PLoS ONE: RhoC Reguliuoja skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją per Sąveika su IQGAP1

Anotacija

Mūsų ankstesni tyrimo rezultatai parodė, kad tiek "Ras homologas šeimos narys, C (RhoC) ir IQ domeno GTPase įsijungiantis baltymas 1 ( IQGAP1) buvo per daug išreikštas skrandžio vėžio audinių ir ląstelių, tačiau jų vaidmuo tumorigenensis nebuvo sprendžiamas aiškiai. Čia mes apie proliferaciją stimuliuojantį poveikį RhoC ir IQGAP1 skrandžio vėžio ląsteles ir tarp dviejų baltymų sąveika reguliuojant skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją. Plazmidės ir virusinės konstruktai kodavimo tikslinę siRNA ir DNR buvo naudojami keisti RhoC ir IQGAP1 išraiška. MTT metodas ir BrdU įtraukimas tyrimas buvo naudojamas analizuojant RhoC poveikį ir įvairių struktūrų IQGAP1 apie platinimą. Baltymų koncentracija IQGAP1 ir RhoC ląstelių linijų buvo aptikta Imunoblotingo metodu. IMUNOFLUORESCENCIJOS ir bendradarbiavimo Imunoprecipitacijos tyrimai buvo taikomi ištirti lokalizavimą ir privalomas tarp RhoC ir IQGAP1. Rezultatai parodė, kad RhoC, IQGAP1 ir C-terminalo fragmentas IQGAP1 patikimai stimuliavo skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją, ir pagerino ciklino E ir ciklino D1 išraiška. Priešingai, mažinimas endogeninio IQGAP1 ar RhoC pagal siRNA susilpnintas ląstelių proliferaciją. Iš IQGAP1 išraiška pagal siRNA išeikvojimas žymiai blokavo dauginimosi veiklą constitutively aktyvaus RhoC, o RhoC slopinimo iki siRNA neturėjo IQGAP1 sukeltos platinimo poveikį skrandžio vėžio ląsteles. Bendras imunoprecipitacijos ir IMUNOFLUORESCENCIJOS tyrimai parodė, kad RhoC ir IQGAP1 jungiasi tarpusavyje. Taigi, mūsų rezultatai rodo, kad RhoC stimuliuoja skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją per įdarbinti IQGAP1 kaip efektoriaus

nurodomoji dalis:. Vu Y Tao Y Chen Y Xu W (2012) RhoC Reguliuoja skrandžio platinimu vėžio ląstelės per sąveiką su IQGAP1. PLoS vieną iš 7 (11): e48917. Doi: 10,1371 /journal.pone.0048917

