PLOS NËMMEN: S100A6 Protein virun reguléieren CacyBP /SIP-Mediated Inhibition vun Gastric Cancer Zell Zouhuelen an Tumorigenesis

Wat VerfÜgung

Calcyclin-verbindlech FAQ (CacyBP /SIP), op der Basis vu senge Géigner identifizéiert zesummekomm mat S100 Proteinen an enger Kalzium-ofhängeg Manéier, war virdrun fonnt der Verbreedung an tumorigenesis vun gastric Kriibs Zellen an eiser Labo ze inhibit. Wichtegst, bleiwen d'Auswierkunge vun S100 Proteinen op der biologescher Behuele vun CacyBP /SIP zu gastric Kriibs onkloer. Ëmzestoussen, Rapport mir de Bau vun eukaryotic Ausdrock vectors fir Wildwest-Typ CacyBP /Schlupp an enger gekierzt Mann- d'S100 FAQ bindend public (CacyBP /SIPΔS100) subtil. Den Ausdrock vun der Wildwest-Typ an gekierzt recombinant Proteinen sech duerch transfection vun MKN45 gastric Kriibs Zellen bewisen. Co-immunoprecipitation assays bewisen Interaktioun tëscht S100A6 a Wëllschwäin-Typ CacyBP /SIP zu MKN45 Zellen. Entfernung vun der S100 FAQ bindend Domain reduzéiert Trainer d'Affinitéit vun CacyBP /SIP fir S100 Proteinen wéi déi reduzéiert Co-immunoprecipitation vun S100A6 vun CacyBP /SIPΔS100 uginn. D'MTT assay, FACS assay, goufen clonogenic assay an entholl xenograft Experimenter standing den Effet vun CacyBP /SIP op Zell Wuesstem an tumorigenesis kënschtlech VerfÜgung a zu VIVO VerfÜgung ze bewäerten. Overexpression vun CacyBP /SIP inhibited der Verbreedung an tumorigenesis vun MKN45 gastric Kriibs Zellen; der Verbreedung an tumorigenesis Tariffer goufen och weider duerch den Ausdrock vun CacyBP /SIPΔS100 reduzéiert. Mir weisen awer och, datt S100 Proteinen negatif CacyBP /SIP-mediated inhibition vun gastric Kriibs Zell Prolifératioun, duerch en Effekt op β-catenin FAQ Ausdrock an transcriptional Aktivatioun vun Tcf /LEF regléieren. Obwuel d'Basisdaten Mechanismus vun Aktioun weider Enquête verlaangt, déi dëser Etude nei Asiicht an der Interaktioun tëscht S100 Proteinen an CacyBP /SIP, déi eist Wëssen vun S100 Proteinen beräichert kéint a fir eist Versteesdemech vun der Entwécklung vun gastric Kriibs hëllefräich sinn. VerfÜgung

Fro: Ning X, Sonn S, Zhang K, Liang J, Chuai Y, Li Y, et al. (2012) S100A6 Protein reguléieren virun CacyBP /SIP-Mediated Inhibition vun Gastric Cancer Zell Zouhuelen an Tumorigenesis. PLoS NËMMEN 7 (1): e30185. Doi: 10.1371 /journal.pone.0030185 VerfÜgung

Redakter: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Italien VerfÜgung

Arnaque: 27 Oktober 2011; Akzeptéiert: 15. Dezember 2011; Publizéiert: 25. Januar 2012 zu

Copyright: © 2012 Ning et al. Dëst ass eng oppen-Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz BY Creative Commons verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt d'Original Auteur an d'Quell Kaiser sinn VerfÜgung

Funding:. Dës Etude war déi Subventioune vum National Natur Science Foundation of China (Nr 30872964, Nr 30772461) ënnerstëtzt. D'funders hu keng Roll am Etude Design, Daten Kollektioun an Analyse, Décisioun, oder Virbereedung vun der mëttelalterlech Handschrëft ze publizéieren VerfÜgung

Wettsträit Interessen:.. D'Auteuren hunn deklaréiert, datt keng Competitioun Interessen existéieren VerfÜgung

