Stomach Health > skrandžio sveikatos >  > Gastric Cancer > skrandžio vėžys

PLoS ONE: Įm IV yra tiesioginis Tikslinė žarnyno transkripcijos faktoriaus CDX2 skrandžio vėžio

Anotacija

REG4
, kuris koduoja taisyklė IV baltymų, yra kalcio priklausomą lėktino narys superšeimai ir stiprus aktyvatorius iš epidermio augimo faktoriaus receptoriaus /Akt /aktyvatorius baltymų-1 signalizacijos kelią. Keli žmogaus vėžio superekspresuotų Reg IV ir taisyklė IV išraiška yra susijusi su žarnyno fenotipas diferenciacijos. Tačiau reguliavimas REG4
transkripcija lieka neaiškus. Šioje studijoje, mes ištirti, ar CDX2 reguliuoja taisyklė IV išraišką skrandžio vėžio (GC) ląsteles. Išraiška Reg IV ir CDX2 buvo analizuojami Vakarų dėmė ir kiekybinės atvirkštinės transkripcijos-polimerazės grandinės reakcijos 9 GC ląstelių linijas ir 2 gaubtinės žarnos vėžio ląstelių linijų. Iš 5'-gretutinė regione REG4
geno buvo būdingas liuciferazės tyrimo funkcija. 9 GC ląstelių linijų, endogeninė Įm IV ir CDX2 išraiška buvo gerai koreliuoja. Naudojant estrogenų receptorių reguliuojama formą CDX2, greitas indukcija Įm IV išraiška buvo pastebėtas HT-29 ląstelių. Reporter genų tyrimai atskleidė svarbų vaidmenį transkripcija sutarimas CDX2 DNR privalomas elementus 5'-gretutinė regione REG4 pervežimas geno. Chromatino Imunoprecipitacijos tyrimai parodė, kad CDX2 jungiasi tiesiai į 5'-gretutines regione REG4
. Šie rezultatai rodo, kad CDX2 baltymų tiesiogiai reguliuoja taisyklė IV išraišką

nurodomoji dalis:. Naito Y Oue N Hinoi T Sakamoto N Sentani K Ohdan O et al. (2012) taisyklė IV yra tiesioginis Tikslinė žarnyno transkripcijos faktoriaus CDX2 skrandžio vėžio. PLoS vieną iš 7 (11): e47545. Doi: 10,1371 /journal.pone.0047545

redaktorius: Wael El-Rifai, Vanderbilt universiteto medicinos centras, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: Gegužės 24, 2012; Priimta rugsėjo 12, 2012 m Paskelbta: Lapkričio 2, 2012

Visos teisės saugomos: © 2012 Naito et al. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė dotacijos-in-pagalbos moksliniams tyrimams iš švietimo, kultūros, mokslo, sporto ir technologijos Japonijos ministerijos, o iš dalies, dotacijos-in-pagalbos trečią Visuotinį 10 metų strategija vėžio kontrolės ir vėžio tyrimų iš sveikatos apsaugos, darbo ir gerovės, Japonija, ministerijos ir nacionalinio instituto Biomedicininės inovacijų (programos skatinimo pagrindinių studijų sveikatos mokslų). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys (GC) yra vienas iš labiausiai paplitusių žmogaus vėžio pasaulyje. Vėžys išsivysto kaip daugelio genetinių ir epigenetinių pokyčių [1] rezultatas. Mes anksčiau vykdyta serijos analizę genų ekspresiją (SAGE) iš keturių pirminių GCS ir nustatė keletą GC-specifinė genų [2]. Šių genų regeneruoja Islet kilmės šeimos narys 4
( REG4
, kuris koduoja taisyklė IV baltymų) yra kandidatas genų vėžio konkrečių išraiškos [3]. REG4
yra narys reg
genų šeima, kuri priklauso kalcio priklausomą lėktino superfamily. REG4
iš pradžių buvo žymimas didelio našumo sekos analizės didelio uždegiminės žarnų ligos kDNR bibliotekos [4]. Taisyklė IV yra stiprus aktyvatorius iš epidermio augimo faktoriaus receptorių (EGFR) /Akt /aktyvatoriaus baltymą-1 (AP-1) signalinio kelio į gaubtinės žarnos vėžio ląstelėse ir padidina išraiška Bcl-2, Bcl-XL ir survivin, kuris yra baltymai, susijęs su apoptozės slopinimo [5]. Stiprinimas REG4
genas buvo pranešta kasos vėžiu [6]. Taisyklė IV buvo įvardyta kaip vienas iš genų iki reguliuojamų vėžiu susidarymą ląstelėse [7]. Mes jau anksčiau išnagrinėjo priverstinio išraiška Reg IV poveikį GC ląstelių linija. Mes parodėme, kad taisyklė IV slopina 5-fluorouracilu (5-FU) indukuotų apoptozę per EGFR aktyvacijos GC ląstelių [8]. Priešingai, taisyklė IV-ekspresija ląstelės neparodė reikšmingų skirtumų platinimu ir invazijos veiklos, palyginti su ląstelėmis perkeltų su tuščiu vektoriumi [8]. Šie duomenys paremti mintį, kad taisyklė IV baltymas dalyvauja skrandžio kancerogenezėje

