PLOS NËMMEN: gezielt Cadherin-17 Inactivates Ras /Raf /MEK /Erk sécher an bremst Zell Zouhuelen vun Gastric Cancer

Wat VerfÜgung

Cadherin-17 (CDH17), ee Member vun 7D-cadherin superfamily, war overexpressed zu gastric Kriibs (GC) a war mat aarmséileg Iwwerliewe, entholl Terrain, Metastasen, an fortgeschratt entholl Etapp assoziéiert. Mettlerweil der bewosst Funktioun a sécher Mechanismus vun CDH17 am GC bleift onkloer. An dëser Etude, awer mir datt iwwer 66% vun GC Zell Linnen (20/30) waren CDH17 positiv. Ray microarray (TMA) assay gewisen, datt 73,6% Chinese GC Stoffer (159/216) waren CDH17 positiv, iwwerdeems 37% respektiven bascht normal Stoffer goufen CDH17 positiv. Knockdown vun CDH17 inhibited Zell Prolifératioun, Migratioun, Haftung a Kolonie Opstellung, an och eng Zell Zyklus verhaft an apoptosis zu AGS Mënsch GC Zellen entschlof. Op der aner Säit, overexpression vun CDH17 vereinfacht MGC-803 GC entholl Wuesstem an Sauna Mais. Antibody vill a Western blotting assay bewisen, dass knockdown vun CDH17 zu AGS Zellen verwandelt-reegelen integrin β Serie Proteinen, inactivated weider de Ras /Raf /MEK /Erk Passerelle a Nerve p53 an p21 Heefung, déi zu Prolifératioun inhibition virgedroen, Zell-Zyklus verhaft an apoptosis kopéiert. Zesummen, eisen Daten éischtens d'Kapazitéit vun CDH17 beweisen d'Aktivitéit vun Ras /Raf /MEK /Erk Passerelle fir Zell Verbreedung zu GC ze regléieren, a proposéiert dass CDH17 wéi eng attraktiv therapeutesch Zil fir Zukunft Recherche déngen kann. VerfÜgung

Fro: Lin Z, Zhang C, Zhang M, Xu D, Fang Y, Zhou Z, et al. (2014) gezielt Cadherin-17 Inactivates Ras /Raf /MEK /Erk sécher an bremst Zell Zouhuelen vun Gastric Cancer. PLoS NËMMEN 9 (1): e85296. Doi: 10.1371 /journal.pone.0085296 VerfÜgung

Redakter: Claude Prigent, Institut de Génétique et Développement de Rennes, Frankräich VerfÜgung

Arnaque: 10 Juni, 2013; Akzeptéiert: 26. November 2013; Publizéiert: 20. Januar 2014 zu

Copyright: © 2014 Lin et al. Dëst ass eng oppen-Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz BY Creative Commons verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt d'Original Auteur an d'Quell Kaiser sinn VerfÜgung

Funding:. D'Auteuren keng Ënnerstëtzung oder Finanzéierung muss Rapport VerfÜgung

Wettsträit Interessen: All Auteurs sinn Mataarbechter oder fréiere Mataarbechter vun Roche R & d Center (China), ausser YanFen Fang, deen Employé vun Osten China normal University, Shanghai, China ass.. Dëst heescht net de onvergläichleche 'Auteuren ofzeänneren un all déi Politiken PLOS NËMMEN op sharing Daten a Material. VerfÜgung

Aféierung VerfÜgung

Gastric Kriibs (GC) ass den zweete Spëtzekandidat Ursaach vun global Kriibs veruerteelt klasséiert an déi véiert stäerkste gemeinsam Kriibs weltwäit [1], [2]. D'Steiren Iwwerliewe Zäit vun GC Patienten ass 7~10 Méint. Meeschten Patienten mat GC präsent mat spéiden-Etapp Krankheet mat engem globale 5-Joer Iwwerliewe vu ronn 20% a Zil Äntwert Tariffer ze konventionell chemotherapeutic Rei regimens kënnt vun 20% bis 40% verbessert ginn [1], [3]. Moment, ass nach cisplatin-baséiert Therapie dicht fir fortgeschratt a metastatic GC zu Medeziner Astellunge benotzt. Ausserdeem, fir HER2-NEU gastric adenocarcinomas overexpressing, Stad (Herceptin) a Kombinatioun mat Chimiotherapie prolongs der Steiren globale Iwwerliewe vu 11,1 Méint (Chimiotherapie eleng) zu 13,8 Méint [4]. Sou héich veruerteelt Taux vun GC, et ass nach ëmmer grouss unmet medezinesch brauchen déi sensibel an zouverlässeg uweist fir fréi Diagnos vun GC a mächtegst therapeutesch Zil fir Behandlung vun GC ze fannen. VerfÜgung

