PLoS ONE: MicroRNA 135a slopina limfmazgio Metastazė per Down-reglamento ROCK1 ankstyvą Skrandžio Cancer

Anotacija

mikro RNR (miRNAs) vaidina svarbų vaidmenį skrandžio vėžio progresavimo ir metastazių. Šis tyrimas tyrė Mirna-135a vaidmenį pradžioje skrandžio vėžiu (EGC), įskaitant limfmazgių (LN) metastazių. Mes išnagrinėjome tarp Mirna-135a saviraiškos ir klinikinių rezultatų koreliaciją 59 pacientų, kuriems buvo atlikta operacija dėl EGC. Naudojant skrandžio vėžio ląstelių linijas, mes atliekame funkcionalus ir tikslinio geno analizę. Mirna-135a išraiška buvo žemyn reguliuojama 33,9% pacientų. Šie pacientai, nustatyta gerokai daugiau pažengęs (TNM stage≥IB, 35,0% vs 12,8%, p = 0,045) ir aukštąjį norma LN metastazių (30,0%, palyginti su 5,1%, p = 0,014), nei tie, su up-reguliavimas Mirna-135a išraiška. Dispersinės analizės, žemyn reguliavimo Mirna-135a buvo nepriklausoma rizikos veiksnys LN metastazių (Pritaikytas šansų santykis, 8,04; 95% pasikliautinasis intervalas, 1,08-59,81; p = 0,042). Funkcinės analizės, naudojant skrandžio vėžio ląstelių linijas parodė, kad Mirna-135a slopino ląstelių gyvybingumą, epitelio-mezenchiminių perėjimą, ląstelių invaziją, ir migracija. ROCK1 buvo Mirna-135a tikslas ir jo išraiška buvo atvirkščiai koreliuoja su ta Mirna-135a. ROCK1 išraiška buvo gerokai padidėjo EGC pacientams su LN metastazių nei tiems, kurie neturi LN metastazių. Mūsų rezultatai patvirtina naviko slopinančio vaidmenį Mirna-135a ir parodyti savo vaidmenį LN metastazių į EGC. Mirna-135a ir jos tikslinio geno ROCK1
gali būti naujų terapinių ir prognostiniai tikslai EGC

nurodomoji dalis:. Shin JY Kim Yi Cho SJ Lee MK, sausainiukai MC Lee JH, ir kt. (2014) MicroRNA 135A slopina limfmazgio Metastazė per Down-reglamento ROCK1 ankstyvo skrandžio vėžio. PLoS ONE 9 (1): e85205. Doi: 10,1371 /journal.pone.0085205

redaktorius: Masaru Katoh, Nacionalinis vėžio centras, Japonija

Įstojo: Spalio 28, 2013; Priėmė: Lapkričio 23, 2013 m Paskelbta: Sausis 21, 2014

Visos teisės saugomos: © 2014 Shin et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis tyrimas buvo finansuojamas dotacija 1110532-3 iš nacionalinio vėžio centro, Korėja. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų. HA yra PLoS ONE redakcinės kolegijos narys ir tai nekeičia autorinę laikymąsi visiems PLoS ONE politikos dalijimosi duomenimis ir medžiagų.

Įvadas

Skrandžio vėžys išlieka antra labiausiai paplitusi priežastis, dėl vėžio mirtingumo visame pasaulyje, nepaisant mažėjančios sergamumo ir mirtingumo išsivysčiusiose šalyse [1 ].

srityse, įskaitant Korėjos ir Japonijos, kur tikrintis dėl skrandžio vėžio atliekamas plačiai, ankstyvas nustatymas dažnai yra įmanoma. Kadangi padidėjęs norma ankstyvam skrandžio vėžio, gali sukelti geresnio prognozės, interesai, pagerinti pacientų gyvenimo kokybę ir naudojant minimaliai invazinės procedūros padidėjo. Pacientams, sergantiems skrandžio vėžio, limfmazgių (LN) metastazės yra vienas iš svarbiausių prognostinių faktorių, ir bendras dažnis iš LN metastazių į anksti skrandžio vėžio (EGC) svyruoja nuo 5 iki 20% [2] - [4].

pašalintas skrandis su LN skrodimo laikomas standartiniu gydymo skrandžio vėžio; Tačiau 80 iki 95% pacientų, sergančių EGC nereikia LN skrodimo, jei skrandžio vėžys yra visiškai pašalintų mažiau invazinės procedūros, pavyzdžiui, endoskopinės rezekcija [5] - [7] arba minimaliai invazinės chirurgijos (, pvz
, paprastas pleišto rezekcija arba Sentinel LN navigacijos chirurgija) [8] - [10]. Nors buvo atlikti tyrimai biologinių prognozinių ir prognozavimo žymekliai LN metastazių į EGC, nėra prognozuojami įrankiai egzistuoja mazgų metastazės EGC realiai.