GC galima suskirstyti į keturias fenotipų pagal mucino išraiška. Skrandžio ar foveolar fenotipas; žarnyno fenotipas; žarnyno ir skrandžio mišri fenotipas; ir nei skrandžio, nei žarnyno fenotipas [9]. atrodo skirtingi genetiniai pokyčiai turi būti susijęs su skrandžio ir žarnyno fenotipas GC [10]. Mūsų ankstesnes pastabas, taisyklė IV buvo išreikšta 30% GC atvejais ir koreliavo su žarnyno fenotipą [11]. Iš Imunohistocheminiais analizės Reg IV skaičius buvo pranešta apie žmogaus vėžio [11] - [20]. Apskritai, šios analizės pranešė, kad taisyklė IV išreiškiamas adenokarcinoma ląstelių rodydami žarnyno fenotipą. , Buvo pastebėta, kad taisyklė IV išraiška yra sukeliama GLI1, kuri yra pagrindinis transkripcijos faktorius the Hedgehog signalinio kelio [21], arba augimo faktoriais, pvz EGF, transformuojančio augimo faktoriaus-alfa (TGF-alfa), hepatocitų augimo faktorių (HGF), arba bazinė fibroblastų augimo faktoriaus (bFGF) [22]. Tačiau šie molekulės yra mažai tikėtina, kad būtų atsižvelgta į tarp Įm IV saviraiškos ir žarnyno fenotipas diferenciacijos asociacijos.

Mes jau anksčiau nustatė, kad išraiška Reg IV koreliavo su CDX2 išraiška [11]. CDX2 yra žinduolių uodegos susijusių žarnyno transkripcijos faktorius, ir svarbu, kad epitelinių ląstelių [23], [24] priežiūros. Kai kurie faktai rodo, kad žarnyno metaplazija skrandžio ir žarnyno fenotipas GC yra susiję su negimdinio CDX2 išraiškos [9], [25]. Šioje studijoje, mes ištirti, ar CDX2 reguliuoja taisyklė IV išraišką GC ir nustatė, kad CDX2 tiesiogiai jungiasi su 5'-gretutinė regione REG4 pervežimas geno ir stiprina rengėjas veiklą.

Rezultatai

Įm IV ir CDX2 išraiška yra susiję GC Cells

pirmasis tirtų indukciją Įm IV išraiškos CDX2 GC ląstelių linijų. Western Blot analizė CDX2 į 9 GC ląstelių linijų parodė, kad ne arba žemo lygio išraiška CDX2 buvo aptikta MKN-7, TMK-1, SSK-44PE, ir KATO-III (1A pav.). Norėdami nustatyti, ar CDX2 ir taisyklė IV išraiška buvo sandariai koreliuoja GC ląstelių, Vakarų dėmė ir kiekybinės atvirkštinės transkripcijos-polimerazės grandininės reakcijos (KRL-PGR) analizė Reg IV buvo atlikti 9 GC ląstelių linijų. Kaip parodyta Fig. 1A, taisyklė IV baltymo ekspresija buvo aptiktas tik 3 ląstelių linijų su aukšto lygio REG4
nuorašai išmatuotas KRL-PGR. Iš 5 GC ląstelių linijų su CDX2 baltymų ekspresijos, 2 ląstelių linijas (MKN-1 ir MKN-28) trūko aptikti išraišką REG4
nuorašai ir baltymų. Ląstelių linijų su neaptinkamas CDX2 baltymų raiškos (MKN-7, TMK-1, SAK-44PE ir KATO-III), neparodė, REG4
nuorašai ar baltymai (1a pav.).

