Stomach Health > skrandžio sveikatos >  > Gastric Cancer > skrandžio vėžys

PLoS ONE: SIRT3 Pagerina Glikolizė ir platinimu SIRT3 ekspresija skrandžio vėžio Cells

Anotacija

SIRT3 yra pagrindinis NAD + - priklauso baltymų deacetilazės į žinduolių ląstelių mitochondrijas, veikianti išvengti ląstelių senėjimą ir transformacija per reguliavimo mitochondrijų medžiagų apykaitos homeostazė. Tačiau, SIRT3 yra taip pat nustatyta, kad išreikšti kai žmogaus navikų; jos vaidmuo šiose SIRT3 ekspresija vėžinių ląstelių turi būti išaiškintas. Šis tyrimas parodė, kad SIRT3 išraiška buvo padidėjusi į skrandžio vėžio ląstelių grupės, palyginti su įprastais skrandžio epitelinių ląstelių. Nors SIRT3 ekspresijos lygis buvo padidintas skrandžio navikų audiniuose, palyginti su gretimų ne navikų audiniuose, SIRT3 teigiamas vėžio ląstelės buvo dažniau aptinkama žarnyno tipo skrandžio vėžio nei Difuzinis tipo skrandžio vėžio, nurodant, kad SIRT3 yra susijęs su potipių skrandžio vėžys. Padidėjusi SIRT3 skatinamas ląstelių proliferaciją ir tvirčiau ATP kartos, gliukozės įsisavinimą, glikogeno susidarymą, MnSOD veiklą ir laktato gamybą, kuri buvo nuslopintos SIRT3 triuškinantis, nurodant, kad SIRT3 vaidina svarbų vaidmenį perprogramavimo į skrandžio naviko ląstelių bioenergetiką. Tolesnė analizė parodė, kad SIRT3 bendravo su ir deacetilinamas laktato dehidrogenazės A (LŠTA), pagrindinį baltymų reguliuojant anaerobinį glikolizės, stiprinant LŠTA veiklą. Be konsistencijos, iš glikolizės susijusių genų klasterių buvo aktyvinama per SIRT3 ekspresija skrandžio naviko ląstelių. Taigi, kartu su gerai dokumentuota SIRT3 tarpininkaujant mitochondrijų homeostazės normaliomis ląstelėmis, SIRT3 gali sustiprinti glikolizės ir ląstelių proliferaciją in SIRT3 ekspresija vėžinių ląstelių

nurodomoji dalis:. Cui Y Čin L, VU J Qu X, Hou C, nuo saulės W, ir kt. (2015) SIRT3 Pagerina glikolizės ir platinimu SIRT3 ekspresija Skrandžio vėžio ląsteles. PLoS ONE 10 (6): e0129834. Doi: 10,1371 /journal.pone.0129834

redaktorius: XiangLin Shi universitetas Kentukis, Jungtinės Valstijos

Įstojo: balandžio 16, 2015; Priimta 13 Gegužė 2015 metų; Paskelbta: Birželis 29, 2015

Visos teisės saugomos: © 2015 Cui et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų Prieinamumas: Visi susiję duomenys yra per popieriaus ir jo Pagalbinė informacija failus

finansavimas:. Šis tyrimas buvo iš dalies remiama nacionalinio Gamtos mokslo fondo Kinijos, Pagrindiniai programos (30930105), Nacionalinis 12-5 paramos planą projektas mokslo ministerija ir technologijos Kinijos (2012BAH30F03), Nacionalinis gamtos mokslų fondas Kinijoje (31.070.740), The 985 ir 211 projektai Xi'an Jiaotong universiteto (JKL) ir nacionalinio vėžio instituto Ro1 dotacija CA152313-01 A1 (JJL).

konkuruojančių interesų. autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Sirtuins, iš NAD šeima + - išlaikomiems histonų deacetilazių (HDACs) žinduolių ląstelės, yra susijęs platų fizinių procesų, įskaitant ląstelių išlikimas, apoptozės, medžiagų apykaitai stresą, senėjimo ir ilgaamžiškumo [1,2]. Tarp septynių sirtuin nariai (SIRT1-7), SIRT3 yra geriausias besiskiriantis mitochondrijų sirtuin, veikianti reguliuoti mitochondrinio dalyvaujančius baltymus oksidacinio fosforilinimo, riebalų rūgščių oksidacija, karbamido cikle, ir antioksidantų atsakas [2-9]. Keletas tyrimų parodė, kad SIRT3 vaidmenį medžiagų apykaitos ir homeostazės normaliomis ląstelėmis ir atskleidė naujus tikslus ir substratai SIRT3 priklausoma deacetilinant [10]. Kim et al pranešė, kad SIRT3 yra pagrindinė mitochondrijų baltymų, ir SIRT3 išraiškos nebuvimas yra susijęs su padidėjusio mitochondrijų DNR žalos ir senėjimo, taip pat padidėjo potencialo Ras sukelta ląstelių transformaciją ir SIRT3 tarpininkaujant MnSOD aktyvavimo, prisidedančios prie mitochondrijų homeostazės [11,12]. Grįsdama žmogaus embriono inkstų 293 ląstelių (HEK293) ląstelės pasižymi sustiprintą SIRT3 išraiška pagal oksidacinio streso, todėl deacetilinant ir aktyvacijos MnSOD [13]. SIRT3 Manoma, kad veiktų kaip auglio slopinamojo geno ir vaidina svarbų vaidmenį didinant ląstelių homeostazę nuo senėjimo ir kancerogeninio poveikio.