Aféierung VerfÜgung

S100 Proteinen sinn de gréisste Ënnergrupp bannen der EF-Hand Ca 2 + -binding FAQ Famill a ginn duerch hir cell- an Otemschwieregkeeten-spezifesch Ausdrock Musteren charakteriséiert. Dës Proteinen si bekannt fir intracellular Prozesser regléieren wéi d'Zell Zyklus Transitioun a bewosst Wuesstem, dat a motility [1]. Eng eenzeg Fonktioun vun dësen Proteinen ass dass eenzel Membere vun spezifesch bewosst compartments en der sinn aus deenen puer gebass sinn op Ca 2+ Aktivéierung [2], [3] ze delokaliséieren. Beim br, kann dës Proteinen der Ca 2+ Signal an enger séchert a raimlech Manéier transduce déi mat verschiddene S100 FAQ-spezifesch Ziler proposéiert. Spannen, sinn déi meescht S100 Genen vun enger Gentherapie Stärekoup op mënschlech chromosome 1q21, engem Site vun heefeg chromosomal abnormalities etabléiert [4]. Dësen Veräin huet proposéiert e Lien tëscht chromosomal abnormalities an der Dereguléierung vum S100 Gentherapie Ausdrock vun verschiddenen erhéijen. Bis Datum, hu vill Membere vum S100 Famill identifizéiert ginn mat entholl Entwécklung an Metastasen verbonne ginn [5], [6]. Allerdéngs sinn déi genee Rollen a Bedeitung vun S100 Proteinen vun der Entwécklung an Promotioun vu Kriibs ganz wéineg verstan. Versteesdemech vun der biologescher Funktioun (s) vun S100 Proteinen gëtt op der Identifikatioun vun S100 FAQ Ziler hänken. Bis elo un, méi méiglech FAQ Ziler, dorënner glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, annexin II, annexin VI, annexin XI, caldesmon an CacyBP /SIP, gewise goufen mat S100 Proteinen kënschtlech VerfÜgung zu engem zesummekomm Ca 2 + -dependent Manéier [5], [7]. VerfÜgung

Calcyclin-verbindlech FAQ (CacyBP /SIP), eng 30 kDa FAQ op der Basis vu senge Géigner identifizéiert mat S100A6 zu engem zesummekomm Ca 2 + -dependent Fassong Ehrlich ascites entholl (EAT) Zellen [8], déi virdrun als Multiple-Drogenofhängeger Resistenz (fir Premier) -related Protein geduecht war zu gastric Kriibs an eiser Labo [9]. Duerch d 'Benotzung vun enger monoclonal antibody géint CacyBP /SIP [10], hu mir dat overexpression vun CacyBP /SIP dës Distanz an der Verbreedung an tumorgenesis vun keen Auto Kriibs Zellen bremst [11]. Weider Etude huet virgeschloen, datt CacyBP /SIP de Wuesstem vun gastric Kriibs Hien [12]. Trotz dëser Fortschrëtt, bleiwen d'Auswierkunge vun S100 Proteinen op CacyBP /SIP zu gastric Kriibs onkloer. Zousätzlech, via bindend Siah1 an Skp1 gin e Bestanddeel vun enger ubiquitination komplex fonnt [13] CacyBP /SIP war och. An dëser ligase war beschriwwen ofgeschnidden vun Net-phosphorylated β-catenin [13] ze regléieren. VerfÜgung

CacyBP /SIP konnt festleeën S100, Siah1 an Skp1 duerch verschidde Regiounen. D'N-Uschloss Regioun (AA 1-80) vun CacyBP /SIP gouf fir Siah1 ze hunn Affinitéit gewisen. D'C-Uschloss Regioun vun CacyBP /SIP (aa178-229) ass bekannt engem α-Wendel ze Form; dësem Beräich kann mat S100 Proteinen, dorënner S100A6 [14] zesummekomm. Skp1 bindend Domain iwwerlageren net mat der S100 bindend Regioun an Skp1 Photo'en zu der Mëtt Deel (aa78-155) vun CacyBP /SIP [15], [16]. Fir d'Auswierkunge vum S100 Proteinen op der biologescher Behuele vun CacyBP /SIP zu gastric Kriibs fest, eukaryotic Ausdrock vectors fir Wildwest-Typ CacyBP /Schlupp an hir gekierzt Mann- d'S100 FAQ bindend public (CacyBP /SIPΔS100) suivéiert goufen erfollegräich gebaut a wierksam ausgedréckt zu MKN45 Zellen. An MTT assay, FACS assay, Experimenter clonogenic assay an entholl xenograft sech standing d'Auswierkunge vun CacyBP /SIP op Zell Wuesstem ze diskutéieren an tumorigenesis souwuel kënschtlech VerfÜgung a zu VIVO VerfÜgung. D'Resultater vun deene Studien kann de Opkläerungsaarbecht vun de Folge vun S100 Proteinen op der biologescher Behuele vun CacyBP /SIP zu gastric Kriibs Zellen droen. VerfÜgung