be to, mes generuoja polikloninį gyventojų MKN-7, TMK-1, HSC-44PE ir KATO-III ląstelių išreiškė aukštą CDX2 infekcija ląstelių su replikacinėmis defektais retrovirusų vežančių pilnametražis žmogaus CDX2 kDNR, nes ne arba žemo lygio išraiška CDX2 buvo aptikta šių ląstelių linijų. Tačiau padidėjusią CDX2 nepavyko aktyvuoti taisyklė IV išraiškos Vakarų dėmė (duomenys neparodyti). Kadangi tai yra įmanoma, kad vien CDX2 nepakanka aktyvuoti taisyklė IV išraiška, išraiška, CDH17
(kodavimas LI-cad baltymas), kuris yra vienas iš CDX2 [24] tikslų, taip pat buvo tiriami. Tačiau aktyvacijos Li-cad išraiškos nerastas MKN-7, TMK-1, SAK-44PE ir KATO-III ląstelės išreiškiantys aukšto lygio CDX2 (duomenys neparodyti). Kadangi mes parodė aktyvacijos Li-cad išraiškos CDX2 į HT-29 gaubtinės žarnos vėžio ląstelių linijos [24], indukcija Įm IV išraiška buvo tiriamas paties ląstelių linija. Kaip parodyta Fig. 1B, indukcija Įm IV išraiška buvo aptiktas HT-29 ląstelių užsikrėtusių retrovirusų vežančių pilnametražis žmogaus CDX2 kDNR. Mes taip pat generuoja polikloninio populiaciją SW480 (gaubtinės žarnos vėžio ląstelių linijos) ekspresuojančių ląstelių, aukšto lygio CDX2 infekcija iš ląstelių, turinčių replikacijos defektu retrovirusų, turintiems pilno ilgio žmogaus CDX2 cDNR. Kaip parodyta Fig. 1B, indukcija Įm IV išraiška buvo rastas SW480 ląstelių užsikrėtusių retrovirusų vežančių pilnametražis žmogaus CDX2 kDNR. Šie rezultatai rodo, kad taisyklė IV išraiška gali būti sukeltas CDX2 ląstelių linijų, gautų iš gaubtinės žarnos vėžio. Kadangi žarnyno metaplazijos skrandžio, CDX2 ir Įm IV išraiška yra gerai koreliuoja [11], iš storosios žarnos vėžio ląstelių linijos naudojimas gali būti tinkamas žarnyno metaplazijos modelį.

Kad geriau įvertinti tarp santykius CDX2 ir taisyklė IV išraiška, mes studijavo taisyklė IV išraišką HT-29-gauto laikantis griežtai reguliuojamas CDX2 veikla. Mes naudojome polikloninį HT-29 ląstelių liniją, kuri buvo transdukuotus su pCDX2-ER vektorių. PCDX2-ER vektorius koduoja chimerinj baltymų, kurioje pilnametražis CDX2 sekos yra lydyto prieš mutavusių estrogenų receptorių (ER) ligandų surišančio domeno. Mutuotos ER ligando-partnerio rišantis domenas nebėra jungiasi estrogenų, bet išlaiko gebėjimą surišti tamoksifeno. Gydymas HT-29 /CDX2-ER ląstelių linijos su 4-hydroxytamoxifen (4 oht) lėmė stiprus indukcijos Įm IV baltymų raiškos per 48 valandas (pav. 1c). Šie rezultatai rodo, kad taisyklė IV yra tiesioginis arba pirminė tikslinė genas reguliuoja CDX2. Tačiau vien CDX2 nepakanka aktyvuoti taisyklė IV išraiška.

slopinimas CDX2 pagal RNR interferencijos (RNRi) rezultatų Down-reguliavimo Reg IV GC Cells

Norėdami nustatyti, ar CDX2 būtina taisyklė IV raiškos GC ląstelių, mes išanalizavo slopina CDX2 ekspresiją RNAi į Įm IV išraiškos lygio SAK-39 ląstelių linijos, nes aukštos endogeninė CDX2 ir taisyklė IV išraiška buvo aptiktas SAK-39 ląstelių linijos poveikį. CDX2 konkrečių mažų trukdančių RNR (siRNAs) reikšmingai slopino CDX2 baltymo ekspresija 3 dienas po transfekciją ir išraiška Įm IV stenograma buvo iki CDX2 siRNAs žemyn reguliuojama apie 50% į SSK-39, palyginti su lygių kontrolės siRNA gydytų ląstelių ( 1D pav.). Šie rezultatai rodo, kad CDX2 dalyvauja palaikant taisyklė IV genų ekspresiją.

Funkcinis apibūdinimas 5'-gretutines regionas, REG4
geno liuciferazės prabavimo

Jei nustatyti galimą CDX2 -binding svetainių buvo atliekama REG4
rengėjas regionas, iš genomo sekų iš karto 5 "į Numanomų transkripcija starto svetainėje paieška, naudojant bendrą sutarimą privalomas elementas CdxA vištienos uodegos pervežimas homologas (5'-A, A /T, T, A /T, A, T, A /G-3 ') [26] ir anksčiau aprašyta paieškos algoritmas [27]. Mes nustatėme, keturis spėjamus CDX2 privalomos svetaines 2 kilobase (KB) 5'-gretutines regionas REG4
genų (Pav. 2a). Tai buvo: svetainė A (5'-AATAATA-3 ", nuo -1828 iki -1834) B svetainė (5'-CTTTACAG-3", nuo -901 iki -908), svetainė, C (5'-TTTTATGG-3 "nuo -114 iki -121), svetainės D (5'-AATAATA -3", nuo -90 iki -96). Įvertinti šių įtariamų CDX2 privalomos svetainių vaidmenį reguliuojant REG4
transkripcija buvo sukurtas įvairių reporteris genų konstruktai. Kaip parodyta Fig. 2B, genas reporteris konstruktai, kurių sudėtyje yra 2.1, 1.2, arba 0.6 KB 5'-gretutines seka iš REG4
genas smarkiai veiklos SSK-39 ląstelių, kurios rodyti stiprų vidinį išraišką REG4
nuorašai ir baltymų. Palyginimui, MKN-1 ląstelės turi tiek vidinį REG4
stenogramą ir rodomas mažai arba visai nėra transkripcijos veikla sukeltas 2.1, 1.2, arba 0,6 kb REG4
Reportažai genų konstruktai (duomenys nebus rodomas) , REG4
Reportažai genų konstruktai, kurių sudėtyje yra bazinių porų -116 iki +58 ir -87 iki +58 sumažino aktyvumas SAK-39 ląstelių (pav 2b.), Nurodant, kad sekas tarp bazinių porų -634 ir - 116 vaidina pagrindinį vaidmenį aktyvuojant REG4
transkripciją. Be to, mes analizuojami vienviečiai ir kelis mutacijas įtariamų CDX2 privalomos svetainių į 5'-gretutinė regione REG4 pervežimas geno naudojant SAK-39 ląstelių (pav. 2c). Kaip ir tikėtasi, įtariamų CDX2 privalomos svetainė C, kuris yra tarp bazinių porų -634 ir -116, vaidina lemiamą vaidmenį aktyvuojant REG4
transkripcija.