redaktorius: Zoran Culig, Insbrukas medicinos universitetas, Austrija

Įstojo: June 26, 2012; Priėmė: Balandis 2, 2012 m Paskelbta lapkričio 7 d 2012

Visos teisės saugomos: © 2012 VU et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis tyrimas parėmė specializuoti mokslinių tyrimų fondo vyresnysis personalas programa Dziangsi universiteto (11JDG114 Nėra.) ir Nacionalinės Gamtos mokslo fondo Kinijos (31.040.002 Nėra.). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Rho GTPases gali sukelti tam tikrą ląstelėje perduoti signalo ir įtakoti įvairių ląstelių veiklą, įskaitant reorganizavimo aktino citoskeleto, genų transkripcijos, išlikimą, ir platinimu [1], [2]. Nors tris Rho izoformų, RhoA, RhoB ir RhoC, eksponatas daugiau nei 85% amino rūgščių tapatybę, jie suteikia skirtumus funkciją ląstelių [3]. RhoA ir RhoC baltymai buvo įrodyta, kad teigiamą vaidmenį platinimu ir piktybinę transformaciją [4], [5], [6], o pasirodo, kad RhoB vaidmuo šiuose procesuose, kad būtų daugiau skiriasi [7], [8]. Dauguma tyrimų parodė, kad RhoC turėjo daugybę funkcijų naviko metastazių, orchestrating keliais tolesniems vykdomuosius, skilimo ir rekonstrukcijos tarpląsteliniame (ECM) veiksmų. Tačiau lieka tam tikrų nesutarimų apie RhoC vaidmenį reguliuojant ląstelių proliferaciją [9] [10], [11], [12]. Rezultatai nuo Pile laboratorijoje parodė, kad RhoA ir RhoC siRNR atstovauti galingus įrankius slopina vėžio ląstelių proliferaciją, invazinis, bei angiogenezę ir in vitro parsisiųsti ir vivo
[9]. Saulė, ir kt
nustatė, kad naviką injekcija RhoA ar RhoC siRNA į nuogas pelėmis gali slopinti auglio augimą [13]. Priešingai, Faried ir kt
pranešė, kad RhoA skatina naviko augimą daugiau nei RhoC, o RhoC sukelia toli metastazių, palyginti su RhoA [11], susitarusi su šių pastabų Clark ir kolegų [14]. Atliktas tyrimas Ikoma ir kolegomis parodė, kad RhoC neturėjo įtakos naviko augimą, tačiau pagerina metastazavusiu pobūdį plaučių vėžio, stimuliuodamas ląstelių judrumą [10]. Todėl reikia atlikti daugiau tyrimų, kad nustatyti RhoC vaidmenį biologiniam aktyvumui vėžinių ląstelių reguliuoti.

I ketv domeno GTPase įsijungiantis baltymų (IQGAPs) yra svarbūs reguliatoriai korinio procesus, kurie apima citoskeleto pertvarkymų ląstelių migraciją proliferacijos ir citokinezė [15], [16], [17]. IQGAP1 yra vienas iš trijų susijusių žinduolių IQGAPs narių ir keičiasi ląstelėje IQGAP1 išraiškos ar funkcija pranešė pakeisti ląstelių veiklą [17], [18], [19], [20]. Kaip pastolių baltymų, IQGAP1 jungiasi kelis baltymus, tokius kaip Onkogeny beta-kateninai ir Src, naviko slopinamojo E-cad ir Rho GTPases Cdc42 ir Rac1 ir sukelia korinio elgesio pakitimų, ypač vėžinių ląstelių. Mūsų Ankstesnis tyrimas parodė, kad didesnės išraiškos RhoC ir IQGAP1 skrandžio vėžio audinyje buvo žymiai atvirkščiai koreliuoja su skrandžio vėžio ląstelių [21] diferencijavimo. Be to, baltymo koncentracija taip pat buvo susiję su proliferacijos ir migracijos vėžio ląstelių. Taigi, mes iškėlė hipotezę, kad tiek RhoC ir IQGAP1 gali vaidinti svarbų vaidmenį vėžio ląstelių transformaciją ir platinimu ir yra potencialus ryšys tarp jų. Šioje mokslinių tyrimų, mes studijavo RhoC įtaką ir įvairių struktūrų IQGAP1 apie vėžio ląstelių proliferaciją ir ląstelės ciklo susiję baltymų. Mes taip pat tyrė abiejų molekulių santykius bendru taikymo siRNA trukdžių ir virusinės infekcijos technika.

