REG4 VerfÜgung, déi Reg IV FAQ encodes, ass e Member vun der Kalzium-ofhängeg lectin superfamily a mächtegst activator vun der epidermal Wuesstem Faktor receptor /Akt /activator FAQ-1 sécher Passerelle. Puer Mënsch Cancers overexpress Reg IV, a Reg IV Ausdrock ass mat intestinal phenotype dat assoziéiert. Allerdéngs, Regulatioun vun REG4 VerfÜgung Transkriptiouns bleift onkloer. Am Moment studéieren, ze propagéieren mir ob Ausdrock Reg IV zu gastric Kriibs (GC) Zellen CDX2 reguléieren. Ausdrock vun Reg IV an CDX2 war vun Western blot a grouss ëmgedréint Transkriptiouns-polymerase Kette Reaktioun vun 9 GC Zell Linnen an 2 Colon Kriibs Zell Linnen analyséiert. D'Funktioun vun der 5'-Reliefsailen Regioun vun der REG4 VerfÜgung Gentherapie vun luciferase assay Zeeche war. An 9 GC Zell Linnen, endogenous Reg IV an CDX2 Ausdrock sech och soll. Mat engem estrogen receptor-reegelen Form vun CDX2, rapid Aféierungs- vun Reg IV Ausdrock war an HT-29 Zellen observéiert. Reporter Gentherapie assays Teamchef eng wichteg Roll an Transkriptiouns fir Konsens CDX2 DNA bindend Elementer an der 5'-Reliefsailen Regioun vun der REG4 VerfÜgung Gentherapie. Chromatin immunoprecipitation assays zougedréckt datt CDX2 Photo'en direkt un der 5'-Reliefsailen Regioun vun REG4 VerfÜgung. Dës Resultater weisen, datt CDX2 FAQ reguléieren direkt Reg IV Ausdrock VerfÜgung Fro:. Naito Y, Oue N, Hinoi T, Sakamoto N, Sentani K, Ohdan H, et al. (2012) Reg IV Ass en Direct Target vun Intestinal Transcriptional Factor CDX2 zu Gastric Cancer. PLoS NËMMEN 7 (11): e47545. Doi: 10.1371 /journal.pone.0047545 VerfÜgung Redakter: Wael El-Rifai, Barnard University Medical Center, Vereenegt Staate vun Amerika VerfÜgung Arnaque: 24, Mee 2012; Akzeptéiert: 12. September 2012; Publizéiert: November 2, 2012 VerfÜgung Copyright: © 2012 Naito et al. Dëst ass eng oppen-Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz BY Creative Commons verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt d'Original Auteur an d'Quell Kaiser sinn VerfÜgung Funding:. Dës Aarbecht war fir déi fir Cancer Control 10-Joer Strategie Drëtte Aneneegräifend vun Stipendie-zu-Hëllef fir Fuerschung vun den Edukatiounsministère, Kultur, Wëssenschaft, Sports, an Technology vu Japan, an, an en Deel, déi vun engem Grant-zu-Hëllef ënnerstëtzt a fir Cancer Research aus dem Gesondheetsministère, Labour an Wuelergoen vun Japan, a fir d'National Institut vun Biomedical Innovation (plangen fir Promotioun vu Grondrechter Ënnersich zu Gesondheet Sciences). D'funders hu keng Roll am Etude Design, Daten Kollektioun an Analyse, Décisioun, oder Virbereedung vun der mëttelalterlech Handschrëft ze publizéieren VerfÜgung Wettsträit Interessen:.. D'Auteuren hunn deklaréiert, datt keng Competitioun Interessen existéieren VerfÜgung Gastric Kriibs (GC) ass eent vun de meescht gemeinsam mënschlech Cancers vun der Welt. Kriibs entwéckelt wéi engem Resultat vu multiple genetesch a epigenetic hire Restaurant [1]. Mir standing virdrun Serien Analyse vun der Gentherapie Ausdrock (Salbei) vu véier primär GCs an identifizéiert puer GC-spezifesch Genen [2]. Vun dësen Genen, islet-ofgeleet Familljemember 4 VerfÜgung regeneréiert ( REG4 VerfÜgung, déi Reg IV FAQ encodes) ass e Kandidat Gentherapie fir Kriibs-spezifesch Ausdrock [3]. REG4 VerfÜgung ass e Member vun der Reg VerfÜgung Gentherapie Famill, déi zu der Kalzium-ofhängeg lectin superfamily gehéiert. REG4 VerfÜgung ursprénglech déi héich-duerch dat Haaptrei Analyse vun enger grousser demagogesch bowel Krankheet cDNA Bibliothéik identifizéiert huet [4]. Reg IV ass e mächtegst activator vun der epidermal Wuesstem Faktor receptor (EGFR) /Akt /activator FAQ-1 (AP-1) sécher Passerelle vun Colon Kriibs Zellen an erhéigt Ausdrock vun BCL-2, BCL-XL an survivin, déi Proteinen sinn verbonne mat der inhibition vun apoptosis [5]. Amplification vun der REG4 VerfÜgung Gentherapie zu pancreatic Kriibs gemellt gouf [6]. Reg IV gouf als eent vun de Genen an-reglementéiert Kriibs-domat Zellen [7] identifizéiert. Mir hunn iwwerpréift virdrun den Effet vun gezwongen Ausdrock vun Reg IV zu GC Zell Linn. Mir weisen datt Reg IV bremst 5-fluorouracil (5-FU) -induced apoptosis duerch EGFR Aktivéierung am GC Zellen [8]. Am Géigesaz, show Reg IV-overexpressing Zellen rauszesichen Differenze zu Prolifératioun an Invasioun Aktivitéit Verglach mat Zellen mat eidelen Vecteure transfected [8]. Dës Conclusiounen Ënnerstëtzung der Notioun dass Reg IV FAQ zu gastric carcinogenesis bedeelegt VerfÜgung GC kann an véier phenotypes no mucin Ausdrock ënnerdeelt ginn:. Gastric oder foveolar phenotype; intestinal phenotype; intestinal an gastric gemëscht phenotype; a weder gastric nach intestinal phenotype [9]. Z'ënnerscheedde genetesch Verännerungen schéngen mat gastric an intestinal phenotype GC gin verbonne [10]. An eiser leschter Observatioune, war Reg IV zu 30% vun GC Fäll ausgedréckt an huet mat intestinal phenotype soll [11]. [20] - A Zuel vun immunohistochemical Analysë vun Reg IV goufen am mënschleche Cancers [11] gemellt. Am Allgemengen, gemellt dësen Analyse datt Reg IV zu adenocarcinoma Zellen ausgedréckt ass eng intestinal phenotype ginn. Et ass confirméiert datt Reg IV Ausdrock vun GLI1 entschlof ass, déi e Schlëssel transcriptional Faktor vun der Hues sécher Passerelle ass [21], oder duerch Wuesstem Facteure wéi EGF, transforméiert Wuesstem Faktor-α (TGF-α), hepatocyte Wuesstem Faktor (HGF), oder Basis fibroblast Wuesstem Faktor (bFGF) [22]. Allerdéngs sinn dës Molekülle onwahrscheinlech fir de Veräin Ausdrock tëscht Reg IV dat an intestinal phenotype zu Kont. VerfÜgung Mir hu fonnt virdrun dass Ausdrock vun Reg IV mat CDX2 Ausdrock soll sech [11]. CDX2 ass eng mammalian caudal-Zesummenhang intestinal Transkriptiouns Faktor a wichteg fir den Ënnerhalt vun intestinal epithelial Zellen [23], [24]. Puer Zeilen Beweiser hindeit, datt intestinal metaplasia vun de Mo a intestinal phenotype GC mat ectopic CDX2 Ausdrock verbonne sinn [9], [25]. Am Moment studéieren, ze propagéieren mir ob CDX2 reguléieren an GC Reg IV Ausdrock an fonnt dass CDX2 Photo'en direkt un der 5'-Reliefsailen Regioun vun REG4 VerfÜgung Gentherapie a verbessert de Promoteur Aktivitéit. VerfÜgung Reg IV an CDX2 Expression sinn am GC BTS soll VerfÜgung Mir éischt Aféierungs- vun Reg IV Ausdrock vun CDX2 am GC Zell Zeilen ze propagéieren. Western blot Analyse vun CDX2 an 9 GC Zell Linnen verroden, datt keen oder niddereg-Niveau Ausdrock vun CDX2 zu MKN-7 nogewise gouf, TMK-1, HSC-44PE, a Kato-III (Figebam. 1A). Fir erauszefannen, ob CDX2 an Ausdrock Reg IV rigoréis am GC Zellen soll sech, Western blot a grouss ëmgedréint Transkriptiouns-polymerase Kette Reaktioun (qRT-Hinnen alleguer) Analysë vun Reg IV sech op 9 GC Zell Linnen gesuergt. Als zu Lalumi gewisen. 1A, Reg IV FAQ Ausdrock ass nëmmen zu der 3 Zell Linnen mat héijen Niveau vun REG4 VerfÜgung gët gemoos qRT-Hinnen alleguer festgestallt. Vun de 5 GC Zell Linnen mat CDX2 FAQ Ausdrock, 2 Zell Linnen (MKN-1 an MKN-28) gefeelt Magnéitfeld Ausdrock vun REG4 VerfÜgung gët an FAQ. D'Zell Linnen mat undetectable CDX2 FAQ Ausdrock (MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, a Kato-III) hu weisen net REG4 VerfÜgung gët oder FAQ (Figebam. 