PLOS NËMMEN: SIRT3 verbessert Glycolysis an Zouhuelen vun SIRT3-ausdrécken Gastric Cancer Cells

Wat VerfÜgung

SIRT3 ass e Schlëssel Nad + - ofhängeg FAQ deacetylase an der Mitochondrie vun mammalian Zellen, analyséieren Zell Alterungsprozess ze verhënneren an Transformatioun via Regulatioun vun Kënschtlech metabolic homeostasis. Allerdéngs, SIRT3 ass och un Zoustëmmung zu puer Mënsch erhéijen fonnt; seng Roll an dëse SIRT3-ausdrécken brauch entholl Zellen opgekläert ze ginn. Dës Etude bewisen, datt de Wëllen vun SIRT3 war an engem Grupp vu gastric Kriibs Zellen am Verglach zu normalen gastric epithelial Zellen erhuewen. Obwuel SIRT3 Ausdrock Niveauen an der gastric entholl Stoffer Verglach zu den zwéin Net-entholl Stoffer fräi waren, goufen SIRT3 positive Kriibs Zellen méi dacks an der intestinal Typ gastric Cancers wéi den diffusen Typ gastric Cancers fonnt, déi besot datt SIRT3 mat bestemmt vun gastric verbonnen ass Kriibs. Overexpression vun SIRT3 gefördert Zell Prolifératioun an verstäerkte ATP Generatioun, Zocker Notzong, Glucogène Opstellung, MnSOD Aktivitéit an lactate Produktioun, déi vun SIRT3 knockdown inhibited waren, beweist dass SIRT3 eng Roll spillt de bioenergetics zu gastric entholl Zellen zu reprogramming. Weider Analyse Teamchef SIRT3 Experten mat an deacetylated der lactate dehydrogenase A (LDHA), e Schlëssel FAQ zu selwescht glycolysis Regulatioun, Tempo LDHA Aktivitéit. An consistence, war e Stärekoup vun glycolysis-verbonne Genen am SIRT3-overexpressing gastric entholl Zellen upregulated. Sou, zousätzlech zu de gutt-dokumentéiert SIRT3-mediated Kënschtlech homeostasis am normalen Zellen, kann SIRT3 glycolysis an Zell Verbreedung zu SIRT3-ausdrécken Kriibs Zellen revaloriséiert VerfÜgung

Fro:. CUI Y, Qin L, Wu J, Qu X, Hou C, Sonn W, et al. (2015) SIRT3 verbessert Glycolysis an Zouhuelen vun SIRT3-ausdrécken Gastric Cancer BTS. PLoS NËMMEN 10 (6): e0129834. Doi: 10.1371 /journal.pone.0129834 VerfÜgung

Redakter: Xianglin Shi, Universitéit vun Kentucky, USA VerfÜgung

Arnaque: 16. Abrëll 2015; Akzeptéiert: 13 Mee, 2015; Publizéiert: 29. Juni 2015 VerfÜgung

Copyright: © 2015 CUI et al. Dëst ass eng oppen Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz CC BY verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt si vum original Auteur an d'Quell Kaiser VerfÜgung

Data Disponibilitéit: All Daten sinn bannent de Pabeier a seng Ennerstëtzung Informatiounen Fichieren VerfÜgung

Funding:. Dës Etude deelweis vun der National Natural Science Foundation vu China, Key plangen (30930105), National 12-5 Support Plan Project vum Ministère vun Science ënnerstëtzt gouf an Technology vu China (2012BAH30F03), d'National Natural Science Foundation of China (31070740), d'985 an 211 Projetën vun Xian Jiaotong University (JKL), an National Cancer Institut RO1 heimat CA152313-01-A1 (JJL).

Wettsträit Interessen:. D'Auteuren hunn deklaréiert, datt keng Competitioun Interessen existéieren VerfÜgung

Aféierung VerfÜgung

Sirtuins, eng Famill vu Nad + - ofhängeg histone deacetylases (HDACs) zu mammalian Zellen, sinn zu engem Netzwierk vu kierperlechen Prozesser dorënner Zell Iwwerliewe, apoptosis, ukuerbelt, Stress Äntwerte, Alterungsprozess an longevity [1,2] agebonne. Dorënner siwen sirtuin Memberen (SIRT1-7), ass SIRT3 de beschte charakteriséiert Kënschtlech sirtuin, analyséieren Kënschtlech Proteinen am oxidative phosphorylation, fatty Seier Chemiker, déi urea Zyklus, an der neier Étude Äntwert [2-9] Équipe ze regléieren. Puer Studien hunn d'Roll vun SIRT3 zu ukuerbelt an homeostasis am normalen Zellen an Teamchef nei Ziler a heescht de Législateur, fir SIRT3-ofhängeg deacetylation [10] ervirgehuewen. Kim et al gemellt dass SIRT3 ass e Schlëssel Mitochondrie FAQ, an Mangel vun der SIRT3 Ausdrock ass fir fräi Kënschtlech DNA Schued an aller Hausnummeren, souwéi fräi Potential fir Ras-entschlof Zell Transformatioun an SIRT3-mediated MnSOD Aktivéierung zu der Kënschtlech homeostasis Contributioun [11,12]. An Ënnerstëtzung, Collectioun mënschlech embryonal Nier 293 Zellen (HEK293) Zellen eng verstäerkte SIRT3 Ausdrock ënner oxidative Stress, flénke deacetylation an Aktivéierung vun MnSOD [13]. SIRT3 ass gegleeft wéi enger entholl suppressor Gentherapie zu Funktioun a spillt eng wichteg Roll an Tempo Zell homeostasis géint Alterungsprozess an carcinogenesis. VerfÜgung