Tačiau kai naviko ląstelės parodyti SIRT3 išraišką ir potencialų vaidmenį SIRT3 šiose vėžinių ląstelių , ypač jos potencialas santykis su agresyvaus fenotipo, buvo prieštaringas [14]. SIRT3 išraiška yra mažesnė arba neaptinkamas į žmogaus vėžio, įskaitant krūties vėžį, glioblastoma, storosios žarnos vėžio, ir osteosarkoma, prostatos ir kiaušidžių vėžio [11,15,16] masyvo. SIRT3 skatina augimo suėmimą ir apoptozę pasirinktu nuslopinami BCL-2 HCT116 ląstelių per tolygiam JNK2 signalizacijos kelią [17]. Be to, SIRT3 pranešė prisidėti prie padidėjęs jautrumas žmogaus leukemijos ląstelės chemoterapijos galbūt per mitochondrijų tarpininkaujant apoptozės [18] indukcija. Kita vertus, SIRT3 išraiška yra taip pat nustatė, būti padidintas burnos vėžį, mazgas-teigiamas krūties vėžio, stemplės vėžio, ir skydliaukės karcinomos; ir padidėjo SIRT3 yra susijęs su didesne piktybinės fenotipo ir downregulation iš SIRT3 padidina naviko jautrumą priešvėžinis gydymas [19-23]. Šie rezultatai įspėti kitą vaidmenį SIRT3 konkrečiose navikų, kad reikia išsiaiškinti.

Vėžio ląstelės yra medžiagų apykaitoje ir suvartoja daugiau ląstelių kuro negu normalios ląstelės. Tačiau vėžio ląstelės pasikliauti daugiausia ATP sintezę, aerobikos glikolizės, funkcija vadinama Warburg poveikio [24]. Toks aerobikos glikolizės Manoma, kad apsaugoti nuo vėžio ląstelės formuoja oksidacinį stresą, nes mitochondrijų kvėpavimo yra pagrindinis šaltinis ląstelėje ROS [25]. Laktato dehidrogenazės A (LŠTA) yra fermentas, kontroliuoti interkonversiją tarp piruvato ir L-laktato grįžtamai tuo paskutinį žingsnį anaerobinio glikolizės [26]. Slopinimas LŠTA mažina tumorogeniškas potencialą su padidėjusia mitochondrijų deguonies suvartojimas ir sumažėjęs mitochondrijų membranos potencialo [26] ir apskritai mobiliojo ATP gamybą ir glikolizės [27].

Šiame tyrime mes ištirti galimą vaidmenį SIRT3 skrandžio vėžinės ląstelės, kad išreikšti SIRT3. Išraiška SIRT3 buvo susijęs su agresyvaus augimo, kuris buvo tarpininkaujant per SIRT3-deacetilintas ir aktyvuota LŠTA, stiprinant glikolizės ir raišką iš glikolizės susijusių genų grupei. Taigi SIRT3-LŠTA tarpininkaujant glikolizės metabolizmas gali būti potencialus terapinis tikslą gydyti vėžines ląsteles, kad išreikšti SIRT3.

Medžiagos ir metodai

Mobilaus ryšio linijos ir kultūra

Žmogaus skrandžio vėžys ląstelių linijų MSV-803, HGC-27, SGC-7901 [28] ir "AGS [29] ir įamžino žmogaus skrandžio epitelio ląstelių linija GES-1 [30] buvo prižiūrimi RPMI-1640 terpėje (Invitrogen) papildytas 10% vaisiaus galvijų serumo ir 1% penicilino /streptomicino, ir kultivuojamos 37 ° C temperatūroje, esant 5% CO2 atmosferoje.

imunoprecipitaciją ir Western blot

Subconfluent ląstelės buvo lizuojamos ir lizatai inkubuojamos su baltymų A /G agarozės karoliukai plius rekomenduojama suma antikūnų arba SIRT3 (Mobilusis Signalizacijos technologijos) arba LŠTA (Santa Cruze "), esant 4 ° C naktį. Mėginiai buvo centrifuguojamas ir atskirti SDS poliakrilamido gelio elektroforezės ir electroblotted ant nitroceliuliozės membranos. Po blokavimo su 5% ne-riebumo pieno TBST, Membranos buvo inkubuojami su pirminiais antikūnais, esant 4 ° C temperatūroje per naktį, po inkubacijos su antriniais antikūnais už 1 valandą kambario temperatūroje. Baltymai objektai buvo regimos ECL nustatymo rinkinys ( "Thermo Fisher).