spontan a Methode VerfÜgung

Zell Linnen an Déieren

d'MKN45 gastric Kriibs Zell Linn, déi den ënneschten Ausdrock vun CacyBP /SIP ze gin an eiser leschter Etude [12], war an eiser Labo agekacht fonnt gouf. D'Zellen sech am RPMI 1640 mëttelfristeg (GIBCO, Grand Island, NY, USA) ergänzt mat 10% Hëtzt-inactivated An et Kallef serum, penicillin (100 U /ml), an streptomycin (100 μg /ml) an engem CO _{2 incubator (Forma Scientic, Marjetta, Oh, USA). BALB /c Sauna Mais bei 4-6 Wochen vun Alter sech duerch d'Shanghai Cancer Institut fir d' gëtt zu VIVO VerfÜgung tumorigenesis studéieren. Dës Etude gouf am strikte Aklang mat de Recommandatioune vun der Guide fir d'Fleeg an Uwendung vun schafft Déieren vun der National Instituter Gesondheetsminister gesuergt. De Protokoll ass duerch de Comité op d'Ethik vun Déieren Experimenter vun der véierter Military Medical University (: 11016 hänkt Number) abruecht. All Agrëff war ënner Natrium pentobarbital Anästhesie gemaach, an huet all Effort gemaach Leed ze minimiséieren. VerfÜgung}

Immunofluorescence staining VerfÜgung

D'Zellen sech op gebotzt coverslips plated a fir 20 min am Sall mat 95% Alkohol fixen Temperatur. D'Zellen op der coverslips sech mat PBS gewäsch a fir 10 min mat 0,5% Triton X-100 vun PBS permeablized. D'Zellen sech mat Anti-S100A6 antibody (verdënntem 1:2000) incubated no mat 3% Bovine serum albumin fir 1 h erauszesichen. D'Zellen sech dann mat FITC-conjugated anti-Maus IgG (Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, USA) incubated an Descher op Glas drënner mat enger Mëschung vun glycerol an polyvinyl Alkohol mat DABCO (1,4- diazobicylo- [2,2 , 2,] - octane). Immunofluorescence war mat engem MRC-1024 Laser Scannen Confocal Imaging System (Bio-Rad) analyséiert. VerfÜgung

Plasmid Bau an Zell transfection VerfÜgung

Oligonucleotide primers wouvun der Eco VerfÜgung RI oder Eco VerfÜgung Site RV Restriktioun sech Wierderbuch, respektiv, fir amplification vun der Disken Haaptrei vun CacyBP /SIP oder engem C-Uschloss Läschen (aa178-229) Mann- vun CacyBP /SIP (Zougank AF_314752). Déi zwee primers goufen: 5 'gggaattcgaatatggcttcagaagagcta 3' (Senn) an 5 "gcgatatctcaaaattccgtgtctcctttg 3 '(anti-Sënn); 5 'gggaattcgaatatggcttcagaagagcta 3' (Senn) an 5 "ccgatatcacacaatataagaactgta 3 '(anti-Sënn), bzw.. D'Hinnen alleguer ware: 5 min bei 94 ° fir initial denaturation, gefollegt vun 35 Zykle vun 45 sec op 94 °, 45 sec op 60 °, an 60 sec op 72 °, mat engem Finale Ausdehnung vun 10 min bei 72 °. De Virsaz vun der Hinnen alleguer Produiten waren 687 BP fir CDen, an 534 BP fir C-Uschloss Läschen. All Hinnen alleguer Produit mat war excised EcoR VerfÜgung ech an EcoR VerfÜgung V Restriktioun unzereegen an gekloonten an och verdaut pFLAG-CMV. Déi nei vectors sech pFLAG-CacyBP (Wildwest-Typ) an pFLAG-ΔS100 (CacyBP /SIPΔS100) benannt. D'Neiegkeet Message sech duerch DNA sequencing confirméiert. VerfÜgung

Zell transfection war mat Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Karlsbad CA) standing wéi déi vun den Hiersteller beschriwwen. Kuerz, goufen Zellen ouni Antibiotiken ze 70-90% Niewebaach plated an ugebaut. Si huet sech duerno mat 1 μg pFLAG-CacyBP oder pFLAG-ΔS100 transfected. Um 24 h der transfection, G418 (350 mg /ml) war fir d'Kultur Medien fir d'Auswiel vun transfected Zellen notéiert. Gemëscht clones sech fir eng zousätzlech 6 Wochen erweidert. Zellen transfected mat eidelen Vecteure, pFLAG-CMV, goufen als negativ Kontroll benotzt. Dës stabil Zell Strecken genannt MKN45-CacyBP, MKN45-ΔS100 an MKN45-pFLAG fir d'Wëld-Typ, gekierzt an negativ Kontroll transfectants, bzw.. VerfÜgung