Allerdéngs weisen puer entholl Zellen den Ausdrock vun SIRT3 an d'Potential Roll vun SIRT3 an dës entholl Zellen , besonnesch potenziellen Relatioun zu der aggressiv phenotype, ass ëmstridden [14] ginn. SIRT3 Ausdrock ass manner oder undetectable an eng Hellewull vu mënschlechen Cancers, dorënner Broscht Kriibs, Gehirtumoren, Colon Kriibs, a Kand besser, Aarbecht a spillt Cancers [11,15,16]. SIRT3 induces Wuesstem verhaft an apoptosis vun selektiv silencing vun BCL-2 zu HCT116 Zellen duerch modulating JNK2 sécher Passerelle [17]. Och, ass SIRT3 Untersuchungshaft fräi Empfindlechkeet vun mënschlech Leukämie Zellen ze Chimiotherapie méiglecherweis duerch d'Aféierungs- vun Mitochondrie-mediated apoptosis [18] ze bedeelegen. Wéinst dem, ass SIRT3 Ausdrock fonnt och am Elysée Kriibs, Node-positiv Broscht Kriibs, esophageal Kriibs, an Schild carcinomas fräi ginn; an d'fräi SIRT3 ass verbonne mat héichen malignant phenotype an downregulation vun SIRT3 verbessert entholl Empfindlechkeet zu Anti-Kriibs Behandlung [19-23]. Dës Resultater iwwerrasche eng aner Roll vun SIRT3 zu spezifesch erhéijen dass opgekläert ginn muss. VerfÜgung

Cancer Zelle metabolically aktiv a konsuméieren méi bewosst Brennstoffer wéi normal Zellen. Ee Etappenrelay Kriibs Zellen op haaptsächlech op der ATP Synthes vun aerobic glycolysis, eng Fonktioun als Warburg Wierkung bekannt [24]. Esou eng aerobic glycolysis ass gegleeft Kriibs Zellen Form oxidative Stress ze schützen zënter Kënschtlech sin d'Haaptgrënn Quell vun intracellular Ros ass [25]. D'lactate dehydrogenase A (LDHA) ass eng Aktivitéit tëscht pyruvate an L-lactate reversibly an der Finale vun der selwescht glycolysis [26] kontroléieren interconversion. Inhibition vun LDHA diminishes der tumorigenic Potential mat fräi Kënschtlech Sauerstoff Konsum a rofgaang Kënschtlech Membran Potential [26] a Punkto bewosst ATP Produktioun an glycolysis [27]. VerfÜgung

An dëser Etude, mir propagéieren d'Potential Roll vun SIRT3 zu gastric Kriibs Zellen datt SIRT3 auszedrécken. Ausdrock vun SIRT3 war mat der aggressiv Wuesstem Hausnummeren, déi via SIRT3-deacetylated an ageschalt LDHA mediated war, glycolysis an Ausdrock vun engem Grupp vun glycolysis-verbonne Genen Tempo. Sou SIRT3-LDHA-mediated glycolysis ukuerbelt vläicht e Potential therapeutesch Zil ginn un Kriibs Zellen entweckelen déi SIRT3 auszedrécken. VerfÜgung

spontan a Methode VerfÜgung

Zell Linnen a Kultur VerfÜgung

Mënscherechter gastric Kriibs Zell Linnen MGC-803, HGC-27, SGC-7901 [28] an AGS [29] an och mënschlech gastric epithelial Zell Linn GES-1 [30] goufen am RPMI-1640 mëttelfristeg (Invitrogen) mat 10% an et Bovine nà haten serum an 1% penicillin /streptomycin, an cultured bei 37 ° C ënner eng Atmosphär vu 5% CO2. VerfÜgung

Immunoprecipitation a westlech blot VerfÜgung

Subconfluent Zellen sech lysed an der lysates sech mat FAQ a incubated /G agarose Glaspärelen plus recommandéiert Montant vun antibodies géint entweder SIRT3 (Zell sécher Technology) oder LDHA (Santa Cruze) bei 4 ° C Iwwernuechtung. Echantillon sech duerch SDS polyacrylamide gelies electrophoresis an electroblotted op nitrocellulose Schläimhait centrifuged a getrennt. mat 5% Nët-Fett Mëllech an TBST No erauszesichen, goufen Schläimhait mat Primärschoul antibody bei 4 ° C Iwwernuechtung gefollegt vun incubation mat Première antibody fir 1 Stonn op RT incubated. Proteinen vun interesséieren sech duerch ECL erkennen Kit (Thermo Fisher) visualized. VerfÜgung