imunohistocheminis tyrimas

Patologiniai skaidrės skrandžio vėžio su analizavo imunohistocheminis tyrimo gretimuose normaliuose audiniuose buvo atlikta pagal gamintojo instrukcijas. Polimero aptikimo rinkinys už imunohistocheminis analizę buvo įsigytas iš Zhongshan Golden Bridge biotechnologijos. Trumpai, parafino dalys buvo devaškuoti ir iš naujo-hidratuotas etanolyje (100%, 90% ir 75%). Skyriai buvo inkubuojamos su 3% H 2O 2 kambario temperatūroje 10 minučių ir tada užblokuotas su neturinti imuniteto ožkų serumo kambario temperatūroje 15 minučių. tada dalys buvo inkubuotos su pirminiais antikūnais į SIRT3 (Mobilusis signalines technologijų) 2 valandas kambario temperatūroje, po to anti-triušio antrinio antikūno inkubacijos 15 minučių kambario temperatūroje. tada dalys buvo inkubuotos su DAB aptikimo reagentu 2 minutes kiekvienas, counterstained hematoksilinu ir dehydraded etanolyje (90% ir 100%). Skyriai buvo sumontuoti ir dažymo buvo analizuojami pagal mikroskopu.

plazmidžių statybos ir ląstelių transfekciją

SIRT3 visą ilgį kDNR buvo susintetinti naudojant RT-PGR su visos RNR išgaunamas iš GES-1 ląstelės kaip šablonas (pradmenys: 5 'CCGCGGTACCATGGCGTTGTGGGGTTG 3 "ir 5" CCGCTCTAGACTATTTGTCTGGTCCATCAAGC 3). Tada kDNR buvo klonuotas į pcDNA3.1 + ekspresijos vektorių (Invitrogen). PGPH1 /GFP /Neo-SIRT3-shRNR plazmidės nukreipti žmogaus SIRT3 (5 'CTTGCTGCATGTGGTTGAT 3 ") ir valdymo shRNR plazmidės buvo gauti iš GenePharma. Generuoti stabilias transfectants, AGS ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelės buvo pernešta naudojant Lipofectamine 2000 reagento (Invitrogen) ir stabilias transfectants atrinko 400ug /ml G418 (Gibco).

ląstelių proliferacija ir clonogenicity tyrimas

proliferacijos tyrimu, ląstelės buvo padengtas į 6 šulinėlių plokštelės 2 x 10 4 ląstelių /gerai. Ląstelių proliferacija buvo apskaičiuota remiantis dienų 2, ​​4, 6, ir 8 po to, kai dengimo. Už clonogenicity tyrime, ląstelės buvo padengtą į 6-šulinėlių plokštelės su įvairių ląstelių skaičių ir kultivuojamos už 14 dienų ir kolonijų tada buvo tamsintas su violetinei ir kolonijų skaičius (> 50 ląstelių /kolonija) buvo skaičiuojamas pagal nustatytą metodų [31].

Matavimo gliukozės, laktato ir glikogeno

fenolio raudonasis nemokamai vidutinio buvo naudojamas kultūros ląstelių 6 šulinėlių plokštelė už 24 valandas ir gliukozės įsisavinimą ir laktato kartos lygiai buvo matuojamas gliukozės Analizės rinkinys ir pieno rūgštimi rinkinį (Jiancheng Bioinžinerija institutas). Santykines vertes buvo normalizuotas pagal ląstelių skaičiaus kiekvieną šulinėlį. Mobilieji glikogeno koncentracija buvo aptikta naudojant glikogeno Analizės rinkinį (Biovision). Trumpai, 1 × 10 6 ląstelės buvo homogenizuoti 200μL vandens ant ledo, ir Homogenatai virti 5 minučių, kad inaktyvuotumėte fermentų ir centrifuguojamas 13,000 apsisukimų per minutę 5 minutes, esant 4 ° C iki pašalinti netirpių medžiagų. Glikogeno gamybą buvo matuojamas su OD vertės 570 nm.

Matavimo ATP gamybą

Mobilieji ATP ir ROS koncentracija buvo matuojamas kaip aprašyta anksčiau [32]. Ląstelės auginamos 6 šulinėlių plokštelės po įvairias gydymo, buvo lizuoti ir korinio ATP koncentracija buvo matuojama ATP Bioluminescence prabavimo Kit (Sigma). Matavimo glikolizę-tarpininkaujant ATP gamybą, ląstelės prieš matavimų buvo gydomi 2 mkm rotenono už 24 valandas.

matavimas ROS kartos

korinio ryšio ROS kartos buvo tirta su 5- (ir 6-) karboksi-2 ", 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetatas (DCFDA) metodas, naudojant microplate spektrometras (Thermo Fisher) esant 488 nm /530 nm bangos ilgiui.

