come Alcam
e Vcam1
, e geni per le proteine ​​del citoscheletro ordinari come Acta2
(actina), mentre MMC esprimono geni desmosome componenti quali DSC2
( desmocollin) e DSG2
(desmoglein), e geni per filamenti intermedi di cheratina, come Krt8
e Krt19
. Desmosomi sono stati segnalati per essere presenti nel epiteli stomaco [35], e si è constatato che le strutture desmosomi-come vengono rilevati in un particolare tipo di MC [36]. È quindi possibile che MMC interagiscono con epiteli adiacente mediante adesione desmosomal nello stomaco. Al contrario, SMC sembrano interagire con le cellule vicine attraverso molecole di adesione come la VCAM-1, ALCAM e VE-caderina (Vcam1
, Alcam1
e Cdh5
). Dal momento che queste molecole di adesione hanno dimostrato di essere coinvolto nella regolazione dinamica del citoscheletro [37, 38], tali interazioni molecola-mediata con celle sottomucosa può essere fondamentale per mantenere le proprietà funzionali e morfologiche di SMC. Infatti, va notato che la maggior parte SMCS sono variabili in forma, e sono spesso allungati e avvolgimento rispetto MMCS [1].
Conclusione
abbiamo stabilito un metodo di amplificazione di RNA da MCs intatte pool isolate da tessuti congelati sezioni, che ci permette di ottenere facilmente il pattern di espressione genica globale di MC da vari tessuti, organi, e specie compresi gli esseri umani. Utilizzando questo metodo, abbiamo dimostrato per la prima volta i distinti profili di espressione genica di sottomucosa e MCs della mucosa dello stomaco del mouse. . I nostri risultati offrono spaccato possibili proprietà non identificati specifici per ogni sottoclasse MC
Metodi
Materiali
I seguenti materiali sono stati ottenuti dalle fonti indicate: HPLC purificato T7- (dT) 24 Primer [5 ' -GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGC GG (T) 24] da GE Healthcare UK Ltd. (Buckinghamshire, Inghilterra), RNase-free acqua, dNTP, SusperScript II, Escherichia coli
(E. coli
) RNase H, E . coli
DNA polimerasi I, E. coli
DNA ligasi, T4 DNA polimerasi e esameri casuali da Invitrogen (San Diego, CA), inibitore della RNasi, glicogeno, e kit di MEGAscript T7 da Ambion (Austin, TX). topi BALB /c sono stati ottenuti da JapanClea (Hamamatsu, Giappone). Questo studio è stato approvato dalla commissione per la ricerca degli animali di Kyoto University Graduate School of Pharmaceutical Sciences. Amplificazione
RNA e oligonucleotide microarray
Mouse BMMCs interleuchina-3-dipendenti sono stati preparati come descritto in precedenza [39].

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