Immunohistochemistry assay VerfÜgung

agebousst drënner vun gastric Kriibs mat bascht normal Stoffer sech duerch immunohistochemistry assay analyséiert goufen folgend d'Uweisungen d'Hiersteller gesuergt. D'Polymer Detektioun Kit fir d'immunohistochemistry Analyse gouf vun Zhongshan Golden Bréck Déi kaaft. Kuerz, goufen paraffin Rubriken dewaxed ae-denken an Ethanol (100%, 90% an 75%). D'Sektiounen sech fir 10 Minutte mat 3% H _{2O 2 op RT incubated an dann fir 15 Minutten mat Net-immun Geess serum um RT gespaart. D'Sektiounen sech dann mat der Primärschoul antibody zu SIRT3 (Zell sécher Technology) fir 2 Stonnen um RT gefollegt vun Anti-Kanéngchen Secondaire antibody incubation fir 15 Minutten am RT incubated. D'Sektiounen sech dann mat botzt erkennen reagent fir 2 Minutten eenzel, counterstained mat hematoxylin an dehydraded an Ethanol (90% an 100%) incubated. D'Sektiounen sech schéi an der staining war ënner microscopy analyséiert. VerfÜgung}

Plasmid Bau an Zell transfection VerfÜgung

SIRT3 ganz Längt cDNA Wierderbuch war mat RT-Hinnen alleguer mat total RNS aus ofgebaut GES-1 Zellen als Schablounen (primers: 5 'CCGCGGTACCATGGCGTTGTGGGGTTG 3 "a 5' CCGCTCTAGACTATTTGTCTGGTCCATCAAGC 3 '). D'cDNA war dann gekloonten an pcDNA3.1 + Ausdrock Vecteure (Invitrogen). D'pGPH1 /GFP /Neo-SIRT3-shRNA plasmid Mënsch SIRT3 (5 'CTTGCTGCATGTGGTTGAT 3 ") an der Kontroll shRNA plasmid gezielt goufen aus GenePharma kritt. Fir stabil transfectants generéieren, AGS an SGC-7901 Zellen sech transfected benotzt Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen) an de Stall transfectants sech duerch 400ug /ml G418 (Gibco) ausgewielt. VerfÜgung

Zell Prolifératioun an clonogenicity assay VerfÜgung

fir Prolifératioun assay, goufen plated Zellen zu enger 6-gutt Plack op 2 x 10 4 Zellen /gutt. Zell Prolifératioun war op Deeg berechent 2, 4, 6, an 8 an di. Fir clonogenicity assay, goufen plated Zellen zu enger 6-gutt Plack mat variéiert Zell Zuelen an cultured fir 14 Deeg an de Kolonien huet sech dann mat glaskloer mauve Kierchefënster, an d'Zuel vun de Kolonien (> 50 Zellen /Kolonie) war folgenden der etabléierter Methoden gezielt [31]. VerfÜgung

Kilometréierung vun Zocker, lactate a Form vu Glucogène VerfÜgung

d'phenol rout gratis mëttel- bis Kultur Zellen zu 6-gutt zappen fir 24 Stonnen an der Niveau vun Zocker Notzong an lactate Generatioun benotzt gouf mat der Glukose Assay Kit an Lactic Saier Kit (Jiancheng Bioengineering Institut) waren gemooss. Der relativer Wäerter goufen zu der Zell Zuel vun all gutt normalized. Bewosst Glucogène Niveauen sech mat der Glucogène Assay Kit (Biovision) fonnt. Kuerz, 1 × 10 6 Zellen sech am 200μL Waasser op Äis homogenized, a sech der homogenates fir 5 Minutten gekacht Enzymen zu inactivate a bei 4 ° C bei 13.000 Ziichter fir 5 Minutten centrifuged zu insoluble Material ewechzehuelen. D'Glucogène Produktioun gouf bei 570 nm mat de sel Wäert gemooss. VerfÜgung

Kilometréierung vun ATP Produktioun VerfÜgung

bewosst ATP an Ros Niveauen virdrun ëmschriwwen gemooss goufen [32]. Zellen cultured zu enger 6-gutt Plack no verschidde Behandlunge, goufen lysed a bewosst ATP Niveauen sech mat ATP Bioluminescence Assay Kit (Fläch) gemooss. glycolysis-mediated ATP Produktioun fir Moossen, sech mat 2 μM rotenone behandelt Zellen fir 24 Stonnen ier Miessunge. VerfÜgung

Kilometréierung vun Ros Generatioun VerfÜgung

bewosst Ros Generatioun gouf mat 5- assayed (an 6-) carboxy-2 ", 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) Method benotzt microplate Spektrometer (Thermo Fisher) op 488 nm /530 nm Wellelängt. VerfÜgung

MnSOD Aktivitéit VerfÜgung

BTS cultured zu enger 6-gutt Plack waren lysed an MnSOD Aktivitéit war vun WST-8 Methode benotzt der MnSOD assay Kit (Beyotime) folgenden Fabrikant d'Instruktioune. VerfÜgung

Tumorigenicity assays an Sauna Mais VerfÜgung

SGC7901 Zellen (7.5 x 10 alles 6) mat SIRT3 overexpression oder sech an entweder Säit vun 5-Woch-alen Mann vun 0,1 ml PBS an inoculated suspendéiert knockdown BALB /c athymic Sauna Mais, an um 28 September Dag no inoculation wann der Bäschten entholl Volume (~ 1500 mm 3) an d'Kontroll Grupp erreecht, goufen d'Experiment kom- an all vun erhéijen aus all Grupp sech excised a gewien. D'experimentell Prozedur sensibiliséieren Déier Tester war am Aklang mat den institutionnelle Richtlinnen gehaal; den institutionnelle Déieren Care an Benotzt Comité (IACUC) op Xian JIAO Tong University speziell dëser Etude (Protokollx181) abruecht. VerfÜgung