MnSOD veikla

Ląstelės auginamos 6-gerai plokštelė buvo lizuoti ir MnSOD veikla nulėmė WST-8 metodus naudojant MnSOD Bandymo rinkinį (Beyotime) Po gamintojo instrukcijas.

tumorogeniš- tyrimai nuogas pelės

SGC7901 ląstelės (7,5 x 10 6) SIRT3 raiškos ar triuškinantis buvo sustabdytas 0,1 ml PBS ir užsėti į vieną iš 5 savaičių senumo vyrų krašto Balb /c athymic nude pelės, ir ne 28 -osios dienos po skiepijimo, kai maksimali auglio apimtis (~ 1500 mm 3) pasiekė su kontroline grupe, eksperimentai buvo nutrauktas ir visi navikų iš kiekvienos grupės buvo pašalintų ir pasverti. Eksperimentinis procedūra, bandymų su gyvūnais buvo atliekami pagal institucinius gaires; institucinė Gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas (IACUC) ne Xian Jiao Tong universiteto specialiai patvirtino šį tyrimą (protokolasx.181).

laktatdehidrogenazės tyrimas

laktato lėmė dehidrogenazės aktyvumas pagal nustatytą protokolą matuojant sumažinimo norma yra absorbcijos bangos ilgiui, 340 nm bangos ilgiui, gautą NADH [27] oksidacijos. Trumpai, ląstelės buvo auginamos 10 cm indai ir homogenizuotas PBS ant ledo. Homogenatai pridėta į buferį, kuriame 6.6 mM NADH, 30 mM natrio piruvato ir 0,2 M Tris-HCl, pH 7,3 ir sumaišyti. Inkubuojama mišinį 5 minutes pasiekti temperatūros pusiausvyrai ir tada įrašyti sumažėjusį greitį absorbciją prie 340 nm bangos ilgiui.

SIRT3 vitro
deacetilinant tyrimas

Žmogaus SIRT3 rekombinantinio fermento ( BPS) buvo inkubuojama su L-laktatdehidrogenazės nuo galvijų širdies (sigma), reakcijos buferyje (50 mm pločio NaCl, 4 mm MgCl 2 ir 10 mm NAD + 50 mM DTT, 50 mmol Tris pH 8,0) su /be SIRT3 inhibitorių nikotinamido (Nam, 10 mm) 37 ° C temperatūroje 1,5 valandos, o tada reakcijos buvo naudojami LŠTA veiklos aprašytą analizę, kaip nurodyta pirmiau.

Realaus laiko PGR

bendras RNR buvo išskirtas naudojant TRIZOL reagentas (Invitrogen), po to veikiant su fenolio /chloroformo ir kritulių su 2-propanolio. tada, kad bendras RNR granulių plautas 75% etanoliu ir resuspenduojamos vandenyje. RNR buvo atliktas atvirkštinę transkripciją su PrimeScript RT-PCR Kit (Takara) ir kiekybinė realaus laiko PGR analizės genai objektai buvo atliekami naudojant SYBR PremixExTaq II komplektą (TAKARA) Po gamintojo instrukcijas. Duomenys buvo normalizuotas į gama tubulino lygiu.

Imunofluorescentinis

AGS pasėtų ląstelių ant A 6 šulinėlių plokštelės dengiamąja buvo nustatytas 4% paraformaldehido 10 minučių ir blokavo 1% BSA 1 valandą kambario temperatūroje. Ląstelės inkubuojamos su pirminių antikūnų prieš SIRT3 ir LŠTA, esant 4 ° C temperatūroje per naktį, po to inkubacijos su fluorescencijos-konjuguoto antrinio antikūno už 1 valandą kambario temperatūroje. Counterstaining buvo atliktas su DAPI naudojant imunofluorescenciniam Kit (Beyotime). Ląstelės buvo montuojamas ir nufotografuotas skenavimo lazeriu mikroskopas.

Statistinė analizė

Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SE bent iš trijų nepriklausomų eksperimentų. Statistinė analizė buvo atlikta su neporiniai du-tailed Stjudento t testą, jeigu nenurodyta kitaip. P
< 0,05 buvo laikomas reikšmingu.

Rezultatai

SIRT3 išraiška skrandžio vėžio ląstelių

SIRT3 yra gerai apibrėžta reguliuojant mitochondrijų homeostazės anti-senėjimo ir anti-transformacijos. Neseniai skirtingi rezultatai būtų pranešami, susijusi su SIRT3 tarpininkaujant ląstelių slopinimo ir platinimu, todėl jo vaidmenų prieštaravimų vėžio [19,20]. Norėdami nustatyti galimą vaidmenį SIRT3 skrandžio vėžio, išraiška SIRT3 buvo aptiktas 4 skrandžio vėžio ląstelių linijų AGS, SGC-7901, MSV-803, HGC-27 ir skrandžio vėžio navikų audiniuose, grupė. Mes nustatėme, kad SIRT3 baltymo koncentracija buvo padidėjusi visomis 4 skrandžio vėžio ląstelių linijų, palyginti su imortalizuotų skrandžio epitelio GES-1 ląstelių (AGS 1,9 karto; SGC-7901, 1,5 karto; MSV-803, 2.0 klosčių ir HGC -27, 1,8 karto, palyginti su GES-1 ląstelių) (pav 1A). Pagal, iRNR lygiai SIRT3 šių ląstelių linijų, taip pat buvo padidintas (MAA, 2,6 karto; SGC-7901, 1,7 karto; MSV-803, 2,5 karto; HGC-27, 2,2 karto), palyginti su GES- 1 ląstelės (pav 1B).

