Eng Erhéijung vun integrin-Hausnummeren kinase Net-canonically jidferengem NF-κB-mediated Wuesstem Virdeeler ze gastric Kriibs Zellen vun ERK1 /2

eng Erhéijung vun integrin-Hausnummeren kinase activating Net-canonically jidferengem NF-κB-mediated Wuesstem Virdeeler ze gastric Kriibs Zellen vun activating ERK1 /2 VerfÜgung méiglech VerfÜgung Background VerfÜgung Geklomm Aktivitéit oder Ausdrock vun integrin-Hausnummeren kinase (ganzer Regioun), déi Zell Haftung reguléieren, Migratioun, an Prolifératioun, féiert zu oncogenesis. Mir identifizéiert de molekulare Basis fir d'Regelung vun der ganzer Regioun an seng alternativ Roll an Laureaten ERK1 /2 /NF-κB-mediated Wuesstem Virdeeler ze gastric Kriibs Zellen. VerfÜgung Resultater VerfÜgung Inhibiting ganzer Regioun mat kuerzen hairpin RNS oder T315, engem putative ganzer Regioun inhibitor, ofgeschaf de Wuesstem an d'mënschlech gastric Kriibs Zellen AGS NF-κB-mediated, SNU-1, MKN45, an GES-1. Ganzer Regioun stimuléiert Ras Aktivitéit der c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /ribosomal S6 kinase /inhibitor vun κBα /NF-κB sécher ze aktivéieren vun der Opstellung vun den IQ Motif-haltege GTPase-activating FAQ 1 (IQGAP1) Saachen - Ras komplex. Forcéiert enzymatic ganzer Regioun Ausdrock gefördert Zell Wuesstem vun ERK1 Saachen /2 /NF-κB sécher. PI3K Aktivéierung oder ofgeholl PTEN Ausdrock länger ERK1 /2 Aktivatioun vun ganzer Regioun aus proteasome-mediated ofgeschnidden schützen. C-Kappgare vun Hëtzt Schock cognate 70 proposéiert FAQ, eng HSP90-verbonne E3 ubiquitin ligase, mediated ganzer Regioun ubiquitination zu Kontroll PI3K- an HSP90-reegelen ganzer Regioun Stabiliséierung a sécher. Zousätzlech zu Zell Wuesstem, gefördert der identifizéiert Passerelle Zell Migratioun a reduzéiert der Empfindlechkeet vun gastric Kriibs Zellen zu der anticancer Agenten 5-fluorouracil an cisplatin. Ausserdeem, exogenous Administratioun vun EGF souwéi overexpression vun EGFR ausgeléist ILK- an IQGAP1-reegelen ERK1 /2 /NF-κB Aktivéierung Zell Wuesstem, a Migratioun. VerfÜgung Conclusioun Eng Erhéijung vun der ganzer Regioun VerfÜgung Net-canonically ERK1 ënnerstëtzt /2 /NF-κB Aktivéierung a féiert zu dem Wuesstem vun gastric Kriibs Zellen. VerfÜgung Schlësselwieder VerfÜgung ganzer Regioun Zell Wuesstem IQGAP1 ERK1 /2 NK-κB Background VerfÜgung Integrin-Hausnummeren kinase (ganzer Regioun), eng 59-kDa serine /threonine kinase, openee direkt mat der cytoplasmic Domän vun β1 integrin [1]. Ganzer Regioun wéinstens dräi Beräicher: N-Uschloss ankyrin (ANK) Widerhuelung, eng zentral pleckstrin homology (PH) -like Domän, an engem C-Uschloss kinase public [2], [3]. Integrin-mediated Zell-extracellular Matrixentgasung (ECM) Haftung oder Wuesstem Faktoren aktivéieren phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) Membran-gebonnen PI 4,5-bisphosphate (PIP2) a produzéiert PI 3,4,5-Adenosintriphosphat (PIP3) zu phosphorylate, déi zu der PH-wëll Domän vun ganzer Regioun Photo'en a activéiert ganzer Regioun [4], [5]. Der ganzer Regioun Aktivéierung, kann d'C-Uschloss kinase Domän vun ganzer Regioun zu verschiddenen Proteinen festleeën, dorënner AKT, affixin, β-Parvin, Glucogène synthase kinase (GSK) -3β, calponin homology-haltege ganzer Regioun-verbindlech FAQ, de 20-kDa reglementaresche Liicht Ketten vun myosin (LC20), de myosin-gezielt subunit vun myosin Liicht Kette phosphatase (MYPT1), paxillin, α-NAC, an d'FAQ phosphatase inhibitors PHI-1, KEPI, an CPI-17 [2], [3] , [6], [7]. D'N-Uschloss ANK Widerhuelung Mediate der Interaktioun vun ganzer Regioun mat ILKAP, e Protein phosphatase 2C Familljemember, an pëtzen, eng LIM Domain-nëmmen adapter FAQ. Ganzer Regioun kann engem PIP3-proposéiert FAQ afgerappt vun PI3K considéréiert ginn; Auswierkunge vun phosphatase an tensin homolog op chromosome 10 (PTEN) [8], [9] geläscht gespaart. PTEN Hien erhéijen vun dephosphorylating PIP3 [10], [11] VerfÜgung ganzer Regioun spillt eng wichteg Roll verschidde bewosst Prozesser an Regulatioun, dorënner Prolifératioun, Survival, Migratioun, Zell Zyklus Werdegang, an angiogenesis. fräi Aktivitéit oder Ausdrock vu ganzer Regioun féiert zu oncogenesis [2], [3]. Nieft modulating sengem Partner Proteinen fir bewosst Prozesser, ass ganzer Regioun Hypothes