Lactate dehydrogenase assay VerfÜgung

D'lactate dehydrogenase Aktivitéit folgenden der etabléierter Protokoll alles war vun der Reduktioun Taux vun der absorbance um Wellelängt vun 340 nm Moosse vun de Chemiker vun NADH doraus [27]. Kuerz, goufen Zellen cultured zu 10 cm Platen a homogenized vun PBS op Äis. D'homogenates bäigebaut an un mat 6,6 mm NADH, 30 mm Natrium pyruvate an 0,2 M Tris-HCl, pH 7.3 a gemëscht. Incubate der Mëschung fir 5 Minutten ze Temperatur equilibration erreechen an dann d'Verloschter Taux vun absorbance bei 340 nm Rekord. VerfÜgung

SIRT3 kënschtlech VerfÜgung deacetylation assay VerfÜgung

Mënscherechter SIRT3 recombinant Aktivitéit ( BPS) war mat L-Lactic Dehydrogenase vun Bovine Häerz (Fläch) zu Reaktioun Prellbock (50 mm NaCl, 4 mm MgCl _{2, 10 mm Nad +, 50 mm DTT, 50 mm Tris, pH 8.0) incubated mat /ouni SIRT3 inhibitor nicotinamide (Nam, 10 mm) op 37 ° C fir 1,5 Stonnen, an da waren d'Reaktioune fir LDHA Aktivitéit assay benotzt beschriwwen wéi uewen. VerfÜgung}

Real-Zäit Hinnen alleguer VerfÜgung

total RNS war mat TRIZOL Reagent (Invitrogen) gefollegt vun Behandlung mat phenol /chloroform an Nidderschlag mat 2-propanol isoléiert. Total RNS PELLET war dann mat 75% Ethanol an resuspended am Waasser gewäsch. RNS war mat PrimeScript RT-Hinnen alleguer Kit (Takara) a grouss real-Zäit Hinnen alleguer Analyse vun Genen interesséieren ëmgedréint Transkriptiouns ënnerworf war mat SYBR PremixExTaq II Kit gehaal (Takara) folgenden d'Uweisungen d'Hiersteller. Date goufen normalized fir den Niveau vun γ-tubulin. VerfÜgung

Immunofluorescence VerfÜgung

AGS rakommen Zellen op der coverslip zu enger 6-gutt Plack waren zu 4% paraformaldehyde fir 10 Minutten fix an zu 1% gespaart BSA fir 1 Stonn op RT. Incubate Zellen mat Primärschoul antibodies géint SIRT3 an LDHA bei 4 ° C Iwwernuechtung, gefollegt vun incubation mat fluorescence-conjugated Secondaire antibody fir 1 Stonn op RT. Counterstaining war mat DAPI benotzt immunofluorescence Kit (Beyotime) duerchgefouert. Zellen sech schéi an duerch Laser Scannen confocal microscope Radioberäich. VerfÜgung

statistique Analyse VerfÜgung

Data sinn als mengen ± SE aus op d'mannst dräi onofhängeg Experimenter presentéiert. Statistesch Analyse huet mat unpaired zwee-tailed Student d't Test gemaach wann et net anescht uginn ass. P VerfÜgung &Si besteet; 0,05 war bedeitendst considéréiert. VerfÜgung

Resultater VerfÜgung

SIRT3 Ausdrock vun gastric Kriibs Zellen VerfÜgung

SIRT3 zu Regulatioun Kënschtlech homeostasis zu Anti-aller an Anti-Transformatioun gutt definéiert ass. Kuerzem, si verschidde Resultater Rapport iwwert zu SIRT3-mediated Zell inhibition an Prolifératioun, fir d'A kéinte vun hirer Roll an Cancers Virwaat [19,20]. Fir d'Potential Roll vun SIRT3 zu gastric Kriibs festzestellen, Ausdrock vun SIRT3 war zu 4 gastric Kriibs Zell Linnen AGS fonnt, SGC-7901, MGC-803, HGC-27 an engem Grupp vun gastric Kriibs entholl Stoffer. Mir hu fonnt, datt SIRT3 FAQ Niveauen an all 4 gastric Kriibs Zell Linnen nik sech am Verglach zu der och gastric epithelial GES-1 Zellen (AGS, 1,9-fantastesch; SGC-7901, 1,5-fantastesch; MGC-803, 2.0-fantastesch; an HGC -27, 1,8-fantastesch Verglach zu GES-1 Zellen) (Lalumi 1A). An Aklang, goufen d'mRNA Niveau vun SIRT3 an dës Zell Linnen och fräi (AGS, 2,6-fantastesch; SGC-7901, 1,7-fantastesch; MGC-803, 2,5-fantastesch; HGC-27, 2,2-fantastesch) am Verglach zu GES- 1 Zellen (Lalumi 1B). VerfÜgung

