PLoS ONE: Didelio našumo sekos ir kopijų skaičiaus kitimas aptikimas naudojant Formalin Fiksuoto Įterptosios Audinių metastazių Skrandžio Cancer

Anotacija

tikslinės terapijos era, mutacija profiliavimas vėžys yra labai svarbus aspektas, priimant sprendimus terapines , Apibūdinti vėžį, kurio molekulinė lygiu, formalinu-fiksuoto parafine patalpinto audinio naudojimas yra svarbus. Mes išbandėme Jonų AmpliSeq Vėžys Hotspot skydas V2 ir nCounter kopijų skaičiaus kitimas prabavimo 89 formalinu fiksuotos parafino įterptųjų skrandžio vėžio mėginiai, siekiant nustatyti, ar jie taikomi archyvinių klinikinių mėginių asmeninį tikslinių gydymo. Mes patvirtinti rezultatus su Sanger sekos, realaus laiko kiekybine PGR, chromosomų dažymas ir imunohistocheminiu. Dažnai aptinkamas įtraukti somatinės mutacijos TP53
(28,17%), APC
(10,1%), PIK3CA
(5,6%), KRAS
(4,5 %), BRO
(3,4%), STK11
(3,4%), CDKN2A
(3,4%) ir SMAD4
(3,4%) , Papildymą iš HER2
CCNE1
MYC
KRAS parsisiųsti ir , EGFR
genai buvo pastebėti 8 (8,9%) , 4 (4,5%), 2 (2,2%), 1 (1,1%) ir 1 (1,1%) atvejai, atitinkamai. Tais atvejais, su amplifikacijos, chromosomų dažymas už HER2
patikrino geno amplifikacija ir imunohistocheminis už HER2, EGFR ir CCNE1 patikrino baltymų vėžinių ląstelių raiška. Taigi, mes sėkmingai atlikta puslaidininkių pagrindu sekos ir nCounter kopijų skaičiaus kitimas analizuoja formalinu fiksuotos parafino įterptųjų skrandžio vėžio pavyzdžius. Didelio našumo atranka į archyvinių klinikinių mėginių leidžia greičiau, tiksliau ir ekonomišką aptikti hotspot mutacijų ar amplifikacijos genų

nurodomoji dalis:. Kim S Lee J Honkongas manyje, IG, Kang SY, ha SY, ir kt. (2014) Didelio našumo sekos ir kopijų skaičiaus kitimas aptikimas naudojant Formalin Fiksuoto Įterptosios audinio skrandžio vėžiui. PLoS ONE 9 (11): e111693. Doi: 10,1371 /journal.pone.0111693

redaktorius: Hiromu Suzuki, Saporas medicinos universitetas, Japonija

Įstojo: balandžio 28, 2014; Priimta rugsėjo 29, 2014 m Paskelbta: Lapkričio 5, 2014

Visos teisės saugomos: © 2014 Kim et al. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų prieinamumas:. autoriai patvirtina, kad visi duomenys, kuriais grindžiamos išvados visiškai prieinama be apribojimų. Visi atitinkami duomenys yra per popieriaus ir jo Pagalbinė informacija failus

Finansavimas:. Šis tyrimas parėmė dotacijos iš Korėja Sveikatos technologijų mokslinių tyrimų & D Project, ministerijos Sveikatos & Gerovės reikalus, Korėjos Respublika (A101130) ir "Samsung" Biomedicinos tyrimų institutas dotacijos (# SBRI-SP1B20112). Šis tyrimas taip pat parėmė "Samsung medicinos centras vidine dotacijos, 20 x 20 projektas (# GFO1140111). Bendraautoriai Seokhwi Kim Jeeyun Lee, Min EUI Hong In-Gu daryti, kad Young Kang, Sang Yun ha, Seung Tae Kim, SE Hoon parkas laimėjo Ki Kang Min-Gew Choi Bir Ho Lee, Tae Senas Sohn , Jae mėnulis Bae, Senas Kim Kyoung-Mee Kim dirba Samsung medicinos centras. Bendraautorius Duk-Hwan Kim dirba Samsung Biomedicininių tyrimų institutas. "Samsung" Biomedicinos tyrimų institutas "ir" Samsung medicinos centras teikia paramą į darbo užmokesčio autoriams Seokhwi Kim, JL, meh, IGD, syk, SYH, STK, SHP, WKK, MSV, JHL, TSS, JMB, Senas Kim KMK ir DHK formos , bet neturėjo jokių papildomų vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar rengiant rankraštį. Konkretūs vaidmenys šių autorių yra aiškiai nurodyta "Autorius įmokos" skyriuje