Co-immunoprecipitation VerfÜgung

D'MKN45 transfectants sech gewäsch an PBS, gesammelt an an enger gefiermt mat 20 mm Tris-HCl (pH 7.5), 8 mm MgCl _{2, 150 mm NaCl, 0,2 mm EGTA, an 1% Nonidet P-40 op Äis lysed. D'dovu ware bei 12.000 Ziichter fir 25 min bei 37 ° an engem microcentrifuge centrifuged. D'supernatants sech fir eng immunoprecipitation assay no der Aféierung vun protease inhibitors (10 mg /L leupeptin, 5 mg /L aprotinin, 20 mg /L soybean trypsin inhibitor, 1 mm phenylmethylsulfonyl fluoride) a laachen vun der Bradford Method benotzt. D'supernatants sech mat 30 μl FAQ A /G-Sepharose an 1 μg stinn antibody fir 1-3 h bei 37 ° (Précoce-Minnen) incubated. D'unbound ufale sech dann mat serum wouvun antibodies géint CacyBP /SIP fir 1,5 h bei 4 ° incubated. Déi Mëschung ass dann mat zousätzleche FAQ A /G-Sepharose Nuecht op 4 ° incubated. D'resin war dann gewäsch dräi Mol zu engem gefiermt 20 mm Tris- HCl (pH 7.5) an 150 mm NaCl wouvun, zweemol zu enger gefiermt mat 20 mm Tris-HCl (pH 7.5) an 500 mm NaCl, an endlech zu 20 mm Tris -HCl um pH 7.5. All vun der Baudeeler datt benotzt huet sech mat protease inhibitors ergänzt. D'resin a gebonnen Proteinen sech zu enger SDS Prouf gefiermt solubilized, fir 5 min gekachten bei 98 °, a fir eng SDS polyacrylamide gelies applizéiert. Den Ausdrock vun S100A6 analyséieren duerch westlech blotting mat antibody géint S100A6. VerfÜgung}

Western blot VerfÜgung

d'Zellen sech op Äis an enger gefiermt wouvun gesammelt an lysed [50 mmol /L Tris-Cl (pH 7.5), 150 mmol /L NaCl, 0,2 mmol /L héich, 1 mmol /L PMSF an 1% NP 40], an duerno vun der Bradford Method laachen. Eng Mesure vun 100 μg vun lysates war zu 10% SDS-PAGE an blotted op engem nitrocellulose Membran electrophoresed. D'Schläimhait sech mat 10% Fett-Mëllech gratis bei Raumtemperatur Iwwernuechtung fir 2 h an incubated mat anti-CacyBP (1:1500) an Anti-β-actin antibody (Fläch, 1:5000) bei 4 ° gespaart. No dräi Mëtten fir 15 min all an TBS mat 0,1% Tween 20 (TBST) ergänzt, war d'Membran mat peroxidase-conjugated Geess anti-Maus /Kanéngchen IgG antibody (Amersham-Pharmacia Biotech, Peking, China) fir 2 h am Sall incubated Temperatur. Verstäerkte chemiluminescence (Amersham, Freiburg, Däitschland) war fir erkennen benotzt. VerfÜgung

Duerch thiazolyl tetrazolium (MTT) assay VerfÜgung

BTS sech rakommen op engem 96-gutt Plack op 2,5 × 10 3 Zellen /gutt an RPMI 1640 Medien 10% Hëtzt-inactivated an et Kallef serum mat. All Prouf haten dräi gefaart. Déi mëttel- war fir 6 Deeg um 2-Dag gebotzt, ersat. D'Zellen sech mat 50 μl vun 0,2% MTT fir 4 h bei 37 ° an engem 5% CO _{2 Atmosphär incubated. No MTT incubation, eng 150 μl aliquot vun 100% DMSO war fir all Kultur notéiert de Kristaller ze verbidden. Liewensfäeg Zellen sech all Dag vun Liesen der absorbance bei 490 nm mat engem 96-Plack Lieser, BP800 (Dynex Technologies, Chantilly, VA). VerfÜgung}

Zell Zyklus Analyse VerfÜgung

Subconfluent Zellen gezielt goufen Katakombe mat Äis-kal PBS, vun 0,5 ml Ethanol Sursis an huet dunn um 4 ° C fir 30 min. D'Spär gouf duerch e 50-μm Nylon ech Filter, an der DNA Inhalt vun Kierchefënster Käre war mat engem Flux cytometer (Epe XL, Coulter, Miami, FL) analyséieren. D'Zell Zyklus Profil war Multicycle-DNA Zell Cycle analyséiert Software analyséiert benotzt. D'proliferative bestinn (PI) sech wéi follegt zesummen:. PI = (G2 + S) /(G1 + S + G2) VerfÜgung