an eng intracellular Signal transduction Reseau Équipe ze ginn. Mechanistically, phosphorylates ganzer Regioun direkt AKT op Ser473 an GSK-3β op Ser9 [4], [9] β-catenin br zu Mediate an AP-1 Ausdrock fir entholl Zell Prolifératioun [12] regléieren. NF-κB Aktivéierung ass wiesentlech fir ganzer Regioun-mediated oncogenic Prozesser, wéi Anti-apoptotic Aktivitéit [13], Survival Promotioun [14], epithelial-mesenchymal Transitioun [15], bewosst Extensioun a Resistenz zu apoptosis [16], angiogenesis [17 ], a Migratioun, Invasioun, an Metastasen [18] - [20]. Ausserdeem, ass NF-κB Aktivéierung fir kanonesche Regulatioun vun IKKα an IKKß vun der ganzer Regioun /AKT Passerelle néideg. Fir Zell Migratioun Iwwerleeung, kann ganzer Regioun aktivéieren de klenge GTPases RAC an CDC42 [21]. Ausserdeem, reguléieren ganzer Regioun ERK1 /2 Aktivatioun vun myogenic dat [22]. Fräi Meenungsäusserung vun microRNA-143 an microRNA-145, déi ganzer Regioun Zil, bremst AKT an ERK1 /2 Weeër [23]. Allerdéngs, d'molekulare Mechanismus Basisdaten ganzer Regioun-mediated ERK1 /2 Aktivéierung bleift onbekannt. D'Stimulatioun vun Zellen vum Wuesstem Facteuren an cytokines wéi och bewosst dÉxistenz ECM Erhéijung ganzer Regioun Aktivitéit VerfÜgung [24]. Zousätzlech zu de molekulare Regulatioun vun PI3K /PTEN vun ganzer Regioun, Aoyagi et al. identifizéiert ganzer Regioun als eng nei Hëtzt Schock FAQ (HSP) 90 Client FAQ a fonnt, datt pharmacologically inhibiting HSP90 zu engem proteasome-ofhängeg Fassong ganzer Regioun ofgeschnidden schéinen [25]. Ausserdeem, bewierkt der HSP90-verbonne E3 ubiquitin ligase C-Kappgare vun Hëtzt Schock cognate 70 proposéiert FAQ (wëssen) ganzer Regioun ofgeschnidden [26]. Hashiramoto et al. bewisen, datt HSP90 ganzer Regioun stabiliséiert an nohalteg AKT an ERK1 /2 Aktivéierung [16]. Sou, spekuléieren mir eng Relatioun tëscht ganzer Regioun Stabilitéit an der Aktivatioun vun hirer afgerappt kinases. Ras /MAPK Passerelle sécher ass wiesentlech fir tumorigenesis [27]. gastric Kriips Erop ganzer Regioun Ausdrock ass Zesummenhang ze héich-Schouljoer [28], Aarbecht Kriibs [29], an Net-kleng Zell haett Kriibs [30], obwuel Zellen an dësen Cancers Toast Ras kennen Hafe [31] - [33]. Ganzer Regioun gezielt mat siRNA Verloschter gastric Kriibs Zell Invasioun, Prolifératioun, a Wuesstum duerch eng onbekannt Mechanismus [34]. Betreffend d'Méiglechkeet, datt ganzer Regioun Offloss vun NF-κB Akte vum Regulatioun IKKα [13], déi zu gastric tumorigenesis agebonne ginn huet [35], ass ganzer Regioun spekuléieren Zell Wuesstem duerch eng NF-κB-reegelen Passerelle ze aktivéieren. Benotzt gastric Kriibs Zellen (AGS, MKN45, an SNU-1), studéiert mir de molekulare Regulatioun vun ganzer Regioun an identifizéiert engem Net-kanonesche Passerelle vun der ganzer Regioun-reegelen ERK1 /2 Aktivéierung fir NF-κB-mediated gastric Kriibs Zell Wuesstem, Migratioun, an Iwwerliewe Promotioun. VerfÜgung Resultater VerfÜgung ganzer Regioun Aktivitéit an Ausdrock sinn wichteg fir NF-κB-mediated Zell Wuesstem VerfÜgung Geklomm Aktivitéit oder Ausdrock vu ganzer Regioun verbessert tumorigenesis vun Zell Wuesstem förderen [6]. RNAi-baséiert ganzer Regioun silencing attenuates gastric Kriibs Zell Wuesstem [34] hierkommen ganzer Regioun overexpression zu gastric tumorigenesis Zesummenhang ass [28]. Am Mënsch gastric erhéijen an AGS-ofgeleet noverfollegt zu BALB /c Mais, Ki-67-positiv Zellen coexpressed ganzer Regioun als bewisen duerch d'fluorescence-baséiert immunostaining (Dorënner 1A) an AEC-baséiert immunostaining (Zousätzleche Fichier 1 proliferating: Allgemeng Material a Methoden; Weider Fichier 2: Dorënner S1) Experimenter. Ze ermëttelen sech d'méiglech Mechanismen Basisdaten ganzer Regioun-mediated gastric Kriibs Zell Wuesstem, e puer gastric epithelial Zell Linnen charakteriséiert laut hire verschiddenen Zell Wuesstem Tariffer, déi fir d'AGS an SNU-1 Zellen héich waren a manner fir d'MKN45 an GES-1 Zellen , an an dëser Etude (: Dorënner S2A Weider Fichier 3) benotzt. Am Verglach mat de MKN45 Zellen, d'AGS an SNU-1 Zellen haten och nik ganzer Regioun Ausdrock (Zousätzleche Fichier 3: Dorënner S2B an S2C). A lentiviral-baséiert shRNA war benotzt ganzer Regioun fir Hammers VerfÜgung genetesch an der AGS, SNU-1, MKN45, an