konkuruojančių interesų. Autoriai turi šias interesus: Šis tyrimas buvo finansuojamas iš dalies Samsung Biomedicininių tyrimų instituto "ir" Samsung medicinos centras. Bendraautoriai Seokhwi Kim Jeeyun Lee, Min EUI Hong In-Gu daryti, kad Young Kang, Sang Yun ha, Seung Tae Kim, SE Hoon parkas laimėjo Ki Kang Min-Gew Choi Bir Ho Lee, Tae Senas Sohn , Jae mėnulis Bae, Senas Kim Kyoung-Mee Kim dirba Samsung medicinos centras. Bendraautorius Duk-Hwan Kim dirba Samsung Biomedicininių tyrimų institutas. Nėra patentai, produktų kūrimo ar parduodamų produktų deklaruoti. Tai nekeičia autorių laikytis visų PLoS ONE politikos dalijimosi duomenimis ir medžiagų.

Įvadas

Nors skrandžio vėžys yra ketvirtoji dažniausia vėžio pasaulyje, ji yra antra mirties priežastis. [1] Jo dažnis yra žymiai didesnis Azijos šalyse, įskaitant Pietų Korėja, kur ji yra antra labiausiai paplitusi vėžio. [2] Neseniai kelios tikslinės terapijos skrandžio vėžio buvo atrasta, kurios teikia papildomų galimybių gydytojų ir pacientų [3] - [5]

tikslinės terapijos, mutacijos profiliavimo sukėlusio vėžio erą. yra labai svarbus terapiniais sprendimus. Mėginimai profilis mutacijas buvo pagaminti naudojant tradicinį "Sanger eiliškumą; Tačiau, tai nėra optimalus metodas klinikinėje aplinkoje dėl išlaidų, laiko ir darbo jėga, reikalinga. Be to, Sanger sekos reikalauja dideles sumas DNR; įvertinti mažus kiekius pavyzdį keletą genų tuo pačiu metu yra neįmanoma. Įvadas naujos kartos sekos (NGS) metodus nutaria šią problemą Multiplex, didelio našumo sekos daugelio mėginių keletą genų vienu metu. [6], [7] Vienas iš NGS platformų, ION Torrent AmpliSeq Vėžys skydas, remiasi ne optinės detekcijos vandenilio jonų A puslaidininkiniams įtaisams [8], ir gali aptikti 2855 onkogeninių mutacijų 50 dažniausiai mutavusių genų (lentelė S1). Jis yra pranašesnis už kitus masių spektroskopijos pagrindu sekos metodais, jeigu seka rezultatus greičiau ir mažesnėmis sąnaudomis. [8] Tai taikoma formalinu fiksuotos parafino įterptųjų (FFPE) audinių bandinių su mažais DNR. Nes jis užtikrina aukštą jautrumą patikros žinomas onkogeniniam mutacijų, [9], [10] ION Torrent AmpliSeq Vėžys skydas yra 5 pagrindines vėžio centrų pasirinkimas Jungtinėse Valstijose molekulinės diagnostikos tikslinės terapijos [11].

stiprinimas onkogenų yra pagrindinis mechanizmas, genų raiškos ir prisideda prie auglių vystymuisi. [12] Pavyzdžiui, stiprinimas iš HER2
RER pervežimas FGFR2 parsisiųsti ir , kras
genai skrandžio vėžio. [13], [14] Atsižvelgiant į kopija skaičių variantų (CNVs) Klinikinių mėginių, chromosomų dažymas (žuvis) ir /arba imunohistocheminis aptikimo (IHC) buvo plačiai naudojamas. Tačiau didelės išlaidos ir mažos imtys biopsijos medžiagos apriboti šių metodų taikymą, ir vis dar yra dėl papildomos didelio našumo technologija lengvai prieinamos, didelio jautrumo ir mažo išlaidų poreikis. nCounter CNV CodeSets (Nanostring technologijos, gyvosios gamtos mokslai, Sietlas, WA) teikti aukščiausios tikslumą ir atkuriamumas studijoms visų dydžių ir gamina geriau, greičiau rezultatus su gerokai mažiau pastangų nei su realaus laiko kiekybine polimerazės grandininė reakcija (qPCR) arba CNV masyvai [ ,,,0],15].