Keletas tyrimų pranešė, kad invazijos, naviko dydžio gylį, ir limfinės invazija yra susijęs su LN metastazių EGC [4], [11]. Tačiau dauguma šių veiksnių buvo nustatyti po galutinio patologinio tyrimo rezekcijos audiniuose, kurios nėra naudinga nustatant gydymo strategiją.

mikro RNR (miRNAs) yra maži nebaltyminių kodavimo RNR. Tyrimai įrodė, kad pakitimai išraiška miRNAs prisideda prie vėžio patogenezės, įskaitant tuos, virškinimo kilmės [12] - [15].

buvo taip pat buvo įrodyta, miRNAs būti naudinga diferencijuojant vėžį ir normaliuose audiniuose [ ,,,0],16], [17]. Be to, miRNAs yra išreikštas skirtingai į kiekvieną skrandžio vėžio kancerogenezėje [18] etape. Mirna-27 [19] ir ZEB1 reguliuojama Mirna-200 šeimos [20] parodė, kad tai susiję su etape epitelio-mezenchiminių perėjimo (EMT) skrandžio vėžys. Todėl miRNAs gali būti susijęs su LN metastazių proceso EGC. Tarp miRNAs, Mirna-135a buvo įrodyta, kad būti auglys slopinančio Mirna, o jo išraiška žemyn reguliuojama keliomis vėžio, įskaitant inkstų ląstelių karcinoma [21] ir limfomos [22]. Savo ruožtu, per išraiškos ar atkūrimo Mirna-135a skatina apoptozę ir slopina proliferaciją vėžinių ląstelių per savo tikslinės genų C-Myc [21] ir JAK2 [22], atitinkamai. Be in vitro pervežimas tyrime Mirna-135a slopino migracijos ir invazinių veiklą skrandžio vėžio ląstelių [23]. Tačiau navikas slopinančio vaidmuo Mirna-135a skrandžio vėžys yra neaiški.

Šios studijos tikslas buvo ištirti ryšį tarp Mirna-135a saviraiškos ir klinikinių rezultatų į EGC pacientų, įskaitant LN metastazių koreliaciją.

medžiagos ir metodai

Žmogaus audinių mėginiai ir klinikiniai duomenys

Penkiasdešimt devyni suaugusių pacientų diagnozuota EGC prie nacionalinio vėžio centro, Pietų Korėja, nuo 2011 metų sausio iki 2013 balandžio buvo perspektyviai įtraukti į šis tyrimas. Šie pacientai buvo gydomi atvirą ar laparoskopija-padeda pašalintas skrandis su D1 + arba daugiau LN skrodimo. Iš LN skrodimo mastu vadovavosi Japonijos skrandžio vėžio asociacijos [24] rekomendacijas. Laikotarpis po operacijos etapas buvo įvertintas pagal 7 ^{-osios Amerikos jungtinio komiteto leidimas vėžio TNM [25]. Žmogaus audiniai, įskaitant ir abu skrandžio vėžio ir suderinti normaliuose audiniuose iš kiekvieno paciento buvo nedelsiant užšaldomos skystame azoto ir saugomi -80 ° C temperatūroje. Nuo medicinos diagramas peržiūros, clinicopathologic charakteristikas, įskaitant amžių, lytį, Helicobacter pylori
statusą, naviko charakteristikos, scenos, ir statusas LN metastazių buvo gautos ir analizuojami. Informuotas sutikimas raštu buvo gauta iš visų pacientų, o tyrimas buvo patvirtintas Institucijų ekspertizės valdyba Nacionalinio vėžio centro, Korėja (NCCNCS-11-445).}