Immunohistochemistry Analyse vun entholl an bascht Net-entholl normal Stoffer aus enger Grupp vun gastric Kriibs Patienten bewisen, dass SIRT3-positiv Zellen zu entholl Stoffer méi dacks festgestallt goufen, wéi dat an normale Stoffer. D'Resultater weisen, datt 55,1% vun entholl Stoffer (7% vun normal Stoffer) héijen Niveau (staark positiv) Schatzkummer, 41,4% vun entholl Stoffer (28% vun normal Stoffer) mëttelfristeg héijen Niveau (schwaach positiv), während 3,5% vun entholl Schatzkummer Stoffer a 64% vun normal Stoffer war negativ an SIRT3 Ausdrock (Lalumi 1c an 1D, S1A Lalumi). Spannen, SIRT3 Ausdrock vun intestinal Typ vun entholl Stoffer (15 Fäll; 93,3% staark positiv an 6,6% schwaach positiv) war méi héich wéi déi vun diffusen Typ vun entholl Stoffer (14 Fäll; 14,3% staark positiv, 78,6% schwaach positiv an 7.1 % negativ) (Lalumi 1c an 1E, S1B Lalumi). Dës Resultater hindeit, datt SIRT3 Ausdrock vun e puer erhéijen Verglach mat Zesummenhang normal Stoffer fräi ass an SIRT3 Ausdrock vun eenzelne erhéijen variéiere kann, dee weider ënnersicht ginn muss. VerfÜgung

SIRT3 Niveaue gi mat Zell Prolifératioun Hausnummeren VerfÜgung

da etabléierten mir SIRT3 overexpression an knockdown Zell Linnen AGS an SGC-7901 Zellen benotzt. Den Ausdrock vun SIRT3 zu stabil transfectants war déi westlech blot confirméiert. Overexpression vun SIRT3 fräi Zell Wuesstem, iwwerdeems SIRT3 inhibited Zell Wuesstem souwuel gastric Kriibs Zell Linnen (Lalumi 2A) knockdown. Weider, overexpression vun SIRT3 méi Kolonie Opstellung wéi Kontroll transfected Zellen ausgeléist dat mat nëmmen manner Kolonien am Géigesaz zu entholl Opstellung Fähegkeet geformt an der SIRT3 knockdown Zellen (Lalumi 2B). VerfÜgung

Fir weider d'Roll vun SIRT3 festzestellen, mir heijen SIRT3 overexpression an knockdown SGC-7901 Zellen an Säite vun Sauna Mais an entholl Wuesstem war fir 28 Deeg an der Zell inoculation (S2 Lalumi) erlaabt. D'Moyenne Gewiicht vun der aus SIRT3 overexpressing Zellen ofgeleet erhéijen war 0.7079g, vill méi grouss ass ewéi déi duerchschnëttlech entholl Gewiicht vun Kontroll (NC), p VerfÜgung = 0,015, (Lalumi 2C, lénks Rot). Am Géigesaz, huet den Duerchschnëtt Gewiicht vun erhéijen aus SIRT3 knockdown Zellen ofgeleet 0.0588g, däitlech méi kleng wéi déi vum Match shRNA Kontroll Zellen (scr) (0.2033g; p VerfÜgung = 0.009) (Lalumi 2C, riets Rot) . D'Moyenne Volume vun aus SIRT3 overexpressing Zellen ofgeleet erhéijen war fräi wéi dat aus Kontroll Zellen (NC) (Lalumi 2C, lénks Rot an riets am Eck). Am Géigendeel, wuessen d'Moyenne Volume vun erhéijen aus SIRT3 knockdown Zellen Verglach ganz kleng war, datt bis aus Kontroll Zellen (scr) (Lalumi 2C, riets Rot an riets am Eck). VerfÜgung

Geographie glycolysis zu SIRT3 ausdrécken gastric Kriibs Zellen VerfÜgung

Mir waren dann gewonnert wéi bewosst bioenergetics zu SIRT3-overexpressing gastric Kriibs Zellen verännert ginn hätt. SIRT3 overexpression dramatesch Zocker Notzong (1,4-fantastesch an AGS an 1,9-fantastesch an SGC-7901) fräi, während SIRT3 knockdown Zocker Notzong ofgeholl (ongeféier 40% vun béiden AGS an SGC-7901) (Lalumi 3A an 3B). Konsequent mat der Muster vun Zocker Uleedung, déi SIRT3 overexpressing Zellen Niveau vun lactate secretion (1,2-fantastesch an AGS an 1,3-fantastesch an SGC-7901) fräi hierkommen SIRT3 knockdown Zellen Niveau vun lactate secretion (55% zu AGS ofgeholl hat an 45 % vun SGC-7901) (Lalumi 3C an 3D). Mir hunn och déi Form vu Glucogène Opstellung vill vun SIRT3 overexpression (1,5-fantastesch an AGS an 1,3-fantastesch an SGC-7901) fräi war, eng Fonktioun vun dëse Wuesstem vun entholl Zell [33], während déi SIRT3 knockdown (40% zu AGS reduzéiert a 70% vun SGC-7901) (Lalumi 3 an 3F). VerfÜgung

SIRT3 bewisen ass an der deacetylation vun global ukuerbelt Enzymen an Ënnerhalt vun basal ATP Niveau vun Zellen souwuel am normalen Zoustand a Krankheeten Équipe [1 , 2]. Total bewosst ATP an glycolysis ATP Generatioun sech zu AGS an SGC-7901 Zellen mat entweder SIRT3 overexpression oder SIRT3 knockdown fonnt. D'total bewosst ATP Niveau waren an SIRT3 overexpressing Zellen (ongeféier 1,3-fantastesch zu souwuel Zell Linnen) fräi, mä Verréngerung vun SIRT3 knockdown Zellen (ongeféier 75% vun béiden Zell Linnen) am Verglach zu NC oder scr Kontroll Zellen (Lalumi 4A an 4B) . Dann behandelt mir Zellen mat rotenone oxidative phosphorylation zu inhibit, a getest ATP Generatioun aus glycolysis. Well et zu Lalumi 4C an 4D gewisen, ugefouert SIRT3 overexpression zu enger Erhéijung vun glycolysis ATP Produktioun (1,4-fantastesch an AGS an 1,6-fantastesch an SGC-7901), während SIRT3 knockdown zu engem groussen Verloscht am glycolysis ATP Produktioun (20% ugefouert zu AGS an 40% vun SGC-7901) am Verglach zu NC oder scr Kontroll. VerfÜgung