Medžiagos ir metodai

Reagentai

skrandžio vėžio ląstelių linijas BGC-823 [22] ir Afrikos žalia beždžionė inkstų fibroblastų ląstelių linijos COS-7 buvo teikiama iš ląstelių biologijos instituto (Šanchajus, Kinija). Žalioji Fluorescencinis baltymas (GFP) plazmidės ir ląstelių transfekcija reagentas Lipofectamin ™ 2000 buvo iš Invitrogen (Carlsbad, CA); Plazmidės kodavimo vėliava tagged IQGAP1 (pFlag-IQGAP1), vėliava tagged IQGAP1, C-galinę fragmentą (pFlag-IQGAP1-C) ir vėliava tagged IQGAP1 N gale fragmentas (pFlag-IQGAP1-N) ir adenoviruso vektoriai kodavimo ß galaktosidazei (PAD-LacZ), konstitutyviai aktyvus forma RhoC (PAD-RhoC-V14), pilnas ilgis IQGAP1 (PAD-IQGAP1) ir C-galinio fragmentas IQGAP1 (PAD-IQGAP1-C) buvo natūra dovanos iš dr Gerry bosas ir dr Renata Pilz universitete Kalifornijoje, San Diegas, Jungtinės Amerikos Valstijos. Žmogaus-EGF BrdU, pelės anti-BrdU antikūnų, dezoksiribonukleazė aš MTT Hoechst 33342, FITC- ir Cy3 konjuguoto antriniai antikūnai buvo iš Sigma (St Louis, MO). Anti-IQGAP1 antikūnas (nuo N-terminalo fragmentas, 314-422 aa), anti-RhoA antikūnų, anti-IgG antikūnų, anti-CDK1 /CDK2 antikūnų, trumpai kištis RNR (siRNA) už RhoC ir neigiamus kontrolinius buvo iš Santa cruz biotechnologijos (Santa Krusas, Kalifornija). Rho, C siRNR yra 3 taikinius konkretaus 20-25 nt siRNAs baseinas skirtas numušti genų ekspresiją su sekas taip: sequence1, jutimo 5'-CUACUGUCUUUGAGAACUAtt-3'and antiprasmiq 5'-UAGUUCUCAA- AGACAGUAGtt-3 "; sequence2, jutimo 5'-GCAGGAAGACUAUGAUCGAtt-3 'ir antisensines 5'-UCGAUCAUAGUCUUCCUGCtt-3'; sequence3, jutimo 5'-CAC- ACCAGCACUUUAUACAtt-3 "ir antisensines 5'-UGUAUAAAGUGCUGGUGUG- TT-3". Anti-IQGAP1 antikūnas (nuo C-galinio fragmentas, atitinkantis amino rūgščių 863-1657 žmonių IQGAP1) buvo iš Millipore (BILLERICA, MA). Anti-RhoC antikūnų buvo iš Abcam (Cambridge, MA). Anti-cikloniniai B antikūnų buvo iš Bioworld technologijos (St Louis Park, MN). Anti-cikloniniai D1 antikūnų ir anti-cikloniniai El antikūnų buvo iš Boster (Wuhan, Kinija). Už IQGAP1 siRNR buvo susintetintas Qiagen (Valencia, CA), taikinys seka buvo IQGAP1 5'-AAGTTCTACGGGAAGTAATTG-3 "(5058-5078 BP). Krienų peroksidazės (HRP) konjuguoto vidurinė antikūnų buvo iš Rockland Immunochemicals (Gilbertsville PA). Baltymai g Plius /Baltymų A agarozės buvo iš CalBiochem (San Diego, CA). Electrochemiluminescence (ECL) reagentai buvo iš Millipore (BILLERICA, MA). Visi naudojami reagentai šiame tyrime buvo analiziškai gryni.

Mobilusis Kultūra, transfekcijq ir Infekcija

BGC-823 ir COS-7 ląstelės buvo auginamos 1 × Dulbecco modifikuota Eagle terpėje (DMEM) su papildomu su 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS), esant 37 ° C temperatūroje 5% CO _{2 atmosferoje. Vidutinės buvo keičiami kas antrą dieną, o ląstelės buvo subrangos kultivuojamos santakoje. Dėl transfekciją, ląstelės buvo subrangos kultūringas dieną prieš procesą ir skrandžio vėžio ląstelių transfekcija su plazmidžių arba siRNR buvo atliekamas pagal gamintojo nurodymus. Infekcijos, 293A ląstelės buvo pernešta su adenoviruso vektorių PAD-lacZ, padas-RhoC-V14, padas-IQGAP1 ir PAD-IQGAP1-C ir virusinės dalelės, išgautos pagal ląstelių buvo surinktos ir sustiprina. Virusai buvo pavadintas Ad-lacZ, skelbimų RhoC-14, Ad-IQGAP1 ir Ad-IQGAP1-C, atitinkamai ir buvo naudojamas užkrėsti BGC-823 ląstelių. Dieną prieš infekcijos, BGC-823 ląstelės buvo šviežiai pasėjamos 70-80% santakoje ir infekcija procesas atliekamas pagal gamintojo nurodymus dėl antrą dieną.}

