PLoS ONE: Sequencing Ultra-Deep rivela il modello microRNA espressione di stomaco umano

Astratto

Sfondo

Mentre microRNA (miRNA) svolgono un ruolo importante nella differenziazione dei tessuti e nel mantenere la fisiologia basale, poco si sa circa i livelli di espressione dei miRNA nel tessuto dello stomaco. Le alterazioni nel profilo miRNA possono portare alla deregolamentazione delle cellule, che può indurre neoplasia.

Metodologia /Principali risultati

Una piccola libreria di RNA del tessuto dello stomaco è stato sequenziato usando high-throughput sequencing tecnologia solida. Abbiamo ottenuto 261.274 qualità legge con partite perfette al miRnome umana, e il 42% dei miRNA noti sono stati identificati. Digital profilo di espressione genica (DGE) è stata effettuata sulla base di lettura abbondanza e ha mostrato che quindici miRNA erano altamente espresse in tessuto gastrico. Successivamente, l'espressione di questi miRNA è stato validato in 10 soggetti sani mediante RT-PCR ha mostrato una significativa correlazione di 83.97% (P < 0,05). Sei miRNA hanno mostrato un andamento variabile bassa di espressione (miR-29b, miR-29c, miR-19b, miR-31, miR-148a, miR-451) e possono essere considerati parte del modello di espressione del tessuto gastrico sano.

Conclusioni /Significato

Questo studio ha lo scopo di convalidare normali profili di miRNA di tessuto gastrico umano per stabilire un profilo di riferimento per i soggetti sani. Determinazione dei processi normativi che agiscono nello stomaco sarà importante nella lotta contro il cancro gastrico, che è la seconda causa di mortalità per cancro in tutto il mondo

Visto:. Ribeiro-dos-Santos Â, Khayat AS, Silva A , Alencar DO, Lobato J, Luz L, et al. (2010) Sequencing Ultra-Deep rivela il modello microRNA espressione di stomaco umano. PLoS ONE 5 (10): e13205. doi: 10.1371 /journal.pone.0013205

Editor: Patrick Tan, Duke-Università Nazionale di Singapore Graduate Medical School, Singapore

Ricevuto: March 30, 2010; Accettato: 8 settembre 2010; Pubblicato: 8 ottobre 2010

Copyright: © 2010 Ribeiro-dos-Santos et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Il lavoro è stato sostenuto dalla Paraense de Genomica e Proteomica Progetto Genoma (Governo do Pará /SEDECT /FAPESPA), PROPESP /UFPA, FADESP e CAPES (Coordenacao de aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

Recentemente, Friedman et al.
2009 ha dimostrato che la maggior parte dei geni umani sono sotto il controllo dei miRNA. Il > 45.000 miRNA siti di destinazione all'interno 3'UTRs umani sono conservati, e > il 60% dei geni codificanti proteine ​​umane sono stati sotto pressione selettiva per mantenere abbinamenti a miRNA [1]. miRNA sono piccole, non codificanti sequenze di 17-25 bp che regolano l'espressione genica legandosi all'estremità 3 'del mRNA bersaglio, con conseguente inibizione della traduzione della [2] mRNA, [3]. Circa 14.000 miRNA sono stati identificati in animali, piante e funghi [4], [5], [6]

I meccanismi che coinvolgono miRNA come regolatori negativi di espressione genica sono simili in animali e piante.; regolano processi cellulari fondamentali [6]. Negli esseri umani, circa il 3% di tutti i geni sono previsti per codificare i precursori di miRNA, e oltre > il 60% dei geni codificanti proteine ​​potrebbe essere regolata da miRNA [1]. MiRNA hanno funzioni essenziali in molti processi cellulari come la crescita e lo sviluppo, la proliferazione cellulare, differenziamento e apoptosi. Di conseguenza, alterazioni nell'espressione miRNA contribuiscono a malattie umane come il cancro [7], [8].

Le alterazioni nei modelli di espressione dei miRNA sono stati osservati in molti tipi di cancro umano, come il seno, del colon, del polmone, prostata, leucemia e tumori dello stomaco. alterazioni espressione miRNA portano ad una perdita o guadagno di funzione e sono associati con lo sviluppo di tumore umano attraverso meccanismi diversi [5].