GES-1 gastric epithelial Zellen (Dorënner 1B, ieweschte Rot) wéi och am A549 a H1975 Mënsch haett adenocarcinoma Zellen, HK-2 Mënsch keen Auto proximal Bléien epithelial Zellen, an THP-1 Mënsch monocytic Zellen (Zousätzleche Fichier 3: Dorënner S2D). An dësen Zellen, ganzer Regioun silencing vill (P VerfÜgung &Si besteet; 0,05) ofgeholl Zell Wuesstem (Dorënner 1B; Weider Fichier 3: Dorënner S2E). Ausserdeem, Zellen mat der ganzer Regioun inhibitor T315 [36] vill (P VerfÜgung &Si besteet; 0,05) bestéet an Portioun-dependently gutt Zell Wuesstem (Dorënner 1c) ouni cytotoxicity (Donnéeën net gewisen). Ausserdeem, ofgeholl Kolonie Équipe an ganzer Regioun-entsat AGS Zellen observéiert gouf (Zousätzleche Fichier 3: Dorënner S2F). Sou, Gentherapie silencing (Zousätzleche Fichier 3: Dorënner S2G) an pharmacological Methoden (Zousätzleche Fichier 3: Dorënner S2H) ze ganzer Regioun Aktivitéit oder overexpression Nerve Zell Zyklus verhaft um G 1 Phase oofgesinn. Dës Resultater weisen engem Wuesstem-Spur Roll vun der ganzer Regioun. Figur 1 ganzer Regioun Ausdrock ass néideg fir Zell Wuesstem an NF-κB Aktivéierung. (A) Vertriederin fluorescence-baséiert immunohistochemical staining weist de coexpression vun der ganzer Regioun (gréng VerfÜgung) an Ki-67 (rout VerfÜgung) zu Mënsch gastric erhéijen an AGS-ofgeleet noverfollegt zu BALB /c Mais. DAPI (blo VerfÜgung) war fir nuklear counterstaining benotzt. Ganzer Regioun + Ki-67 + Zellen am immunofluorescently Kierchefënster Otemschwieregkeeten Rubriken sinn als Punkt-Diagramm vun engem FACS-wëll Analyse presentéiert vum TissueQuest Software benotzen. D'Zellen sech den Prozentsaz an der Zell Zuel vun den Total Zellen (DAPI + Zellen) pro Terrain berechent. (B) Western blot vum ganzer Regioun Ausdrock vun Zellen mat shRNAs transfected gezielt ganzer Regioun (shILK VerfÜgung) oder eng Kontroll luciferase (shLuc VerfÜgung). β-actin war wéi eng intern Kontroll benotzt. WST-8-baséiert assay weist d'inhibition vun Zell Wuesstem zu ganzer Regioun-entsat Zellen. (C) D'Portioun-ofhängeg Effet vun der ganzer Regioun inhibitor T315 op d'inhibition vun AGS Zell Wuesstem. (D) Vertriederin fluorescence-baséiert immunohistochemical staining weist de coexpression vun der ganzer Regioun (gréng VerfÜgung) an phosphorylated NF-κB Ser536 (rout VerfÜgung) zu Mënsch gastric erhéijen an AGS-ofgeleet noverfollegt zu Mais. DAPI (blo VerfÜgung) war fir nuklear counterstaining benotzt. De Punkt-Diagrammer weisen coexpression vun der ganzer Regioun an NF-κB Ser536. (E) Logistic Réckgang Analyse weisen eng Korrelatioun tëscht ganzer Regioun, phosphorylated NF-κB Ser536, an Ki-67 an 93 gastric Kriibs uplanzen getest. R-wäissfeldreg (R VerfÜgung 2 VerfÜgung) a P VerfÜgung Wäerter sinn gewisen. (F) EMSA Musiktherapie- NF-κB Aktivéierung. (G) Luciferase reporter assay weist den Aktivéierungscode Verhältnis vun NF-κB Renilla luciferase vun Zellen mat der NF-κB inhibitor Cape (25 μg /ml) behandelt ze kontrolléieren. (H) Wuesstem vun 25 μg /ML Cape-behandelt AGS Zellen. (Ech) NF-κB Aktivatioun vun shLuc- oder shILK-transfected Zellen. (J) NF-κB Aktivéierung no 6 h vu T315 Behandlung an AGS Zellen. Fir Zell Wuesstem, Kolonie Opstellung, an luciferase Aktivitéit, sinn Donnéeën mengen ± Fils vum dräi onofhängeg Experimenter. * P VerfÜgung &Si besteet; 0,05, ** P VerfÜgung &Si besteet; 0,01, an *** P VerfÜgung &Si besteet; 0,001 Verglach mat Day 0 oder Bekannten Kontroll. #P VerfÜgung &Si besteet; 0,05, ## P VerfÜgung &Si besteet; 0,01, an ### P VerfÜgung &Si besteet;. 0,001 Verglach mat shLuc VerfÜgung Fir d'Fonctioune vun ganzer Regioun-reegelen Zell Wuesstem Markenzeeche, NF- κB sécher iwwerpréift war well ganzer Regioun Offloss vun NF-κB Akt kann IKKα [13] andeem Regulatioun. Vun immunostaining, war d'coexpression vun der ganzer Regioun an phosphorylated NF-κB (Ser536) zu Mënsch a Maus gastric Stoffer (Dorënner 1D) observéiert, an hir coexpression vill (P VerfÜgung &Si besteet; 0.01) a positiv mat der Zuel vun proliferating Zellen soll , déi vum 55. AAA-positiv Fäll vun den insgesamt 93 gastric Kriibs uplanzen (;: Dorënner S3 Weider Fichier 4 Dorënner 1E) uginn gëtt. Immunostaining fir NF-κB nuklear br (Zousätzleche Fichier 3: Dorënner S2I) de konstitutiven Aktivatioun vun