Imunoblotingo

Kultūringas ląstelės tris kartus buvo plaunamos PBS ir lizuojamos Ripa buferiniu tirpalu (50 mM tris-HCl, pH 7,4, 1% (v /v) Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM leupeptiną, 1 mM fenilmetilsulfonilfluoridą fluorido, 10 mM NaF 1 mmol Na _{3VO 4). Lygios sumos baltymų buvo atskirtos 8% arba 12% SDS-PAGE pagal baltymų molekulinės masės. Pirminiai antikūnai buvo inkubuojami per naktį esant 4 ° C, ir atitinkami antriniai antikūnai buvo inkubuojami 1 h kambario temperatūroje. Trys plovyklos buvo atliekami su TBS /T po kiekvieno antikūnų inkubacijos. ECL reagentai buvo naudojamas parodyti teigiamus juostas ant membranos.}

MTT

0,5-1 × 10 ^{3cells 150 įxL terpė buvo padengtas į šulinį 96-gerai plokštės. Po to, kai priedą, ląstelės buvo užkrėstas su atitinkamo adenoviruso 48 h, arba transfekuota su siRNA 72 h, atitinkamai. Į kombinaciją grupių, ląstelės buvo transfekuota su siRNR taikymo RhoC arba IQGAP1 24 h ir tada užkrėstas su Ad-IQGAP1-C /Ad-IQGAP1 arba Ad-RhoC-V14 už papildomą 48 h 37 ° C temperatūroje 5% CO _{2. Išauginti ląstelės buvo išplauti su PBS, gydomi 20 pL MTT (0,5 mg /ml), ir tada inkubuojamas 37 ° C temperatūroje 1 val. Vidutinės buvo pašalintas ir 100 mikrol, dimetilsulfoksido (DMSO) buvo pridėta į kiekvieną šulinėlį. Absorbcija buvo nustatomas 490 nm, naudojant microplate skaitytuvą. Visi tyrimai buvo atliekami tris kartus.}}

BrdU registracija Analizės

DNR sintezė lygis buvo matuojamas BrdU steigimo imr.rnofluorescencija. Kristalizavimo inicijavimą suma ląstelių kiekis buvo koreguotas siekiant pasiekti 70-80% santakoje tankumą transfekcijos dieną. Plazmidės pFlag-IQGAP1, pFlag-IQGAP1-C arba pFlag-IQGAP1-N buvo bendrai perkeltų su GFP plazmidės į bgc-823 ląstelių naudojant Lipofectamin ™ 2000, kaip aprašyta aukščiau. , Po 24 valandų transfekciją, ląstelės buvo serumo-alkanas per naktį, gydomi 200 μ
M BrdU ir inkubuojami apie 16 h. Po to ląstelės buvo plaunamas PBS, nustatyta iš šviežiai paruošto 4% (v /v) paraformaldehidas kambario temperatūroje 10 min, ir padarytos laidžiomis su 0,5% (v /v) Triton X-100, po to inkubacijos su DNaze I (0,5 U /mikrol) 30 minučių esant 37 ° C temperatūroje. Ląstelės buvo inkubuojami su pirminiais antikūnais prieš BrdU per naktį 4 ° C temperatūroje, vėliau Cy3-konjuguoto antrinio antikūno 1 valandą, o kambario temperatūroje. Galiausiai branduoliai buvo Skaitliukas tamsintas su Hoechst 33342 15 minučių, nuplauti PBS tris kartus ir vizualizuoti fluorescencinių mikroskopu. Kiekvienas tyrimas buvo atliktas Quadruplet ir kartojamas tris kartus.