Clonogenic assay VerfÜgung

d'Prolifératioun Tarif vun enger eenzeger Zell ze moossen kënschtlech VerfÜgung, zappen clonogenic a mëll Agar clonogenic assays sech standing [17]. clonogenic assay fir d'Plack, 1 × 10 3 Zellen sech rakommen an enger 9-cm Plat an cultured zu RPMI 1640 mëttelfristeg fir zwou Wochen fir Kolonie Équipe ze erlaben. D'Kolonien sech zu 70% Ethanol fix, Kierchefënster mat Giemsa Léisung an gezielt. Fir d'mëll Agar clonogenic assay, goufen d'Zellen ugebauten an 0.3% agarose mat engem 0,5% agarose als (1 × 10 3 /och zu engem 24-Meter zappen) plated. D'Zuel vun Foci > 100 μm war no 20 Deeg gezielt VerfÜgung

entholl Wuesstem an Sauna Mais VerfÜgung

Logarithmically wuessen Zellen (1 × 10 7 Zellen) huet an 0,1 trypsinized, resuspended. ml d'Hanks Léisung, an an den Hals hypodermia vun all athymic Sauna Maus heijen. De Mais sech dann fir entholl Volumen, Punkto Gesondheet iwwerwaacht, an total Kierpergewiicht. D'Gréisst vun der Mass subcutaneous entholl war fir fënnef Wochen vun caliper gemooss. Entholl Volumen ass no der Formel berechent: 0,5 × Längt × Breed 2. All experimentell Grupp aus fënnef Mais. VerfÜgung

Reporter Gentherapie assay VerfÜgung

Fir d'Wierkung vun CacyBP /Schlupp an CacyBP /SIPΔS100 op der transcriptional Aktivitéit vun Tcf /LEF assay, de Rapporteur Gentherapie assay Leeschtung war ëmschriwwen [18]. Kuerz, sech mat Co-transfected vun Zellen engem 24-gutt Plack (50.000 Zellen pro gutt) oder ouni pFLAG-CMV, pFLAG-CacyBP, pFLAG-ΔS100 an de Rapporteur plasmid, pTOPFLASH, mat Wëld-Typ Tcf /LEF bindend Siten wou Lipofectamine 2000; Praxis-TkLanguage Renilla VerfÜgung luciferase reporter als Kontrollorgan fir transfection Effizienz. D'luciferase Aktivitéit war an engem luminometer mat der Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Southampton, U.K.) gemooss an quantitated. Experiment an triplicate an widderholl zweemol gesuergt. Resultater sinn wéi d'heeschen vum Verhältnis tëscht der Liichtkäfer luciferase Aktivitéit an der renilla luciferase Aktivitéit ausgedréckt. VerfÜgung

statistique Analyse VerfÜgung

All Donnéeën analyséiert goufen mat der SPSS statistesch Software Package (SPSS Galaxy, Chicago, Illinois), an P VerfÜgung &Si besteet; 0,05 war statistesch relevant considéréiert. D'Bedeitung vun der Differenz vun Frequenz vun CacyBP /SIP-positiv staining tëscht bascht entholl Echantillonen an erhéijen d'Chi-Feld Test analyséiert. Student d' t VerfÜgung Test an eent-Manéier Analyse vun Varianz vun DUNNETT d'Pluralitéit Verglach Tester gefollegt waren fir Analyse vun anere Donnéeën agestallt. VerfÜgung

Resultater VerfÜgung

Endogenous Ausdrock vun S100A6 zu gastric Kriibs Zell Linn MKN45 VerfÜgung

S100A6 war wéi e Modell ausgewielt den Effet vun S100 Proteinen op der biologescher Funktioun vun CacyBP /SIP ze observéieren. D'endogenous Ausdrock vun S100A6 zu MKN45 gastric Kriibs Zell Linn war éischt duerch westlech blot an immunofluorescence staining fonnt. Als zu Lalumi gewisen. 1A, S100A6 war zu MKN45 Zellen ausgedréckt. Immunofluorescence staining beweist dass S100A6 haaptsächlech an der Nuklearenergie Membran verdeelt war mat ganz wéineg an d'nuklear Plasma vun der MKN45 Zellen fonnt (Figebam. 1B). VerfÜgung

Zesummespill vun S100A6 an CacyBP /SIP zu gastric Kriibs Zellen MKN45

an enger viregter Rapport, CacyBP /SIP, déi op engem relativ niddregen Niveau vun MKN45 Zellen, war vun e puer verschidden Zorte vun gastric Kriibs Zell Linnen [12] dicht ausgedréckt ausgedréckt huet. Fir d'Interaktioun tëscht S100A6 an CacyBP /SIP, Wildwest-Typ an Mann- (aa178-229) CacyBP /SIP cDNAs sech gekloonten an der pFLAG-CMV Vecteure an stably transfected an MKN45 Zellen ze diskutéieren. Mir évaluéieren den Ausdrock vun CacyBP /SIP an dës stabil Zell Linnen vum südwestlechen blot. Als zu Lalumi gewisen. 2A, FÄNDEL-afp CacyBP /SIP nogewise gouf am Wildwest-Typ an Mann- CacyBP /SIP transfectants mat anti-Fändel antibody, iwwerdeems kee Signal vun Zellen fonnt gouf mat eidelen Vecteure transfected. VerfÜgung