CDX2 Tiesiogiai jungiasi prie 5 ' -flanking regionas, REG4
Genų

Jei išanalizuoti, ar CDX2 tiesiogiai jungiasi prie spėjamo CDX2 privalomos svetainių REG4
5'-gretutines regionas, mes atlikto chromatino imunoprecipitacijos (Chip) tyrimai naudojant SAK-39 ląstelių. Naudojant 6 gruntai REG4
5'-gretutines regionas (3A pav.), Mes atsigavo DNR fragmentų, kurių sudėtyje yra REG4
5'-gretutines regioną gruntas 1, kuris apimtų spėjamasis CDX2- jungimosi vietos C (3B pav.). DNR fragmentai iš 5'-gretutines regione REG4
, kuris buvo sukurtas naudojant pradmenis 2, 3, 4, 5 ir 6 taip, kad jose nebuvo spėjamasis CDX2 privalomus svetainių, nebuvo išieškotos Kovos su CDX2 antikūnas. Iš išieškojimo ypatumai REG4
rengėjas regionas po Chip su Anti-CDX2 antikūnų buvo parodyta tai, kad kiti neturi reikšmės DNR fragmentai trūksta CDX2-jungimosi vietų (pavyzdžiui, Exon 3 CDX1
genas) nebuvo išieškota (pav 3b.). Be to, maketas imunoprecipitacijos (pelės IgG) davė keletą REG4
arba CDX1
specifinę DNR fragmentai (pav. 3B). Visi šie faktai rodo, kad CDX2 aktyvuoja REG4
transkripcijos tiesiogiai jungiasi prie sekų 5'-gretutinė regione geno.

Trimethylation iš Histonas H3 Lizinas 27 (H3K27me3) dėl REG4
Rėmėjas į GC ląstelių linijų

Nors CDX2 baltymo ekspresija buvo rastas MKN-1 ir MKN-28 ląstelių linijų, šie 2 ląstelių linijos trūko aptikti išraišką REG4
stenograma ir baltymų. Kadangi tai buvo pranešta, kad DNR hypermethylation CpG salų yra susijęs su triukšmo slopinimo kelių genų [28], mes ištirti, ar DNR metilinimas sukeltas transkripcijos nukenksminimą Reg IV MKN-1 ir MKN-28 ląstelių. Mes apdorojimo šias ląsteles su demetilinimą agento, 5-aza-2'-deoksicitidino (aza-nuolatinės srovės) ir tada atliekamas KRL-PGR. Tačiau taisyklė IV išraiška nebuvo atkurta šių ląstelių linijas (duomenys neparodyti), o tai rodo, kad DNR metilinimas yra mažai tikėtina, kad įtakos taisyklė IV išraiška. Ji buvo taip pat pranešė, kad H3K27me3 buvo susijęs su nuslopintos genų ekspresijos [29]. Mes toliau tiriama H3K27me3 GC ląstelių linijų. Norėdami nustatyti H3K27me3 praturtėjimą dėl REG4
promotorius GC ląstelių linijas, buvo atlikta Chip tyrimai. Į MKN-1 ir MKN 28-ląstelių linijas, H3K27me3 lygius REG4
rengėjas regionas buvo didelė, o HSC-39 ląstelių linija, H3K27me3 lygiu REG4
rengėjas regionas buvo mažas (pav. 3C). Šie rezultatai rodo, kad uždara chromatino struktūra REG4
rengėjas gali slopinti taisyklė IV ekspresiją CDX2.