NF-κB an der AGS Zellen awer net zu der MKN45 Zellen, EMSA (Dorënner 1F), an Promoteur assays (Dorënner 1G) confirméiert. Bestéet Zellen mat der NF-κB inhibitor Cape vill (P VerfÜgung &Si besteet; 0.001) reduzéiert NF-κB Aktivéierung (Dorënner 1G) an Zell Wuesstem (Dorënner 1H). Entweder ganzer Regioun silencing (Dorënner 1I; Weider Fichier 3: Dorënner S2J) oder T315 Behandlung (Dorënner 1J) bedeitend (P VerfÜgung &Si besteet; 0,05) opgehalen NF-κB Aktivitéit. Dës Resultater bewisen, dass ganzer Regioun fir Zell Wuesstem an der Zell Linnen getest onverzichtbar ass, well bechter NF-κB Aktivatioun vun gastric Cancers. VerfÜgung ganzer Regioun reguléieren Ras Aktivitéit vun de komplexe vun IQGAP1-Ras Saachen MAPK-ageschalt NF-κB zu Kontroll
Well AGS Zellen PIK3CA VerfÜgung an KRAS VerfÜgung kennen Hafe [37], iwwerpréift mir méiglech reglementaresche Auswierkunge vun ganzer Regioun op der modulation vun NF-κB Aktivitéit vun dësen 2 kinases [38]. Mat Hëllef vun engem Mënsch Phospho-MAPK Singular Kit, identifizéiert mir 10 kinases datt sech méi héich an de AGS Zellen ausgedréckt wéi am MKN45 Zellen. Dës kinases meeschtens gesonge gouf vun der PI3K an MAPK sécher Weeër (Zousätzleche Fichier 5: Dorënner S4A). Vum südwestlechen blotting, bestätegt mir eng fräi phosphorylation vun AKT, ERK1 /2, an IκBα vun IκBα ofgeschnidden an der AGS Zellen (Dorënner 2A) begleet. D'pharmacological inhibition vun c-Raf, MEK1 /2, an PI3K vill (P VerfÜgung &Si besteet; 0,05) reduzéiert Zell Wuesstem (Dorënner 2B), IκBα phosphorylation (Ser32) an ofgeschnidden (Dorënner 2C), an NF-κB Aktivitéit ( Figur 2D), wat beweist, datt souwuel PI3K- an Ras-activating sécher Weeër NF-κB Aktivéierung vereinfacht. D'Auswierkunge vun ganzer Regioun muss mat Zell growth- an NF-κB-verbonne AKT [4], [9] well vu sengem Interaktioune dicht studéiert ginn. Verwonnerlech, huet ganzer Regioun silencing net AKT Afloss an GSK-3β phosphorylation an der AGS an SNU-1 Zellen mä Ofstand reduzéiert c-Raf a ERK1 /2 Aktivatioun vun all getest Zellen (Dorënner 2E; Weider Fichier 5: Dorënner S4B). Ouni AKT aktivéiert, mir eng Alternativ Passerelle fir activating NF-κB duerch e Mechanismus sensibiliséieren MAPK /p90RSK /IκBα sécher [38] bewäert. D'knockdown vun der ganzer Regioun VerfÜgung Uschlossgoal Multiple phosphorylation vun RSK (Thr573, Thr359 /Ser363, an Ser380) an IκBα phosphorylation (Ser32) a fräi IκBα Heefung (Dorënner 2E). Inhibiting MEK1 /2 ähnlechen Effekter (Zousätzleche Fichier 5: Dorënner S4C) ëmmer an eng Zell Zyklus verhaft um G 1 Phase (Zousätzleche Fichier 5: Dorënner S4D). A Ras banal-verwandelt assay Teamchef inhibiting ganzer Regioun Ras aktivéiert ëmmer d'Stabilitéit vun der Ras FAQ (Dorënner 2F) ouni Auswierkungen. Dës Conclusiounen bewisen e Potential Net-kanonesche Passerelle fir ganzer Regioun NF-κB bis well vun Ras /c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /IκBα sécher Regulatioun. Figur 2 ganzer Regioun-IQGAP1-Ras komplex Friem Ras Aktivitéit c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /RSK /IκBα /NF-κB sécher ze aktivéieren. (A) Western blot vum uginn Proteinen am AGS an MKN45 Zellen. β-actin war wéi eng intern Kontroll benotzt. AGS Zellen behandelt mat c-Raf inhibitor GW5074, MEK1 /2 inhibitors U0126 oder PD98059, oder PI3K inhibitor LY294002 fir 48 h waren fir hire Wuesstem (B) évaluéiert, phosphorylation vun IκBα um Ser32 (pIκBα VerfÜgung) a Ganzen FAQ (C ), an NF-κB Aktivéierung (d). (E) An shLuc- oder shILK-transfected Zellen, show westlech blots den Ausdrock vun der uginn Proteinen. β-actin war wéi eng intern Kontroll benotzt. (F) Ras Aktivéierung assay weist Ras Aktivitéit an FAQ Ausdrock vun shLuc- an shILK-transfected AGS Zellen. (G) Vertriederin fluorescence-baséiert immunohistochemical staining der coexpression vun der ganzer Regioun (gréng VerfÜgung) weist an phosphorylated ERK1 /2 Tyr202 /Thr204 (rout VerfÜgung) zu Mënsch gastric erhéijen an AGS-ofgeleet noverfollegt zu BALB /c Mais. DAPI (blo VerfÜgung) war fir nuklear counterstaining benotzt. De Punkt-Diagrammer weisen coexpression vun der uginn Proteinen. An Kontroll an IQGAP1-siRNA transfected AGS Zellen um 48 h, den Ausdrock vun der uginn Proteinen (H), NF-κB Aktivéierung, an Zell Wuesstem (ech) huet dës Distanz. Protein