D'Interaktioun tëscht S100A6 an CacyBP /SIP zu transfectant MKN45 Zellen war duerno vun de Ko-immunoprecipitation bewäert. No incubation mat anti-CacyBP antibody, goufen immunoprecipitate vun S100A6 antibody fonnt. Als zu Lalumi gewisen. 2B, en Zesummespill tëschent S100A6 a Wëllschwäin-Typ CacyBP /SIP zu MKN45-CacyBP Zell lysates observéiert gouf; Ee, Mann- CacyBP /SIP datt aus der aa178-229 Regioun gekierzt gouf, produzéiert klenge Signal an d'Co-immunoprecipitation assay. Dofir, war d'gekierzt Mann- CacyBP /SIP CacyBP /SIPΔS100 genannt a stellt eng nëtzlech Hëllefsprogramm fir Enquête vun de Folge vun S100A6 op der biologescher Behuele vun CacyBP /SIP zu gastric Kriibs Zellen. VerfÜgung

Effects vun S100A6 op Zell Prolifératioun entschlof vun CacyBP /SIP vun der Linn gastric Kriibs Zell MKN45 kënschtlech

MTT an FACS assays gesuergt huet d'Auswierkunge vun S100A6 op Zell Prolifératioun vun CacyBP /SIP zu MKN45 Zellen entschlof ënnersicht kënschtlech VerfÜgung. Am Verglach mat den eidelen Vecteure transfectants, MKN45-pFLAG, souwuel Wildwest-Typ an CacyBP /SIPΔS100 transfectants zougedréckt vill rofgaang Tariffer vun Zell Zouhuelen vun der MTT assay ( P VerfÜgung &Si besteet; 0,05) (. Lalumi 3A). CacyBP /SIPΔS100 transfectants Schatzkummer awer, eng bedeitend méi ofgeholl Taux am Verglach mat Wëld-Typ CacyBP /SIP transfectants ( P VerfÜgung &Si besteet; 0,05). VerfÜgung

D'Resultater vun der Zell Zyklus Analyse vun FACS ähnlech weg datt vun overexpression entweder wëll oder Mann- CacyBP /SIP verklengert MKN45 Prolifératioun. Allerdéngs war d'Moyenne proliferative wand (PI) vun MKN45-ΔS100 Zellen (0.19 ± 0,03) méi déif wéi déi vun MKN45-CacyBP Zellen (0,29 ± 0.02) ( P VerfÜgung &Si besteet; 0,05) (. Lalumi 3B) . Geholl zesummen, weg dës Donnéeën staark dass Wëllschwäin-Typ CacyBP /SIP d'Prolifératioun vu MKN45 Zellen bremst, iwwerdeems CacyBP /SIPΔS100 dëser inhibition vun Prolifératioun intensifies. VerfÜgung

Effects vun S100A6 op tumorigenesis entschlof vun CacyBP /SIP an der MKN45 gastric Kriibs Zell Linn kënschtlech VerfÜgung a zu VIVO

Anchorage-onofhängeg Wuesstem ass eng wichteg Charakteristik vun kënschtlech VerfÜgung entholl Wuesstem. Dofir, iwwerpréift mir ob upregulation vun CacyBP /SIP Ausdrock zu Medien a mëll Agar MKN45 Zell Wuesstem inhibited. Als zu Lalumi gewisen. 4A a B, CacyBP /SIP Ausdrock e schéinen markéiert Reduktioun vun MKN45 Zell Wuesstem zu enger Kolonie Opstellung assay, mat enger Moyenne Reduktioun vun 32,1% op mëttel- a 62,0% vun mëll Agar ( P VerfÜgung &Si besteet; 0,05) . Allerdéngs, transfection vun CacyBP /SIPΔS100 schéinen en och méi erofgoen zu Wuesstem mat engem duerchschnëttlech Ofsenkung Tariffer vun 84,2% op mëttel- a 82,8% vun mëll Agar ( P VerfÜgung &Si besteet; 0.01). VerfÜgung

dat Effekt ze confirméieren zu VIVO VerfÜgung, mir MKN45-CacyBP, MKN45-ΔS100 an MKN45-pFLAG Zellen an un der Nuque hypodermia vun Sauna Mais subcutaneously heijen. No dräi Wochen, gouf d'Moyenne Volumen entholl vun all Grupp aus, datt vun der anerer vill anescht. Um 5 September Woch, de Schnëtt Volumen entholl an der MKN45-pFLAG Grupp war 776,9 ± 90,9 mm 3, déi wéi déi vun der MKN45-CacyBP Grupp vill méi ass (578.9 ± 51,2 mm 3 () P VerfÜgung &Si besteet; 0,05), an och méi wéi déi vun der MKN45-ΔS100 Grupp (364.9 ± 71,9 mm 3) ( P VerfÜgung &Si besteet; 0,05) (Figebam. 4C). VerfÜgung