Bendras imunoprecipitacijos

Jei ištirti ryšį tarp RhoC ir IQGAP1, COS-7 ir sąveiką bgc-823 ląstelės buvo infekuoti ad IQGAP1 arba Ad-IQGAP1-C ir Ad-RhoC-V14 už 48 val ir tada buvo lizuoti su Ripa buferio, kaip aprašyta. Antikūnas prieš RhoC, IQGAP1 arba izotipo suderintos IgG kiekis buvo naudojamas Imunoprecipitacijos, atitinkamai. Immunoprecipitates buvo analizuojami imunoblotingo, kaip nurodyta pirmiau, naudojant anti-RhoC arba anti-IQGAP1 antikūnų.

IMUNOFLUORESCENCIJOS mikroskopija

ląstelės išauginti dangtelis lapeliai buvo nustatytos su šviežiai paruošto 4% (v /v ) paraformaldehidas PBS 15 min, laidžiomis su 0,3% Triton X-100-PBS 10 min, ir užblokuotas su 3% (m /t) jaučio serumo albuminas (BSA) PBS. Už IMUNOFLUORESCENCIJOS, ląstelės ant dengiamosios lapeliai buvo iš eilės inkubuojamas su triušio polikloninio antikūno prieš IQGAP1, esant 4 ° C temperatūroje per naktį, FITC konjuguoto ožkos anti-triušio IgG už 1 h kambario temperatūroje, pelės monokloniniai antikūnai prieš RhoC 2 val kambario temperatūroje, ir pagaliau ožkos anti-pelės IgG konjuguoto su Cy3 1 val kambario temperatūroje. Trys plovyklos buvo atlikti po kiekvieno antikūnų inkubacijos. Branduolys buvo kovos su tamsintas su Hoechst 33342. Rezultatas buvo stebimas pagal fluorescencijos mikroskopu suformuotą su CCD kamera (Leica).

Statistinė analizė

duomenys buvo analizuojami naudojant dviejų uodega ANOVA arba Studento , T
-test su SPSS statistikos programinė įranga, išreikštas reiškia ± standartinis nuokrypis (SD). P
. ≪ 0,05 buvo laikomas reikšminga

Rezultatai

RhoC skatino BGC-823 ląstelių

iš RhoC poveikis ląstelių proliferacija platinimu taip pat tiriami. BGC-823 ląstelės buvo užsikrėtę adenovirusinė kodavimo constitutively aktyvaus RhoC ir ląstelių proliferacija buvo aptikta MTT. Rezultatai parodė, kad RhoC taip pat skatinama skrandžio vėžio ląstelių BGC-823 platinimu. Per išraiška RhoC-V14 į BGC-823 ląstelių sukėlė 48,7% padidinti ląstelių proliferaciją (1a. Ir B pav). Tuo tarpu, išeikvojimas RhoC iki siRNA sumažino BGC-823 ląstelių proliferaciją 43,1% (1C pav. Ir D).

IQGAP1 sustiprino BGC-823 ląstelių proliferaciją

(1) rezultatai MTT.

Jei įvertinti IQGAP1 prisidėti prie platinimo, MTT buvo naudojamas aptikti skrandžio vėžio ląstelių linijos BGC-823 gyvybingumą. Rezultatai parodė, kad, lyginant su kontrolinės ląstelių (Ad-LacZ grupė), aukštos raiškos, C-galinių fragmentu IQGAP1 (Ad-IQGAP1-C grupė), arba visą ilgį IQGAP1 (Ad-IQGAP1 grupė) glaudesnio ląstelių proliferacija 116%, o 39%, atitinkamai ( *
P < 0,05, *
P. < 0,05, pav 2A ir B). Priešingai, N-terminalas fragmentas IQGAP1 neturi akivaizdaus poveikio dėl ląstelių proliferaciją. Kita vertus, trukdžių iš IQGAP1 išraiškos su siRNA sumažino ląstelių proliferaciją 43%, lyginant su neigiamos kontrolės ( *
P. ≪ 0,05, pav 2C ir D). Šie rezultatai parodė, kad IQGAP1 galėjo paspartinti ląstelių proliferaciją; veiklioji domenas buvo įsikūrusi C-terminalo fragmentu baltymų.