lysates aus onbehandelt AGS Zellen Quecksëlwer (J) oder mat shLuc an shILK transfection (L, M) waren immunoprecipitated (IP VerfÜgung) mat Kontroll IgG (C. IgG VerfÜgung) oder mat antibodies géint ganzer Regioun, IQGAP1, an Ras . Immunoblots (normal schwätzen VerfÜgung) weisen d'Expressioun vun ganzer Regioun, IQGAP1, an Ras. (K) Vertriederin fluorescence-baséiert immunohistochemical staining der coexpression vun der ganzer Regioun (gréng VerfÜgung) weist, IQGAP1 (rout VerfÜgung), an Ras (rout VerfÜgung) zu AGS Zellen. DAPI (blo VerfÜgung) war fir nuklear counterstaining benotzt. Fir Prolifératioun an luciferase Aktivitéit, sinn Donnéeën mengen ± Fils vum dräi onofhängeg Experimenter. ** P VerfÜgung &Si besteet; 0,01 a *** P VerfÜgung &Si besteet; 0,001 Verglach mat Kontroll. Éierlechkeet Dräieck, fräi Meenungsäusserung; Inverted Dräieck, ofgeholl Ausdrock ganzer Regioun VerfÜgung kann ERK1 /2 Aktivéierung ënner Zell Wuesstem an dat [22] änneren. Ee, huet de molekulare Regelung am Kader Ras sécher net dokumentéiert ginn [2], [3]. D'coexpression vun der ganzer Regioun an phosphorylated ERK1 /2 (Tyr202 /Thr204) war am mënschleche gastric erhéijen an AGS-ofgeleet noverfollegt zu BALB /c Mais (Dorënner 2G) bewisen. Ganzer Regioun openee mat IQGAP1 [7], e Ras GTPase-activating-wëll FAQ dass him aus GAP ass, déi Ras fir seng Aarbechtslosegkeet Staat transforméiert. Well IQGAP1 Ras /MAPK sécher Kontrollen, et ass oncogenic [39], [40]. Den Ausdrock vun IQGAP Famill Proteinen war dropp am AGS an MKN45 Zellen, och an der ganzer Regioun silencing (Zousätzleche Fichier 5: Dorënner S4E). Allerdéngs, silencing oncogenic IQGAP1, mä net IQGAP3, (Zousätzleche Fichier 5: Dorënner S4F-S4H) wierksam inhibited c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /RSK sécher (Dorënner 2H), NF-κB Aktivitéit, a Zell Wuesstem ( Figur 2I). Vun engem coimmunoprecipitation assay leeschtungsfäeg, hien huet mir eng potentiell komplex ausser ganzer Regioun, IQGAP1, an Ras (Dorënner 2J). Immunostaining confirméiert datt ganzer Regioun um Niveau ähnlechen coexpressed war zu deene vun IQGAP1 an Ras (Dorënner 2K; Weider Fichier 6: D'Grondidee S5). Gëlt, erofgaangen silencing ganzer Regioun de IQGAP1-Ras komplex (Dorënner 2L an 2M). Dës Resultater bewisen, dass ganzer Regioun der Opstellung vun der IQGAP1-Ras komplex vereinfacht Ras Aktivitéit ze stützen. VerfÜgung Enzymatic ganzer Regioun modulates der Opstellung vun der IQGAP1-Ras komplex a ERK1 /2-mediated Zell Wuesstem VerfÜgung Eis bruet huet dass pharmacologically inhibiting ganzer Regioun ofgeholl Zell Wuesstem, beweist den essentiel Roll vun der enzymatic Aktivitéit vun ganzer Regioun. Weider ganzer Regioun vun der genetesch Approche inhibiting erofgaangen-IQGAP1 mediated sécher Ras. Ganzer Regioun Aktivitéit Inhibiting pharmacologically mat T315 (Dorënner 3A) oder genetesch vun transfecting der enzymatic Mann- ganzer Regioun A262V [41] (Dorënner 3B) erofgaangen och d'Équipe vun der IQGAP1-Ras komplex an der AGS Zellen. Dräi gekierzt Regioune vun ganzer Regioun (Dorënner 3C) waren an der MKN45 Zellen overexpressed d'Domain essentiel fir Gank der IQGAP1-Ras komplex z'identifizéieren. Coimmunoprecipitation assays bewisen, dass overexpressed ganzer Regioun gesond ausser PH an Katalysator kinase Domain Regiounen immunoprecipitated mat IQGAP1 an Ras (Dorënner 3D). Dofir, nëmmen kinase Domain-haltege ganzer Regioun ageschalt ERK1 /2 (Dorënner 3). Am Verglach mat der voller-Längt ganzer Regioun (ganzer Regioun 1-452), transfecting der kinase-dout Mann- ganzer Regioun A262V hutt aktivéieren net ERK1 /2 (Dorënner 3F). Weider Experimenter bewisen, datt nëmmen kinase Domain-haltege ganzer Regioun fräi MEK1 /2-reegelen NF-κB Aktivéierung (Dorënner 3G) gefollegt vun MEK1 /2- an NF-κB-reegelen Zell Wuesstem (Dorënner 3H) an der MKN45 Zellen. Dës Resultater weisen, datt enzymatic ganzer Regioun der Opstellung vun der IQGAP1-Ras komplex mediated ERK1 ausléisen /2- an NF-κB-mediated Zell Wuesstem. Figur 3 KENNT ganzer Regioun Ausdrock maaachen Zell Wuesstem vun Pinguin ERK1 /2 /NF-κB Aktivéierung. Protein lysates aus AGS Zellen behandelt mat T315 (A) ofgebaut oder transfected mat Myc-DDK-afp Mann- ILKA262V (B) waren immunoprecipitated (IP VerfÜgung) mat antibodies