Geriau pritaikytos vėžio gydymas gali pagerinti pacientų rezultatus. Pacientų navikų mėginiuose bus reikalaujama, kad būtų apibūdinti vėžį molekuliniame lygmenyje ir nustatyti ligos pogrupius, kurie turėtų gauti skirtingus procedūros. Iš FFPE naudoti audinius yra svarbu, kad taip sudarant galimybę tokius tyrimus. [16] Čia mes patikrinome AmpliSeq ir nCounter užsakymą CNV plokštės FFPE skrandžio vėžio mėginiai siekiant nustatyti, ar jie taikomi archyvinių klinikinių mėginių asmeninį tikslinių gydymo.

Medžiagos ir metodai

Pavyzdžiai

naviko ląstelių procentas daugiau kaip 75% buvo išpjaustytų pagal mikroskopu nuo 4 mm nedažytų skyriuose, lyginant su H & El tamsintas skaidrę, ir genomo DNR buvo išskirta naudojant Qiagen DNR FFPE audinių rinkinį (Qiagen, Hilden, Vokietija) pagal gamintojo instrukcijas iš 96 pacientų, sergančių išplitusiu skrandžio vėžiu. Po ekstrahavimo, mes išmatuota koncentracija, taip pat 260/280 ir 260/230 nm santykį spektrofotometru (ND1000, Nanodrop technologijos, ThermoFisher Mokslinė, MA, JAV). tada kiekvienas mėginys buvo įvertintas su kubitas fluorometru (Life technologies, Karlovi Varai, Kalifornija). Genomo DNR su > 10 ng matuojamas kubitas fluorometru buvo atliktas bibliotekos preparato ir septyni mėginiai nepavyko pastatyti bibliotekas ir buvo pašalintas iš šiame tyrime. Galiausiai, 89 atvejų pagaliau buvo analizuojami ir įtraukti 31 moterų ir 58 vyrams. 1 lentelėje išvardytos klinikinių ir patologinių funkcijų pacientų šiame tyrime. Pasikartojimas arba metastazės sukūrė 11 pacientams, sergantiems Stebėjimo trukmės mediana laikotarpį 76 mėnesių (5,5-149,3). Tyrimas patvirtino institucinę peržiūros plokštės (IRB) Samsung medicinos centras. Visi klinikinis tyrimas buvo atliktas pagal išreikštoms Helsinkio deklaracijos principais. Raštiškas sutikimas buvo atsisakyta pagal IRB dėl atgaline data analizės ir anoniminius duomenis. Mėginiai buvo imami kaip pagal įprasto medicinos procedūros ir buvo surinkti pagal šio tyrimo autorių. Mėginiai iš mirusių pacientų arba gyvų pacientų buvo visi išbraukimo identifikuoti, įskaitant pašalinimą bet ir visą demografinę informaciją, prieš analizę ir informuoto sutikimo formos buvo atsisakyta pagal IRB.