1A). VerfÜgung Next, generéiert mir eng polyclonal Populatioun vun MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, a Kato-III Zellen héijen Niveau vun CDX2 vun Wonn vun den Zellen mat Gedächtnis-defekt ëm ausdrécken, e voll-Längt Mënsch CDX2 cDNA Droen well keen oder niddereg-Niveau Ausdrock vun CDX2 war an dës Zell Linnen fonnt. Allerdéngs, overexpression vun CDX2 gescheitert Reg IV Ausdrock vun Western blot (Donnéeën net gewisen) ze aktivéieren. Well et méiglech ass, datt CDX2 eleng net duer geet fir activating Reg IV Ausdrock, Ausdrock vun CDH17 VerfÜgung (Zeechesaatz LI-cadherin FAQ), wat ee vun den Ziler vun CDX2 ass [24], war och ze propagéieren. Allerdéngs, Aktivatioun vun LI-cadherin Ausdrock net an MKN-7 fonnt gouf, TMK-1, HSC-44PE, a Kato-III Zellen héijen Niveau vun CDX2 ausdrécken (Donnéeën net gewisen). Well mir Aktivatioun vun LI-cadherin Ausdrock vun CDX2 an der HT-29 Colon Kriibs Zell Linn zougedréckt [24], Aféierungs- vun Reg IV Ausdrock war an der selwechter Zell Linn ze propagéieren. Als zu Lalumi gewisen. 1B, Aféierungs- vun Ausdrock Reg IV war an HT-29 Zellen Krankheet mat ëm Droen voll-Längt Mënsch CDX2 cDNA fonnt. Mir entsteet och eng polyclonal Populatioun vun SW480 (Colon Kriibs Zell Linn) Zellen ausdrécken héijen Niveau vun CDX2 vun Wonn vun den Zellen mat Gedächtnis-defekt ëm e komplette-Längt Mënsch CDX2 cDNA Droen. Als zu Lalumi gewisen. 1B, Aféierungs- vun Reg IV Ausdrock war zu SW480 Zellen Krankheet mat ëm Droen voll-Längt Mënsch CDX2 cDNA fonnt. Dës Resultater hindeit, datt Reg IV Ausdrock kënnt vun CDX2 zu Zell Linnen vun Colon Kriibs ofgeleet entschlof ginn. Well zu intestinal metaplasia vun de Mo, CDX2 an Ausdrock Reg IV gutt soll ginn [11], d'Benotzung vun enger Zell Linn Colon Kriibs kéint fir de Modell vun intestinal metaplasia gëeegent ginn. VerfÜgung Fir besser d'Relatioun bewäerten tëscht CDX2 an Reg IV Ausdrock, studéiert mir Reg IV Ausdrock vun enger HT-29-ofgeleet Linn mat rigoréis reegelen CDX2 Aktivitéit. Mir ginn eng polyclonal HT-29 Zell Linn, datt mat der pCDX2-ER Vecteure transduced schonn haten. D'pCDX2-ER Vecteure encodes engem chimeric FAQ an déi voll-Längt CDX2 Message Offloss vun enger mutated estrogen receptor (ËH) ligand-verbindlech Domain Äonen sinn. D'mutated ËH ligand-verbindlech Domän kee Photo'en méi estrogen, mä datt d'Fähegkeet tamoxifen zu kruet. Traitement vun der HT-29 /CDX2-ER Zell Linn mat 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) schéinen staark Aféierungs- vun Reg IV FAQ Ausdrock bannent 48 Stonnen (Figebam. 1c). Dës Resultater weisen, datt Reg IV ass eng direkt oder Primärschoul Zil- Gentherapie vun CDX2 reegelen. Mä, dësen CDX2 ass fir activating Reg IV Ausdrock net genuch. VerfÜgung Inhibition vun CDX2 vun RNS Léif (RNAi) Bilan vun der Down-Regulatioun vun Reg IV zu GC BTS VerfÜgung Fir erauszefannen, ob CDX2 fir Reg IV Ausdrock am GC Zellen néideg ass, analyséiert mir den Effet vun den RNAi inhibiting an de Niveau vun Reg IV Ausdrock am HSC-39 Zell Linn CDX2 Ausdrock well héich endogenous CDX2 an Reg IV Ausdrock am HSC-39 Zell Linn fonnt gouf. CDX2-spezifesch kleng interfering RNAs (siRNAs) bedeitend Trupen CDX2 FAQ Ausdrock 3 Deeg no transfection, an Ausdrock vun Reg IV ët war verwandelt-reegelen ongeféier 50% vun CDX2 siRNAs am HSC-39 am Verglach mat sengen Niveauen am Kontroll siRNA-behandelt Zellen ( Figebam. 1D). Dës Resultater weisen, datt CDX2 zu Erhalen Reg IV Gentherapie Ausdrock Équipe ass. VerfÜgung Fonctionnement Characterization der 5'-Reliefsailen Regioun vun REG4 VerfÜgung Gene vun Luciferase Assay VerfÜgung Fir z'identifizéieren Potential CDX2 -binding Siten am Promoteur Regioun VerfÜgung REG4, eng Sich vun der Frankräich Message direkt 5 'fir de kritt Site Transkriptiouns Start gesuergt huet, e Konsens mat den CdxA Poulet caudal VerfÜgung homologue bindend Element (5'-a, a /T, T, a /T, a, T, a /G-3 ") [26] an engem virdrun beschriwwen Sich sind [27]. Mir hunn véier putative CDX2-verbindlech Siten an der 2 kilobase (KB) 5'-Reliefsailen Regioun vun der REG4 VerfÜgung Gentherapie (Figebam. 2A). Dës goufen: Site A (5'-AATAATA-3 ", aus -1828 bis -1834), Site B (5'-CTTTACAG-3", vun -901 bis -908), Site C (5'-TTTTATGG-3 ', vun -114 bis -121), Site d (5'- AATAATA -3 ", aus -90 bis -96). Fir d'Roll vun dësen kritt CDX2-verbindlech Siten zu Regulatioun bewäerten REG4 VerfÜgung Transkriptiouns, goufen verschidde reporter Gentherapie gesond entsteet. Als zu Lalumi gewisen. 