Mobilusis kultūra ir transfekcija

normalus žmogaus skrandžio epitelio ląstelių linija HFE145 [26], [27] buvo dovana nuo dr Hassan Ashktorab ir Duane T. Smoot (Howard universiteto Vašingtone, JAV) ir komerciškai prieinamų skrandžio vėžio ląstelių linijų AGS, YCC2, MKN28, KATOIII, SNU1 , SNU5, SNU16, SNU216, SNU601, SNU638, SNU668 ir SNU719 buvo gauti iš Korėjos ląstelių linijos bankas (KCLB, Seulas, Pietų Korėja). Visi mobilieji linijos buvo prižiūrimi RPMI 1640 laikmenos, kuriuose yra 10% vaisiaus jaučio serumo (FBS) ir 1% antibiotikus (INVITROGEN, Carlsbad, Kalifornija, JAV). Tarp skrandžio vėžio ląstelių linijas, MKN28 ir SNU668 ląstelių linijos buvo pasirinktas, nes jie retai išreikšti Mirna-135A ir YCC ir KATOIII ląstelių linijos buvo pasirinktas, nes jie turi didelę pradinę išraišką Mirna-135a (1a pav.) Transfekcija su Mirna-135A imituoja (mirVana ™ Mirna imituoja, Ambion, Austin, TX, JAV), kurio Mirna-135a inhibitorių (mirVana ™ Mirna inhibitorius, Ambion, Ostinas, TX, Jungtinės Amerikos Valstijos) ir ROCK1 siRNR (5'-UGAUGCAAAGAUUGUACUC- 3 "; UGBioneer, Seulas, Pietų Korėja) ir SNU668, YCC2, MKN28 ir KATOIII ląstelių linijos buvo atliekama naudojant Lipofectamine RNAiMAX ir Lipofectamine 2000 reagentai (INVITROGEN, Carlsbad, CA, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. MKN28, SNU668, YCC2 ir KATOIII ląstelių linijos buvo surinktos dvi dienas po transfekciją ir buvo atliekami įvairūs tyrimai.

RNR gavybos ir miRNAs kiekybinis

Viso RNR buvo išskirta iš 13 ląstelių linijų ir 59 skrandžio vėžio pacientų audiniai, atitinkamai, naudojant TRIzol (INVITROGEN, Carlsbad, CA, JAV), kaip už gamintojo protokolą. buvo naudojamas TaqMan universalus PGR meistras mix reagentai komplektas (Taikomoji Biosystems, Tokijas, Japonija). Amplifikacija ir aptikimo buvo atliekama naudojant 7900HT Sequence Detection sistema (Applied Biosystems, Tokijas, Japonija) su 40 ciklų denatūruojant 95 ° C temperatūroje (15 sekundžių) ir atkaitinimo /pratęsimo esant 60 ° C (60 sekundžių). Tai buvo prieš atvirkštinės transkripcijos esant 50 ° C temperatūroje 30 minučių ir denatūruojant 95 ° C temperatūroje 10 minučių. Norėdami quantitate brandus miRNAs, TaqMan MicroRNA tyrimų rinkiniai (Applied BIOSYSTEMS, Tokijas, Japonija) buvo naudojamas aptikti Mirna-135a ir kontrolės Mirna (RNU6B).

Vakarų dėmė analizė

Baltymai buvo išgauti iš 13 ląstelių linijų ir 59 EGC pacientų audinių mėginiai naudojant Ripa buferis (Biosesang, Seulas, Pietų Korėja), įskaitant proteazių inhibitorius kokteilis (Sigma, St Louis, Misūrio valstija, JAV) pagal gamintojo protokolą. Be to, imunoblotingu buvo atliekama naudojant anti-ROCK1 ir anti-β-aktino (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, JAV) antikūnus. Signalai buvo aptikta su ECL premjero Kit (GE Healthcare, Piskatavėjus, NJ, JAV) pagal gamintojo instrukcijas.

ląstelių proliferaciją tyrimai

ląstelių proliferacija buvo matuojamas naudojant MTT. Ląstelės buvo padengtą 96 duobučių kultūros plokštės (3 × 10 ^{3 ląstelės per šulinio) ir perkeltų su Mirna-135A imituoja po dviejų dienų inkubacijos. Vėliau, 200 pL MTT (0,5 mg /ml, Sigma, St. Louis, MO, JAV) buvo pridėta į kiekvieną šulinėlį. Po keturių valandų papildomo inkubacijos, buvo atmestos MTT sprendimai, 200 pL DMSO (Amresco, Solonas, OH, JAV) buvo pridėta į kiekvieną šulinėlį, ir plokštelės buvo atsargiai sukratyti. Optinių buvo matuojamas ELISA skaitytuvu (Moecular prietaisų, Saniveilas CA, JAV), kai bandymo bangos 570 nm.}

Mobilaus ryšio ciklo analizė

Ląstelės buvo padengtas į 60π kultūros plokštės ir perkeltų su Mirna -135a imituoja arba Mirna imituoja neigiamos kontrolės (imituoja-NC). Šios ląstelės buvo surenkamos trypsinization ir nustatytas 70% etanolio ne mažiau kaip dvi valandas -20 ° C temperatūroje. Mobilaus ryšio granulės buvo plaunamos šaltu fosfato buferinis fiziologiniu tirpalu ir inkubuojami 30 minučių kambario temperatūroje PI /RNaze Dažymo buferis (BD Biosciences, San Diego, CA, USA). Po dažymo, mėginiai buvo analizuojami su FACScan srauto citometre (BD biomokslų, San Chosė, CA, JAV) ir 10.000 įvykių buvo surinkta už mėginį. Duomenys iš tėkmės citometrijos buvo analizuojami naudojant Mobilusis Quest Software (Becton Dickinson, San Chosė, CA, JAV).