SIRT3 der homeostasis vun Ros an gastric Kriibs Zellen reguléieren VerfÜgung

a Beweiser ënnerstëtzt dass Ros Niveau fräi engem ass kritescher charakteristesche zu Kriibs Zellen, déi Kriibs Zellen méi sensibel fir zousätzlech Ros Stress [34] maachen. Hei fannt mir dass overexpression vun SIRT3 ofgeholl Ros Niveauen zu 70% an 80% vun AGS an SGC-7901 Zellen, am Ufank inhibition vun SIRT3 Ausdrock Ros Niveauen fräi (1,4-fantastesch an AGS Zellen an 1,6-fantastesch an SGC-7901 Zellen) bzw. (Lalumi 5A an 5B). Am Accord mat der Literatur weist SIRT3 deacetylates an activéiert MnSOD (11, 12), an gastric Kriibs Zellen, war MnSOD Aktivitéit verstäerkte vun SIRT3 overexpression (1,4-fantastesch an AGS Zellen an 1,2-fantastesch an SGC-7901 Zellen), mee verréngert SIRT3 knockdown (50% zu AGS Zellen an 65% vun SGC-7901 Zellen) (Lalumi 5C an 5D) suggeréiert datt SIRT3 Zellen aus oxidative Stress-entschlof Schued schützen kann duerch rebalancing intracellular Ros duerch Tempo MnSOD Aktivitéit zu gastric Kriibs Zellen.

SIRT3 deacetylates an activéiert LDHA VerfÜgung

LDHA spillt eng wichteg Roll an entholl Initiatioun, Ënnerhalt a Werdegang. Inhibition vun LDHA Aktivitéit Bleck tumorigenicity an entholl Werdegang [26,27] an LDHA Aktivitéit ka vun acetylation /deacetylation Modifikatioun regulariséiert ginn [35]. Mir waren Fro, ob SIRT3 zu der Regelung vun LDHA Aktivitéit Équipe ass. Mir hu fonnt, datt, an gastric Kriibs Zellen, war LDHA Aktivitéit vill an SIRT3 fräi Zellen overexpressing hierkommen an SIRT3 knockdown Zellen erofgaangen am Verglach zu NC oder scr Kontroll Zellen getrennt ouni Magnéitfeld Verännerung LDHA FAQ Niveau vun der stabil transfectants (Lalumi 6A). Immunostaining Resultater weisen, datt LDHA an SIRT3 an der Zytoplasma Co-en der huet (Lalumi 6B), a Co-IP Analyse mat entweder LDHA oder SIRT3 antibody Teamchef SIRT3 gebass ass mat LDHA (Lalumi 6C) zesummekomm. Ausserdeem war de Niveau vun LDHA acetylation zu SIRT3 overexpressing Zellen ofgeholl, mä an SIRT3 knockdown Zellen (Lalumi 6D) fräi. Weider, kënschtlech VerfÜgung LDHA Aktivitéit assay gehaal kommerziell Mënsch recombinant SIRT3 an Bovine Häerz L-Lactic Dehydrogenase benotzt uginn dass LDHA Aktivitéit mat der Präsenz vun SIRT3 vun der Reaktioun fräi war, deen duerch d'Aféierung vun SIRT3 inhibitor réckgängeg war , nicotinamide (Lalumi 6E). Z'identifizéieren Site Potential SIRT3 deacetylation (s) op LDHA, gesichte mir Datebank an fonnt dass K5, K14, K57, K81, K118, K126, K222 an K318 sinn potentiell acetylation Siten vun LDHA, a virdrun Etude confirméiert datt K5 acetylation /deacetylation war zu der Regelung vun LDHA Aktivitéit agebonne [35]. Dunn hu mir LDHA Aktivitéit assay lysine mat 5 an lysine 318 acetylation rescht (K5Q /K318Q) oder deacetylation rescht (K5R /K318R) Mann- LDHA, an fonnt dass weder K5 nach K318 néideg war fir SIRT3-mediated LDHA Aktivéierung (S3 Lalumi). Weider Identifikatioun vun SIRT3-mediated LDHA deacetylation brauchen ass. VerfÜgung

SIRT3 upregulates Genen vun bewosst ukuerbelt VerfÜgung Équipe

Fir de molekulare Ënnerschrëft vun SIRT3-LDHA mediated bioenergetics zu gastric Kriibs Zellen Markenzeeche, mir gemooss der Ausdrock vun Genen mat Zocker Transport an glycolysis assoziéiert. Donnéeën zu Lalumi 7A an 7B zougedréckt datt overexpression vun SIRT3 zu AGS oder SGC-7901 den Ausdrock vun HK2 (1.47-fantastesch an AGS Zellen, 1,3-fantastesch an SGC-7901 Zellen) entschlof, MCT4 (2,3-fantastesch an AGS Zellen, 1.34 -fold zu SGC-7901 Zellen) an Glut1 (1,55-fantastesch an AGS Zellen, 1.38-fantastesch an SGC-7901 Zellen) op mRNA Niveau getest vun real-Zäit Hinnen alleguer. Am Géigendeel, ofgeholl SIRT3 knockdown den Ausdrock vun der Gentherapie HK2 zu 76%, MCT4 zu 73% an Glut1 zu 62% an AGS Zellen, iwwerdeems HK2 zu 80%, MCT4 zu 62% an Glut1 zu 74% an SGC-7901 Zellen. Ausserdeem, wann SIRT3 overexpressed war, war MCT1 mRNA Niveau vun AGS Zellen vun 1,6-fantastesch fräi mä net zu SGC-7901 Zellen, a wann SIRT3 knockdown war, war MCT1 zu 59% an AGS an 65% vun SGC-7901 Zellen rofgaang bzw.. VerfÜgung