CDH17, ee Member vun 7D-cadherin superfamily, Kaddoen an an et Liewer an gastrointestinal TRACT während embryogenesis, also och als Liewer-intestinal cadherin (LI cadherin) genannt gëtt. CDH17 ass zu hepatocellular carcinoma overexpressed [5], [6], gastric Kriibs [7], ductal pancreatic Kriibs [8] an colorectal Kriibs [9] - [11]. Als gemellt, war CDH17 haaptsächlech op der Zell Membran a veréiert zu normal gastric Stoffer an de positiven Taux war bal 78,4% [12]. Den Ausdrock Niveau vun CDH17 war Eegenheet vun der fortgeschratt gastric carcinoma datt mat aarmséileg hätt verbonne war, [13]; an et war och mat der lymph Node Metastasen zu gastric Kriibs [14] vill verbonnen. Knockdown CDH17 mat lentivirus-mediated miRNA inhibited d'Prolifératioun, onvergläichleche entholl Wuesstem, an Metastasen vun BGC823 Mënsch gastric Kriibs Zellen souwuel eng kënschtlech an VIVO [15] - [17]. CDH17 gouf als oncogene an enger nëtzlech Bewaacher fir Diagnos vun gastric Cancers [18] proposéiert. Et gouf Siicht datt CDH17 mediated oncogenic sécher an HCC mat Wnt sécher Passerelle Zesummenhang ass [5]. Kuerzem, war et confirméiert, datt CDH17 tumorigenesis an lymphatic Metastasen am GC duerch Aktivatioun vun NFκB Passerelle sécher entschlof [19]. CDH17 reegelen sécher α2β1 integrin spezifeschen Schwéierpunkt Haftung kinase an Ras Aktivéierung zu induce, déi zu Zell Haftung an Prolifératioun vun Colon Kriibs Zellen [11] zu der Erhéijung gefouert. Allerdéngs bleift d'Haaptgrënn Roll a sécher Mechanismus vun CDH17 am GC onkloer. An dëser Etude, CDH17 als potentiell therapeutesch Zil fir GC ze validéieren an der sécher Mechanismus vun CDH17 am GC ze ermëttelen, zeechne mir den Ausdrock vun CDH17 mënschlechen GC Zell Linnen an Chinese GC Stoffer, konsultéiert d'Afloss vun CDH17 knockdown oder eropgeluede Ausdrock op tumorigenic an metastatic Effet vun GC Zell Linnen, an lant de méiglech Signal CASCADES zu CDH17 dinn. Mir gesinn eng héich CDH17 Ausdrock vun mënschlecher GC Zell Linnen an Chinese GC Stoffer, an eng kloer inhibition zu Zell Prolifératioun, Migratioun, Haftung, Kolonie Opstellung, apoptosis kopéiert, a Zell Zyklus verhaft no an Linnen Mënsch GC Zell vun CDH17 silencing. Ausserdeem, weisen eis Resultater éischtens d'Kapazitéit vun CDH17 der Aktivitéit vun integrin-Ras /Raf /MEK /Erk Passerelle fir Zell Verbreedung zu GC ze regléieren, a proposéiert dass CDH17 wéi eng attraktiv therapeutesch Zil fir Zukunft Recherche déngen kann. VerfÜgung

spontan a Methode VerfÜgung

IFLA- Ausso VerfÜgung

d'Benotzung an Pfleeg vun experminteller Déiere vun de Finanzpolitiker Déieren Care an benotzt Comité (IACUC), Roche R &ofgeseent gouf; d Center (China). De Mënsch GC Otemschwieregkeeten Bleck mat entspriechende bascht Otemschwieregkeeten Bleck sech vu Shanghai Biochip Company kritt, e CRO Service Firma. All Mënsch Stoffer sech mat schrëftlech Erlaabnes vun Quell Patienten gesammelt. All Zell Strecken aus ATCC, USA, Japanesch Collection vun Research Bioresources, an Shanghai Instituter vun Biochimie a Zell Biologie, Chinese Academy vun Science kaaft. VerfÜgung

Zell Linnen an Reagents VerfÜgung

de All Zell Linnen aus American onmarkéierte Zell Collection (ATCC), japanesch Collection vun Research Bioresources, an Shanghai Instituter vun Biochimie a Zell Biologie, Chinese Academy vun Science waren am respektiven Wuesstem mëttelfristeg haten déi vun de Forainen recommandéiert goufen. Sou as-18T-CDH17 plasmid aus Sino biologesch Galaxy Tetracycline (Mierwaasser) war aus Fläch, war Zell Counting Kit-8 aus Dojindo cuisine Tech war. Mënsch Plasma Fibronectin war vun R & D Systemer. Transwell ëmkomm war vun Corning (6.5-mm Duerchmiesser, 8-μm pore Gréisst). CDH17 oligo siRNA war vun Genepharma Co. mat der Haaptrei 5'AAGGCCAAGAACCGAGUCATT 3 '. Scram RNS Kontroll (Allstar®) war vun QIAGEN. VerfÜgung

Ray Mikro vill immunohistochemistry VerfÜgung

Zwee honnert an den Aachtelsfinalë paraffin Ënnerbewosstsinn zesummen gastric Kriibs Otemschwieregkeeten Bleck mat bascht Otemschwieregkeeten Bleck entspriechend (bascht Otemschwieregkeeten war mannst anerer 5 cm vum primäre erhéijen ewech) huet vun Shanghai Biochip Company gesammelt an verschéckt. Stoffer goufen sectioned an zoufälleg op 3 Mikro vill drënner virbereet. Den Encadrement vun Patienten goufen 32-84 Joer (Steiren Alter 65) mat Stadium vun 1A-4 laut amerikanesche Gemeinsam Comité op Cancer (AJCC) Richtlinnen ver.7. All déi Fäll goufen déi zwee Senior pathologists mat erlieft Spezialitéit zu gastric Kriibs wirklech diagnostizéiert. Nuecht op 4 ° C; (D MAB1032 1:2000 zu TBS /T R &) D'drënner an erauszesichen serum fir 20 min incubated goufen, da vun 100 μL anti-Mënsch Affinitéit Cadherin-17 stilvoller monoclonal Ab, Maus IgG iwwerzunn. D'drënner waren déi 100 μL DAKO Stellt + /HRP, Kanengchen /Mouse Daach der grëndlech mat TBS gewäsch ginn. Honnert microliters vu Realitéiten-chromogen Léisung (botzt) sech un der drënner applizéiert a bei Raumtemperatur fir 10 min incubated. Kierchefënster drënner waren microscopically vun zwee immunohistochemistry Experten iwwerpréift. Déi normal Maus IgG war als negativ Kontroll benotzt. Staining war als negativ ze gin wann keen positiven Zell Membran staining identifizéiert a positive ginn hätt, wou méi wéi 10% vun entholl Zellen zougedréckt Zell Membran-positiv immunostaining. VerfÜgung