Effects vun S100A6 op CayBP /SIP-mediated β -catenin ofgeschnidden VerfÜgung

Wéi eng Komponent vun ubiquitin ligase komplex, CacyBP /SIP an ofgeschnidden vun unphosphorylated β -catenin via Équipe ass Skp1 an Siah1 obligatoresch. Also Ausdrock vun β -catenin war den Afloss vun S100 op Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 unbiquitin ligase zu indirekt diskutéieren fonnt. Eischtens, zougedréckt Co-immunoprecipitation assay datt gekierzt Mann- CacyBP /SIP kruet souwuel Skp1 an Siah1 (Figebam. 5A), proposéiert S100A6 net d'Équipe vun Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 unbiquitin ligase komplex Afloss huet. Zweetens, ass β- catenin FAQ zu MKN45-ΔS100 Zellen vill rofgaang ass, am Verglach zu MKN45-CacyBP Zellen, iwwerdeems mat kee Changement an der mRNA Priedegt (Figebam. 5B). Zousätzlech, well β-catenin als cofactor fir d'Aktivatioun vun der Transkriptiouns Faktor, Tcf /LEF néideg ass, sech mir d'Effete vun CayBP /SIPΔS100 op Tcf /LEF Aktivitéit flüchteg transfection reporter Gentherapie assays benotzt. Ausdrock vun CacyBP /SIPΔS100 schéinen ënneschten Tcf /LEF Aktivitéit wéi Wildwest-Typ CacyBP /SIP (Figebam. 5C). MG132, konnt inhibitor vun proteasome, den Effet vun deenen zwou Wildwest-Typ CacyBP /Schlupp an CacyBP /SIPΔS100 op Tcf /LEF Aktivitéit eliminéiert. Geholl zesummen, opgrond mir dass S100A6 CayBP /SIP mediated β -catenin ofgeschnidden Afloss kéint mat CayBP /SIP via proposéiert. VerfÜgung

Diskussioun VerfÜgung

S100 Famill Proteinen hunn wéinst hire Ënnerscheed Ausdrock verdengten Interessi entholl Stoffer an hir Bedeelegung am Kriibs Werdegang an Metastasen [19] - [22]. S100 Proteinen sech mat e puer Zil- Proteinen am Kalzium-ofhängeg oder Kalzium-onofhängeg Art a weider gesetzlech Funktioun vun dësen Ziler [5], [23]. CacyBP /SIP ass e neien Zil- FAQ datt mat S100 Proteinen, dorënner S100A6, S100A1, S100B, an S100P, mä net zu S100A4, calbindin D, parvalbumin oder calmodulin so kann [8], [16]. Virdrun Wierker an eiser Labo zougedréckt datt overexpression vun CacyBP /SIP kéint d'Verbreedung an tumorigenesis vun gastric Kriibs a keen Auto Zell carcinoma [11], [12] inhibit. Trotz dëser Fortschrëtt, bleiwen d'Auswierkunge vun S100 Proteinen op CacyBP /SIP propagéieren gin. VerfÜgung

Fir d'Regulatioun vun S100 Proteinen op CacyBP /SIP Funktioun entschlësselen, gebaut mir de gekierzt CacyBP /SIP Mann- ouni S100 FAQ bindend Domän , sou datt Mann- FAQ konnt net S100 Proteinen zesummekomm an datt ëmmer mat Siah1 an Skp1 zesummekomm. An dëser Etude, goufen eukaryotic Ausdrock vectors fir Wildwest-Typ CacyBP /Schlupp an hir gekierzt Mann- effektiv zu MKN45 Zellen ausgedréckt. Co-immunoprecipitation bewisen eng Interaktioun tëscht S100A6 a Wëllschwäin-Typ CacyBP /SIP zu MKN45 Zellen. Allerdéngs, CacyBP /SIPΔS100 onverännert Signal vun de Ko-immunoprecipitation assay, eng schwaach oder nee dÉxistenz S100A6 ugëtt. MTT assay, FACS assay, Experimenter clonogenic assay an entholl xenograft an Sauna Mais sech standing den Effet vun Wëllschwäin an Mann- CacyBP /SIP op Zell Wuesstem ze testen an tumorigenesis souwuel kënschtlech VerfÜgung a kënschtlech
. Dës Experimenter weisen datt overexpression vun CacyBP /SIP kéint d'Verbreedung an tumorigenesis vun MKN45 gastric Kriibs Zellen inhibit. Wichtegst, mat CacyBP /SIPΔS100 transfected Zellen Schatzkummer méi intensiv Effekter relativ zu Wildwest-Typ transfectants suggeréiert datt S100 Proteinen kéint negativ d'inhibition vun Zell Prolifératioun vun CacyBP /SIP zu gastric Kriibs Zellen. VerfÜgung