Qui, presentiamo uno studio genetico del miRNA dello stomaco umano, perché nonostante l'importanza dell'organo, pochi dati genetici sono disponibili sul loro presenza e regolazione nell'uomo. Questo lavoro è il primo sequenziamento completo miRnome di normale tessuto dello stomaco utilizzando la tecnologia di sequenziamento di prossima generazione

Risultati

Nel presente studio, i profili sono stati ottenuti mediante sequenziamento ultra profonde utilizzando la piattaforma solida (. life Technologies, CA, USA). Questo è il primo studio a utilizzare questa procedura per descrivere la miRnome del tessuto gastrico normale. miRNA sono stati isolati da normale cardias mucosa di un singolo paziente sano. I profili sono stati convalidati usando Real Time PCR per determinare l'espressione dei 15 miRNA più altamente espressi in altri 10 pazienti sani.
Sequenziamento

ULTRA-sequenziamento profondo

Ultra-deep ha prodotto un totale di 104 milioni cruda legge e 5 milioni di legge per la libreria gastrica Cardia miRNA. Per ulteriori analisi, 3,2 milioni letture sono stati selezionati in base alla qualità di sequenza (almeno QV≥10 nei primi 10 basi) [8]. conteggio Dopo la mappatura questi per il genoma umano (versione 19), il totale mappato leggere era 2.534.490 milioni di letture (il 75% della qualità totale letture). Circa il 38% dei 2,5 milioni di legge (963.460 letture) sono stati sequenze di DNA ripetitivo, tRNA, rRNA o altre piccole molecole; 10% (261.274) sono stati accettati legge, perfettamente in asse con note miRNA maturi (miRBase versione 15, rilasciare 04/2010) [9]; e il resto della legge (52%) sono stati abbinati al genoma sequenze (Figura 1).

Per l'analisi dell'espressione dei miRNA, legge solo con partite a maturare miRNA sequenze (261.274 letture) sono stati inclusi. In cardias, abbiamo identificato 404 di 970 note sequenze maturo miRNA (42%). Per analizzare l'espressione dei miRNA, abbiamo definito cinque gamme: da 1 a 10 conteggi di lettura; 11 a 100; Da 101 a 1.000; 1.001 a 5.000; e un conteggio lettura di oltre 5000 (Figura 2) (ulteriori dettagli sono riportati nella Tabella S1). Il primo intervallo (1-10) comprende il 40% dei miRNA osservate; il secondo intervallo (11 a 100) comprende il 26%; il terzo intervallo (da 101 a 1.000) compresi 20%; e il quarto e quinto gamme (> 1000 conteggio lettura) costituiti 14%

Con questa classificazione, 347 miRNA maturi sono stati espressi tra il primo e il terzo range e 57 tra il quarto e il quinto gamme.. Per la caratterizzazione del miRnome, abbiamo selezionato una serie di 15 miRNA che sono state espresse ai massimi livelli (≥1,000 letture).

Tabella 1 e Figura 3 lista dei 15 miRNA maturi individuati nei cardias umani . La mappa termica di figura 4 riassume l'espressione di questi miRNA 15 nel cardias e attraverso normali tessuti umani, i dati DGE, disponibili nella banca dati microRNA.org [10], [11]. miRNA maturo potrebbe essere classificati in due gruppi: i) cardia-tessuti: miRNA raramente espressi in altri tessuti, ma espresso in cardias, tra cui miR-148a, miR-192, miR-200a e miR-200b; ii) quasi-onnipresente: miRNA espressi in molti tessuti e condizioni, tra cui miR-29c, miR-21, miR-24, miR-29b, miR-29a, miR-451, miR-31, miR-145, miR-26a , miR-19b e let-7b.

REAL TIME PCR

i risultati di sequenziamento ultra profonde sono stati convalidati usando il singleplex Real Time PCR (RT-PCR) metodo su 15 miRNA selezionati determinare la loro espressione nella regione cardias da 10 individui sani. Tra i soggetti di prova, il 60% erano maschi, l'età media era di 39,1 (± 12,8) anni e il 50% dei soggetti studiati sono risultati positivi per H. pylori
, secondo i criteri internazionali stabiliti per la loro identificazione [12], [13] (Tabella 2) (ulteriori dettagli sono riportati nella Tabella S2).