TR stabil Zell Linnen VerfÜgung

D'pLenti6 /TR Vecteure (Invitrogen, Cat. Nr V48020) an pLenti3.3 /TR Vecteure (Invitrogen, Cat. Nr A11114) waren benotzt stabil Zell Zeilen ze generéieren, déi constitutively héijen Niveau vun der Mierwaasser repressor auszedrécken. Dës Ausdrock plasmids enthale Elementer déi vun der bauen an virions an der blasticidin oder geneticin Resistenz Bewaacher fir Auswiel vun stably transduced Zell Linnen erlaben geléist. Kuerz, 293FT Verpackungen Zellen (Invitrogen, Cat. Nr R700-07) sech mat der pLenti6 /TR oder pLenti3 /TR an der ViraPower TM duerf Mix transfected (Invitrogen, Cat. Nr K4975-00) lentiviral ze produzéieren Deelchen. D'lentivirus benotzt goufen AGS Zellen oder MGC-803 an der blasticidin (8 μg /ml, Invitrogen, Cat. Nr R210-01) oder geneticin (200 μg /ml, Invitrogen, Cat. Nr 10131-027) zu transduce war AGS Zellen ze wielt fir eng stabil TR-ausdrécken genannt TR-AGS stabil Zell Linn oder TR-ausdrécken MGC-803 Zellen genannt TR-MGC-803 stabil Zell Linn benotzt. Dës TR ausdrécken Zell Strecken wéi Lëntgen fir Ausdrock gesond benotzt déi Mierwaasser-reegelen Ausdrock vun CDH17 shRNA (kuerz hairpin RNS) oder CDH17 Gentherapie erliichtert, bzw.. VerfÜgung

gëllt AGS Zellen mat Mierwaasser-reegelen Ausdrock shRNA vun CDH17 Gentherapie VerfÜgung

Véier miRNA oligonucleotides gezielt CDH17 Gentherapie ([Homo] Gene ID: 1015) huet en Internet Applikatioun System entworf benotzt (Invitrogen). Dës duebel-gekëmmert DNA waren an der pcDNA6.2 Jonglenster ™ -GW /EmGFP-Mir Ausdrock System (Invitrogen, Cat. Nr K4936-00) déi sech dann transiently transfected an AGS Zellen vun der Lipofectamine 2000 normale Prozeduren (Invitrogen, Cat . Nr 11668-027). Laut real-Zäit Hinnen alleguer Analyse, d'Haaptrei 90-2 (Stiermer primer: 5'-TGCTGTGTACTTCACACCAAACACTAGTTTTGGCCACTGACTGACTAGTGTTTTGTGAAGTACA-3 "; Réckproduktioun primer: 5'-CCTGTGTACTTCACAAAACACTAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTAGTGTTTGGTGTGAAGTACAC-3") vun miRNAs zougedréckt a dem héchste Effizienz a war pro Form BP recombination gewielt ze pENTR-miRNA ze kréien. Dëst Element Vecteure war dann benotzt am LR recombination mat pLenti4 /A /V5 (Invitrogen, Cat. Nr K4920-00) pLenti4 /A /V5-miRNA lentivirus benotzt Gateway® Technik (Invitrogen, Cat.No.12535-019 ze kréien ). D'lentivirus sech agesat fir TR-AGS stabil Zellen an 200 μg /ml Zeocin (Invitrogen, Cat. Nr R250-05) transduce gouf benotzt fir eng stabil Mierwaasser-reegelen CDH17 shRNA Ausdrock Zellen TR-AGS-CDH17_KD stabil Zell genannt déieren Linn. VerfÜgung

gëllt MGC-803 Zellen mat Mierwaasser-reegelen overexpression vun der Gentherapie VerfÜgung CDH17

Kuerz, war aus Sou as-18T-CDH17 plasmid (Sino biologesch Galaxy) an subcloned an IRES CDH17 Haaptrei Implikatioune -EGFP Vecteure CDH17-IRES-EGFP ze kréien andeems Primers benotzt: Stiermer primer: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCCACCATGATACTTCAGGCCCATCTTCAC-3 "; Ëmgekéierte primer: 5'-TAGGGGGGGGGGAGGGAGAGGGGCGGATCCTCACCTTCTCAGAGGTTTGACTTCA-3 "). Dëst bauen war benotzt BP recombination zu Leeschtunge pENTR-CDH17-IRES-EGFP ze kréien. Dunn der Entrée Vecteure an pLenti6.3 /A /V5 (Invitrogen, Cat. Nr V370-06) Vecteure waren am LR recombination benotzt pLenti6.3 /A /V5-CDH17-IRES-EGFP ze kréien. Dunn huet sech de lentivirus produzéiert zu TR-MGC-803 stabil Zellen a 4 μg /ml blasticidin benotzt gouf zu wielt fir eng stabil Mierwaasser-reegelen CDH17 Gentherapie Ausdrock Zellen genannt TR-MGC-803-CDH17_Over stabil Zell Linn transduce. VerfÜgung