2B, reporter gesond Gentherapie mat 2.1, 1,2, oder 0.6 KB vun 5'-Reliefsailen Haaptrei aus der REG4 VerfÜgung Gentherapie zougedréckt staark Aktivitéit am HSC-39 Zellen, déi vun staarke endogenous Ausdrock Ecran REG4 CDX2 Photo'en direkt un der 5 ' -flanking Regioun vun REG4 VerfÜgung Gene VerfÜgung fir analyséieren ob CDX2 Photo'en direkt un der putative CDX2-verbindlech Siten am REG4 VerfÜgung 5'-Reliefsailen Regioun, mir chromatin immunoprecipitation gesuergt (Chip) assays benotzt HSC-39 Zellen. Benotzt 6 primers fir den REG4 VerfÜgung 5'-Reliefsailen Regioun (Figebam. 3A), mir DNA Fragmenter mat de wéint REG4 VerfÜgung 5'-Reliefsailen Regioun vun primer 1, dee kritt CDX2- Krankheeten verbindlech Site C (Figebam. 3B). DNA Fragmenter vun der 5'-Reliefsailen Regioun vun REG4 VerfÜgung, déi 2 primers benotzt generéiert huet, 3, 4, 5 a 6 sou dass se net kritt CDX2 bindend Siten enthalen huet, waren déi vun der anti net erholl CDX2 antibody. D'Spezifizitéit vun Erhuelung vun der REG4 VerfÜgung Promoteur Regioun folgenden Chip mat anti-CDX2 antibody war duerch de Fait gewisen, datt aner Roll DNA Fragmenter subtil CDX2-verbindlech Siten (zB, Exon 3 vun der CDX1 Trimethylation vun Histone H3 Lysine 27 (H3K27me3) op den REG4 VerfÜgung Zell zesummeféieren VerfÜgung Obwuel CDX2 FAQ Ausdrock vun MKN-1 an MKN-28 Zell Linnen, dës 2 Zell Linnen gefeelt Magnéitfeld Ausdrock vun REG4 VerfÜgung fonnt gouf ët an FAQ. Well et huet gemellt ginn, datt DNA hypermethylation vun CpG Inselen mat silencing vu verschiddene Genen assoziéiert ass [28], ermëttelen mir ob DNA methylation transcriptional inactivation vun Reg IV zu MKN-1 an MKN-28 Zellen entschlof. Mir behandelt dësen Zellen mat engem demethylating Agent, 5-AZA-2'-deoxycytidine (December-DC) an dann standing qRT-Hinnen alleguer. Allerdéngs, Ausdrock Reg IV net an dës Zell Linnen restauréiert gouf (Donnéeën net gewisen), datt DNA methylation suggeréiert ass net wahrscheinlech Reg IV Ausdrock ze beaflossen. Et gouf och confirméiert, dass H3K27me3 huet mat repressed Gentherapie Ausdrock verbonne ginn [29]. Mir weider H3K27me3 am GC Zell Zeilen ze propagéieren. Ze bestëmmen de Räichtum vun H3K27me3 op den REG4 VerfÜgung Promoteur an de GC Zell Linnen, Chip assays waren gesuergt. An MKN-1 an MKN-28 Zell Linnen, H3K27me3 Niveauen op der Promoteur Regioun VerfÜgung REG4 waren héich hierkommen am HSC-39 Zell Linn, H3K27me3 Niveau op den REG4 VerfÜgung Promoteur Regioun war niddereg (Figebam. 3C). Dës Resultater hindeit, datt zougemaach chromatin Struktur vun REG4 VerfÜgung Promoteur kann Reg IV Ausdrock vun CDX2 inhibit. VerfÜgung Obwuel et gouf confirméiert, datt Reg IV Ausdrock vun GLI1 entschlof ass [21] oder EGF [22], dësen Molekülle sinn onwahrscheinlech fir d'Associatioun tëscht Reg IV an intestinal dat ze Kont. Am Moment studéieren, awer mir dass endogenous CDX2 an Ausdrock Reg IV zu GC Zell Linnen gutt soll sech. Zousätzlech, eng ËH-reegelen Form vun CDX2 Hëllef, hunn mir dass et rapid Aféierungs- vun Reg IV Ausdrock no 4-OHT Behandlung war. Reporter Gentherapie assays Teamchef eng wichteg Roll fir Konsens CDX2 DNA bindend Elementer am REG4 VerfÜgung Promoteur Regioun an hirer Reunioun. Kierzunge Chip assays zougedréckt datt CDX2 Photo'en direkt un der REG4 VerfÜgung Promoteur. Mir weisen virdrun, dass an der Primärschoul GC Otemschwieregkeeten an intestinal metaplasia vun de Mo, CDX2 an Reg IV Ausdrock sech och soll [11]. Dës Resultater weisen, datt CDX2 FAQ reguléieren Reg IV Ausdrock am GC an intestinal metaplasia vun de Moo. VerfÜgung CDX2 ass overexpressed zu intestinal phenotype GC an intestinal metaplasia vun de Mo [9], [25] direkt. Am Géigesaz, Verloscht vun CDX2 Ausdrock gouf