Jonų AmpliSeq vėžys skydelis V2

naudojamas jonų AmpliSeq Vėžys skydas v2 (jonų Torrent) aptikti dažnai somatinių mutacijų, kurios buvo pasirinktos remiantis literatūros apžvalga. Ji nagrinėja 2855 mutacijas 50 dažniausiai mutavusių onkogenų bei navikų slopintuvas genų (lentelė S1). Pirma, 10 ng DNR iš kiekvienos 89 FFPE navikų mėginiuose patyrė vieną vamzdelių Multiplex PGR naudojant jonų AmpliSeqCancer Primer baseinas ir jonų AmpliSeqKit REAGENTAI (Life technologies "). Gydymo atsirandančių Amplikonų su fupa reagento dalinai suardomas pradmenis ir fosforilinamos į amplikonų. Į fosforilinamos amplikonų liguojami Ion adapteriai ir išgrynintas. Dėl barcoded bibliotekos rengimo, mes pakeisti barcoded adapteriai iš Jonų Xpress Brūkšninių kodų adapteriai 1-96 Rinkinys ne barcoded adapterio mišinį tiekiamo į Jonų AmpliSeq bibliotekos rinkinys. Liguotą DNR patyrė nick-vertimo raštu ir stiprinimas baigti tarp adapteriai ir Amplikonų sąsajas ir generuoti pakankamai medžiagos tolesniems šablonų paruošimo. Dviejų turų Agencourt AMPure XP reagento įrišimo 0,6 ir 1,2 karoliukas-to-imties tūrio santykis pašalinti įvesties DNR ir neįregistruotas pradmenis iš Amplikonų. Galutiniai biblioteka molekulės buvo 125~300 bp dydžio. Mes tada perdavė bibliotekas į Ion ONEtouch automatizavimo sistemų šablonų paruošimo. Sekos buvo atliktas jonų PGM sekvenseri pagal gamintojo instrukcijas. Mes naudojome IonTorrent Programinė įranga automatizuoto duomenų analizė.

Jei išmatuoti jautrumas ir specifiškumas ION AmpliSeq vėžio skydelyje buvo naudojami nesmulkinti exome sekvenavimo rezultatai 4 skrandžio vėžio mėginiai, kurie serga mutacijų būklę [17].

nCounter Kopijuoti Taškų kitimas CodeSets

aptikimo CNV, nCounter Kopijuoti Taškų kitimo CodeSets buvo naudojamas su 300 ng išgrynintas genomo išskirtą DNR iš 2-3 skirsniuose 4 mkm storio FFPE atstovas naviko blokų naudojant QIAamp DNR FFPE Audinių komplektas (Qiagen, Hilden, Vokietija). DNR buvo suskaidyta per AluI virškinimą ir denatūruotas 95 ° C temperatūroje. Išskaidyti DNR buvo hibridizuoj 86 genų į nCounter vėžio KN prabavimo Kit (Nanostring Technologies) 18 valandų codeset 65 ° C ir kuris perdirbtas pagal gamintojo instrukcijas. NCounter Skaitmeninis analizatorius skaičiuojami ir pateikiami lentelėse su reporteris zondai ir vidutinius count skaičių >signalus; 3 buvo vadinamas ir patvirtina IHC, žuvų arba realiojo laiko PGR

IHC už HER2, EGFR (HER1) ir CCNE1.

įteisinimo CNV rezultatus, gautus nCounter, mes atliekame IHC už HER2 visais atvejais, ir EGFR ir CCNE1 pasirinktų atvejų. Po deparaffinization ir Rehidratacija, 4 mm ruožų silano dengtos skaidres buvo immunostained už HER2. HercepTest (Dako, Glostrup, Danija) buvo naudojami pagal gamintojo rekomendacijas, kaip aprašyta anksčiau. [18] Dėl EGFR mes naudojamas anti-NKV-L-EGFR 384 pelės monokloninis antikūnas (pagrindinis 1:100 skiedimą; Novocastra /Vizija BIOSYSTEMS, Niukaslio, Jungtinė Karalystė) ir CCNE1 mes naudojamas anti-CCNE1 /cikloniniai E1 antikūnas (klonas HE12; 1:200 praskiedimo; "Thermo Fisher Scientific", MA). Ventana Benchmark XT automatizuotas Pristatymas apdorojimo sistema buvo naudojama pagal gamintojo protokolą. Ekspertas patologas (KMK) įvertino rezultatus

žvejoti HER2

žuvis buvo atliekama naudojant dvejopo spalvų DNR specifinių zondai iš PathVision ™ (Abbott /Vysis:. LSI HER2 SpectrumOrange ™ ir CEP 17 SpectrumGreen ™), kaip anksčiau aprašyta atvejų su dviprasmiška HER2 raiškos. [19] Mes skaičiuojamos hibridizacijos signalus 20 branduolių skaičius imtyje pagal fluorescencinio mikroskopo (Zeiss® Axioskop), naudojant filtrą rinkiniai rekomenduojamus Vysis (DAPI /Spektro Orange dvigubos praeinamumo, DAPI /Spektro Žalioji dvigubos dažnių praeinamumo). Visi užeina branduoliai buvo atmesti, ir tik branduoliai su atskira branduolinės sienos buvo įvertintas. HER2
genas buvo laikoma sustiprina kai žuvis signalo santykis HER2 /CEP17
buvo didesnis nei arba lygus 2,0 [20].