Diskusijos

Nors buvo pranešta, kad taisyklė IV išraiška yra sukeliama GLI1 [21] arba "EGF [22], šios molekulės yra mažai tikėtina, kad būtų atsižvelgta į tarp Reg IV ir žarnyno diferenciacijos asociacijos. Šiame tyrime mes parodėme, kad endogeninė CDX2 ir taisyklė IV išraiška buvo gerai koreliuoja GC ląstelių linijų. Be to, naudojant ER-reguliuojamas formą CDX2, mes nustatėme, kad ten buvo greitas indukcija Įm IV išraiškos po 4-oht gydymą. Reporter genų tyrimai atskleidė svarbų vaidmenį sutarimas CDX2 DNR privalomas elementus REG4 pervežimas promotoriaus regione jos transkripcijos. Vėlesni Chip tyrimai parodė, kad CDX2 jungiasi tiesiai į REG4
rengėjas. Mes anksčiau parodė, kad pirminėje GC audinių ir žarnyno metaplazijos skrandžio, CDX2 ir Įm IV išraiška buvo gerai koreliuoja [11]. Šie rezultatai rodo, kad CDX2 baltymų tiesiogiai reguliuoja taisyklė IV ekspresiją GC ir žarnyno metaplazijos, skrandžio.

CDX2 yra aktyvuojami žarnyno Fenotipiniam GC ir po žarnyno metaplazijos skrandžio [9], [25]. Priešingai, praradimas CDX2 išraiška buvo pastebėtas pirminių storosios žarnos vėžio pogrupyje, paprastai menkai diferencijuotų kolorektalinio vėžio [30]. Iš keičiant CDX2 išraiška žmogaus vėžiui reikšmė lieka neaišku, todėl svarbu apibrėžti tikslines genus, kurie yra pasroviui nuo CDX2. Mes nustatėme keletą CDX2 reguliuojama genų, pavyzdžiui, CDH17
(kuris koduoja Li-cad) [24] HEPH
(kuris koduoja hephaestin) [31] ABCB1
(kuris koduoja atsparumą daugeliui vaistų 1) [32], ir DSC2
(kuris koduoja desmocollin 2) [33]. Tarp šių genų, ABCB1
pradžių buvo identifikuojami kaip ekspresija ir sustiprina geno keliais vaistams atsparių ląstelių, o jo produktas, P-glikoproteino, atrodo, vaidina svarbų vaidmenį atsparumo vaistams [34]. Anksčiau mes pranešta, kad priverstinio išraiška Reg IV GC ląstelių slopina 5-FU sukeltas apoptozę per indukcijos BCL-2 ir dihidropirimidino [8] dehidrogenazės. Kartu paėmus, tai yra įmanoma, kad žarnyno fenotipas GC, saviraiškos (arba negimdinis išraiška) iš CDX2 skatina Reg IV ir naviko atsparumą daugeliui 1 išraišką, ir kurio narkotikų atsparumo padidėjimas. Tiesą sakant, tai buvo pranešta, kad pooperacinis chemoterapija nėra naudinga pacientams, sergantiems žarnyno fenotipas GC [35].

Nors mūsų duomenys patvirtina, kad CDX2 vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant REG4 pervežimas transkripcijos per prisijungimas prie promotoriaus regione, keli faktai rodo, kad vien CDX2 nepakanka aktyvuoti REG4
išraiška. Šiame tyrime mes generuoja polikloninį gyventojų MKN-7, TMK-1, SAK-44PE ir KATO-III ląstelių, kurios išreikšti aukšto lygio CDX2 infekcija su retrovirusų vežančių pilnametražis žmogaus CDX2 kDNR. Tačiau padidėjusią CDX2 nepavyko aktyvuoti taisyklė IV išraiška. GC ląstelių linijų, nė vienas iš ląstelių linijų su neaptinkama CDX2 baltymų raiškos turėjo aptikti REG4
nuorašai ir baltymų. Todėl CDX2 reikalingas Įm IV išraiškos, tačiau vien CDX2 nepakanka aktyvuoti taisyklė IV išraiška. Šioje studijoje, devyni GC ląstelių linijos buvo tirta. Iš ląstelių linijų ištakos buvo taip. MKN-7, MKN-28 ir MKN-74 ląstelių linijos buvo nustatytas nuo žarnyno tipo GC. TMK-1 ir MKN-45 ląstelių linijos buvo nustatytas nuo difuzinio tipo GC. Kato-III, hsc-39 ir SSK-44PE ląstelių linijos buvo nustatytas nuo antspaudo žiedas ląstelių karcinoma. MKN-1 ląstelių linija buvo įkurta iš adenoplokščialąstelinio ląstelių karcinoma. Kadangi žarnyno metaplazijos skrandžio, CDX2 ir taisyklė IV išraiška yra gerai koreliuoja, įsteigtos nuo difuzinio tipo GC ar antspaudo žiedas ląstelių karcinoma GC ląstelių linijos gali netikti dėl Įm IV indukcijos analizės CDX2. Iš tiesų, taisyklė IV išraiška gali būti sukeltas CDX2 į ląstelių linijų, gautų iš gaubtinės žarnos vėžio šiame tyrime. Be to, mes parodėme, kad H3K27me3 lygiai REG4
promotoriaus regione buvo didelė MKN-1 ir MKN-28 GC ląstelių linijų. Šie 2 ląstelių linijos trūko aptikti išraišką , buvo nustatyta REG4
nors CDX2 baltymų išraiška. Todėl H3K27me3 lygiai REG4
rengėjas regionas gali būti didelis MKN-7, TMK-1, SAK-44PE ir KATO-III ląstelės, kurioje padidėjusią CDX2 nepavyko aktyvuoti taisyklė IV išraiška.