Zell Prolifératioun assay VerfÜgung

fir siRNA flüchteg transfection assays, Zellen mat enger Dicht vu 5 op 10 cm Plat rakommen sech × 10 6 Zellen /Plat an transfected mat 20 nm siCDH17 oder Alaister siRNA. No 48 h vu incubation, goufen d'Zellen disassociated an zu 96-gutt Plack um Dicht vun 3000 iwwerginn Zellen /gutt, da fir aner 72 h incubated. D'Zell Nuetsvolen war mat CCK-8 Kit (Donjindo, Japan) assayed. Fir TR-inducible AGS-CDH17_KD stabil Zellen, goufen Zellen vun 60 mm × 15 mm Plat rakommen a behandelt mat oder ouni Mierwaasser (0, 2,5 an 5.0 μg /ml) fir verschidden Zäit. Zellen waren der 2, recoltéiert 3, 4, 5 a 6 Deeg an der Zell Zuel sech duerch ScepterTM Gen Automatëscht Zell blëtzaarteg (millipore) gezielt. Fir Prolifératioun Rettungsplang assay, goufen TR-inducible AGS-CDH17_KD stabil Zellen rakommen an 60 mm × 15 mm Plat an cultured fir 10 Deeg mat oder ouni 5.0 μg /ml Mierwaasser. Fir Rettungsplang Grupp, war d'Kultur mëttelfristeg Mierwaasser wouvun déi frësch mëttelfristeg op Dag ersat 4, an Zellen sech weider bis 10. BTS vun all Grupp ze wëssen cultured gin goufen 2 op Dag gesammelt, 4, 6, 8 an 10 fir Zell Zuel Zielen a Western blotting Analyse. VerfÜgung

Zell Migratioun assay VerfÜgung

TR-AGS-CDH17_KD stabil Zellen sech zu 10 cm Plat rakommen a behandelt mat oder ouni Mierwaasser (5 μg /ml). No 120 h vu Kultur, gesammelt an gezielt Zellen goufen. 0,1 ml vun Zell Ophiewe (1, 2, 3 × 10 4 Zellen /ml) war an der ieweschter unzekräizen vun der Chambre notéiert. 0.6 ml 10% FBS mëttelfristeg war bis den ënneschten unzekräizen, wéi eng Chimio attractant notéiert. No 24 h vu incubation bei 37 ° C, goufen Zellen bei 4 ° C fir 30 min mat 90% EtOH fix an da mat 0,1% glaskloer mauve fir 15 min Kierchefënster. D'Net-Migranten Zellen sech aus der ieweschter Gesiicht vun der transwell Membran mat engem Koteng Swab geläscht. D'grousst Zellen huet dono ënner Liicht microscopy fotografeschen an gezielt. VerfÜgung

Zell Haftung assay VerfÜgung

TR-AGS-CDH17_KD stabil Zellen sech zu 10 cm Plat rakommen a behandelt mat oder ouni Mierwaasser (5 μg /ml). Pre-zerwéiert vun 96-gutt Plaque war Nuecht op 4 ° C vun incubating Wells mat 25 μg /ml fibronectin gesuergt. Ze reduzéieren Net-spezifesch bindend, 1% Bovine serum albumin (BSA) war gutt mateneen notéiert a fir 60 min bei 37 ° C incubated, war BSA zwee Mol mat steril PBS gewäsch. 120 h der knockdown CDH17 mat Mierwaasser sech Zellen gesammelt an rakommen an Pré-Beschichtete 96-gutt Placke mat 4 × 10 4 Zellen /gutt. 2 h drop, Net-Operstéiungszeen Zellen sech fir dat Duebelt vun wäschen mat steril PBS geläscht. D'Operstéiungszeen Zellen sech duerch d'CCK-8 Kit assayed. VerfÜgung

Kolonie Opstellung assay VerfÜgung

Eischtens, 6-gutt Placke mat ënnen Agar Layer (0.6% gelies) virbereet goufen. Dunn, TR-AGS-CDH17_KD Zellen oder siCDH17 Zellen transfected (als Prolifératioun assay) zu komplett mëttelfristeg suspendéiert goufen mat 0.3% -0,4% Noble Agar (Fläch-Aldrich, St. Louis, MO) an rakommen an bereed 6-gutt zappen an cultured fir 7 oder 14 Deeg. Zellen sech fir 2 h mat thiazolyl blo tetrazolium bromide (MTT) geschriwwen. D'Zuel vun Zell Kolonie war gezielt. VerfÜgung

Zell Zyklus Analyse VerfÜgung

TR-AGS-CDH17_KD stabil Zellen an enger sechs gutt zappen rakommen sech op 1.0 × 10 5 Zellen /gutt an behandelt mat 5 μg /ml Mierwaasser. 120 h drop, Zellen sech bei 4 ° C fir 3 h mat trypsin an fix mat EtOH recoltéiert. Dunn Zellen sech op 1500 g fir 5 min an Katakombe mat PBS centrifugated. Re-suspendéiert Zellen zu RNase /PBS Léisungen (20 μg /ml), incubated bei 37 ° C fir 15 min, dobäi dann PI /PBS Léisungen (20 μg /ml) an um RT incubated fir 30 min, Aenzeien d'Kierchefënster Zellen mat BD FACS Calibur an analyséiert d'Date mat BD CellQuest Pro Software. VerfÜgung