Realaus laiko PGR už KRAS ir MET amplifikacija

Mes naudojome PNI, gautų iš FFPE skrandžio karcinoma navikų audiniuose. Reakcijos mišinys pateikta 2 ul genomo DNR šabloną, 10 mkl Togman universalus PGR meistras mišinio (taikoma BIOSYSTEMS Inc "," Foster City, Kalifornija) ir 0,2 um kiekvieno gruntu. Tiksliai aptikti KN pakeitimus, mes išanalizavo tris skirtingus regionus kras
geno: regioną per introno 1 (TaqMan kopijos numeris prabavimo Hs06943812_cn), regioną per intronas 2 (Hs002534878_cn), ir per egzono regioną 6 (Hs02739788_cn). . Nes MET
genas, mes panaudojome pradmenų kaip aprašyta anksčiau [21]

matuojamas kopijų skaičiaus padidėjimas pagal šią anketą: 2 min 50 ° C temperatūroje, denatūruoti 95 ° C 10 min, po to 40 ciklų 95 ° C temperatūroje 15 sekundžių ir 60 ° C temperatūroje 1 min. Mes nustatomas santykinis kiekybiškai naudojant 7900 HT greitai realaus laiko PGR sistema keturiais egzemplioriais. RNaseP tyrimas rinkinys ( "Applied Biosystems) buvo naudojamas kaip kontrolės. Po amplifikacijos, mes importavo eksperimento rezultatus, kurių sudėtyje yra riba ciklo vertes kopijavimo numerį ir nuorodą testo į CopyCaller Programinė įranga (Applied Biosystems) Po-PGR duomenų analizei kaip buvo aprašyta anksčiau. [22] Mes priskirtas KN įgyti statusą ir kras
kopijų remiantis rezultatų nuoseklūs į mažiausiai dviejų iš trijų zondai.

Analizės metodai skaičių

Mes atmesti visas sinonimas pakeitimus po automatizuota mutacija-paskambinę algoritmas naudojamas aptikti turėjo mutacijas. Pasikartojančios skambučiai daugiau nei 10 iš 89 mėginių buvo laikomi klaidingai teigiamas ir buvo atmesti. Mes naudojome Ribinės vertės daugiau kaip 6% variantas dažnumas ir daugiau nei X100 aprėpties nustatyti tikrąsias mutacijų pakeitimus laikydamasis ankstesnių studijų ir mūsų pačių patirties. [9], [10] Mes filtruoti vieno nukleotido polimorfizmas po rankinio peržiūros kiekvieno polimorfizmo tyrimai somatinių mutacijų katalogas vėžiu (Cosmic, http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic~~HEAD=pobj) ( Figūra 1). Dėl gerai žinomų genų mutavusių skrandžio karcinoma (, TP53
APC
PIK3CA
STK11
CDKN2A
, KRAS
HRAS
BRAF parsisiųsti ir CTNNB1
), rankinis apžvalga automatinio skambinimo rezultatus buvo atlikta sugauti žalingas mutacijas šiek tiek nedidelių, variantas dažnis.