buvo pranešta, kad REG4
iRNR raiška buvo sustiprina stimuliaciją su TGF-α, EGF HGF arba bFGF per aktyvavimo mitogenu aktyvinto proteino kinazės (MAPK) rūšyse [22] , Taigi, tai gali būti iškėlė hipotezę, kad taisyklė IV taip pat reglamentuoja vartotojų grandies transkripcijos veiksnių MAPK kelius. Mes atlikome silikochromatas
analizė REG4
genas 5'-gretutines regioną ir rasti bent vienas Fiksuotas AP 1 sutarimas sekas (bent -883 bazinių porų REG4
genas 5'-gretutines regionas), kuri yra pasroviui transkripcijos faktorius MAPK signalizacijos. Šioje studijoje, SAK-39 ląstelių parodė panašų transkripcijos veiklą reporteris genų darinių, kurių sudėtyje yra 1,2 kb ir 0,6 kb, REG4
5'-gretutines seka. Kadangi EGF poveikis arba TGF-alfa apie REG4
transkripcija nebuvo tirtas šio tyrimo duomenimis, tolesnis tyrimas yra reikalingas paaiškinti signalines priemones, kurios sužadina reguliavimą REG4
transkripcijos.

Taigi, mūsų dabartiniai duomenys rodo, kad CDX2 baltymų tiesiogiai reguliuoja taisyklė IV išraiška. Taisyklė IV suaktyvina EGFR /Akt /AP-1 signalinė kelią. Kaip žarnyno fenotipas GC dažnai išreiškia EGFR [36], ji teigė, kad ši taisyklė IV aktyvuota kelias vaidina svarbų vaidmenį šiame GC potipio. Kadangi CDX2 taip pat skatina išraiška atsparumo daugeliui vaistų geno ABCB1
anti-EGFR terapija bet ne chemoterapija gali būti naudingas pacientams, sergantiems žarnyno fenotipas GC.

Medžiagos ir metodai

plazmidės

CDX2 kDNR buvo įtraukta į kelių klonavimo svetainėje retrovirusų ekspresijos vektorius pPGS-CMV-Cite-neo, kaip aprašyta anksčiau [24]. Pilno ilgio, laukinio tipo CDX2 kDNR buvo subklonuotas į retrovirusų vektoriaus pBabe-Puro ER, kaip aprašyta anksčiau generuoti pCDX2-ER [24]. PCDX2-ER vektorius koduoja chimerinj baltymų, kurioje pilnametražis CDX2 sekos yra lydyto prieš mutavusių ER ligandų surišančio domeno. Mutuotos ER ligando-partnerio rišantis domenas nebėra jungiasi estrogenų, bet išlaiko gebėjimą surišti tamoksifeno. Genomo DNR sekas iš 5'-gretutinė regione žmogaus REG4
geno buvo papildyta PGR naudojant genomo DNR išvalytas nuo SAK-39 ląstelių kaip šabloną ir subklonuotas į pGL4.10 [luc2] vektoriaus (Promega Madison, WI). PGR pagrįsti metodai buvo naudojami pristatyti mutacijas į įtariamų CDX2 privalomos svetainių pGL4.10-REG4 reporteris genų statyti naudojant QuikChange sait-mutagenezes rinkinį (Stratageno, La Jolla, Kalifornija). buvo pakeistas Keturi spėjamas CDX2-jungimosi vietų. Visi fragmentai generuoja PGR buvo patikrintas automatizuoto sekos. Plazmidės pGL4.74 [hRluc /TK] vektorius (Promega) buvo naudojamas kaip valdymo transfekciją efektyvumo reporteris tyrimus.