Diskussioun VerfÜgung

Dës Etude stellt d'Beweiser, dass SIRT3 zu puer Kriibs Zellen ausgedréckt, wéi gastric Kriibs Zellen, mat der verstäerkter aggressiveness vun SIRT3-mediated bioenergetics via deacetylation Zesummenhang kann an Aktivéierung vun LADH. Obwuel dofir aktueller beweist dass SIRT3 eng Schlësselroll an de Schutz vun normalen Zellen géint Alterungsprozess an malignant Transformatioun spillt, datt seng Funktioun an schon transforméiert Zellen wéi entholl Zellen auszedrécken SIRT3 propagéieren gin brauch [19]. Keng SIRT3 zu MEFs féiert zu Frankräich Déséquiliber an eng héich Frequenz vun Transformatioun Zell mediated vun Ras mat engem fräi Taux vun entholl Équipe an aller suggeréiert datt SIRT3 Préventioun vun bewosst Alterungsprozess an carcinogenesis néideg ass [11,15]. Zousätzlech, opgepasst oder manner Ausdrock vun SIRT3 ass an e puer Mënsch Cancers an SIRT3 Niveau fonnt gëtt mat der Empfindlechkeet vun Kriibs Zellen verbonne zu chemo- an radiotherapy [11,15,16]. Allerdéngs ass SIRT3 och mat Therapie Resistenz [19,21,36] zu Mënsch Cancers an verbonne ginn overexpressed gewisen. Dës Resultater hindeit, datt SIRT3 verschiddene Proteinen tëscht normal a Kriibs Zellen Zil- kënnen, an datt SIRT3 Ausdrock kann an verschidden Zorte vu Kriibs, wéi déi aktuell Resultater ofwiesslungsräich ginn beweist dass der intestinal Typ vun gastric Kriibs äussert engem héichen Niveau vun SIRT3 wéi den diffusen Typ vun gastric Kriibs. VerfÜgung

Et ass allgemeng ugeholl, datt entholl Zellen méi bewosst Energie konsuméieren der fast Wuesstem an Prolifératioun wéi déi normal Zellen ze ënnerstëtzen glycolysis den Haaptgrond Quell vum ATP Generatioun benotzt amplaz oxidative phosphorylation [24] . Am Moment studéieren, hien huet mir dat, an gastric Kriibs Zellen, openee SIRT3 mat an deacetylates LDHA, fräi LDHA Aktivitéit dauernd; an SIRT3 overexpression féiert bewosst ATP Produktioun an MnSOD Aktivitéit paralleled mat reduzéierter bewosst Ros Niveau ze fräi, eng fräi oxidative Ralley Fähegkeet vun SIRT3 méiglecherweis via deacetylation-mediated MnSOD Aktivitéit Aktivéierung ugëtt. Méi Beweiser weist dass SIRT3 fir den Ënnerhalt vun bewosst an Mitochondrie homeostasis néideg ass duerch Mitochondrie ukuerbelt a bewosst redox Gläichgewiicht System, Protektioun Zellen géint oxidative Stress via Regulatioun Ros Generatioun, engem kriteschen Mechanismus zu Alterungsprozess, Kriibs an Häerzkrankheeten [1,2 Regulatioun, 37]. SIRT3 kann e Grupp vun Mitochondrie Ziler deacetylate souwuel an der Regulatioun vun agebonne glycolysis a bewosst oxidative Stress. Kuerzem, ass SIRT3 kënnen fonnt pyruvate dehydrogenase Aktivitéit zu Kriibs Zellen ze deacetylate an Erhéijung, déi Kënschtlech bioenergetics an glycolysis souwuel kann [38]. Am Accord, beweist déi aktuell Etude dass SIRT3 deacetylate kann an LDHA aktivéieren, datt fir béid Kënschtlech sin an glycolysis benotzt kënne ginn. Op der aner Hand, kann SIRT3 deacetylate an dono aktivéieren aner Mitochondrie dat heescht de Législateur, wéi MnSOD [11,12], Foxo3 [39] an IDH2 [9] Ros zu scavenge vun oxidative phosphorylation produzéiert, Protektioun Zellen aus der oxidative Schued [40] . Och konsequent mat dëse Conclusiounen, zu dëser Etude, fonnt mir dass overexpression vun SIRT3 Erhéijunge MnSOD Aktivitéit, déi ënner verstäerkte bewosst ukuerbelt Conditioun ee Grond vun reduzéiert bewosst Ros Niveau kéint. VerfÜgung