rezultatai

rezultatai jonų AmpliSeq vėžys skydelio

apie DNR koncentracija, jų koncentracija kartus, vidutinis padengimo mėginių, iš viso numeriai bazių, > Q20 bazės, skaito, reiškia skaityti ilgis, priskirti skaito, nuo tikslinių tarifas (%), vidutinis gylis ir vienodumo rezultatų aprašyti S2 lentelėje. Iš viso gavome 8178 variantas skambučius iš 89 mėginių, iš jų 3554 buvo raginama ne sinonimai pokyčiai. Po atfiltruodami pasikartojančių skambučių, < 6% variantas-alelio dažnumas, < 100X aprėpties ir tas, introno regione, buvo atrinkti 65 variantas skambučiai. Be to, mes peržiūrėjo automatizuotas skambučius žinomų mutacijų, pavyzdžiui, BRAF
KRAS parsisiųsti ir PIK3CA parsisiųsti ir galėtų išgelbėti du variantas skambučius, kurių per filtravimą procesai. Trisdešimt devyni iš 89 mėginių (43,8%) priglaudė bent vieną mutaciją (1 paveikslas). Du atvejai parodė 22 ir 5 mutacijas, atitinkamai. Pastarasis atvejis priglaudė MLH1
somatinių mutacijų [missense mutacija egzono 20: c.1147A > G (p.M383 v)] ir MLH1
rengėjas hypermethylation su MLH1 baltymų nuostoliai IHC naudojant anksčiau aprašytieji metodai [23] rodo, hypermutated auglį. Tačiau, nors rašo Pirmuoju atveju praėjo variantas dažnis ir aprėptis mutacijos supjaustyti kompromisai, tos mutacijos nebuvo patvirtinta Sanger sekos, rodo klaidingai teigiami šiuo atveju dėl prastos kokybės DNR. Taigi, šiuo atveju buvo pašalintas iš galutinių analizės rezultatais. Dažnai aptinkamas įtraukti somatinės mutacijos TP53
(24 atvejai, 27,0%), APC
(9 atvejai, 10,1%), PIK3CA
(5 atvejai, 5,6%), %), , kras
(3 atvejai, 3,4%), BRO
(4 atvejai, 4,5%), STK11
(3 atvejai, 3,4%), CDKN2A
(3 atvejai, 3,4%), ir SMAD4
(3 atvejai, 3,4%), kaip parodyta 2 lentelėje 2 lentelėje taip pat apibendrino aminorūgščių pokyčius dažnai mutavusių genų. Rasta 19 pacientams (21,3%) su dviem ar daugiau unikalių ir gretutinių somatinių mutacijų.

keturias skrandžio vėžio mėginiai su žinomais mutacijų dažniai nustatytais visai exome sekos ir patvirtintas Sanger sekos, mes nustatyti somatinės mutacijos , TP53
erbB4 parsisiųsti ir CTNNB1
be klaidingų teigiamų skambučių kitų genų (lentelė S3).

stiprinimas nCounter ir patvirtinus IHC, žuvų arba realaus laiko PGR

papildymą iš HER2 pervežimas CCNE1 pervežimas MYC pervežimas KRAS parsisiųsti ir EGFR
genai buvo pastebėti 8 (8,9%), 4 (4,5%), 2 (2,2%), 1 (1,1%) ir 1 (1,1%) atvejais, atitinkamai (3 lentelė). Mes nesilaikė stiprinimas iš MET
FGFR2
CDK4
ir CDK6 bet kuriuo iš atvejų. Tais atvejais, su amplifikacijos, IHC už HER2, EGFR ir CCNE1 parodė, raiška baltymų auglio ląstelių (pav 2A, B ir C). Vienu atveju su HER2 2+ iki HercepTest, ŽUVYS parodė nevienalytė stiprinimas iš HER2
genų (2D pav.)

realaus laiko PGR už KRAS pervežimas, vienu atveju su amplifikacijos parodė padidėjo kopijų skaičiaus (36, 37 ir 49 punktus); tais atvejais, kurie buvo neigiamas, kras
stiprinimas, nebuvo kopijų skaičiaus padidėjimas (nuo 0,9 iki 2,4, vidutinis 1.4).

MET
genas, randame ne teigiamas atvejis, nes jų retumo [21]. Todėl, mes panaudojome papildomą dešimties (penki kiekvienas sustiprina ir ne papildyta) skrandžio vėžys mėginiai ir RER
sustiprina skrandžio vėžio ląstelių linijas (MKN45 ir SNU5) su žinomais kopijų skaičiaus ir iRNR sumas. CNVs aptikta nCounter koreliuoja ir su aptiktų realaus laiko PGR (lentelė S4 ") ir mRNR lygių MET
genų kopijų skaičiumi (Pirsono koreliacijos testas; r = 0,874, p = 0,001). (S2 pav)