imunohistocheminis analizė naviko ir gretimuose ne vėžinių normalių audinių iš skrandžio vėžiu sergančių pacientų grupėje parodė, kad SIRT3 teigiamas ląstelės buvo dažniau aptinkama naviko audiniuose negu normaliuose audiniuose. Rezultatai parodė, kad 55,1% navikinių audinių (7% sveikų audinių) eksponuojama aukšto lygio (stiprus teigiamas), 41,4% navikinių audinių (28% normalių audinių) eksponuojami vidutinio ir aukšto lygio (silpnas teigiamas), o 3,5% naviko audiniai ir 64% normalių audinių buvo neigiamas SIRT3 išraiškos (pav 1C ir 1D, S1A pav). Įdomu tai, kad SIRT3 išraiška žarnyno tipo navikų audiniuose (15 atvejai; 93,3% stiprus teigiamas ir 6,6% silpnas teigiamas) buvo reikšmingai didesnis negu difuzinio tipo navikų audiniuose (14 atvejai; 14,3% stipri teigiama, 78,6% silpnas teigiamas ir 7,1 % neigiama) (pav 1C ir 1E, S1B pav). Šie rezultatai rodo, kad SIRT3 išraiška padidėjo kai kurių auglių palyginti su susijusiomis normalių audinių ir SIRT3 išraiška gali būti skiriasi atskirose navikai, kuriuos reikia toliau tirti.

SIRT3 lygiai yra susiję su ląstelių proliferaciją

Tada mes sukūrėme SIRT3 raiška ir triuškinantis ląstelių linijas per AGS ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląsteles. Iš SIRT3 išraiška stabiliomis transfectants buvo patvirtinta Vakarų dėmė. Padidėjusi SIRT3 padidėjo ląstelių augimą, o SIRT3 triuškinantis slopinamas ląstelių augimą tiek skrandžio vėžio ląstelių linijų (pav 2a). Be to, padidėjusią SIRT3 sukėlė daugiau kolonijų susidarymą, nei kontrolės perkeltų ląstelių, kurios buvo priešingai tik mažiau kolonijų suformuota per SIRT3 triuškinantis ląstelių (pav 2b).

Jei toliau nustatyti SIRT3 vaidmenį navikų susidarymo galimybes, mes švirkščiamas SIRT3 raiška ir triuškinantis SGC-7901 ląsteles į šonus nuo nuogas pelėmis ir auglių augimas buvo leista 28 dienas po ląstelių suleistas (S2 pav). Vidutinis svoris navikų, gautų iš SIRT3 ekspresija ląstelių buvo 0.7079g, žymiai didesnis nei vidutinis naviko svorio kontrolei (NC) P
= 0,015, (pav 2C, kairė skydo). Priešingai, vidutinis svoris navikų, gautų iš SIRT3 triuškinantis ląstelių buvo 0.0588g, gerokai mažesnis nei nuo plaktai shRNR kontrolinių ląstelių (SCR) (0.2033g P
= 0,009) (pav 2C, tiesa grupė) , Vidutinis tūris navikų, gautų iš SIRT3 ekspresija ląstelių buvo padidintas, nei iš kontrolinių ląstelių (NC) (Pav 2C, kairė skydelį dešiniajame kampe). Priešingai, vidutinis tūris navikų auga iš SIRT3 triuškinantis ląstelių buvo dramatiškai mažas, palyginti su iš kontrolės ląstelių (SCR) (pav 2C, tiesa panelė iki dešiniajame kampe).

Glaudesnis glikolizės į SIRT3 išreikšti skrandžio vėžiu ląstelės

tada buvo įdomu, kaip korinio bioenergetika gali būti pakeista SIRT3 ekspresija skrandžio vėžio ląsteles. SIRT3 raiškos smarkiai išaugo gliukozės įsisavinimą (1,4 karto, AGS 1,9 karto, SGC-7901), o SIRT3 nokdaunas sumažėjo gliukozės įsisavinimą (apie 40% abiejų AGS ir SGC-7901) (pav 3A ir 3B). Suderinamas su gliukozės naudojimo modelį, SIRT3 ekspresija ląstelės buvo padidėjęs laktato išsiskyrimą (1,2 karto, AGS 1,3 karto, SGC-7901), o SIRT3 Klojinius išardomi ląstelės buvo sumažėjęs laktato išsiskyrimą (55% AGS ir 45 % iš SGC-7901) (pav 3c ir 3d). Mes taip pat nustatė, kad glikogeno susidarymą buvo žymiai padidėjo SIRT3 raiškos (1,5 karto, AGS 1,3 karto, SGC-7901), iš greitai augant vėžinių ląstelių [33] funkcija, o sumažintas SIRT3 triuškinantis (40% AGS ir 70% SGC-7901) (pav 3e ir 3f).