(2) rezultatai BrdU pridėjimo metodu.

bromdeoksiuridino įtraukimas tyrimas buvo pažymėta per reaguojant, pobūdis panašus į stebėtą MTT. Išraiška vėliavos IQGAP1 ir vėliavos IQGAP1-C gerokai paaukštintas DNR sintezę lygius beveik 1-flod ir 2 kartus nei buvo pastebėta su vėliava D1 (* p < 0,05, * p. ≪ 0,05, pav 2E ir F) , o IQGAP1-N nebuvo parodyta jokių poveikį DNR sintezei, o tai rodo, kad IQGAP1 skirtingai reguliuoja DNR sintezę per įvairiose srityse.

asociacija tarp RhoC ir IQGAP1 skatinant neplatinimo BGC-823 ląstelių

(1) RhoC ir IQGAP1 nepaveikė išraiškos tarpusavyje.

pirmiau pateikti rezultatai aiškiai rodo, kad tiek RhoC ir IQGAP1 prisidėjo prie BGC-823 ląstelių proliferaciją. Siekiant išsiaiškinti galimą ryšį tarp RhoC ir IQGAP1 reguliuojant ląstelių proliferaciją, mes pirmiausia ištirti jei IQGAP1 ir RhoC įtakos jų išraiška vienas kito. BGC-823 ląstelės buvo pernešta su siRNA į triuškinantis į RhoC ar IQGAP1 išraiška, ir tada buvo užsikrėtę adenovirusinė kodavimo IQGAP1, IQGAP1-C arba constitutively aktyvaus RhoC atitinkamai. Imunoblotingu buvo taikomas siekiant nustatyti, ar keičiant išraiška ir aktyvumą vieno baltymo gali turėti įtakos kitos baltymų arba ne išraiška. Rezultatai parodė, kad didinant egzogeninė ar triuškinantis endogeninio IQGAP1 ar IQGAP1-C, neturėjo įtakos RhoC išraiška. Be to, didėja constitutively aktyviai RhoC ar įsikišimas endogeninio RhoC nebuvo paveikti IQGAP1 ar IQGAP1-C (pav. 3A). Raišką

(2) IQGAP1 buvo iš RhoC efektorinių skatinant platinimu ląstelių.

MTT buvo naudojamas išsiaiškinti ryšį tarp RhoC ir IQGAP1 santykį skatinant platinimu. Rezultatai parodė, kad RhoC-siRNR turėjo ne akivaizdaus poveikio dėl proliferacijos, kurį sukelia IQGAP1 (** p < 0,01, 3B pav.). Tačiau išeikvojimas IQGAP1 išraiška pagal siRNA blokavo platinimu sukelia išraiškos constitutively aktyvaus RhoC (* p < 0,05, ** p < 0,01 pav 3c.). Tai rodo, kad siekiant skatinti proliferaciją BGC-823 ląstelių proceso metu, RhoC reikėjo IQGAP1 dalyvavimą. Be to, kadangi RhoC anketa poveikis privalo IQGAP1 o IQGAP1 anketa poveikis nereikėjo RhoC, RhoC gali būti, kad IQGAP1 tiekėjų ir paėmė IQGAP1 kaip vykdymo elemento.

poveikis RhoC ir IQGAP1 nuo ląstelės ciklo Susiję baltymų

Jei dar patvirtinti platinimu stimuliuojantį poveikį RhoC ir IQGAP1 ir ištirti galimą mechanizmą, per kurį šie baltymai reguliuoja ląstelių proliferaciją, mes taikomas Imunoblotingo aptikti ląstelių ciklo susijusių baltymų ekspresiją ląstelėse gydomi metodais didėja ar mažėja RhoC ir IQGAP1. Rezultatai parodė, kad RhoC ir IQGAP1 padidėjimas paskatino cikloniniai E ir ciklino D1 išraišką, kol jis neturėjo apie ciklino B ir CDK1 /2 išraiškos poveikį. Kita vertus, RhoC ir IQGAP1 sumažėjimas slopino ciklino E ir ciklino D1 išraiška. Tuo tarpu, atsižvelgiant į RhoC yra nuslopinami atveju pagal siRNA, vis IQGAP1 arba IQGAP1-C vis dar padidinti nuo ciklino E ir ciklino D1 (4 pav.) Išraiška. Disertacija rezultatai parodė, kad RhoC ir IQGAP1 gali reguliuoti platinimu per keičiant ląstelės ciklo susiję baltymo ekspresiją ir sukelia daugiau ląstelių įvesti S fazę.