Diskusijos

naudojant jonų AmpliSeq v2 mes nustatėme, kad 39 iš 89 išplitusiu skrandžio adenokarcinoma mėginiai esančius somatinės mutacijos, o tai rodo, kad ši platforma yra lengvai taikomas archyvinių FFPE audinių pavyzdžius. , TP53
buvo dažniausiai rasti mutaciją, po APC pervežimas PIK3CA
ir KRAS
. Be to, mūsų užsakymą, CNV panelė sėkmingai aptikti KN padidėjimus HER2 pervežimas CCNE1 pervežimas MYC pervežimas EGFR parsisiųsti ir KRAS
genai, kuriuos mes patvirtino IHC ir realaus laiko PGR

mutacijų dažniai Kosminėje duomenų atskleisti esmines panašumų į duomenis gavome iš šio tyrimo. , TP53
(32%), PIK3CA
(10%), KRAS
(6%), APC
(6%), CTNNB1
(5%), CDKN2A
(5%), FBXW7
(5%), BRO
(4%) erbb2
(2%) ir STK11
(2%). Naujausi visa exome sekos tyrimai skrandžio adenokarcinoma parodė šiek tiek aukštesnius dažnius, TP53
(atitinkamai 36% ir 73%) ir PIK3CA
(14% ir 20%) mutacijos, palyginti su mūsų rezultatus. [24], [25] Nors mūsų mutacijų dažniai buvo mažesnės, palyginti su exome sekos rezultatus, buvo gerokai padidėjo, palyginti su mūsų ankstesnių duomenų apie masių spektrometrijos pagrindu OncoMap v4. [26] Ir AmpliSeq ir OncoMap mutacijoms hotspot regionuose, kuriuose paaiškinti išvadas rečiau mutacijos kai onkogenų bei navikų slopintuvas genų. S1 paveiksle palygina AmpliSeq V2 ir OncoMap v4 juntamomis mutacijų profilius. Ankstesnės OncoMap testai 237 skrandžio adenokarcinomos atskleidė, kad PIK3CA
mutacijos dažnai stadijose liga (5,1% IV etapas; 6,4% II etapo /III; 2,4% IB stadija). [26] Šiame tyrime mes pastebėtas trijų PIK3CA
mutacijos pacientams su III ir antrajame etape etape II ligos, patvirtinantys jų biologinę vaidmenį naviko progresavimo. Mes taip pat pastebėjo, HER2
( erbb2
) c.2524G > A (V842I) mutacija į skrandžio vėžio atveju. Ikiklinikinių tyrimų metu, ląstelių linijas priglaustų V842I mutacija buvo atsparios trastuzumabu, bet buvo jautrus negrįžtamo HER2 inhibitorius, neratinib [27].

Puslaidininkių pagrindu sekos turi esminių skirtumų, stebėjimo ir signalų perdavime, palyginti su masių spektrometrija pagrindu sudarytas sekos. Vietoj to, naudojant optinius metodus aptikti nukleotidų pakeitimų, puslaidininkių pagrindu technika jaučia pH pokyčiai pagal išleidimo protonų (O ^{+), kai nukleotidai integruotis į didėjantį DNR grandines. [8] Todėl, yra žymiai sumažinti išlaidų ir laikas, reikalingas duomenų apdorojimo, palyginti su kitomis NGS platformų. Teikti greitą ir tikslią informaciją apie mutacijų mažomis sąnaudomis yra labai svarbus pacientams, sergantiems labai agresyvių vėžio, įskaitant skrandžio vėžio.}

Šiame tyrime mes rankomis peržiūrėjo automatizuotas skambučius žinomų mutacijų tepdami nukirpimas vertybes dažnio ir apimtis, vėliau pridedant du skambučius mažai variantas aprėptį. Nors jų aprėpties vertės nepasiekė mūsų pradinių kriterijų, jų dažniai viršijo mūsų pirmasis parametras (6%) ir duomenų kokybė buvo gera. Tai pabrėžia rankinio peržiūros po automatizuoto tikrinimo svarbą. Neseniai paskelbti rezultatus, gautus naudojant AmpliSeq kaip analizuojant platforma taip pat pabrėžti, kompensaciją patikros duomenimis su mechanine peržiūros [9], [10].