SIRT3 buvo įrodyta, dalyvauja pasaulinėse apykaitos fermentų ir priežiūra bazinių ATP lygį ląstelėse ir įprastomis sąlygomis ir ligų [1 deacetilinant , 2]. Iš viso ląstelių ATP ir glikolizės ATF karta buvo aptikta AGS ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelių su kuriuo SIRT3 raiškos ar SIRT3 triuškinantis. Bendras mobilieji ATP koncentracija padidėjo SIRT3 ekspresija ląstelių (apie 1,3 karto abiejose ląstelių linijų), tačiau sumažėjo SIRT3 triuškinantis ląstelių (apie 75% abiejų ląstelių linijų), palyginti su NC arba SCR kontrolės ląstelių (pav 4a ir 4b) , Tada mes traktuojami ląsteles rotenono slopinti oksidacinis fosforilinimas, ir išbandyti ATP gamybą iš glikolizės. Kaip parodyta pav 4c ir 4d, SIRT3 raišką lėmė glikolizės ATP gamyba (1,4 karto, AGS 1,6 karto, SGC-7901) padidėjimas, o SIRT3 nokdaunas buvo labai sumažėjo glikolizės ATP gamybai (20% į AGS ir 40% SGC-7901), palyginti su NC arba SCR kontrolės.

SIRT3 reguliuoja ROS homeostazę skrandžio vėžio ląstelių

įrodymų kūno pritaria tam, kad padidėjo ROS lygis yra kritiškai charakteristika vėžinių ląstelių, kurios sudaro vėžinės ląstelės jautresni papildomam ROS streso [34]. Čia mes nustatėme, kad padidėjusią SIRT3 sumažėjo ROS lygį iki 70% ir 80% AGS ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelių, o slopinimas SIRT3 išraiška padidėjo ROS lygį (1,4 karto, AGS ląstelių ir 1,6 karto, SGC-7901 ląstelių), atitinkamai (pav 5A ir 5B). Pagal susitarimą su literatūroje rodo SIRT3 deacetylates ir aktyvina MnSOD (11, 12), skrandžio vėžio ląsteles, MnSOD veikla buvo sustiprintas SIRT3 raiškos (1,4 karto, AGS ląstelių ir 1,2 karto, SGC-7901 ląstelių), tačiau sumažintas SIRT3 triuškinantis (50% AGS ląstelių ir 65% į SGC-7901 ląstelių) (pav 5C ir 5D), o tai rodo, kad SIRT3 gali apsaugoti ląsteles nuo oksidacinio streso sukeltos žalos subalansavimo ląstelėje ROS per didinant MnSOD veiklą skrandžio vėžio ląsteles.

SIRT3 deacetylates ir aktyvina LŠTA

LŠTA vaidina svarbų vaidmenį navikų inicijavimo, priežiūros ir progresavimą. Slopinimas LŠTA veiklos blokai tumorogeniš- ir naviko progresavimo [26,27] ir LŠTA veikla gali būti reglamentuojama acetilinimo /deacetilinant pakeitimo [35]. Mums buvo įdomu, ar SIRT3 dalyvauja nuo LŠTA veiklos reguliavimu. Mes nustatėme, kad skrandžio vėžio ląsteles, LŠTA veikla buvo gerokai padidėjo SIRT3 ekspresija ląsteles, o sumažėjo SIRT3 triuškinantis ląstelių, palyginti su NC arba Scr kontrolinių ląstelių atskirai, be juntamo pasikeitimo LŠTA baltymų lygio arklidėje transfectants (pav 6a). Imunodažymu rezultatai parodė, kad LŠTA ir SIRT3 buvo bendrai lokalizuotas citoplazmą (pav 6B), ir bendro IP analizė su bet LŠTA ar SIRT3 antikūnų atskleidė, kad SIRT3 sugeba bendrauti su LŠTA (pav 6c). Be to, LŠTA acetilinimo lygis sumažėjo SIRT3 ekspresija ląstelių, tačiau padidėjo SIRT3 triuškinantis ląstelių (pav 6d). Be to, in vitro
LŠTA veikla tyrimas atliktas naudojant komercinę rekombinantinis žmogaus SIRT3 ir galvijų širdies L-laktatdehidrogenazės nurodė, kad LŠTA veikla buvo padidintas su SIRT3 buvimo reakcijos, kuri buvo atstatomi į SIRT3 inhibitoriumi papildomai , nikotinamidas (6E pav). Nustatyti galimą SIRT3 deacetilinant svetainėje (-ų) LŠTA, mes ieškoma duomenų bazę ir nustatė, kad K5, K14, K57, K81, K118, K126, K222 ir K318 yra potencialūs acetilinimui svetainėse LŠTA, o ankstesnė studija pranešė, kad K5 acetilinimo /deacetilinant buvo susijęs su LŠTA veiklos [35] Reglamentas. Tada mes padarėme LŠTA veiklos tyrimą, naudojant lizino 5 ir lizino 318 acetilinimui mimikos (K5Q /K318Q) arba deacetilinant mimikos (K5R /K318R) mutantas LŠTA ir nustatė, kad nei K5, nei K318 reikėjo SIRT3 tarpininkaujant LŠTA aktyvavimo (S3 pav). Daugiau identifikavimas SIRT3 tarpininkaujant LŠTA deacetilinant yra poreikis.