Transeuropiniai filtras migracija ir invazija tyrimai

ląstelės buvo pernešta su Mirna-135A imituoja , mirna-135A inhibitoriai, ROCK1 siRNR, ir ROCK1 siRNR neigiama kontrolė (scRNA) už vieną dieną ir tada perkelti į viršutinę kameroje transwell plokštelę, padengtą 0,5 mg /ml kolageno I tipo (BD biologijos, Bedford, MA, JAV) ir 01:15 skiesti Matrigel (BD biologijos mokslų, Bedford, MA, JAV). RPMI 1640 su 10% FBS ir 1% antibiotikams (Gibco BRL, Grand Island, NY, JAV) buvo įtraukta į apatinę kamerą ir plokštelės buvo inkubacija 20 valandų. Migruojantys ir užplūsta ląstelės buvo įvertinami naudojant hematoksilinu ir eozinas dažymo.

liuciferazės Reporter plazmidės konstrukcijos

laukinio tipo 3 "UTR ir ROCK1, kuriame privalomi svetaines Mirna-135a sustiprino naudojant gDNA iš SNU668 ląstelės kaip šabloną. Susietų mutantas konstruktai buvo sukurtas mutavo sėklas regionus, Mirna-135 jungimosi vietų. Tiek laukinio tipo ir mutantas 3 'UTR buvo klonuotas pasroviui nuo liuciferazės geno į pGL3 kontrolės vektorių. Į konstruktai buvo patikrintas sekos.

liuciferazės tyrimas

liuciferazės tyrimai buvo atliekami SNU668 ir YCC2 ląsteles. SNU668 ir YCC2 ląstelės buvo pernešta su kiekviena iš plazmidės (tuščia vektorius [MOCK] ROCK1 3 "UTR laukinio tipo [WT] ir ROCK1 3 'UTR mutantas [MUT], kaip Mirna-135a privalomu svetainėje) kartu su miRNA- 135A imituoja, Mirna-135A inhibitoriai, ir neigiamus kontrolinius RNR 24-duobučių lėkštelėse. Dvi dienas po to, kai transfekciją, Ląstelės buvo surinktos ir lizuojamos. Liuciferazės tyrimai buvo atliekamas panaudojant lizatuose naudojant liuciferazės reagentq rinkini (PROMEGA, Madison, WI, JAV). Liuciferazė veikla buvo standartizuoti beta galaktosidazei.

imunohistocheminį dažymo

Imunohistocheminis (IHC) dažymo buvo atliekama reprezentatyvių 20 atvejų iš ROCK1 mažos ir didelės raiškos grupes. Antigenas paieškos buvo padaryta su termiškai apdorojama 30 min pH 8,0 tri-EDTA buferinio (CC1, Ventana medicinos sistema, Tucson, AZ, JAV), esant 95 ° C temperatūroje. Audinių skaidres buvo inkubuojami 42 ° C temperatūroje 30 min su anti-ROCK1 mAb (ab134181 klonas EPR638Y, triušio monokloniniai, 1:5,000; Abcam, Cambridge, MA, JAV). Neigiami kontroliniai mėginiai buvo naudojami vienodai su nonimmunized triušio IgG. Rezultatai buvo aiškinama patyręs patologas (MC sausainiukai).

Statistinė analizė

Scale duomenys pateikiami kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis (SD). Chi-kvadrato ar Fisher'io testai ir Mann-Whitney U testas buvo naudojamas palyginti kategorinius kintamuosius ir nuolat kintamieji, atitinkamai. Pearson koreliacijos koeficientas buvo naudojamas lyginant genų ekspresijos šabloną tarp Mirna-135a ir ROCK1. Daugiamatis logistinės regresijos modelis buvo naudojamas siekiant nustatyti nepriklausomų veiksnių, susijusių su LN metastazių. Kintamųjų, kurie buvo reikšmingi naudojant chi kvadrato ar Fisher'io testai ( P
< 0,05) buvo įrašytas į logistinės regresijos modelį. Visi duomenys buvo analizuojami naudojant Stata 12.1 "(Stata Corp", College Station, TX, USA). buvo laikomas P
vertė mažesnė negu 0,05 statistiškai reikšmingas.