zu engem Ziel vun der Primärschoul colorectal Cancers, meeschtens an schlecht ënnerscheet colorectal Cancers [30] observéiert. D'Bedeitung vun den Aménagement vun CDX2 Ausdrock vun mënschlecher Cancers bleift kloer, an duerfir ass et wichteg d'Zil Genen ze definéieren, déi vun CDX2 matgeholl ginn. Mir hunn e puer CDX2-reegelen Genen identifizéiert wéi CDH17 VerfÜgung (déi LI-cadherin encodes) [24], HEPH VerfÜgung (déi encodes hephaestin) [31], ABCB1 Obwuel eis Daten der Vue Ënnerstëtzung datt CDX2 eng Roll spillt an Regulatioun REG4 VerfÜgung Transkriptiouns via bindend puer Conclusiounen fir de Promoteur Regioun, dass CDX2 eleng fir activating net genuch ass REG4 VerfÜgung Ausdrock. Am Moment studéieren, mir entsteet eng polyclonal Populatioun vun MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, a Kato-III Zellen deen héije Niveau vun CDX2 duerch Krankheet ausdrécklech mat ëm e komplette-Längt Mënsch CDX2 cDNA Droen. Allerdéngs, overexpression vun CDX2 Explicatioun Reg IV Ausdrock aktivéieren. An GC Zell Linnen, keent vun der Zell Linnen mat undetectable CDX2 FAQ Ausdrock hu festgestallt REG4 VerfÜgung gët an FAQ. Dofir, ass CDX2 néideg fir Ausdrock Reg IV, mä CDX2 eleng ass net genuch fir activating Ausdrock Reg IV. Am Moment studéieren, huet néng GC Zell Linnen studéiert. D'Originne vun der Zell Strecken wéi follegt. D'MKN-7, MKN-28, an MKN-74 Zell Strecken aus intestinal Typ GC etabléiert. D'TMK-1 an MKN-45 Zell Strecken vun diffusen Typ GC etabléiert. D'Kato-III, HSC-39, an HSC-44PE Zell Strecken aus signet Ring Zell carcinoma etabléiert. D'MKN-1 Zell Linn war vun adenosquamous Zell carcinoma etabléiert. Well zu intestinal metaplasia vun de Mo, CDX2 an Reg IV Ausdrock sinn och soll, gegrënnt GC Zell Linnen vun diffusen Typ GC oder Zell carcinoma signet Ring kann net fir d'Analyse vum Reg IV Aféierungs- vun CDX2 gëeegent ginn. An Tatsaach, kann Reg IV Ausdrock vun CDX2 zu Zell Linnen ofgeleet vun Colon Kriibs an de Grëff ze studéieren entschlof ginn. Doriwwer eraus, awer mir dass H3K27me3 Niveauen op der REG4 VerfÜgung Promoteur Regioun héich waren an MKN-1 an MKN-28 GC Zell Linnen. Dës 2 Zell Linnen gefeelt Magnéitfeld Ausdrock vun REG4 VerfÜgung obwuel CDX2 FAQ Ausdrock fonnt huet. Dofir, ausfale H3K27me3 Niveauen op der REG4 VerfÜgung Promoteur Regioun héich kënnen zu MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, a Kato-III Zellen, an déi overexpression vun CDX2 Reg IV Ausdrock ze aktivéieren. Et ass confirméiert datt em <> REG4 VerfÜgung mRNA Ausdrock vun Stimulatioun mat TGF-α, EGF, HGF, oder bFGF duerch Aktivatioun vun der mitogen-ageschalt FAQ kinase (MAPK) Passerelle [22] verstäerkte war . Sou, kéint et Hypothes gin dass Reg IV och vun afgerappt transcriptional Faktoren vun MAPK Weeër reglementéiert ass. Mir standing zu silico VerfÜgung vun der Analyse REG4 VerfÜgung Gentherapie 5'-Reliefsailen Regioun, an op d'mannst ee kritt AP-1 Konsens Message (bei -883 huel Puer REG4 fonnt An Conclusioun, weisen eis heiteg Donnéeën datt CDX2 FAQ Reg IV Ausdrock direkt reguléieren. Reg IV activéiert der EGFR /Akt /AP-1 sécher Passerelle. Als intestinal phenotype GC EGFR dacks äussert [36], ass et ugeholl, datt dës Reg IV-ageschalt Passerelle eng wichteg Roll an dësem subtype vun GC spillt. Well CDX2 induces och Ausdrock vun der multidrug Resistenzgen, ABCB1 VerfÜgung, anti-EGFR Therapie awer net Chimiotherapie vläicht fir Patiente mat intestinal phenotype GC positiv sinn. VerfÜgung Plasmids VerfÜgung d'CDX2 cDNA war an der Pluralitéit Klone Site vun der Realitéit Ausdrock Vecteure pPGS-CMV-CITE-Tendenz virdrun ëmschriwwen hin [24]. D'voll-Längt, Wildwest-Typ CDX2 cDNA war och an der Realitéit Vecteure pBabe-Puro ËH subcloned wéi virdru beschriwwen pCDX2-ER [24] ze generéieren. D'pCDX2-ER Vecteure encodes engem chimeric FAQ an déi voll-Längt CDX2 Message