SIRT3 upregulates genus ląstelių metabolizmą

Jei apibūdinti molekulinę parašas SIRT3-LŠTA tarpininkaujant bioenergetikos skrandžio vėžio ląsteles, mes matuojama genų, susijusių su gliukozės transportavimą ir glikolizės. Duomenys pav 7A ir 7B parodė, kad padidėjusią SIRT3 į AGS ar SGC-7901 sukeltas į HK2 (1,47 karto į AGS ląsteles, 1,3 kartus per SGC-7901 ląstelių), MCT4 (2.3 karto, AGS ląstelių 1,34 išraiška -kartų į SGC-7901 ląstelių) ir Glut1 (1,55 karto, AGS ląsteles, 1.38 kartus per SGC-7901 ląstelių) ne išbandė realaus laiko PGR iRNR lygiu. Priešingai, SIRT3 nokdaunas sumažėjo genų HK2 išraišką 76%, MCT4 iki 73% ir Glut1 iki 62% visų AGS ląstelių, o HK2 80%, MCT4 iki 62% ir Glut1 į 74% Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelių. Be to, kai SIRT3 buvo ekspresija, MCT1 iRNR lygis buvo padidintas AGS ląstelių 1,6 karto, bet ne SGC-7901 ląsteles, o kai SIRT3 buvo triuškinantis, MCT1 sumažėjo iki 59% AGS ir 65% SGC-7901 ląstelių , atitinkamai.

Diskusijos

Šis tyrimas suteikia įrodymų, kad SIRT3 išreikšti kai kurių vėžio ląstelių, tokių kaip skrandžio vėžio ląstelių, gali būti susietas su sustiprinto agresyvumo iki SIRT3 tarpininkaujant bioenergetikos per deacetilinant ir aktyvacijos LADH. Nors kaupti įrodymus matyti, kad SIRT3 vaidina, pavyzdžiui, vėžinių ląstelių, kurios išreikšti SIRT3 turi būti ištirta [19] pagrindinis vaidmuo apsaugos normalios ląstelės nuo senėjimo ir piktybinę transformaciją, jos funkcijos jau transformuotų ląstelių. Trūksta SIRT3 į MEF veda prie genomo nestabilumo ir didelio dažnio ląstelių transformacijos tarpininkaujant Ras su padidėjusiu navikų susidarymo ir senėjimo, o tai rodo, kad SIRT3 būtina užkirsti kelią ląstelių senėjimo ir kancerogeninio poveikio [11,15]. Be to, trūksta arba mažesnis išraiška SIRT3 aptinkamas į keletą žmogaus vėžio ir SIRT3 lygis yra susijęs su vėžio ląstelių jautrumą chemoterapijoje ir radioterapijos [11,15,16]. Tačiau SIRT3 taip pat rodomas būti ekspresija žmogaus vėžio ir susijęs su atsparumu terapijos [19,21,36]. Šie rezultatai rodo, kad SIRT3 gali siekti skirtingų baltymų tarp normalių ir vėžinių ląstelių, ir kad SIRT3 išraiška gali būti įvairi įvairių tipų vėžio, pavyzdžiui, dabartinių rezultatų, liudijančių, kad žarnyno tipas skrandžio vėžio išreiškia aukštesnį lygį SIRT3 nei difuzinės tipo skrandžio vėžio.

Jis buvo visuotinai pripažįstama, kad vėžinių ląstelių suvartoja daugiau ląstelių energiją remti greitą augimą ir proliferaciją, nei normalios ląstelės naudojant glikolizės kaip pagrindinį šaltinį ATP kartos vietoj oksidacinio fosforilinimo [24] , Be dabartinio tyrimo, mes parodė, kad skrandžio vėžio ląsteles, SIRT3 sąveikauja su ir deacetylates LŠTA, sukelia didesnį LŠTA veiklą; ir SIRT3 raiška sukelia padidėjęs ląstelių ATP gamybą ir MnSOD veikla lygiagrečiai su riboto ląstelių ROS lygio, byloja apie padidėjusią oksidacinis maitėda gebėjimas SIRT3 galbūt per deacetilinant tarpininkaujant MnSOD fermentų aktyvinimo. Daugėja įrodymų matyti, kad SIRT3 yra reikalinga ląstelių ir mitochondrijų homeostazės priežiūra per reguliuojant mitochondrijų medžiagų apykaitą ir ląstelių redokso balanso sistemą, apsaugoti ląsteles nuo oksidacinio streso per reguliavimo ROS susidarymą, kritiškai mechanizmą senėjimo, vėžio ir širdies ligų [1,2, 37]. SIRT3 gali deacetylate daug mitochondrijų tikslų grupę Susijęs su tiek glikolizės ir ląstelių oksidacinį stresą reglamentą. Neseniai SIRT3 randamas galės deacetylate ir padidinti piruvato dehidrogenazės aktyvumas vėžinių ląstelių, kurios gali padidinti tiek mitochondrinio bioenergetiką ir glikolizės [38]. Pagal susitarimą, dabartinis tyrimas rodo, kad SIRT3 gali deacetylate ir aktyvuoti LŠTA kuri gali būti naudojama tiek mitochondrijų kvėpavimo ir glikolizės. Kita vertus, SIRT3 gali deacetylate ir vėliau aktyvuoti kitas mitochondrijas substratai, pavyzdžiui, MnSOD [11,12], Foxo3 [39] ir IDH2 [9] Przedmuch ROS pagamintos oksidacinio fosforilinimo, ląstelių apsaugai nuo oksidacinio pažeidimo [40] , Taip pat suderinama su šiomis išvadomis, šiame tyrime, mes nustatėme, kad padidėjusią SIRT3 padidina MnSOD veiklą, kuri gali būti viena iš priežasčių, dėl sumažėjusio ląstelių ROS lygį pagal tvirtesnio ląstelių metabolizmą būklės.