COMPARARISON CON DGE e RT-PCR

Sia singleplex (RT-PCR) e multiplex (piattaforma solida) tecnologie hanno mostrato elevata espressione (espressione oltre 1.000 legge nel DGE e 7 volte sopra il controllo endogeno nella RT-PCR) dei 15 miRNA (figure 4 e 5)

Gli stessi campioni di RNA sono stati analizzati da due diverse piattaforme: DGE e RT-PCR - Life Technologies.. Gli esperimenti risultati sono stati confrontati e sono state osservate regressione lineare tra 2 ^{-ΔCt e radice quadrata del numero di conteggio letto. correlazione di Pearson è alto 83,9% con il test statisticamente significativa (P < 0,05). e convalidato solidi risultati}

Inoltre, i risultati DGE sono stati confrontati con la quantificazione della gamma espressione dei miRNA in 10 soggetti sani, da Real Time PCR. La regressione per media di saggi di RT-PCR contro
radice quadrata del numero di conteggio letto. correlazione di Pearson è alto 68,4% con il test statisticamente significativa (P < 0,05).

potuto osservare miRNA con elevata variabilità interindividuale, per exempla miR-21, e un altro con una bassa variabilità interindividuale, ad esempio pattern di espressione un po 'variabile (miR-29b, miR-29c, miR-19b, miR-31, miR-148a, miR-451).

Discussione

miRNA regolano la maggior parte dei geni umani; tuttavia, solo pochi miRNA hanno avuto i loro obiettivi e le funzioni specifiche identificate [14]. Nel nostro studio, il campione stomaco è stato ottenuto da un singolo individuo senza neoplasia dello stomaco o altre condizioni pre-neoplasia, come l'atrofia, metaplasia o displasia. lesioni pre-cancerose, come la gastrite portano alla genomica ipo-metilazione nello stomaco che potrebbe modificare il pattern di espressione dei miRNA [15]. Il campione è stato ottenuto dal tessuto normale da un paziente senza patologie, che ha contribuito ad evitare il rischio di raccolta di un campione di tessuto apparentemente normale con micro invasioni di cellule tumorali nella fase iniziale come potrebbe verificarsi in pazienti con una qualsiasi delle patologie sopra.

Questo studio è il primo sequenziamento ultra-high-throughput dei miRNA nel fisiologicamente normale stomaco umano. Solo 5,06% di miRNA identificati nel tessuto gastrico era già stato rilevato in altri tessuti e catalogati in banche dati di bioinformatica come microRNA.org [10]. Ci aspettiamo che questo gruppo di miRNA di essere regolatori dei geni housekeeping, che sono abbondanti nei tessuti umani. Un altro 7,84% di miRNA non aveva corrispondenze nei database di espressione dei miRNA e potrebbe rappresentare miRNA che sono specifici per il sistema digestivo o allo stomaco.

Studi simili sono stati condotti con altri tessuti normali, come la bocca, della faringe, esofago, ano e intestino. Abbiamo confrontato questi dati con i nostri dati di espressione miRNA per definire il pattern di espressione del tessuto dello stomaco. Abbiamo trovato elevati livelli di espressione in 15 miRNA, di cui 13 erano già stati identificati come altamente espresso in altri tessuti.