Offloss vun enger mutated ËH ligand-verbindlech Domain Äonen sinn. D'mutated ËH ligand-verbindlech Domän kee Photo'en méi estrogen, mä datt d'Fähegkeet tamoxifen zu kruet. Frankräich DNA Message vun der 5'-Reliefsailen Regioun vun der mënschlecher REG4 VerfÜgung Gentherapie sech vun Hinnen alleguer Kick mat Frankräich DNA sidd aus HSC-39 Zellen als Skelett an subcloned an der pGL4.10 [luc2] Vecteure (Promega , Madison, allem). Hinnen alleguer-baséiert Approche sech benotzt kennen an de kritt CDX2-verbindlech Siten an der pGL4.10-REG4 reporter Gentherapie bauen QuikChange Site-Direkter Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA) benotzt aféieren. Véier putative CDX2-verbindlech Siten sech geännert. All vun Hinnen alleguer generéiert Fragmenter sech duerch automatiséiert sequencing ubelaangt. D'plasmid pGL4.74 [hRluc /TkLanguage] Vecteure (Promega) war als Kontrollorgan fir transfection Effizienz vun reporter assays benotzt. VerfÜgung Zell zesummeféieren, Aen do Aids, a Cargolux Prefabrizéierten VerfÜgung D'amphotropic Phoenix Verpakung Zell Linn war vun G. Nolan (Stanford University, Stanford, CA) [37] gëtt. Néng Zell Linnen ofgeleet vu mënschlechen GC an 2 Zell Linnen ofgeleet vu mënschlechen Colon Kriibs sech benotzt. D'TMK-1 Zell Linn war an eiser Labo [38] gegrënnt. D'HSC-39 an HSC-44PE Zell Linnen goufen duerch ee vun den Auteuren (Kazuyoshi Yanagihara) [39], [40] gegrënnt. Fënnef GC Zell Linnen vun der MKN Serie waren Audit vum Dr. Toshimitsu Suzuki gëtt [41], [42]. D'Kato-III Zell Linn war vun Dr. Morimasa Sekiguchi Audit gëtt [43]. D'HT-29 an SW480 Colon Kriibs Zell Strecken vum amerikanesche Type Kultur Collection kritt. Zellen sech am flëssegem Stéckstoff bis d'Initiatioun vun dëser Etude gespäichert. No aus gefruerenem Bourse thawing, goufen d'Zellen am niddereg Trip uechter d'Etude huet. Konsequent Zell Wirklechkeet war duerch Verglach vun microscopic Biller iwwerwaacht. D'Verpakung Zellen Phoenix sech mat Realitéit Ausdrock gesond transfected (pPGS-CDX2, pPGS-Tendenz, an pCDX2-ER) an der supernatant nonreplicating amphotropic Virus war wéi virdru beschriwwen recoltéiert [24]. An HT-29 Zellen der CDX2-ER Fusioun FAQ ausdrécken (HT-29 /CDX2-ER), war CDX2 Funktioun vun Zousätzlech vun 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) (Fläch chemesche, St. Louis, MO) un de Wuesstem ageschalt mëttelfristeg op eng final Konzentratioun vun 500 nmol. Ze ermëttelen, ob DNA methylation transcriptional inactivation vun Reg IV entschlof, goufen Zellen mat engem Finale Konzentratioun vun 1 μM December-DC (Fläch chemesche) fir 5 Deeg behandelt, ier se fir RNS Extraktioun gesammelt goufen. VerfÜgung Western Blot Analys Fir Western blot Analyse, goufen Zellen ëmschriwwen lysed virdrun [44]. Protein Konzentratioune sech duerch Bradford FAQ assay (BioRad, Richmond, CA) mat BSA wéi de Standard benotzt alles. D'lysates (20 μg) waren an Laemmli d'Prouf gefiermt solubilized vun kachen an duerno zu 12% SDS-polyacrylamide gelies electrophoresis vun elektro-Transfert op engem nitrocellulose filter duerno ënnerworf. D'filter war fir 1 Stonn bei Raumtemperatur mat enger Anti-Reg IV antibody (Kanéngchen polyclonal antibody an eiser Labo, Refus entwéckelt. 10) incubated oder anti-CDX2 antibody (BioGenex, San Ramon, CA). Peroxidase-conjugated anti-Kanéngchen oder anti-Maus IgG war an de Secondaire Reaktioun benotzt. Immunocomplexes huet mat enger ECL Plus Western Blot Detektioun System (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) visualized. β-actin (Fläch chemesche) war och als Luede Kontroll fonnt. VerfÜgung qRT-Hinnen alleguer Analys VerfÜgung Total RNS war mat enger RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA) ofgebaut, an 1 μg vun insgesamt RNS war mat engem éischt Strand cDNA Synthes Kit (Amersham Biosciences) zu cDNA ëmgerechent. Quantitation