géint ganzer Regioun. Immunoblots (normal schwätzen VerfÜgung) weisen d'Expressioun vun ganzer Regioun, IQGAP1, an Ras. Plasmids baséiert op pcDNA3.1-Fändel-ganzer Regioun mat voller-Längt ganzer Regioun (ganzer Regioun VerfÜgung 1 VerfÜgung -452 VerfÜgung), ofgesprengt 171-452 (ganzer Regioun VerfÜgung 171 VerfÜgung -452 VerfÜgung) , ofgesprengt 1-170 (ganzer Regioun VerfÜgung 1 VerfÜgung -170 VerfÜgung) (C), oder Myc-DDK-afp waren Mann- ILKA262V an MKN45 Zellen transfected. (D) Coimmunoprecipitation vun Fändel mat de uginn Proteinen ass andems westlech blotting gewisen. Verglach mat pcDNA3.1-Fändel (Fändel VerfÜgung) nëmmen, show westlech blots den Ausdrock vun phosphorylated ERK1 /2 op Tyr202 /Thr204 (pERK1 VerfÜgung /2 VerfÜgung) (E, F). β-actin war wéi eng intern Kontroll benotzt. NF-κB Aktivéierung (G) an Zell Wuesstem (H) goufen och am Unterrecht oder Präsenz vun PD98059 a Cape fonnt. Date sinn mengen ± Fils vum dräi onofhängeg Experimenter. ** P VerfÜgung &Si besteet; 0,01 Verglach mat Kontroll. ## P VerfÜgung &Si besteet; 0,01 Verglach mat ILK1-452. Éierlechkeet Dräieck, fräi Meenungsäusserung. VerfÜgung PI3K Aktivéierung a rofgaang PTEN Ausdrock ERK1 /2 /NF-κB Aktivéierung vereinfacht duerch ganzer Regioun stabilizing VerfÜgung Well ganzer Regioun ofhängeg op PI3K-mediated PIP3 Generatioun fir seng Aktivéierung ass [4], Wuesstem factor- an integrin-mediated PI3K Aktivéierung oder engem PI3K stattfannen an der AGS Zellen [37] Mindanao Ausdrock an Aktivéierung ze ganzer Regioun. Am Verglach mat de Wuesstem vun der MKN45 Zellen, war de Wuesstem vun der AGS Zellen onberéiert vun nik IL-6 Niveauen [42], an den Ausdrock vun β1 an β3 integrins net geklommen (Zousätzleche Fichier 7: Dorënner S6). Mir bestätegt weider dass PIP3 Generatioun war héich an de PI3K-mutated AGS Zellen (Dorënner 4A). Fir der Relatioun tëscht der PI3K, ganzer Regioun, an Ras sécher Weeër entdecken, déi AGS Zellen mat der MEK1 /2 behandelt goufen, PI3K, ganzer Regioun, oder Ras inhibitor fir verschidden durations. Um 6 Auer an der Behandlung, T315 gehumpelt MEK1 /2 an ERK1 /2 phosphorylation (: Dorënner S7 Weider Fichier 8) inhibited. Um 24 h der Behandlung, PI3K inhibition erofgaangen ganzer Regioun Ausdrock, déi vun MEK1 /2 /ERK1 /2 aktivéiert 24 h der Behandlung (Dorënner 4B) duerno war. Allerdéngs huet Ras inhibition net AKT oder ganzer Regioun an der AGS Zellen opginn, obwuel Ras kann PI3K Aktivéierung [27] Mediate. Ähnlech zu der ganzer Regioun-entsat AGS Zellen, souwuel MKN45 an LY294002-stimuléiert AGS Zellen zougedréckt reduzéiert Ras Aktivitéit (Dorënner 4C). Der Iwwersetzung inhibitor cycloheximide vereinfacht LY294002-entschlof ganzer Regioun downregulation (Dorënner 4D) an der proteasome inhibitor MG132 réckgängeg téléchargéiert Effekt an ERK1 /2 inactivation (Dorënner 4E). D'entholl suppressor phosphatase PTEN reguléieren negatif PI3K /PDK1 /AKT sécher [10], [11] an ganzer Regioun Aktivitéit [8], [9], an der AGS Zellen e niddereg Ausdrock vun PTEN (Dorënner 2A) Schatzkummer [43]. D'gezwongen Ausdrock vun PTEN am AGS Zellen net attenuated nëmmen de konstitutiven phosphorylation vun PDK1, AKT, an PAK1 mä och Ausdrock inhibited ganzer Regioun, ERK1 /2 phosphorylation (Dorënner 4F), an NF-κB Aktivéierung (Dorënner 4G). Dës Resultater uginn dass PI3K Aktivéierung a rofgaang PTEN Ausdrock ganzer Regioun stabiliséieren zu ERK1 /2 /NF-κB Aktivéierung regléieren. Figur 4 PI3K Aktivéierung a rofgaang PTEN Ausdrock ERK1 /2 /NF-κB Aktivéierung duerch ganzer Regioun Stabiliséierung vereinfachen. (A) A PIP3 Mass Elisa Kit war benotzt PI3K Aktivitéit ze bestëmmen vun der Quantitéit vun PIP3 ofgebaut aus onbehandelt AGS an MKN45 Zellen an aus AGS Zellen Moossen fir 24 h mat LY294002 behandelt. (B) AGS Zellen sech mat PD98059, LY294002, T315 behandelt, oder Ras inhibitor FTI-277 fir de uginn Mol. Western blots weisen d'Expressioun vun der uginn Proteinen. β-actin war wéi eng intern Kontroll benotzt. (C) Ras Aktivitéit war an AGS, MKN45, an LY294002-behandelt AGS Zellen no 24 h fonnt. Western blots weisen d'Expressioun vun der uginn Proteinen am AGS Zellen mat der Iwwersetzung inhibitor cycloheximide (CHX VerfÜgung) pretreated (D) oder proteasome inhibitor MG132 (E) fir 0,5 h an da fir 24 h mat