RhoC ir IQGAP1 Bendras lokalizuota ir Bound tarpusavyje ląstelių

Imunofluorescentinis ir bendradarbiavimo imunoprecipitacijos metodas buvo taikomas toliau nagrinėti galimas privalomas tarp RhoC ir IQGAP1. Tiek BGC-823 ir COS-7 ląstelės buvo infekuoti Ad-IQGAP1 ir Ad-RhoC-V14 ar Ad-IQGAP1-C ir Ad-RhoC-V14 48 h, o bendras ląstelių lizatas buvo immunoprecipitated su anti-RhoC antikūno ir tyrinėjo su antikūnais prieš IQGAP1 arba immunoprecipitated su anti-IQGAP1 antikūnų ir tyrinėjo su antikūnais prieš RhoC, atitinkamai. Rezultatai parodė, RhoC ir IQGAP1 jungiasi tarpusavyje, su C-galinio fragmento IQGAP1 kaip privalomą svetainėje RhoC (. 5A ir C pav). Be to, Imunofluorescentinis tyrimas atskleidė, kad IQGAP1 buvo platinamas daugiausia citoplazmą, kur jis bendrai lokalizuota su RhoC (pav. 5B ir D).

Diskusijos

Nevaldomas vėžio ląstelių proliferacija reikalauja koordinuoto ir Šis procesas griežtai reguliuojamas funkcija iš daugelio baltymų [23], [24], [25], [26]. Ji yra, todėl, labai svarbu mokytis tai, kaip tie baltymai sąveikauja reguliuojant vėžys ląstelių proliferaciją mechanizmą. Mūsų ankstesni rezultatai dokumentuojami, kad IQGAP1 ir RhoC išraiška buvo padidinti skrandžio vėžio audiniuose ir vėžio ląstelių linijų [21]. Jų išraiškos lygis turėjo didelę koreliaciją su vargšais diferenciacijos skrandžio vėžio. Tačiau tai ne visai aišku, ar IQGAP1 ir RhoC yra susijęs su ląstelių proliferacija tumorigenensis. Šiame tyrime sąvoka lygio IQGAP1 ir RhoC ir jų biologiniu aktyvumu, skrandžio vėžio ląstelių linijos BGC-823 buvo pritaikytos per infekcijos adenoviruso konstruktai ar transfekciją su plazmidžių DNR arba siRNA. Iš ląstelių proliferacija tada buvo tiriamas naudojant BrdU steigimą tyrimą ir MTT metodą. Rezultatai parodė, kad constitutively aktyvus RhoC gerokai skatino platinimo veiklą skrandžio vėžio ląstelių linijos BGC-823 ir išeikvojimas RhoC iki siRNA slopino bruožų. Tyrimo duomenys parodė, kad RhoC turėjo svarbų vaidmenį ląstelių migracijos ir metastazių [27], [28] [29] [30], [31], tačiau būta prieštaravimų dėl to, ar RhoC reguliuoti transformavimo ir platinimo procesą naviko ląstelėse [27], [29], [32]. Mūsų rezultatai pateikti įrodymų, kad RhoC turiu platinimo skatinant poveikį skrandžio vėžio ląsteles. Tai bus naudinga remiantis būtų aiškinamasi RhoC vaidmenį reguliuojant platinimu vėžinių ląstelių.