Rezultatai

Mirna-135a ekspresijos lygis susijęs su progresavimo ir LN metastazių į EGC

Ankstesnis tyrimas parodė, kad Mirna-135a išraiška žemyn reguliuoja skrandžio vėžio ląstelių linijų [23]. Naudojant KRL-PGR, mes taip pat nustatė, kad Mirna-135a išraiška žemyn reguliuojama įvairiais skrandžio vėžio ląstelių linijų, palyginti su normaliai skrandžio epitelio ląstelių linijos (1a pav.)

Tačiau koreliacija tarp Mirna-135a išraiška ir klinikiniai rezultatai skrandžio vėžio nebuvo tirtas. Todėl mes išmatavo Mirna-135A raiškos lygį pirminės skrandžio vėžiu ir jų atitinkamus lygius sveikuose audiniuose iš 59 pacientų, sergančių EGC. Down-ir iki reguliavimui genų navikų audiniuose, kai tai susiję su normaliuose audiniuose buvo apibrėžiamas kaip naviko santykis su įprastomis audinių genų ekspresijos lygių < 1,0 ir >. 1.0, atitinkamai

Priešingai rezultato iš in vitro
eksperimentas, tik 20 (33,9%) iš 59 pacientų, sergančių EGC eksponuojami žemyn reguliavimas Mirna-135a išraiška. Tačiau šie pacientai reikšmingai buvo labiau pažengęs (TNM stage≥IB, 35,0% vs 12,8%, p = 0,045; žalios keista santykis [AR] 2,11; 95% pasikliautinasis intervalas [PI], 1.08-4.10) ir didesnis tarifas LN metastazių (30,0%, palyginti su 5,1%, p = 0,014; neapdirbtas arba, 2,73; 95% PI, 1,50-4,98) nei su iki-reguliavimo Mirna-135a išraiškos (lentelė S1). Jautrumas ir specifiškumas Mirna-135a ekspresijos būklė prognozuojant LN metastazių buvo 75,0% ir 72,5%, atitinkamai. Be to, pacientams, sergantiems daugiau pažengęs (1b paveikslas) ar LN metastazių (1c pav), nustatyta gerokai mažesnė santykis naviko prie normalių Mirna-135a ekspresijos lygį, negu su IA etape arba be LN metastazių. Daugiamatis logistinės regresijos analizė taip pat parodė, kad Mirna-135a žemyn reglamentas buvo nepriklausomai susijęs su LN metastazių (koreguotas, 8,04; 95% PI, 1,08-59,81; p = 0,042; 1 lentelė). Bendrai, šie rezultatai rodo, kad žemyn reguliavimo Mirna-135a išraiška gali būti susijęs su skrandžio vėžio progresavimą, įskaitant LN metastazių.

Mirna-135a slopina skrandžio vėžio ląstelių gyvybingumas, EMT, migracija, ir invazija

Jei toliau tirti tarp Mirna-135a ir klinikinių rezultatų asociaciją, mes atliekame funkciniai tyrimai ląstelių gyvybingumo, ląstelės ciklo, EMT, migracijos, ir invazijos skrandžio vėžio ląstelių linijas. Padidėjusi Mirna-135a pagal Mirna-135A imituoja reikšmingai slopino ląstelių gyvybingumą (2a pav) ir padidino subdiploid frakcija SNU668 ląstelių, ląstelių linija, kad retai išreiškia Mirna-135A (2B pav), o tai rodo padidėjusį apoptozę skrandžio vėžio ląsteles. Tačiau slopinimas Mirna-135a iki Mirna-135A inhibitorių sukeltas nei in ląstelių gyvybingumo didinimas, nei subdiploid frakcija sumažėjo YCC2 ląstelių, ląstelių linija, kad išreiškia didelę Mirna-135A (2a pav ir 2b). Mes taip pat tyrė ryšį tarp Mirna-135a saviraiškos ir EMT asociaciją skrandžio vėžio ląsteles, nes Mirna-135a down-regulation buvo nepriklausoma rizikos veiksnys LN metastazių į EGC pacientų (1 lentelė). Padidėjęs išraiška Mirna-135a buvo susijęs su slopinimo EMT ir parodė į E-cad raiškos padidėjimas ir tiek N-cad slopinimas ir Slug į SNU688 ląsteles. Priešingai, slopinimas Mirna-135a išraiška lėmė aktyvavimo EMT įskaitant E-cad raiškos slopinimo ir up-reguliavimo tiek N-cad ir slunkius raiškos YCC2 ląstelių (2c pav.) Be funkcinių pasekmių, raiška nuo Mirna-135a pagal Mirna-135A imituoja vertinimo reikšmingai slopino migracijos ir invazija gebėjimus SNU668 skrandžio vėžio ląstelių (2d pav). Priešingai, blokada Mirna-135a iki Mirna-135A inhibitorių gerokai padidėjo migracija ir invazija YCC2 skrandžio vėžio ląstelių (2e pav). Apskritai, mūsų rezultatai rodo, kad Mirna-135a yra navikas slopinančio reguliatorius skrandžio vėžio platinimu ir metastazių.