Mobilaus ryšio linijos, retrovirusų Infekcijos ir narkotikų gydymo

amphotropic Phoenix " pakavimo ląstelių linijos buvo pateikta G. Nolan (Stanfordo universitetas, Stanfordo, CA) [37]. buvo naudojami Devyni ląstelių linijas, pagaminti iš žmogaus GC ir 2 ląstelių linijų iš žmogaus gaubtinės žarnos vėžio. TMK-1 ląstelių linija buvo įkurta mūsų laboratorijoje [38]. SSK-39 ir SAK-44PE ląstelių linijos buvo įkurta viena iš autorių (Kazuyoshi Yanagihara) [39], [40]. Penki GC ląstelių linijų iš MKN serijos buvo maloniai pateikė dr Toshimitsu Suzuki [41], [42]. Kato III ląstelių linija buvo maloniai pateikė dr Morimasa Sekiguchi [43]. HT-29 ir SW480 gaubtinės žarnos vėžio ląstelių linijos buvo gauti iš Amerikos tipinių kultūrų kolekcijoje. Ląstelės buvo saugomi skystame azote iki šio tyrimo inicijavimą. Po atšildymo iš užšaldytos pradinės, ląstelės buvo laikomi žemoje plaukimo per visą tyrimą. Nuoseklus ląstelių morfologija buvo stebimas lyginant mikroskopinių vaizdų. Fenikso pakavimo ląstelės buvo pernešta su imunodeficito raiškos konstruktų (pPGS-CDX2, pPGS-Neo, ir pCDX2-ER) ir virš nuosėdų, kurių sudėtyje yra nonreplicating amphotropic virusas buvo paruošta kaip aprašyta anksčiau [24]. Be HT-29 ląstelių išreiškiančius CDX2-ER sulietą baltymą (HT-29 /CDX2-ER), CDX2 funkcija buvo aktyvuota to 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) ( "Sigma cheminis, St. Louis, MO) į augimo vidutinės, kurio galutinė koncentracija 500 nmol. Ištirti, ar DNR metilinimas sukeltas transkripcijos inaktyvaciją taisyklė IV, ląstelės buvo gydomi kad galutinė koncentracija būtų 1 pM aza-DC (Sigma Chemical) 5 dienas, kol jie buvo paruošta RNR ekstrakcijos.

Western Blot analizė

Vakarų blot analize, ląstelės buvo lizuoti, kaip aprašyta anksčiau [44]. Baltymų koncentracija buvo nustatoma pagal Bradfordo baltymų tyrimo (BioRad, Richmond, CA) su BSA naudojama kaip standartas. Lizatai (20 mikrogramų) buvo ištirpintas Laeminli s pavyzdžių buferio virinant ir tada taikoma 12% SDS-poliakrilamido gelyje, po to elektromagnetinio-perdavimo ant nitroceliuliozės filtro. Filtras buvo inkubuojami 1 valandą kambario temperatūroje su anti-Įm IV antikūnas (triušis polikloniniu antikūnų sukurta mūsų laboratorijoje, 10 ref.) Arba Anti-CDX2 antikūnų (Biogenex San Ramon, CA). Peroksidazės-konjuguoto anti-triušiai arba anti-pelės IgG buvo naudojamas antrinė reakcija. Imunokompleksas buvo ryškinamos su ECL Plus Vakarų dėmė aptikimo sistemos (Amersham biomokslų, Piscataway, NJ). β-aktino ( "Sigma Chemijos) taip pat buvo atpažintas kaip pakrovimo kontrolę.

KRL-PGR analizė

Viso RNR buvo išskirta su RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) ir 1 mikrogramų visos RNR buvo konvertuojami į kDNR su First Strand kDNR sintezės Kit (Amersham Biosciences). Kiekybinę REG4
iRNR lygiai buvo atliktas realaus laiko fluorescencijos aptikti, kaip aprašyta anksčiau [45]. PGR buvo atliekama su SYBR Žalioji PGR Core Reagentai Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Realaus laiko nustatymas emisijos intensyvumo SYBR žalia įpareigotas dvigrandę DNR buvo atliktas su ABI PRISM 7900 seka aptikimo sistema (Applied Biosystems), kaip aprašyta pirmiau [46]. ACTB
specifinę PGR produktai buvo papildytas iš tų pačių RNR mėginių ir tarnavo kaip vidaus kontrolė. Sekos pradmenis, REG4
KRL-PGR rodomi 1 lentelėje KRL PGR reakcijų buvo atliekami trimis egzemplioriais kiekvienam mėginiui pradmenimis, o vidutinis ir standartinis nuokrypis (SN) iš trijų eksperimentų buvo apskaičiuojamas kaip santykinis kiekybinis vertė. Pasibaigus 40 PGR ciklų pabaigoje, reakcijos produktai buvo elektroforezės atskirta nuo 8% ne denatūravimo poliakrilamido geliai vizualiai patvirtinimo PGR produktų.

RNRi

Jei triuškinantis endogeninę CDX2, RNRi buvo atliktas , Du siRNA dupleksus taikymo CDX2 (5'-AACCAGGACGAAAGACAAAUA-3 ', CDX2 siRNA1; ir 5'-AAGCCUCAGUGUCUGGCUCUG-3', CDX2 siRNA2) ir nonsilencing siRNR dvipusis (5'-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3 ') buvo susintetintas (Qiagen). Transfekcijq buvo atliekama naudojant Lipofectamine RNAiMAX (INVITROGEN, Karlovi Varai, CA) pagal gamintojo protokolą. Trumpai, 60 pmol siRNA ir 10 pL Lipofectamine RNAiMAX buvo sumaišyti 1 ml RPMI terpėje (10 nmol /L galutinis siRNR koncentracija). Po to, kai 20 min inkubavimo, mišinys buvo įtraukta į ląsteles ir jie buvo su padengtu patiekalai kiekvienam tyrimui. Trys dienos po transfekciją, ląstelės buvo analizuojami visų eksperimentų.