L'espressione del miR-148a e miR-192 era stato identificato in altri tessuti umani normali e tumorali, ma non è stato over-espresso. Mir-192 era già stato rilevato in tessuti gastrointestinali come il colon, ileo, duodeno, intestino tenue, stomaco, pancreas e del fegato [16]. espressione basale di mir-148a è stata osservata nel tessuto connettivo e tessuto endocrino [17]. Recentemente, mir-148a è risultato essere repressa nelle cellule del sangue del cordone ombelicale [18] e messo a tacere dalla metilazione nei tumori del colon [19]. Abbiamo osservato elevata espressione del cluster miR-200 (A e B) in cardias come osservato nelle isole di Langerhans [11]. In un esperimento di microarray, mir-200a e miR-200b sono stati rilevati a bassi livelli nei tessuti gastrointestinali, ma ad alti livelli nel colon, dello stomaco e del pancreas [16]. Una recente pubblicazione atlante di espressione microRNA hanno mostrato che questo miRNA è caratteristica per il tessuto endocrino [17]. Recenti scoperte mostrano che la bassa espressione del cluster miR-200 è correlato con tumore ovarico [19], [20]. Pertanto, il cluster mir-200 può essere importante nel mantenere l'integrità dei tessuti digestivi come cardias perché tale elevata espressione up-regolata l'espressione di e-caderina, la proteina responsabile dell'organizzazione dell'architettura del tessuto epiteliale. Inoltre, i risultati suggeriscono fortemente un ruolo importante della famiglia miR-200 nella repressione del epitelio-mesenchimale transizione (EMT) e la progressione del cancro [21].

Tabella 1 e 2 mostrano il numero di possibili obiettivi per ciascuna altamente espresso maturo miRNA. La tabella 2 mostra alcuni target di miRNA previsti dal TargetScan contro le famiglie di miRNA conservati. Con l'eccezione di miR-451, tutte in comune almeno altri due geni bersaglio. I geni ANKD52
e UBN2
, sono obiettivi di dieci dei quattordici miRNA analizzati, mentre il gene TNRC6B
è di nove miRNA, ei geni Eps15
, NFAT5
, BACH2
, BRWD1
, NUFIP2
, PTEN
, CDK6
, e PTPRD DD6
, sono bersaglio di otto miRNA. Questo risultato suggerisce che questi miRNA sono forti candidati per essere messa a tacere nella regione cardias. La verifica sperimentale di questi geni, seguito da un'analisi della funzione di ognuno può rivelare il ruolo fisiologico di questi miRNA in tessuto gastrico normale.

Molti miRNA possono disciplinare la traduzione di proteine ​​che agiscono nella proliferazione tissutale e patterning tessuti quali mir-200A (che può indirizzare integrina) e mir-145 (che possono interagire con ERBB4
mRNA). Molti obiettivi mRNA predetti sono risultati essere comuni a più miRNA altamente espressi. Per esempio, la (il recettore 5-idrossitriptamina [serotonina]) HTR4
e AFF2
mRNA ( AF4 /FMR2
famiglia, membro 2) sono stati previsti per essere bersaglio di 13 dei 15 miRNA più altamente espressi. Altri cinque mRNA, tra cui IGF-1
(fattore di crescita insulino-simile 1 [somatomedina C]), erano comuni gli obiettivi previsti di 12 miRNA. Otto miRNA avevano 222 obiettivi previsti in comune; per esempio, mir-29b è stato previsto di indirizzare 196 di questi. Cinque miRNA (19b, 29a, 29b, 29c e 148a) condiviso 70 previsti obiettivi, alcuni dei quali ( CDK6
, PTEN
, IGF1
, FRS2
, PDGFRA
, PIK3R1
e MXD1
) regolano la proliferazione cellulare e la soppressione del tumore.

Diverse osservazioni collegano miRNA al cancro. Innanzitutto, molti miRNA sono coinvolti nella proliferazione cellulare e apoptosi. In secondo luogo, molti loci miRNA si trovano in siti fragili del genoma umano, le regioni che sono spesso amplificate o cancellati in neoplasie umane e causare grandi differenze di espressione miRNA rispetto ai tessuti normali [21], [22], [23], [24 ].

la tecnica Real Time PCR (che utilizza quantificazione relativa) ha confermato 15 miRNA identificati come mostra la più alta espressione della solida piattaforma (che si basa su numeri assoluti) (figure 4 e 5). Pertanto, questi miRNA possono essere considerate sovraespresso [25], [26], [27], [28]. La correlazione tra DGE e saggi di RT-PCR era chiaro e statistica significativa. E esperimento DGE poteva essere considerato rappresentativo dei tessuti campioni gastrici isolati da 10 soggetti di salute e definiscono una parte del pattern di espressione del tessuto gastrico sano.