ROCK1 yra tikslinė genas Mirna-135a skrandžio vėžio

aiškinsis mechanizmus, sukeliančius į Mirna-135a dėl klinikinių rezultatų poveikis, mes ieškoma tariamą tikslus naudojant TargetScan 6.2 duomenų bazę. 718 užkonservuotas tikslus, mes išrinkome tikslus su aukščiausią balą, kurio žemyn reglamentavimas gali padidėti vėžio ląstelių dauginimosi, migracijos ir invazijos. Mes nustatėme, kad ROCK1 gali būti tikslinė genas Mirna-135a dėl slopinimo arba slopinimą ROCK1 buvo pranešta skatinti apoptozę ir slopina migracija, invazija, ir proliferaciją vėžinių ląstelių įskaitant ir skrandžio vėžio [28] - [30]. TargetScan analizė parodė, kad 3'UTR seka ROCK1 turi vieną galimą jungimosi vietos Mirna-135a (3a pav.) Norėdami patvirtinti, ar ROCK1 yra Mirna-135a tikslas, liuciferazės tyrimas buvo atliktas. Aprašyti metodai skyriuje liuciferazės 3'UTR konstruktai buvo bendrai perkeltų į SNU688 ląstelių su Mirna-135A imituoja ir į YCC2 ląstelių su Mirna-135A inhibitoriais. Mes taip pat pastatytas ROCK1 3'UTR MUT mutacijų c punktas → G galimo jungimosi svetainėje (3A pav.) Santykinis liuciferazė veikla ROCK1 3'UTR WT buvo žymiai padidėjo nuo Mirna-135A inhibitorių (3b pav) buvimą. Priešingai, ši veikla buvo gerokai sumažėjo į Mirna-135A imituoja (3c pav) buvimą. Skrandžio vėžio ląstelių linijas, Mirna-135a ir ROCK1 parodė priešingą išraišką modelis. Vakarų dėmė analizė parodė, kad ROCK1 išraiška buvo žemyn reglamentuojama Mirna-135A imituoja buvimą, ir up-reglamentuojama Mirna-135A inhibitorių (3D paveiksle ir 3e) buvimą. Kartu paėmus, šie rezultatai rodo, kad Mirna-135a slopina ROCK1 išraiška tiesiogiai nukreipti savo 3'UTR.

išraiška ROCK1 yra atvirkščiai koreliuoja su ta Mirna-135a pacientams su EGC

Analizė 59 pacientams, sergantiems EGC parodė, kad ekspresijos lygis ROCK1 turėjo didelį neigiamą koreliaciją su tais Mirna-135a (r = -0.697, p < 0,001; 4A pav.) Be to, pacientams, sergantiems iki-reguliavimo Mirna-135a išraiška buvo žymiai mažesnes ROCK1 baltymų raiškos nei su žemyn reguliavimo Mirna-135a (vidutinis naviko į normalų santykį, 0.81 vs 1,55, p < 0,001; 4b paveikslas) .

ROCK1 yra susijęs su LN metastazių į EGC ir dalyvauja skrandžio vėžio ląstelių migracijos ir invazija Mirna-135a

nutylėtų Norėdami papildomai įvertinti tarp ROCK1 saviraiškos ir klinikinių rezultatų asociaciją EGC, mes analizavo ROCK1 raiškos modelius su nuoroda į LN metastazių statuso įtrauktų pacientų. Pacientams, sergantiems LN metastazių turėjo žymiai didesnę raišką ROCK1 baltymų nei be LN metastazių (vidutinis naviko prie normalaus santykio, 1,86 vs 0,93, p = 0,007; 5A pav). Be to, lygiai ROCK1 IHC dažymo buvo panašūs į ROCK1 raiškos Vakarų dėmė analizė (, ty
, pacientai be LN metastazių turėjo silpnų IHC nusidažymo [5B pav], bet tie, su LN metastazių buvo stipri teigiama IHC dažymo [5C pav]).