genas reporteris Bandymai

SAK-39 ir MKN-1 ląstelės buvo pasėjamos į 6-duobučių lėkštelėse (BD Falcon Franklin ežerų, NJ ). Transfekcijq ląstelių bent 50% -80% susiliejimo buvo atliktas su 3 įxL FuGENE6 transfekcijq reagentas (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), 0,8 mikrogramų pGL4.10 reporteris genų konstruktai, o 0,2 mikrogramų pGL4.74 [hRluc /TK] vektoriaus (Promega). Praėjus 48 valandoms po transfekciją, ląstelės buvo surinkti ir resuspenduojamos pasyvaus lizės buferiniame tirpale (Promega). Liuciferazė veikla buvo nustatomas dvigubas liuciferazės bandymo sistemos (GloMax 96 microplate luminometer, Promega).

Chip Bandymai

Chip tyrimai buvo atliekami naudojant EZ-Chip chromatino Imunoprecipitacijos rinkinį (MILLIPORE, BILLERICA MA) už gamybos instrukcijose. Išanalizuoti, ar CDX2 tiesiogiai jungiasi prie spėjamo CDX2 privalomos svetainių REG4
5'-gretutinė regione, mes atliekame Chip tyrimus, atliekamus naudojant SAK-39 ląstelių. Trumpai tariant, SSK-39 ląstelių (1-2 × 10 7) buvo skersiniais ryšiais sujungtas su 1% formaldehido į fosfatinio buferio druskų tirpalu (PBS) 15 min, esant 37 ° C, ir glicino užgesinimui pridėta reaktyvių aldehidų. Nuplovus ląsteles šaltu PBS, ląstelės resuspenduojamos SDS lizės buferiniame tirpale (1% SDS, 10 mm EDTA ir 50 mM Tris pH 8.1) su proteinazės inhibitorius (Roche Diagnostics). Po mėginiai buvo Sunaikintos Ultragarsas, chromatino ekstraktai, kurių sudėtyje yra DNR fragmentai (vidutinis dydis, 500 bazių porų) buvo immunoprecipitated naudojant 2 mikrogramų monokloninis anti-CDX2 antikūnas (Biogenex) arba 2 mikrogramai pelės IgG (MILLIPORE). Kiekvienas immunoprecipitated DNR mėginys buvo įvertintas qPCR naudojant 1 lentelėje išvardytas Kaip neigiamos kontrolės pradmenis, An maždaug 200 bazių porų DNR fragmentas egzono 3 CDX1
genas buvo papildyta PGR naudojant specifinius pradmenis (1 lentelė ).

Norėdami nustatyti H3K27me3 praturtėjimą dėl REG4
promotorius GC ląstelių linijų, Chip tyrimai buvo atliekami naudojant MKN-1 MKN-28 ir SAK-39 ląstelių linijas. Trumpai tariant, GC ląstelių (1-2 × 10 7) buvo skersiniais ryšiais sujungtas su 1% formaldehido į PBS 15 min 37 ° C temperatūroje, ir glicino užgesinimui pridėta reaktyvių aldehidų. Nuplovus ląsteles šaltu PBS, ląstelės buvo resuspenduota SDS lizės buferio su proteinazės inhibitorius (Roche Diagnostics). Po mėginiai buvo Sunaikintos Ultragarsas, chromatino ekstraktai, kurių sudėtyje yra DNR fragmentai (vidutinis dydis, 500 bazinių porų) buvo immunoprecipitated naudojant 2 mikrogramai polikloninis kovos su H3K27me3 antikūnas (Abcam, Cambridge, MA) arba 2 mikrogramų triušio IgG (MILLIPORE). Kiekvienas immunoprecipitated DNR mėginys buvo įvertintas qPCR naudojant REG4
Gruntas 1 (1 lentelė).

qPCRs buvo atliekami trimis egzemplioriais kiekvienam mėginiui pradmenimis, o vidutinis ir standartinis nuokrypis (SN) trys eksperimentai buvo apskaičiuota kaip santykinio kiekybinio įvertinimo vertės. Pasibaigus 40 PGR ciklų pabaigoje, reakcijos produktai buvo elektroforezės atskirta nuo 8% ne denatūravimo poliakrilamido geliai vizualiai patvirtinimo PGR produktų.

Padėka

Mes dėkojame ponui Shinichi Norimura puikios techninės pagalbos ir konsultacijos. Šis darbas buvo atliktas su malonų bendradarbiavimą mokslinių tyrimų centro Molekulinės medicinos fakulteto medicinos Hirosimos universitete. Dėkojame analizės centras gyvosios gamtos mokslų, Hiroshima University, už jų įrenginių naudojimą.

Other Languages