Mūsų rezultatai parodė, kad panašus į RhoC, per išraiška egzogeninės IQGAP1 ir IQGAP1-C taip pat skatino platinimu BGC-823 ląstelių, o triuškinantis endogeninio IQGAP1 susilpnintas dauginimąsi gebėjimas ląstelę, nurodant, kad IQGAP1 taip pat prisideda prie ląstelių proliferaciją reglamentą. Atsižvelgiant į tai, kad tiek RhoC ir IQGAP1 turi vaidmenį reguliuojant platinimu vėžinių ląstelių ir jų išraiškos stipriai koreliavo, mes toliau nagrinėti funkcinę asociaciją tarp RhoC ir IQGAP1. Rezultatai parodė, kad BGC-823 ląstelių su knock-žemyn IQGAP1 išraiškos, infekcija su adenovirusinė kodavimo constitutively aktyvaus RhoC negalėjo stimuliuoti platinimo veiklą nebėra; o BGC-823 ląstelių su knock-žemyn RhoC išraiškos, per išraiškos IQGAP1 arba IQGAP1 C per užkrėsti ląsteles adenovirus koduojančių atitinkamą DNR dar sukelia didesnį platinimo veiklą. Tai rodo, kad RhoC vairavo naviko proliferaciją per IQGAP1, ypač per C-galinio fragmento IQGAP1. Toks funkcinis ryšys tarp RhoC ir IQGAP1 toliau buvo remiama bendradarbiavimo Imunoprecipitacijos ir IMUNOFLUORESCENCIJOS. Šie rezultatai rodo, kad RhoC paėmė IQGAP1 kaip reguliuojant vėžinių ląstelių proliferaciją, mesdamas naują užuominą apie šių baltymų santykių vykdymo elemento.

Jei pirmiausia ištirti pasroviui mechanizmą, per kurį RhoC /IQGAP1 reguliuoti skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją mes tyrė RhoC /IQGAP1 poveikis ląstelės ciklą, susijusių baltymų raiškos, įskaitant ciklino E, ciklino D1, ciklino B ir ciklino priklausomo kinazės (CDK). Rezultatai parodė, kad tiek RhoC ir IQGAP1 skatino ciklino E ir ciklino D1 išraiška, bet neturėjo dėl ciklino B ir cdk išraiškos poveikį. Iš eukariotinių ląstelių proliferacija yra kontroliuojama konkretiems kiekis ląstelės cikle, ypač per pirmąjį tarpo fazės (G1) į DNR-sintetinis fazės (S), o antroji tarpo fazės (G2) į mitozės (M) perėjimų. Iš kurių, G1-S perėjimai yra pagrindinis reguliavimas punktas iš ląstelės ciklo. CIKLONAS D1 ir cikloniniai El kontroliuoti ląstelių progresiją skatinant G1 į S fazę ląstelės ciklo. Mūsų rezultatai rodo, kad kai RhoC buvo aktyvuota tarpląstelinio ar ląstelėje signalo, jis privalo IQGAP1 ir tada turėjo įtakos ląstelės ciklo susijusių baltymų ekspresiją tiesiogiai ar netiesiogiai per kai neaiškiomis signalo perdavimo žingsnių, kurie ilgainiui galėtų sukelti ląstelių progresavimo kaitą ir proliferacija (6 pav.).

Taigi, šie duomenys iš dabartinio tyrimo, kartu su anksčiau paskelbtais duomenimis [21], patvirtina hipotezę, kad RhoC dalyvauja tiek migracijos ir proliferacijos skrandžio vėžio ląsteles. IQGAP1 taip pat dalyvauja į vėžio ląstelių proliferaciją reguliavimą kaip vartotojų vykdymo elemento iš RhoC. Šie duomenys gali šviesti šviesos dėl terapinių metodų plėtros skrandžio vėžio.

Padėka

Mes dėkojame dr Gerry Boss dr Renate Pilz universitete Kalifornijoje, San Diego, CA, JAV, už natūra dovanos adenoviruso konstruktų.

• PLoS ONE: polimorfizmai ERCC1 ir XPF genų ir rizika skrandžio vėžio su Rytų Kinijos gyventojų
• PLoS ONE: Įm IV yra tiesioginis Tikslinė žarnyno transkripcijos faktoriaus CDX2 skrandžio vėžio