Apoptosis Analyse VerfÜgung

TR-AGS-CDH17_KD stabil Zellen sech zu enger sechs gutt zappen rakommen bei 1.0 × 10 5 Zellen /gutt an mat 5 μg /ml Mierwaasser behandelt. 120 h drop, Zellen sech eemol mat Précoce-gi si PBS mat trypsin an Katakombe recoltéiert. Zellen sech zu 500 μl 1 × bindend gefiermt an 5 μL PI a 5 μl AnnexinV (BD) bäigebaut du-gespaart. No incubation an donkel (Raumtemperatur) fir 10 min, goufen d'Kierchefënster Zellen mat BD FACS Calibur Aenzeien. Déi gesammelt Daten war mat BD CellQuest Pro Software analyséiert. VerfÜgung

Western blotting Analyse VerfÜgung

BTS vum Ripa lysed ware gefiermt [150 mm NaCl, 1% NP40, 0,25% deoxycholate an 10 mm Hepes (pH 7.4)] mat engem protease inhibitor Cocktail (Roche cuisine Biochemicals). Protein Konzentratioune sech mat der bicinchoninic Seier (BCA) Method (Pierce) laachen. Drësseg micrograms vun pro Prouf FAQ war zu Luede gefiermt gekachten a 8-12% packt SDS polyacrylamide gels (Invitrogen) an transferéiert op nitrocellulose Schläimhait electrophoresed. D'Schläimhait sech mat antibodies (CDH17, Integrin β1, Integrin β4, Integrin β5, p-p53, p53 Komedie, p21 aus R &goufen; D, Raf, p-MEK, MEK, p-Erk, Erk aus Zell sécher waren, an K-Ras war vun Santa Cruz) a vun engem peroxidase-conjugated immunoglobulin gefollegt. Western blots huet mat enger verstäerkter chemiluminescence (ECL) Kit (GE, Gesondheetswiesen) visualized VerfÜgung

Antibody flamenden Ofgrond assay VerfÜgung

dräi Zorte vun antibody flamenden Ofgrond sech aus R kritt &. D Systemer, Inc. fir antibody flamenden Ofgrond assay. Mënsch Phospho-Kinase Singular Kit (Cat. Nr ARY003) enthält 43 verschiddene kinases. Mënsch Soluble Receptor Singular Kit Non-Hematopoietic Panel (Cat. Nr ARY012) enthält 119 verschiddene soluble kenne. Mënsch Apoptosis Singular Kit (Cat. Nr ARY009) enthält 35 verschiddene apoptosis antibodies. http://www.rndsystems.com/: D Systeme goen; méi ustrengend Informatiounen iwwert dësen flamenden Ofgrond kann an de Link vun R &fonnt ginn. TR-AGS-CDH17_KD stabil Zellen waren der 120 h recoltéiert behandelt mat oder ouni Mierwaasser (5 μg /ml) an der Proteinen sech duerch lysis gefiermt mat der protease inhibitors lysed, Zell dovu waren verdënntem an incubated mat den dräi Zorte vun antibody flamenden Ofgrond Iwwernuechtung . D'flamenden Ofgrond sech gewäsch ze unbound Proteinen ewechhuelen, gefollegt vun incubation mat engem Cocktail vun biotinylated erkennen antibodies. All Prozedure laut den Instruktioune vun de Kit. Blots sech duerch densitometry analyséiert, an FAQ Ausdrock war zu enger positiver Kontroll normalized déi zu all Membran vertruede war. VerfÜgung

Kilometréierung vun am VIVO Aktivitéit VerfÜgung

TR-MGC803-CDH17_Over Zellen (1 × 10 7 Zellen vun 0,2 ml PBS) waren an lénks Dréckstipp vun 5~6-Woch BALB /c heijen Nu /Nu athymic weiblech Maus (Sino-britesch SIPPR /BK déngt. Déierefrënn Ltd, China). Entholl Volumen (mm 3) war mat calipers gemooss a berechent als (W 2 × L) /2, wou W d'Breet ass an L ass d'Längt. Wann entholl Volumen ~100 mm erreecht 3, huet de Mais an zwou Gruppen zoufälleg (9 Mais vun all Grupp). Tetracylcine Aféierungs- (Invitrogen, 0,2 mg /ml, an goen Drénkwaasser versuergt ginn 2,5% sucrose wouvun) gouf op d'Glidderung Dag initialized. Goen Drénkwaasser 2,5% sucrose wouvun war an Net-entschlof Grupp fir de Mais geliwwert. Entholl Bänn gouffen all 3 Deeg bis Déieren geaffert huet. No 35 Deeg kopéiert, goufen xenograft entholl Stoffer gesammelt a fir famill FAQ Ausdrock ze Western blot Analyse ënnerworf. VerfÜgung

statistique Analyse VerfÜgung

Data ausgedréckt huet als Mëttel ± s.d. an statistesch ze Student d'unpaired T-Test ënnerworf. A Niveau vun P &Si besteet; 0,05 war als bedeitendst gin VerfÜgung

Resultater VerfÜgung

Expression Profil vun CDH17 zu gastric Kriibs VerfÜgung

Den Ausdrock Niveau vun CDH17 Proteinen zu 30 Zell Linnen war kategoriséiert. an 4 Gruppen op d'Donnéeën vun optesch Dicht Analyse géint Beta-actin baséiert. AGS Zell Linn war bestinn d'Ënnerscheeder tëscht gels wéi intern Standard benotzt. Iwwer 66% vun GC Zell Linnen (20/30) waren CDH17 positiv (Dorënner 1A). VerfÜgung