D'Mechanismus entschlof regléieren ugestallten vun S100A6 CacyBP /SIP Funktioun leien kéint zu FAQ Molekülle an Fonctionnalitéiten well. CacyBP /SIP ass identifizéiert an ubiquitination an ofgeschnidden vun β-catenin Équipe ze ginn [24] - [28]. β- catenin fonnt gouf zu proliferating Zellen an zu vill erhéijen [29] overexpressed oder aktivéiert ze ginn - [31]. Péckt et al. [32] fonnt dass CacyBP /SIP Knockout Zellen leider weisen (-catenin ofgeschnidden an engem futtisse G1 Zell Zyklus Bomm, wat beweist, datt de β-catenin ofgeschnidden Passerelle mediated vun CacyBP /SIP eng essentiel Bomm Werdegang fir thymocyte Entwécklung an Zell Zyklus definéiert. Eis virdrun Studie weisen och, datt CacyBP /SIP Wuesstem an Prolifératioun vu gastric Kriibs Zellen bremst deelweis via ofgeschnidden vun β -catenin. Ob S100 CacyBP /SIP-mediated ubiquitin ligase Bunnbeweegung onbekannt reguléieren. aktueller dofir gewisen, datt e puer Memberen vun der S100 FAQ Famill regléieren kéint der Aktivatioun vun hirem Ziel Proteinen [33], [34]. a kuerzem entdeckt Happ homolog vun CacyBP /SIP, Sgt1, net nëmme mat S100 Proteinen am Kalzium reegelen-Art openee, mä Associéeën och mat Skp1 Skp1 /cullin1 /F ze Form -.. Këscht ubiquitin ligase komplex [35] Et fonnt gouf, datt S100A6 der phosphorylation vun Sgt1 vun casein kinase inhibit konnt II d'Aktivitéit ze beaflossen [36] an eis heiteg Experimenter, mir och identifizéiert datt CacyBP /SIPΔS100 Fähegkeet behale mat ze associéieren Skp1 an Siah1, S100 Protein suggeréiert Afloss kéint net Équipe vun Siah1 /Skp1 /CacyBP ubiquitin ligase komplex. Trotzdem, ass β-catenin FAQ ouni eng Ännerung vun der mRNA Niveau vun CacyBP /SIPΔS100 transfected Zellen Ofstand manner wéi Wildwest-Typ transfectant Zellen. D'transcriptional Aktivitéit vun Tcf /LEF, eng Zilscheif Gentherapie vun β-catenin, war verzweifelt Mann- CacyBP /SIP ofgeholl ouni S100 bindend, am Verglach zu wëll CacyBP /SIP. Accoding fir dësen Resultater, ka mir dat S100 FAQ kéint d'Aktivitéit vun Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 ubiquitin ligase vun dÉxistenz CacyBP /SIP negatif regléieren. Also erauszesichen der Kombinatioun vun S100 an CacyBP /SIP konnt β -catenin ofgeschnidden förderen, Resultat vun der Verbreedung vum Kriibs Zellen inhibiting. Dëst Spekulatiounen kënnen deelweis duerch Lee et al ënnerstëtzt ginn, déi am Zellen mat manner Niveau vun S100A6 de Montant vun β -catenin ass reduzéiert [26]. D'Resultater ginn am Accord mat Daten déi weider-Regulatioun vun S100 Proteinen an erhéijen ofgeschnidden vun β -catenin zu entholl an proliferating Zellen iwwert [37]. Ausserdeem war CacyBP /SIP dës mat tubulin an ERK1 /2 a spillen eng wichteg Roll am rearrangements vun der cytoskeleton, Zell dat oder hiren [38] zesummekomm -. [42] VerfÜgung

Konklusiounen VerfÜgung

S100A6 FAQ reguléieren negatif CacyBP /SIP-mediated inhibition vun Prolifératioun gastric Kriibs Zell, deelweis duerch Effekt op β-catenin ofgeschnidden an transcriptional Aktivatioun vun Tcf /LEF. Allerdéngs, verlaangen d'Basisdaten Mechanismen fir Regulatioun vun S100A6 op FAQ ubiquitination an aner Funktiounen via CacyBP /SIP-ofhängeg Passerelle weider Enquête. VerfÜgung

• PLOS NËMMEN: Activating Transkriptioun Factor 4 jidferengem eng Multidrug Resistance Phenotype zu Gastric Cancer BTS duerch Transactivation vun SIRT1 Expression
• PLOS NËMMEN: schiefgang an enger Haplotype zu Heparanase Gene Associatiounen mat der zerstéiert an hätt vun Gastric Cancer an enger Northern Chinese Population