LY294002 behandelt. PTEN war zu AGS Zellen overexpressed andems pcDNA3.1-GFP-PTEN (PTEN VerfÜgung). Western blots weisen d'Expressioun vun der uginn Proteinen Verglach mat pcDNA3.1-GFP (Vecteure VerfÜgung) transfection (F), an NF-κB Aktivéierung (G) war och alles. Fir kinase an luciferase Aktivitéit, sinn Donnéeën mengen ± Fils vum dräi onofhängeg Experimenter. * P VerfÜgung &Si besteet; 0,05, ** P VerfÜgung &Si besteet; 0,01, an *** P VerfÜgung &Si besteet; 0,001 Verglach mat Kontroll. Éierlechkeet Dräieck, fräi Meenungsäusserung; Inverted Dräieck, ofgeholl Ausdrock. VerfÜgung HSP90-verbonne wëssen E3 ligase negatif ganzer Regioun Stabiliséierung Kontrollen, ERK1 /2 /NF-κB Aktivéierung, an Zell Wuesstem VerfÜgung Vun weider de Mechanismus Basisdaten ganzer Regioun Déstabiliséierung dër, eis Resultater weisen, datt AKT inhibition rauszesichen ganzer Regioun Stabilitéit hierkommen PI3K inhibition betraff ganzer Regioun Stabilitéit (Zousätzleche Fichier 9: Dorënner S8) betreffen. HSP90 war nächst propagéieren well et ganzer Regioun ofgeschnidden verursaache kann [25]. Ähnlech zu de Resultater vun PI3K inhibition, shRNA-baséiert (Dorënner 5A) oder pharmacological inhibition vun HSP90 (Zousätzleche Fichier 10: D'Grondidee S9A) Verspéidung net nëmmen PDK1 /AKT phosphorylation awer och c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 Aktivéierung der ganzer Regioun ofgeschnidden. Ausserdeem, genetesch oder pharmacologically HSP90 vun Behandlung mat 17-AAG oder der HDAC inhibitor Saha, déi HSP90 an eng acetylated, enzymatically Aarbechtslosegkeet Staat drun hënnert, attenuated NF-κB Aktivitéit inhibiting (Dorënner 5B; Weider Fichier 10: D'Grondidee S9B) an Zell Wuesstem ( Figur 5C). Cotreatment mat MG132 gerett d'Auswierkunge vun 17-AAG (Dorënner 5D) an Saha op ganzer Regioun ofgeschnidden an ERK1 /2 inactivation (Zousätzleche Fichier 10: D'Grondidee S9C). An der MKN45 Zellen, Behandlung mat MG132 fräi ganzer Regioun Ausdrock, MEK1 /2 an ERK1 /2 phosphorylation (Zousätzleche Fichier 11: D'Grondidee S10), an NF-κB Aktivéierung (Donnéeën net gewisen). Coimmunoprecipitation der Opstellung vun der HSP90-ganzer Regioun komplex bewisen (Daten dës net). Mat Hëllef vun engem lentiviral-baséiert shRNA Approche (Dorënner 5E), HSP90-verbonne E3 ligases, dorënner Chip Cullin 4A, an Cullin 4B [26], [44], [45], huet sech fir hir Rollen am ganzer Regioun ofgeschnidden iwwerpréift. D'Resultater weisen, datt nëmme wëssen gerett silencing ganzer Regioun ofgeschnidden an ERK1 /2 inactivation (Dorënner 5F), NF-κB aktivéiert (Dorënner 5G), an Zell Wuesstem inhibition (Dorënner 5H) no der pharmacological inhibition vun PI3K an HSP90. Wëssen war fir ganzer Regioun ubiquitination an der LY294002-behandelt AGS Zellen (Dorënner 5I) néideg. Dës Resultater bewisen, dass HSP90 /wëssen wéi sécher PI3K-mediated ganzer Regioun Stabiliséierung an ganzer Regioun-reegelen ERK1 /2 /NF-κB Aktivéierung an domat maaachen Zell Wuesstem reguléieren. Figur 5 wëssen bestëmmt ganzer Regioun Déstabiliséierung, ERK1 /2 /NF-κB inactivation, an Zell Wuesstem inhibition der PI3K /HSP90 inactivation. AGS Zellen sech mat shLuc oder shHSP90 transfected oder pretreated mat der HSP90 inhibitor 17-AAG (0,1 μM) fir 48 h. Western blots weisen d'Expressioun vun der uginn Proteinen (A), an NF-κB Aktivéierung (B) an Zell Wuesstem (C) goufen och alles. (D) MG132 pretreatment (0,5 h) réckgängeg ganzer Regioun Ausdrock an phosphorylated ERK1 /2 op Tyr202 /Thr204 (pERK1 VerfÜgung /2 VerfÜgung) zu 17-AAG-behandelt AGS Zellen. (E) Chip Cullin 4A, an Cullin 4B sech zu AGS Zellen vun shRNAs entsat. shRNA-transfected Zellen sech mat LY294002 oder 17-AAG fir 24 h behandelt. Western blotting zougedréckt a dem Wëllen vun der ganzer Regioun an phosphorylated ERK1 /2 op Tyr202 /Thr204 (pERK1 VerfÜgung /2 VerfÜgung) (F), an NF-κB Aktivéierung (G) an Zell Wuesstem (H) goufen och alles. (Ech) An shLuc- an shCHIP-transfected AGS mat LY294002 behandelt Zellen, huet ganzer Regioun immunoprecipitated, a seng ubiquitylation Komedie war. Fir westlech blot Analyse, war β-actin wéi eng intern Kontroll benotzt. Fir luciferase Aktivitéit an Zell Wuesstem, Daten sinn mengen ± Fils vum dräi onofhängeg Experimenter. ** P VerfÜgung &Si besteet; 0,01 a *** P VerfÜgung &Si besteet; 0,001 Verglach mat Kontroll. ## P VerfÜgung &Si besteet; 0,01 an ### P VerfÜgung &Si besteet; 0,001 Verglach mat shLuc oder DMSO. NS: net relevant. Éierlechkeet Dräieck, fräi Meenungsäusserung; Inverted Dräieck, ofgeholl Ausdrock. VerfÜgung PI3K /HSP90 /wëssen /ganzer Regioun /IQGAP1 /ERK1 /2 /NF-κB sécher Wanderung an Empfindlechkeet op 5-FU an cisplatin ganzer Regioun Aktivitéit oder Ausdrock VerfÜgung Geklomm regléieren kéint zu Zell dréit oncogenic Prozesser, dorënner Zell Prolifératioun, Migratioun, an Iwwerliewe [3], [6]. Mir studéiert d'Potential Abannung vun der identifizéiert PI3K /HSP90 /wëssen /ganzer Regioun /IQGAP1 /ERK1 /2 /NF-κB sécher Passerelle an Virdeeler Zell Wuesstem. Am Verglach mat de MKN45 Zellen, huet de AGS Zellen Opbau Aktivitéit fräi; Ee, silencing ganzer Regioun oder IQGAP1 vill (P VerfÜgung &Si besteet; 0.001) ofgeschaaft Zell Migratioun (Zousätzleche Fichier 12: D'Grondidee S11A). Pharmacologically erauszesichen PI3K /HSP90 /ganzer Regioun /MEK1 /2 /NF-κB sécher an der AGS Zellen och vill (P VerfÜgung &Si besteet; 0.001) attenuated den Opbau ëmmer (Zousätzleche Fichier 12: D'Grondidee S11B), a wëssen knockdown réckgängeg gefierwt der inhibitory Effekter vun der inhibition vun PI3K an HSP90 ëmmer (Dorënner 6A; Weider Fichier 12: d'Grondidee S11C). D'anticancer Agenten 5-FU an cisplatin sinn an der Behandlung vun gastric Cancers [46] Toast benotzt. Bestéet d'AGS Zellen mat 5-FU oder cisplatin, besonnesch an der ganzer Regioun oder IQGAP1 silencing, ëmmer méi waat bis apoptosis (Dorënner 6B). T315 fräi der Empfindlechkeet vun der AGS Zellen zu 5-FU an cisplatin (Zousätzleche Fichier 12: D'Grondidee S11D). Pharmacologically inhibiting PI3K /HSP90 /ganzer Regioun /MEK1 /2 /NF-κB sécher och de AGS Zellen zu 5-FU-entschlof apoptosis (Dorënner 6C) sensitized hierkommen wëssen silencing der synergistic Auswierkunge vun LY294002 a 17-AAG op 5-FU gutt -induced apoptosis (Dorënner 6D). Am Géigesaz, déi overexpression vun der ganzer Regioun eng Katalysator kinase Domain wouvun, dorënner ganzer Regioun 1-452 a ganzer Regioun 171-452, verstäerkte MEK1 /2 /NF-κB-reegelen Zell Migratioun (Dorënner 6E) an Zell Iwwerliewe der Behandlung mat 5-FU (Dorënner 6F). Dës Resultater uginn der gemeinsamer Auswierkunge vun ganzer Regioun an IQGAP1 op ERK1 /2 /NF-κB Aktivéierung fir Zell Migratioun a Survival. Figur 6 PI3K /HSP90 /wëssen /ganzer Regioun /ERK1 /2 /NF-κB sécher bestëmmt Migratioun Zell an Kontrollen waat un der anticancer Agenten 5-FU an cisplatin. (A) Migratioun Aktivitéit war an shLuc- oder shCHIP-transfected AGS Zellen behandelt mat LY294002 (25 μM) a 17-AAG (0,2 μM) fir 12 h getest. shLuc, Kontroll siRNA, oder DMSO sech als negativ Kontrollen benotzt. D'Zuel vun migrated Zellen am observéiert Terrain sinn gewisen. PI staining gefollegt duerch onkontrolléiert cytometry Analyse zougedréckt 5-FU- oder cisplatin-entschlof apoptosis fir 2 Deeg zu shILK- oder siIQGAP1-transfected AGS Zellen (B), AGS Zellen pretreated mat der uginn inhibitors fir 0,5 h (C), an shLuc- oder shCHIP-transfected AGS Zellen behandelt mat LY294002 oder 17-AAG (D). shLuc, Kontroll siRNA, oder DMSO sech als negativ Kontrollen benotzt. Plasmids baséiert op pcDNA3.1-Fändel-ganzer Regioun mat voller-Längt ganzer Regioun (ganzer Regioun VerfÜgung 1 VerfÜgung -452 VerfÜgung), ofgesprengt 171-452 (ganzer Regioun VerfÜgung 171 VerfÜgung -452 VerfÜgung) , oder ofgesprengt 1-170 (ganzer Regioun VerfÜgung 1 VerfÜgung -170 VerfÜgung) waren an MKN45 Zellen transfected. Verglach mat pcDNA3.1-Fändel (Fändel VerfÜgung) nëmmen, Zell Migratioun (E) an apoptosis entschlof vum 5-FU (5 μM) (F) sech am Unterrecht oder Präsenz vun PD98059 a Cape fonnt. Date sinn mengen ± Fils vum dräi onofhängeg Experimenter. * P VerfÜgung &Si besteet; 0,05, ** P VerfÜgung &Si besteet; 0,01 a *** P VerfÜgung &Si besteet; 0,001 Verglach mat Kontroll. #P VerfÜgung &Si besteet; 0,05, ## P VerfÜgung &Si besteet; 0,01, an ### P VerfÜgung &Si besteet; 0,001 Verglach mat Kontroll.

• Kombinéiert Fonctiounen baséiert op MT1-MMP Ausdrock, CD11b + immunocytes Dicht an LNR virauszesoen Medeziner Resultater vun gastric Kriibs
• Charakteristike vun Epstein Barr Virus Varianten verbonne mat gastric carcinoma am Süden Tunesien