Galiausiai, siekiant ištirti, ar pagal Mirna-135a suteiktų nutylėtų migracija ir invazija gebėjimai iki reguliavimą pastebėtas skrandžio vėžio ląstelių linijų iš ROCK1 rezultatas iki reguliavimą, mes atliekame migracija invaziją tyrimai, naudojant skrandžio vėžio ląstelių linijas perkeltų konkretesnės ROCK1 siRNA. ROCK1 siRNR slopino migracijos ir invazinių veiklą SNU668 ląstelių (5d pav). Be YCC2 ląstelių bendrai transfektuotose Mirna-135A inhibitorių ir ROCK1 siRNA (5e pav), migracijos ir invazija tyrimai parodė, kad slopinimas ROCK1 pagal siRNA reikšmingai sumažino didinimo migracijos ir invazinių poveikį Mirna-135a žemyn reglamento Mirna-135A inhibitorių (5F pav.)

Bendrai, šie rezultatai rodo, kad ROCK1 yra susijęs su LN metastazių į EGC pacientų, o tai lemia didesnį ROCK1 išraiška į Mirna-135a žemyn reguliavimo kontekste. Todėl ROCK1 gali dalyvauti Mirna-135a-nutylėtų skrandžio vėžio metastazių.

Diskusijos

Šiame tyrime mes nustatėme, kad Mirna-135a turėjo vėžinių slopinamąją vaidmenis skrandžio vėžio. Pacientams, sergantiems EGC, žemyn reguliavimo Mirna-135a buvo nepriklausoma rizikos veiksnys LN metastazių. Skrandžio vėžio ląstelių iki reguliuojama Mirna-135a slopino skrandžio kancerogenezės slopina ląstelių proliferaciją, EMT ir metastazių. Be to, mes taip pat nustatė naują tikslą geną Mirna-135a, ROCK1, kuris buvo susijęs su LN metastazių skrandžio vėžio.

Pacientams, sergantiems EGC, vertinimas LN metastazių prieš gydymą yra svarbus žingsnis nustatant gydymo strategijas. Mažiau invazinės procedūros, pavyzdžiui, endoskopinės rezekcija [5] - [7] arba Sentinel LN navigacijos chirurgija [9], [10], gali būti įmanoma EGC pacientams be LN metastazių. Šie gydymo metodai pagerėjo pacientų gyvenimo kokybę atsižvelgiant į pavėluotų komplikacijų, susijusių su standartiniais chirurginio gydymo, įskaitant dempingo sindromas, svorio kritimas, ir refliukso susijusių simptomų [31]. Todėl daugiau specifiškas ir jautrus biologiniai žymenys turi prognozuoti LN metastazių būklės pacientams, sergantiems EGC. Šioje studijoje, Mirna-135a žemyn reglamentas buvo, kaip nepriklausomas faktorius LN metastazių ir prognozavimas vertė Mirna-135a ekspresijos būklė buvo santykinai didelė su jautrumu 75%, o specifiškumas 73%. Nors reikia papildomų tinkamumo patvirtinimo tyrimai, šie rezultatai parodė, kad matavimo Mirna-135A lygiai prieš nustatant gydymo planą EGC pacientams gali būti naudinga bandymo prognozuoti LN statusą.

Įdomu, Mirna-135a buvo pranešta būti naviko slopinantį ir onkogeninė. Padidėjusi Mirna-135a buvo susijęs su slopinimo naviko proliferaciją ir augimo inkstų ląstelių karcinoma [21] ir su padidėjusia apoptozės ir geriau ligos neapimtos teritorijos išlikimui limfoma [22]. Priešingai, Mirna-135a dalyvavo kolorektalinio vėžio progresavimo [32] ir padidėjo krūties ląstelių migracijos ir invazijos [33]. Šioje studijoje, Mirna-135a buvo įrodyta, kad būti auglys slopinančio Mirna, kuris yra susitarusi su ankstesnės tyrimo [23] rezultatas. Specialiai, tuo didesnė raiška Mirna-135a slopino kelis žingsnius skrandžio kancerogenezėje įskaitant dauginimosi, migracijos ir invazijos. Be to, mes taip pat nustatė, kad Mirna-135a gali slopinti EMT, kuris pranešė, kad būti susijęs su daugiapakopį procesą kancerogenezėje ir skatinimo metastazių [34], [35] inicijavimo. Prieš šio tyrimo duomenimis, tarp Mirna-135a ir EMT asociacija nebuvo tirta, nors ankstesni tyrimai parodė, kad miRNAs, pvz Mirna-27 [19] Mirna-200 šeimos [20], Mirna-7 [36] ir Mirna-1228 [37] slopinti EMT per savo tikslinių genų skrandžio vėžio. Kartu paėmus, Mirna-135a yra navikas slopinančio Mirna skrandžio vėžio.