I risultati di entrambe le metodologie indicano che miRNA-21 è stato il più altamente espresso nel tessuto cardias. Questo miRNA è distribuito anche in altri tessuti umani (per esempio, le cellule dendritiche, cellule T, pancreas) e potrebbe essere coinvolta nella regolazione dell'espressione dei geni housekeeping ( ATPAF1
, KIF3A
,
CYBRD1).

La solida piattaforma ha dimostrato che miR-192 e 148a sono specifici per tessuto gastrico. Inoltre, Real Time PCR ha confermato che questi miRNA sono sovra-espressi. Pertanto, nel complesso, questi miRNA sono suscettibili di regolare l'espressione di geni correlati alla omeostasi tessuto gastrico. Pertanto, i bassi livelli di espressione di questi miRNA potrebbero essere correlate allo sviluppo di una neoplasia dello stomaco. L'uso potenziale di miRNA-192 e miRNA-148a come marcatori di rischio nel cancro gastrico potrebbero essere meglio indagati attraverso l'analisi dei miRnomes di diversi tipi istologici di cancro gastrico.

La comprensione dei processi normativi che agiscono nel umana stomaco sarà importante nella lotta contro il cancro gastrico, che è la seconda causa di mortalità per cancro in tutto il mondo.

Materiali e metodi

MATERIALE BIOLOGICO

il cardias è una zona microscopica che si trova nella parte più prossimale dello stomaco, vicino all'apertura esofageo (orifizio cardiaco o cardias) e contiene le ghiandole cardiache. Il nostro campione di tessuto fresco per il sequenziamento ultra profonde è stato ottenuto da una biopsia gastroscopic (~4 mm ^{3). Il paziente aveva 33 anni, senza evidenza di cancro e di un normale giunzione gastroesofagea. Macroscopica l'osservazione del tessuto non ha mostrato alcuna evidenza di lesioni, e l'esame istologico ha confermato condizioni normali e sani.}

Per confermare i risultati del sequenziamento ultra profonde, i campioni Cardia, orifizio cardiaco nei pressi, da 10 Inoltre, individui sani sono stati anche ottenuti da biopsie endoscopiche (~4 mm ^{3) e, dopo l'esame istologico escluso anomalie, sono stati analizzati mediante Real Time PCR. H. pylori
infezione è stata diagnosticata in base all'aspetto tipico del batterio lungo lo strato di muco che copre la mucosa gastrica biopsie Antral state prese per la valutazione istologica grazie alla maggiore densità dei batteri in gastrico e all'eccellente sensibilità di questo metodo diagnostico , secondo i criteri internazionali stabiliti per la loro identificazione [12], [13] (ulteriori dettagli sono riportati nella Tabella S2).}

ETICA DICHIARAZIONE

consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i pazienti, e lo studio è stato approvato dal Comité de Ética em Pesquisa (CEP) di Ospedale Universitario João Barros Barreto (HUJBB) -. Università federale del Pará (UFPA) (numero protocollo 14.052.004 /HUJBB)

miRNA BIBLIOTECA

il piccolo RNA totale è stato ottenuto dal campione di tessuto utilizzando il kit di isolamento Mirvana (Ambion Inc., US). La concentrazione e la qualità sono stati determinati utilizzando un NanoDrop 1000 spettrofotometro, e la purificazione e la selezione del formato sono state eseguite utilizzando il 6% elettroforesi su gel di poliacrilamide. Utilizzando il solido Piccolo Kit RNA Espressione (Ambion Inc., US), 200 ng di piccoli RNA di 150-200 bp sono stati utilizzati come modello per ottenere la libreria miRNA. Tutti i miRNA della biblioteca sono stati contrassegnati con primer di amplificazione uniche e specifiche, noto come il sistema di codici a barre (Life Technologies, CA, USA). Poi, 50 pg della libreria è stata abbinata ad altre sette librerie miRNA alla stessa concentrazione. Una frazione della piscina libreria (0,1 pg) è stato amplificato e fissato su biglie magnetiche utilizzando un'emulsione PCR. Il prodotto ePCR è stato depositato su una singola diapositiva e sottoposto alla reazione di sequenziamento SOLiD multiplex.