LŠTA, kaip šeimos narys laktato dehidrogenazės (LDH), yra nustatyta, egzistavo glikolizinių ląstelių ir lokalizuota mitochondrijoje be citozolyje [41], ir daugiausia katalizuoti inter-konversija piruvato ir laktato [42]. LŠTA rodomas vaidinti pagrindinį vaidmenį aerobinio glikolizės ir tumorogeniš- į piktybinių ląstelių [26,27]. Be vėžio ląsteles, LŠTA greitai sunaudoja piruvato pagamintą glikolizinių keliu, todėl padidėjo aerobikos laktato gamyba [26]. Slopinimas LŠTA skatina ROS gamybą, mažina ląstelių ATP lygį ir slopina glikolizės, todėl slopina ląstelių augimą ir sukelia ląstelių žūtį vėžio [27]. Susideda su šiomis ataskaitomis, mes nustatėme, kad SIRT3 gali sąveikauti ir aktyvuoti LŠTA. Į SIRT3 padidėjusia ląsteles, LŠTA acetilinimo sumažėjo su padidėjusia LŠTA fermento aktyvumą. Nors tikslus mechanizmas sukelia SIRT3 tarpininkaujant LŠTA reglamentą, turi būti toliau tiriamas, šie rezultatai rodo, kad LŠTA kontroliuojama glikolizės kelią, kad pagreitina vėžinių bioenergetiką gali paveikti SIRT3 ekspresijos lygį.

Mūsų dabartinis tyrimas taip pat atskleidė, kad išraiška genų, pavyzdžiui, MCT1, MCT4, HK2 ir Glut1, žinomas kaip pagrindinių reguliavimo energijos apykaitos vėžio grupė taip pat padidėjo SIRT3 ekspresija skrandžio vėžio ląsteles, o tai rodo galimą vaidmenį SIRT3 stiprinant glikolizės naviko ląstelėse. HK2 katalizuoja fosforilinimą gliokozės gliukozės-6-fosfato pradiniame žingsnyje glikolizės [43]. Gliukozė transporteris (GLUT) kontroliuoja gliukozės visoje plazminės membranos transportu, veikia kaip pirmosios normos ribojimo žingsnis gliukozės metabolizmą [44]. MCT1 ir MCT4 nariai monokarboksilatų (pvz laktato ir piruvato) transporterio šeimos, taip pat dalyvauja glikolizės priklausomų auglių [45] augimas. Kartu šie rezultatai rodo galimą sąveiką SIRT3 ir glikolizės susijusių genų signalizacijos naviko agresyvų augimą, kuris turi būti toliau tiriamos grupės.

Taigi, nors SIRT3 yra gerai, besiskiriantis tuo, mitochondrijų homeostazės prieš ląstelių senėjimo ir transformavimas, išraiška SIRT3 naviko ląstelėse yra susijęs su padidintu platinimu ir agresyvaus augimo skrandžio vėžio ląsteles. SIRT3 sąveikauja ir aktyvuoja LŠTA, todėl padidėja glikolizės ir ATP gamybą, kuris kartu su padidėjusiu mitochondrijų antioksidantas MnSOD veikla ir sumažėjo ląstelėje ROS lygį (A hipotetinis modelis siūloma pav 7c). Taigi, augimas stimuliuojančio funkcija SIRT3 rodo galimą tikslą gydyti auglius su SIRT3 išraiška.

Pagalbinė informacija
S1 pav. Reprezentacinės patologiniai skaidres nustatymo SIRT3 išraiška žmogaus skrandžio vėžio egzempliorių.
A parafino įterptųjų žmogaus skrandžio vėžys ir suporuoti gretimų patologiškai normalaus audinio mėginiai buvo tiriami imunohistocheminis dažymą su SIRT3 antikūnų (rudas), po to branduolių kontrasto hematoksilinu ( mėlynos, kiekvienas navikas buvo parodyta su gretimuose normaliuose audiniuose vienoje eilėje 20 × ir 40 ×). B atstovybės vaizdai SIRT3 raiškos žarnyno ir pasklidųjų tipų skrandžio vėžio. Mastelio juosta, 50 mkm
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0129834.s001
(TIF)
S2 pav. Padidėjusi SIRT3 skatinamas naviko in vivo.
SGC-7901 ląsteles SIRT3 raiškos (A) arba triuškinantis (B), buvo po oda švirkščiamas į dešinio krašto į nuogas pelių santykinius kontrolinių ląstelių (NC arba SCR) į kairę šoninė. Ksenografiniuose navikai pašalintų ir sveriami 28 dieną po skiepijimo ląstelių. Vaizdai dešinės skydelyje parodė, svetimo transplantanto navikai in vivo eksperimento pabaigos. Vaizdai parodė, naviko augimą pelių
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0129834.s002
(TIF)
S3 pav.

Other Languages