vun REG4 VerfÜgung mRNA Niveauen war vun real-Zäit fluorescence erkennen standing wéi virdru beschriwwen [45]. Hinnen alleguer war mat engem SYBR Green Hinnen alleguer Haaptentwéckler Reagents Kit (Obwuel Biosystems, Foster City, CA) gesuergt. Real-Zäit ze erkennen vun der Emissioun Intensitéit vun grénge SYBR gebonnen un double-gekëmmert DNA huet mat enger Abi PRISM 7900 liichtkraaftarm Detektioun System (Obwuel Biosystems) ëmschriwwen virdrun [46] gesuergt. ACTB VerfÜgung -specific Hinnen alleguer Produite goufen aus der selwechter RNS Echantillon Kick an als eng intern Kontroll. Message vun primers fir REG4 VerfÜgung qRT-Hinnen alleguer sinn an Table dës 1. qRT-PCRs sech zu triplicate fir all Prouf primer Set gesuergt, an dat an normale deviation (Fils) vun den dräi Experiment war den berechent relativer quantification Wäert. Um Enn vum 40. Hinnen alleguer Monaco, Reaktioun Produite goufen electrophoretically op 8% Nët-denaturing polyacrylamide gels fir visuell Confirmatioun vun Hinnen alleguer Produiten getrennt. VerfÜgung RNAi VerfÜgung Fir d'endogenous CDX2 knockdown, war RNAi gesuergt . Zwee siRNA duplexes gezielt CDX2 (5'-AACCAGGACGAAAGACAAAUA-3 ", CDX2 siRNA1; an 5'-AAGCCUCAGUGUCUGGCUCUG-3", CDX2 siRNA2) an engem nonsilencing siRNA duplex (5'-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3 ") goufen Wierderbuch (QIAGEN). Transfection war mat standing Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Karlsbad CA) no de Protokoll d'Hiersteller. Kuerz, goufen 60 pmol vun siRNA an 10 μL vun Lipofectamine RNAiMAX zu 1 ml vun RPMI mëttelfristeg gemëscht (10 nmol /L Finale siRNA Konzentratioun). No 20 min vu incubation, war d'Mëschung an d'Zellen kommen an dësen huet op Platen fir all assay plated. Dräi Deeg no transfection, goufen Zellen fir all Experimenter ze analyséieren. VerfÜgung Reporter Gene Assays VerfÜgung HSC-39 an MKN-1 Zellen zu 6-gutt Placke rakommen waren (BD Falcon, Franklin sin, NJ ). Transfection vun Zellen bei 50% -80% confluency war mat 3 μL vun FuGENE6 Transfection Reagent (Roche kinnt, Indianapolis, IN), opgeféiert 0,8 μg vun pGL4.10 reporter Gentherapie gesond, an 0,2 μg pGL4.74 [hRluc /TkLanguage] Vecteure (Promega). Um 48 Stonnen no transfection, Zellen sech am passiv lysis Prellbock (Promega) gesammelt an resuspended. Luciferase Aktivitéit huet mat enger duebel luciferase assay System (GloMax 96 Microplate Luminometer, Promega) alles. VerfÜgung Chip Assays VerfÜgung Chip assays sech mat der EZ-Chip Chromatin Immunoprecipitation Kit (Millipore, Billerica gesuergt , MA) pro Fabrikatioun Uweisungen. Ze analyséieren, ob CDX2 Photo'en direkt un der putative CDX2-verbindlech Siten am REG4 VerfÜgung 5'-Reliefsailen Regioun, standing mir Chip assays HSC-39 Zellen benotzt. An dowéinst, HSC-39 Zellen (1-2 × 10 de Räichtum vun H3K27me3 op den REG4 VerfÜgung Promoteur an de GC Zell Linnen, Chip assays sech standing benotzt MKN-1, MKN-28, an HSC-39 Zell Zeilen ze bestëmmen. An dowéinst, GC Zellen (1-2 × 10 qPCRs sech zu triplicate fir all Prouf primer Set gesuergt, an dat an normale deviation (Fils) vun déi dräi Experiment war wéi d'famill quantification Wäert berechent. Um Enn vum 40. Hinnen alleguer Monaco, Reaktioun Produite goufen electrophoretically op 8% Nët-denaturing polyacrylamide gels fir visuell Confirmatioun vun Hinnen alleguer Produiten getrennt. VerfÜgung Merci Mir Här Shinichi Norimura fir excellent technesch Assistenz a Berodung. Dëst Wierk war mat der Aart Kooperatioun vun der Research Center fir Krankheeten, Fakultéit fir Medezin, Hiroshima University duerchgefouert. Mir soen der Analys Center vun Life Science, Hiroshima University, fir de Gebrauch vun hire Raimlechkeeten. VerfÜgung
Aféierung VerfÜgung
Resultater VerfÜgung