Den Ausdrock a Lokalisatioun vun CDH17 zu Rubrik Primär- Otemschwieregkeeten paraffin vun immunohistochemistry op Otemschwieregkeeten microarrays festgestallt gouf. Verglach mat Kontroll drënner Kierchefënster déi normal Maus IgG, CDH17 MAB- staining gouf bewisen kloer Zell Membran Lokaliséierung (Dorënner 1B). Vun 216 Fäll mat bestätegt wirklech Diagnos Rapport, 73,6% kriibserreegend Stoffer (159/216) harbored positive CDH17 stain mat spillen aus + zu +++, iwwerdeems 37% positive CDH17 stain zu respektiven bascht normal Stoffer (Table 1). An CDH17 positiv Fäll, huet den Ausdrock Niveau vun CDH17 positive Korrelatioun mat lymph Node Metastasen. Allerdéngs ass den Ausdrock Niveau reversely mat gastric Mauer Invasioun, entholl wäit Metastasen, an entholl TNM Etappen assoziéiert. Eis Observatioun war konsequent mat virdrun Medeziner Rapporten [20] - [22]. Dorënner CDH17 positiv Fäll, Schatzkummer kriibserreegend Stoffer staark staining vun CDH17 (32.1% als ukomm +, 25,2% als ukomm ++ an 42,8% als ukomm +++) wéi dat vun bascht normal Stoffer (62.5% als ukomm +, 21,3% als spillen ++ an 16,3% als ukomm +++). Iwwerdeems kee groussen Relatioun tëschent der stain spillen a Krankheete Etapp observéiert. Alles dat zesummen dofir, kann CDH17 engem diagnostic Bewaacher gin fir fréi Etapp gastric Kriibs an Chinese Populatiounen. VerfÜgung

RNAi-mediated CDH17 hummeren erof op GC Zell Linnen zougedréckt Ennerdréckung vun Zell Prolifératioun a Kolonie Opstellung kënschtlech VerfÜgung

Baséierend op de Resultater vun CDH17 Ausdrock Profil an engem Rot vu GC Zell Linnen (Lalumi 1A), AGS (héich CDH17), BGC-823 (ënneschten CDH17) an HGC-27 (keent CDH17) Zell goufe fir weider ausgewielt kënschtlech bewosst funktionell Foussgänger mat RNAi-mediated CDH17 silencing. Western blotting zougedréckt datt AGS Zellen héich CDH17 FAQ Niveau an Ausdrock vun CDH17 Équipe war Uewerschenkel bal ganz vum siCDH17. BGC823 Zellen haten niddereg CDH17 FAQ Niveau an HGC-27 hat kee CDH17 FAQ (Dorënner 2A). Am Verglach mat de Match Kontroll Zellen, Sax CDH17 hu wéineg Effet erof op d'proliferative Fähegkeet vun BGC823 an HGC27 Zellen, am Ufank nëmmen déi dramatesch Effekt op AGS (vun 60% op 72 h, Dorënner 2B). Mëllt Agar assay gewisen, datt d'Fähegkeet Kolonie ze Form war zu AGS Zellen inhibited wann CDH17 hummeren verwandelt (vun 66% op 14 d) war, mä am BGC823 Zellen an HGC27 Zellen, CDH17 Sax verwandelt hat wéineg Effet op der Kolonie Opstellung Fähegkeet (Dorënner 2C). Et war net ze iwwersinn, Ënnerscheed tëscht BGC823 Zellen (Niddereg CDH17 Niveau) an HGC-27cells (Net-CDH17) an d'inhibition vun Prolifératioun a Kolonie Opstellung entschlof vun siRNA CDH17 knockdown. VerfÜgung

gëllt Zell Linnen TR inducible knockdown vun Droen CDH17 zu AGS Zellen an overexpression vun CDH17 zu MGC-803 Zellen VerfÜgung

D'Zil Haaptrei am exon13 (90-2) iwwer 90% Reduktioun vun mRNA Niveau (Dorënner 3A) Kriseperiod. Da ginn mir pLenti4 /A /V5-miRNA-90-2 CDH17 lentivirus TR-AGS stabil Zellen a krut eng stabil Mierwaasser-reegelen Ausdrock shRNA vun CDH17 Gentherapie Zellen (TR-AGS-CDH17_KD) deen de CDH17 FAQ Niveau gouf reduzéiert ze transduce iwwer 90% an der mat 5 μg /ml Mierwaasser (Dorënner 3B) entschlof. D'pLenti6.3 /A /V5-CDH17-IRES-EGFP lentivirus benotzt gouf TR-MGC-803 stabil Zellen a ausgewielt mat blasticidin ze kréien e stabil Mierwaasser-reegelen Ausdrock CDH17 Gentherapie Zellen (TR-MGC-803-CDH17_Over) zu transduce . D'overexpression vun CDH17 an dëser stabil Zell war op d'FAQ Niveau vun Western blotting (Dorënner 4A) confirméiert. VerfÜgung