Asmeninės skirta terapija pažengusiems vėžio pirmiausia remiasi koncepcija "onkogeno priklausomybę," į kurio daugelis genetinių anomalijų yra priklausomi nuo vieno ar kelių genų naviko ląstelių priežiūros ir išlikimui. [28] Atviro, tarptautinis, 3 fazės, atsitiktinių imčių kontroliuojamų Toga (Trastuzumabas skrandžio vėžio) tyrimas parodė, kad trastuzumabo derinys su chemoterapija yra naujas standartas galimybė pacientams, sergantiems HER2 teigiamas išplitusiu skrandžio ar virškinimo stemplės jungties vėžio. [29] Ikiklinikinių bandymus parodė, kad skrandžio vėžio su EGFR
arba MET
stiprinimas ir raiška atsakyti cetuksimabui arba RER receptorių tirozino kinazės inhibitorių vartojimo poaibis. [30] Be to, amplifikacijos apie ląstelių ciklo tarpininkas CCNE1
rodo, skirtų naudoti terapijoje slopinimu cikloniniai priklausoma kinazės skrandžio vėžio potencialą. [31] Atranka išplinta genus tikslingai terapijos su didelio našumo technologija yra labai svarbus. Tradiciniai metodai, pavyzdžiui, žuvis ir masyvo lyginamosios genomo hibridizacijos kenčia nuo žemo genomo regionų, brangumo rezoliucijos ir yra Labor ir laiko. [32] Be šio pirmojo tyrimo nCounter CNV analizes, mes nustatėme, kad ši technologija yra taikoma FFPE klinikinius mėginius ir mes patvirtinti rezultatus IHC, žuvis ir realiojo laiko PGR. Nors mes nepatvirtino visas genus naudojamus užsakymą gruntai, patvirtinimo rezultatai keliose pasirinktose genų buvo puikus.

Apibendrinant, mes sėkmingai atlikta puslaidininkių pagrindu sekos ir nCounter CNV analizes FFPE audinių pavyzdžius nuo 89 skrandžio adenokarcinoma. Didelio našumo sekos ir CNV atranka į archyvinių klinikinių mėginių leidžia greičiau, tiksliau ir ekonomišką aptikti hotspot mutacijų ir CNV genų. Atsižvelgiant į asmeninį genomo medicinos eros, mes planuojame naudoti šiuos įrankius ekrano skrandžio vėžiu sergantiems pacientams, kuriems gali gauti naudos iš tikslinių gydymo.

Pagalbinė informacija
S1 paveiksle.
palyginimas aprėpties Ion AmpliSeq v2 vėžio skydelyje palyginti Oncomap v4
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0111693.s001
(TIF)
S2 pav.
Sklypai Koreliacija tarp MET
CNVs aptiktų nCounter ir mRNR lygių MET
genas realaus laiko
Doi PGR: 10,1371 /journal.pone.0111693.s002.
(TIF)
S1 lentelėje. Viesbutis The Genų sąrašas ION Torrent AmpliSeq vėžio Panel
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0111693.s003
(xls)
S2 lentelėje. Bendrovės iš DNR, jų koncentracijos kartus, vidutinis padengimo mėginių, visų numerių bazių, >koncentracijų; Q20 bazių, skaito, reiškia skaityti ilgis, priskirti skaito, nuo tikslinių tarifas (%), vidutinis gylis ir vienodumą.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0111693.s004
(xls)
S3 lentelėje.
somatinės mutacijos TP53 pervežimas erbB4
ir CTNNB1
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0111693.s005
(XLS)
lentelė S4 ".
CNVs aptikta nCounter koreliuoja ir su aptiktų realaus laiko PGR kopijų skaičiaus
Doi.: /journal.pone.0111693.s006
(XLSX)
10,1371

• PLoS ONE: anksti šėrimas per burną po skrandžio vėžio chirurgijos Įmanoma? Sisteminė apžvalga ir metaanalizė randomizuotų kontroliuojamų tyrimų
• PLoS ONE: Palyginimas rezoliucinės pasiekimais ir mokymosi kreivė tarp laparoskopinių ir robotų pašalintas skrandis skrandžio vėžio