LDHA, als Familljemember vun lactate dehydrogenase (LDH), ass vierdrun zu glycolytic Zellen an en der an Mitochondrie nieft dem Zytosol [41], fonnt an haaptsächlech d'inter-Konversioun vun pyruvate an lactate catalyzing [42]. LDHA ass dës eng Schlësselroll an aerobic glycolysis an tumorigenicity zu malignant Zellen ze spillen [26,27]. Am Kriibs Zellen, verbraucht LDHA séier pyruvate vun glycolytic Passerelle produzéiert, Virwaat aerobic lactate Produktioun ze iwwerdribblen fir [26]. Inhibition vun LDHA induces Ros Produktioun, Verloschter bewosst ATP Niveauen a glycolysis bremst, also Zell Wuesstem bremst a kontrolléiert Zell Doud Kriibs [27]. Deemools mat deene Rapporten, fonnt mir dass SIRT3 kann LDHA zesummekomm an aktivéieren. An der SIRT3 overexpressing Zellen, war LDHA acetylation mat eng fräi LDHA Aktivitéit Aktivitéit ofgeholl. Obwuel genau Mechanismus dauernd Regulatioun SIRT3-mediated LDHA brauch weider ënnersicht ginn, vermëttelt dës Resultater datt LDHA glycolysis Passerelle kontrolléiert datt entholl bioenergetics gut iwwerstan vun SIRT3 Ausdrock Niveauen betraff kann. VerfÜgung

Eis aktuell Etude verroden och, datt d'Expressioun vun engem Grupp vu Genen, wéi MCT1, MCT4, HK2 an Glut1, wéi wichteg Reglementatioun vun Energie ukuerbelt zu Kriibs bekannt ginn och zu SIRT3-overexpressing gastric Kriibs Zellen fräi, an Tempo glycolysis zu entholl Zellen e Potential Roll vun SIRT3 Musiktherapie-. HK2 catalyzes phosphorylation vun Zocker ze Zocker-6-phosphate um éischte Schrëtt vun glycolysis [43]. Zocker Fernsehn (GLUT) Kontrollen der Transport vun Zocker ganze Plasma Membran, analyséieren den éischte Saz-limitéieren Schrëtt fir Zocker ukuerbelt [44]. MCT1 an MCT4, Membere vun monocarboxylates (wéi lactate an pyruvate) Fernsehn Famill, sinn och an de Wuesstem vun glycolysis-ofhängeg erhéijen [45] Équipe. Zesumme, proposéiere dëse Resultater e Potential System léisst tëscht SIRT3 an enger Grupp vun glycolysis-verbonne Genen vun entholl aggressiv Wuesstem sécher, dat weider ze propagéieren gin muss. VerfÜgung

An Conclusioun, obwuel SIRT3 gutt an Kënschtlech homeostasis géint Zell charakteriséiert ass Alterungsprozess an Transformatioun, Ausdrock vun SIRT3 zu entholl Zellen ass mat verstäerkte Prolifératioun an aggressiv Wuesstem vun gastric Kriibs Zellen verbonnen. SIRT3 openee an activéiert LDHA, fir fräi glycolysis a ATP Produktioun Virwaat, deen zesumme mat fräi Kënschtlech neier Étude MnSOD Aktivitéit an intracellular Ros Niveau ofgeholl (e hypothetic Modell ass an Lalumi 7C proposéiert). Sou, beweist de Wuesstem-Spannend Funktioun vun SIRT3 e Potential Zil- erhéijen mat SIRT3 Ausdrock unzegesin. VerfÜgung

Informatiounen Ennerstëtzung VerfÜgung S1 Figebam. Vertrieder agebousst drënner der SIRT3 Ausdrock vun mënschlecher gastric Kriibs uplanzen fir bestëmmend. VerfÜgung A, paraffin-Ënnerbewosstsinn Mënsch gastric Kriibs a vläit bascht pathologically normal Otemschwieregkeeten uplanzen sech mat SIRT3 antibody (bronger) déi duerno Kären ze immunohistochemistry staining ënnerworf counterstain mat hematoxylin ( blo; war all entholl mat bascht normal Stoffer an ee Stéck vun 20 × 40 ×) gewisen. B, Vertrieder Biller vun SIRT3 Ausdrock vun der intestinal an diffusen Zorte vun gastric Kriibs. Skala Bar, 50 μm VerfÜgung Doi:. 10,1371 /journal.pone.0129834.s001 VerfÜgung (TIF) VerfÜgung S2 Figebam. Overexpression vun SIRT3 gefördert entholl Belaaschtung an VIVO. VerfÜgung SGC-7901 Zellen mat SIRT3 overexpression (A) oder knockdown (B) waren subcutaneously an riets Ofwiersäit vun der Sauna Mais heijen mat der famill Kontroll Zellen (NC oder scr) an der lénker Säit. Xenograft erhéijen sech um 28. Dag vun der Zell inoculation excised a gewien. Biller vu riets Rot zougedréckt xenograft erhéijen an VIVO um Enn vun der Experimenter. Biller weisen entholl Wuesstem zu Mais VerfÜgung Doi:. 10,1371 /journal.pone.0129834.s002 VerfÜgung (TIF) VerfÜgung S3 Figebam.

• PLOS NËMMEN: Lymph Node Metastasen, eng eenzegaarteg Onofhängeg Prognostic Factor zu Early Gastric Cancer
• PLOS NËMMEN: Umeldung an Characterization vun CXCR4-Positiv Gastric Cancer BTS Stammzellefuerschung