Ankstesnis tyrimas analizuojant 353 žmogaus skrandžio vėžio audiniuose parodė, kad ekspresijos modeliai miRNAs yra skirtingos ir kad kai miRNAs buvo susiję su progresavimo ir prognozės skrandžio Vėžys [14]. Tyrime, Mirna-135a buvo klasifikuojamas kaip onkogeniniam Mirna skrandžio vėžio, remiantis DNR Mikrogardelė analizuoja rezultatus. Tačiau neseniai [23] ir mūsų tyrime, Mirna-135a veikė kaip naviko slopintuvas nepaisant dideliu greičiu pacientų su Mirna-135a iki reguliavimą. Nors daugeliui pacientų (66%) turėjo iki-reguliavimo Mirna-135a panašus į ankstesnį tyrimą [14] Todėl šie pacientai, nustatyta gerokai mažiau pažengęs ir mažesnį tarifą LN metastazių. Be to, papildomi in vitro
tyrimai taip pat parodė, kad didesnė raiška Mirna-135a buvo susijęs su slopinimo skrandžio kancerogenezėje. Šie rezultatai rodo, kad ekspresijos modeliai miRNAs gali skirtis nuo klinikinių rezultatų, todėl, kad patvirtintumėte tikslią vaidmenis konkrečių miRNAs, reikia papildomų tyrimų.

ROCK1 yra Rho-susijusia serino /treonino narys kinazės šeima, kuri veikia kaip centrinis reguliatorius aktino citoskeleto organizavimo ir dinamiką [23], [38]. ROCK1 turi įvairiausių funkcijų Tumorigenesis įskaitant migracijos, invazijos ir metastazių [28]. ROCK1 yra keletas miRNAs įvairių vėžio, įskaitant Mirna-584 inkstų ląstelių karcinoma [39] tikslas, Mirna-335 į neuroblastoma [40], ir Mirna-146A prostatos vėžio [41]. Skrandžio vėžio, ROCK1 buvo teigiamai koreliuoja su LN metastazių ir TNM etape [42], ir dalyvauja Mirna-148A-sukeltas slopinimo skrandžio vėžio ląstelių migracijos ir invazijos [30]. Be to, ROCK1 inhibitorius skatinamas apoptozę skrandžio vėžio ląstelių [29]. Šioje studijoje, mes nustatėme, kad ROCK1 yra Mirna-135a tikslas skrandžio vėžiu ir jo išraiška yra teigiamai susijęs su LN metastazių į EGC pacientams. in vitro
eksperimentai parodė, kad ROCK1 dalyvauja skrandžio vėžio ląstelių judrumui ir invazijos. Šie rezultatai rodo, kad ROCK1 gali būti naujas terapinis taikinys su gebėjimu slopinti skrandžio vėžio metastazių.

Taigi, mes nustatėme Mirna-135A kaip naujas prognostinį biologinis žymuo LN metastazių pacientams, sergantiems EGC ir parodė, kad Mirna-135a slopino skrandžio kancerogenezės (, ty
, platinimu, EMT ir metastazių skrandžio vėžio ląstelių linijų) nukreipiant ROCK1. Nors šie duomenys reikalauja patvirtinti kitais nepriklausomais pacientų grupių, jie rodo, kad Mirna-135a ir jos tikslinio geno ROCK1 gali būti naujas biologinis ir terapinis taikinys skrandžio vėžiu su metastazėmis LN.

Pagalbinė informacija
S1 lentelė ,
Clinicopathologic charakteristikos pacientams su ankstyvos skrandžio vėžio pagal Mirna-135a ekspresijos būklė
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0085205.s001
(DOC)

• PLoS ONE: Asociacija tarp polimorfizmai XRCC1 genų ir gydymo rezultatus pacientams, sergantiems išplitusiu skrandžio vėžiu: sisteminė apžvalga ir metaanalizė
• PLoS ONE: Nukreipimas cad-17 inaktyvuoja Ras /Raf /MEK /ERK signalizacijos ir slopina ląstelių proliferaciją in skrandžio vėžio