Knockdown vun CDH17 entschlof inhibition zu Zell Prolifératioun, Migratioun, Haftung, Kolonie Équipe an Aféierungs- zu Zell-Zyklus verhaft an apoptosis VerfÜgung

d'TR-AGS Zellen (Kontroll Zellen) an TR-AGS-CDH17_KD Zellen sech benotzt d'Potential bewosst funktionell Auswierkunge vun shRNA-mediated CDH17 knockdown zu AGS Zellen ze bewäerten. TR-AGS-CDH17_KD Zellen mat 5 μg /ml Mierwaasser behandelt enger Reduktioun vun Zell Prolifératioun zougedréckt (vun 75,8% op 5 Deeg), Zell Migratioun Fähegkeet (vun 68,1% op 16 h), Zell Haftung Fähegkeet (vun 46,8% op 30 Minutten ), a Kolonie Fähegkeet (vun 92,7% op 7 Deeg) am Verglach mat Mierwaasser gratis (d'Grondidee 3C administrativ). An Prolifératioun Rettungsplang studéieren, CDH17 knockdown vun TR-AGS-CDH17_KD Zellen duerch Mierwaasser entschlof kann andeems Mierwaasser gerett ginn. Mierwaasser op Daag 4, bass-Ausdrock vun CDH17 No Stoppen war op den Dag observéiert 8 an 10 vun der Kultur an CDH17 shRNA knockdown AGS Zellen. Re-Ausdrock vun CDH17 kéint d'Prolifératioun Fähegkeet vun TR-AGS-CDH17_KD Zellen (Dorënner 3D) retten. Am Verglach zu Mierwaasser gratis TR-AGS-CDH17_KD Zellen, Mierwaasser op Zellen hien eng bedeitend fräi Prozentsaz vun Zellen an G0 /G1 an G2 /M Phas an eng dramatesch verstuerwenen Prozentsaz vun Zellen am S Phase (Dorënner 3). An der Tëschenzäit, observéiert mir och, datt d'Zuel vun apoptotic Zellen (vun 52,2% op 5 Deeg) vun verwandelt-Regulatioun vun CDH17 vun TR-AGS-CDH17_KD Zellen (Dorënner 3F) fräi war. Nee groussen Ënnerscheed war zu TR-AGS stabil Zell Linn mat oder ouni Mierwaasser incubation. VerfÜgung

Overexpression vun CDH17 gefördert de Wuesstem vun entholl xenografts an Sauna Mais VerfÜgung

TR-MGC-803-CDH17_Over Zellen fonnt sech subcutaneously an de Säite vun BALB /c Sauna Mais bis Form staark entholl heijen. Den Ausdrock vun CDH17 war ënnert der Kontroll vum Mierwaasser an Drénkwaasser. Resultater weisen, datt no 35 Deeg kopéiert, group-Mierwaasser entschlof (entholl Volumen = 1849,08 ± 423.46m3) Schatzkummer engem 2.27-fantastesch méi Wuesstem Fortschrëtt Taux versus Mierwaasser-gratis Grupp (entholl Volumen = 814,04 ± 234.69m3) (p &Si besteet; 0,05) ( Figur 4B), an entschlof CDH17 Ausdrock vun entholl Stoffer kënne vun Western blotting (Figur 4C analyséiert ginn). Et uginn dass CDH17 eng wichteg Roll an der carcinogenesis vun gastric Kriibs spillt. Mir ginn och den TR-AGS-CDH17_KD Zellen ob ze observéieren silencing vun CDK17 an Sauna Mais d'tumorigenicity Afloss kann. Leider Entschlossenheet der Zesummenhang FAQ Niveauen no CDH17 knockdown vun Antibody flamenden Ofgrond assay br>

Laut dem tumorigenic Effekter (inhibition vun Zell Prolifératioun, Kolonie Opstellung, an entholl Wuesstem zu VIVO) an metastatic Effekter (inhibition vun Zell Wanderung an Haftung) vun CDH17 knockdown, wielt mir dräi antibody flamenden Ofgrond (aus R & d Systemer ) d'famill FAQ Ännerungen ze testen an ze hoffen mächtegst CDH17 reegelen Zesummenhang Proteinen ze fannen. An der apoptosis onerfëllt, phospho-p53 (S15, S46 an S392) an p21 /CIP1 /CDNK1A Ausdrock fräi iwwer zwee Weeër no 5 μg /ml Mierwaasser Behandlung fir 5 Deeg am Verglach zu onbehandelt Zellen (Dorënner 5A (en) an 5B). An der phospho-kinase onerfëllt, phospho-p53 (S15, S46 an S392) Ausdrock och no Mierwaasser Behandlung fräi an, an der selwechter Zäit, Ausdrock vun phospho-ERK1 /2 (T202 /Y204) ofgeholl (Dorënner 5A (b) an 5B). An der soluble receptor onerfëllt, knockdown vun CDH17 zu AGS Zellen konnt den Ausdrock vun integrin β1 däitlech erofgoen, β4, β5, iwwerdeems net de Wëllen vun EGFR (Dorënner 5A (c) an 5B) Impakt huet. Den Aménagement nennen vun interesséiert Proteinen tëscht Mierwaasser-wollt an Mierwaasser-gratis AGS Zellen sech am Dorënner 5B zesummegefaasst. VerfÜgung

Knockdown vun CDH17 zu AGS β-integrins an Ras /Raf /MEK /Erk sécher Passerelle VerfÜgung downregulated