SOLiD SEQUENCING ultra profonde E ANALISI DEI DATI

Il solido (versione 2.0) del sistema di sequenziamento (Life Technologies) è stato utilizzato per generare legge che erano lunghi 35 bp. Il secondo passo era per decodificare il codice a barre, corrispondenti ciascuna sequenza tallone con l'identità del campione. Tutte le piccole sequenze di RNA di cardias sono disponibili nel NCBI Sequenze Leggi Archive (SRA012099). Le analisi della sequenza è stata effettuata utilizzando il solido sistema Piccolo RNA Analysis Tool (Life Technologies) e MiRanalyzer [8]. In primo luogo, abbiamo filtrato tutte le sequenze che corrispondono contaminanti RNA come il tRNA, rRNA, ripete DNA e molecole di adattamento. Dopo aver escluso contaminante legge, noi allineati contro tutte le sequenze di miRNA sequenze precursori (miRBase ver. 12) e quindi incluso solo la legge che abbinati sequenze maturo miRNA [9]. Per confrontare questi dati di espressione con quelli di altri tessuti umani, dati di espressione dei miRNA sono stati importati dal database microRNA.org, e l'espressione di ogni maturano miRNA è stata normalizzata dal conte letto totale [10]. Analisi grafica è stata effettuata utilizzando Genepattern ^{10. I rapporti di processo miRNA-biologico sono stati previsti con miRNApath (http://lgmb.fmrp.usp.br/mirnapath/tools.php).}

miRNA REAL TIME PCR (validazione)

La biopsia campioni di tessuti cardias sono stati raccolti da 10 pazienti sani. Dopo la raccolta, i campioni sono stati immediatamente processati e conservati a -80 ° C fino estrazione di RNA. RNA totale è stato estratto omogeneizzando 40 milligrammi di tessuto congelato, seguito da isolamento dell'RNA da TRIzol reagente (Life Technologies) secondo le istruzioni del produttore. La concentrazione e la qualità dei miRNA sono stati determinati utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop 1000 (ND-1000; NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). L'RNA totale è stato trascritto inversa utilizzando un kit di TaqMan @ MicroRNA trascrizione inversa (Life Technologies).

L'analisi dei livelli di miRNA è stata eseguita su un Real-Time PCR 7500 (Life Technologies) con saggi TaqMan miRNA secondo il le istruzioni del produttore (Life Technologies) utilizzando primer disegnati con Primer Express (Life Technologies). Il livello medio di espressione di tre controlli umane endogene (Z30, RNU19 e RNU6B - calibratori). È stato utilizzato come controllo interno in tutti gli esperimenti miRNA per consentire il confronto dei risultati di espressione

I livelli elevati di espressione di miRNA identificati mediante sequenziamento ultra profonde (in ordine discendente: miR-29c, miR-21, miR-148a, miR-29a, miR-24, miR-29b, miR-192, miR-451, miR-145, miR-31, miR-200a, miR-19b, miR-200b, let-7b e miR-26a) sono stati validati con i saggi TaqMan miRNA (Life Technologies). Queste analisi sono stati utilizzati per misurare i livelli di espressione di miRNA maturi e la variabilità inter-individuale nei 10 campioni di tessuto sano cardias. I dati di espressione di ogni miRNA maturi sono stati normalizzati al livello significare espressione dei tre controlli endogeni umani (Z30, RNU19 e RNU6B). I relativi livelli di espressione di miRNA sono stati quindi calcolati con il metodo del ciclo soglia di confronto (Ct) (2 ^{-ΔCt). test di correlazione è stata effettuata usando il metodo di Pearson (SPSS v.12).}

informazioni di supporto
Tabella S1.
identità e dati di abbondanza per tutti i miRNA noti in massello di set di dati di sequenza in stomaco umano e il database miRamda
doi:. 10.1371 /journal.pone.0013205.s001
(0.44 MB PDF)
Tabella S2.
Descrizione e risultati di RT-PCR di 10 campioni provenienti da individui sani ottenuti da biopsie endoscopiche. I campioni dimensione è di circa ~4 mm3. Per tutti i campioni sono stati eseguiti un esame istologico e l'individuazione da H. pylori
doi:. 10.1371 /journal.pone.0013205.s002
(0.03 MB XLS)

Riconoscimenti

Il autori grazie D. Calcagno e S. Demaschki per i loro commenti, idee e aiuta.

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