gët an FAQ. Vergläich, MKN-1 Zellen hunn klenge endogenous REG4 VerfÜgung ët an ugewisen wéineg oder keen entschlof transcriptional Aktivitéit vun der 2.1, 1.2, oder 0.6 KB REG4 VerfÜgung reporter Gentherapie gesond (Donnéeën net gewisen) . D' REG4 VerfÜgung reporter Gentherapie gesond Basis Puer -116 zu +58 an -87 bis +58 wouvun déi reduzéiert Aktivitéit am HSC-39 Zellen (Lalumi 2B.), Wat beweist, datt e Message tëscht huel Puer -634 an - 116 eng Schlësselroll Leeschtung vun activating REG4 VerfÜgung Transkriptiouns. Ausserdeem, analyséiert mir eenzeg an Multiple Projet'en am kritt CDX2-verbindlech Siten an der 5'-Reliefsailen Regioun vun der REG4 VerfÜgung Gentherapie benotzt HSC-39 Zellen (Figebam. 2C). Wéi erwaart, kritt CDX2-verbindlech Site C, déi tëscht huel Puer -634 an -116, spillt eng wichteg Roll an activating REG4 VerfÜgung Transkriptiouns etabléiert ass. VerfÜgung
Gentherapie) sech net emmer (Figebam. 3B). Zousätzlech, Kriseperiod mierkt immunoprecipitation (Maus IgG) puer REG4 VerfÜgung oder CDX1 VerfÜgung -specific DNA Fragmenter (Figebam. 3B). All dës Conclusiounen hindeit datt CDX2 activéiert REG4 VerfÜgung Transkriptiouns duerch direkt bindend fir e Message vun der 5'-Reliefsailen Regioun vun der Gentherapie. VerfÜgung Diskussioun VerfÜgung
[32], a DSC2 VerfÜgung [33] (déi desmocollin 2 encodes) (déi multidrug Resistenz 1 encodes). Dorënner Genen, ABCB1 VerfÜgung ursprénglech als overexpressed an Implikatioune Gentherapie zu Multiple EPO-resistent Zellen identifizéiert gouf, a seng Produit, P-glycoprotein, schéngt eng kritesch Roll an Drogenofhängeger Resistenz ze spillen [34]. Virdrun, gemellt mer dat missen Ausdrock vun Reg IV zu GC Zellen inhibited 5-FU-entschlof apoptosis duerch Aféierungs- vun BCL-2 an dihydropyrimidine dehydrogenase [8]. Geholl zesummen, ass et méiglech, datt am intestinal phenotype GC, Ausdrock (oder ectopic Ausdrock) vun CDX2 induces Reg IV an multidrug Resistenz 1 Ausdrock, deen eng Erhéijung vun EPO-Resistenz. An Tatsaach, huet et schonn erwähnt, datt Thes Chimiotherapie fir Patiente mat intestinal phenotype GC net positiv ass [35]. VerfÜgung
Gentherapie 5'-Reliefsailen Regioun), déi eng matgeholl transcriptional Faktor vun MAPK sécher ass. Am Moment studéieren, zougedréckt HSC-39 Zellen ähnlechen transcriptional Aktivitéit vun reporter Gentherapie gesond mat 1,2 KB an 0.6 KB vun REG4 VerfÜgung 5'-Reliefsailen Haaptrei. Wéi den Effet vun EGF oder TGF-α op REG4 VerfÜgung Transkriptiouns net an de Grëff ze studéieren propagéieren war, ass weider Enquête waren der sécher Mechanismen ze klären, déi Regulatioun vun REG4 VerfÜgung Transkriptiouns induce.
spontan a Methode VerfÜgung
Arbeschterlidder VerfÜgung
Anti-Coronavirus Moleküle vu Mikroben kënne Schlëssel sinn fir nei Behandlungen
Patienten op Immuntherapie solle méi Faser konsuméieren,
Wëssenschaftlecht Symposium bei LABVOLUTION konzentréiert sech op Schlësselthemen am Liewenswëssenschaften
Detailléiert Kaart vum mënschlechen Zongmikrobiom
Vaginale Bakterien verbonne mat virzäiteger Gebuert
DNA Metabarkodéierung kéint d'Analyse vun der mënschlecher Ernährung verbesseren
Microbiome kéint hëllefen de Virkriibsrisiko bei Fraen mat HPV z'identifizéieren
Eng nei Studie verëffentlecht am Open-Access Journal PLOS Pathogenen am Mäerz 2020 bericht dméiglech Notzung vun de Bakterien Gardnerella fonnt an der Gebärmutterhalskanal an der Vagina vu Fraen m
Gutt Immunzellen kéinte verantwortlech si fir de Stoffwiessel Ännerungen fënnt Studie
Eng nei Studie huet gewisen datt dImmunzellen am Darm mam Taux vum Metabolismus verbonne kënne sinn. DResultater vun der neier Etude mam Titel, Darm intraepithelial T Zellen kalibréieren de Stoffwiess
Biologesch Therapie kann de Risiko vu schwéiere COVID-19 erofgoen
Eng rezent Observatiounsstudie vu spuenesche Fuerscher, aktuell verfügbar op medRxiv* Virdruck Server, suggeréiert datt Patienten mat immun-mediéierten Krankheeten, déi biologesch Therapie kréien, e