D'FAQ Ännerunge vum antibody vill assay sech duerch Western blotting Analys confirméiert. D'Resultater uginn engem däitleche Minus vun integrin β1, β4, β5 an phospho-Erk zu CDH17 AGS Zellen knockdown, mee keng bedeitend Ännerung am Ganzen Erk (Dorënner 5C). Dunn bewäert mir d'Bedeelegung vun anere Ras /Raf /MEK /Erk sécher Passerelle Voleten. Knockdown vun CDH17 schéinen Ugrëff-Regulatioun vun de Raf, phospho-MEK, an phospho-Erk Proteinen (Dorënner 5C). Vun TR-MGC-803-CDH17_Over zu VIVO studéieren, observéiert mir de overexpression vun CDH17 der integrin β1 coopération, β4, β5 Ausdrock an Erk Aktivéierung (Dorënner 4C) an et ass konsequent mat uewendriwwer Conclusiounen. Ze ermëttelen, ob den Effet vun CDH17 op integrins oder Ras FAQ direkt Interaktioun ass oder net, eng Co-immunoprecipitation vun CDH17 mat integrin β1, integrin β4, integrin β5, integrin α2, an Ras war zu gastric Kriibs AGS Zellen gehaal, bzw.. Out vun Erwaardung, am Géigesaz zu Bartolomé d'Resultat [11], war et keen direkten association tëscht CDH17 an all eent vun dësen integrins oder Ras FAQ (Donnéeën net gewisen). VerfÜgung

Diskussioun VerfÜgung

Et ass eng grouss Erausfuerderung fir clinicians an elementar Wëssenschaftler de molekulare lues mat de Werdegang an hätt vun Zesummenhang Cancers verbonne ze bestëmmen. An Liewer an gastric Cancers, ass et ugeholl, datt déi héich Ausdrock vun CDH17 mat aarmséileg Iwwerliewe verbonne war, entholl Terrain, entholl Invasioun, Metastasen an fortgeschratt entholl Etapp [23] - [25]. Am Moment studéieren, dorënner 30 Brieder GC Zell Linnen, iwwer 66% vun eiser getest Zell Linnen (20/30) sinn CDH17 positiv, a bal d'Halschent vun dësen Zell Linnen hunn héich CDH17 Ausdrock. An eiser wirklech Diagnos Rapport, 73,6% Chinese GC kriibserreegend Stoffer (159/216) harbored positive CDH17 stain. An CDH17 positiv Fäll, huet den Ausdrock Niveau vun CDH17 positive Korrelatioun mat lymph Node Metastasen. Allerdéngs ass den Ausdrock Niveau reversely gastric Mauer Invasioun, entholl wäit Metastasen verbonnen, an entholl TNM Etappen. Eis Observatioun war konsequent mat virdrun Medeziner Rapporten [20] - [22]. Alles an allem dës dofir zesummen, kann CDH17 engem diagnostic Bewaacher gin fir fréi Etapp gastric Kriibs an Chinese Populatiounen. VerfÜgung

den Effet vun CDH17 zu gastric Kriibs tumorigensis an metastatic Potential, souwuel oligo siRNA an TR inducible pLentiviral vectors ze identifizéieren mat spezifesch miRNA (exton13) géint CDH17 sech fir hummeren-verwandelt CDH17 Ausdrock vun gastric Kriibs Zell Linnen benotzt. CDH17 silencing vun oligo siRNA konnt Zell Prolifératioun a Kolonie Équipe an GC Zell Linnen mat héije CDH17 Ausdrock inhibit. D'inhibitory Effekt war dramatesch op AGS déi eng méi héich CDH17 Ausdrock ass, mä net op BGC823 an HGC27 Zellen, déi ganz niddreg oder keen Ausdrock vun CDH17 FAQ hunn (Dorënner 2). Et uginn, datt d'CDH17 Ausdrock ze Kriibs Zell Prolifératioun a Kolonie Opstellung Fähegkeet an AGS Zellen droen kann. Ausserdeem, ähnlech Resultater goufen och am Mierwaasser-entschlof shRNA-mediated CDH17 knockdown zu AGS Zellen observéiert deen zu inhibition vun Zell Prolifératioun virgedroen, Migratioun, Haftung, Kolonie Équipe an Aféierungs- vun apoptosis an Zell Zyklus verhaft kënschtlech. Re-Ausdrock vun CDH17 kéint d'Prolifératioun Fähegkeet vun TR-AGS-CDH17_KD Zellen (Dorënner 3) retten. Zousätzlech, Mierwaasser iwwer-Ausdrock vun CDH17 vun TR-MGC803-CDH17_Over Zellen entschlof konnt de Wuesstem vun entholl xenografts zu VIVO (Dorënner 4) förderen. Alles dat zesummen dofir, kënne mer schléissen, datt et tëscht CDH17 Ausdrock an der tumorigenic an metastatic Fähegkeeten vun gastric carcinoma, an CDH17 kann als potentiell therapeutesch Zil fir Zukunft Recherche déngen. VerfÜgung

Obwuel verschidde virdrun e wesentleche Korrelatioun ass Studien an der Tatsaach dat CDH17 vun silencing kéint d'Zell Verbreedung zu GC Zellen, déi sécher Mechanismus vun CDH17 inhibit bleift onkloer. Et gouf Siicht datt CDH17 mediated oncogenic sécher an HCC mat Wnt sécher Passerelle Zesummenhang ass [5]. Mä, huet et puer Differenzen tëscht eis Resultater an d'vum Liu an HCC gemellt Resultater. Eis Resultater awer keng Verännerung phosphorylated Form vu Glucogène synthase kinase 3β (GSK-3β an der Erhalung vun β-catenin am helle der CDH17 silencing (Donnéeën net gewisen). Dës Ënnerscheeder vun de Benotze vu verschiddene Kriibs Zell Typ erkläert ginn a

• PLOS NËMMEN: MicroRNA 135a Hien Lymph Node Metastasen duerch Down-Veruerdnung vun ROCK1 zu Early Gastric Cancer
• PLOS NËMMEN: Séminairen Resultater fir Gastric Cancer folgenden Adjuvant Chemoradiation schreiwen Intensitéit Modulated versus Dräi-Dimensiounen Conformal Radiotherapy