Stomach Health > skrandžio sveikatos >  > Gastric Cancer > skrandžio vėžys

PLoS ONE: MicroRNA-149 slopina proliferaciją ir ląstelinį ciklą per ZBTB2 orientuojantis į Human Skrandžio Cancer

Anotacija

Vis daugėja įrodymų rodo, kad Pasaulis-149 gali tiek slopina ir skatinti navikų augimą priklausomai nuo navikas tipas. Tačiau, miR-149 vaidmuo skrandžio vėžio (GC) progresavimo lieka nežinomas. Čia mes pranešti, kad miR-149 yra auglio slopintuvas žmogaus skrandžio vėžio. Pasaulis-149 išraiška sumažėjo GC ląstelių linijų ir klinikinių mėginių, palyginti su normalaus skrandžio epitelio ląstelių ir audinių, atitinkamai. Ekspresijos lygis miR-149 taip pat koreliuoja su diferenciacijos laipsnio GC ląstelių ir audinių. Be to, negimdinis išraiška miR-149 skrandžio vėžio ląsteles slopina proliferaciją ir ląstelių ciklo progresavimą žemyn reguliavimo ZBTB2
, stiprus represoriaus iš ARF-HDM2-P53-P21 keliu, su potencialiu privalomą svetainėje Pasaulis-149 į jo iRNR anketa 3'UTR srities. Taip pat nustatyta, kad ZBTB2 išraiška didėja GC ląstelių ir audinių, palyginti su įprastais skrandžio epitelio ląstelių ir audinių, atitinkamai. Triukšmo slopinimo ir ZBTB2
sukelia slopinimo ląstelių augimą ir ląstelių ciklo arešto G0 /G1 fazės, nurodant, kad ZBTB2 gali veikti kaip GC onkogeno. Be to, transfekcija miR-149 imituoja į skrandžio vėžio ląsteles sukelia žemyn reguliavimą ZBTB2 ir HDM2, ir up-reguliavimo ARF, p53 ir p21, palyginti su kontrole. Apibendrinant galima teigti, kad mūsų duomenys rodo, kad Pasaulis-149 veikia kaip naviko slopintuvas į žmogaus skrandžio vėžį, bent iš dalies per, tikslinio taikymo ZBTB2

nurodomoji dalis:. Wangas Y Zheng x Zhang Z, Zhou J, Zhao G, Yang J, ir kt., (2012) MicroRNA-149 slopina proliferaciją ir ląstelinį ciklą per orientacija ZBTB2
žmogiškųjų skrandžio vėžio. PLoS vieną iš 7 (10): e41693. Doi: 10,1371 /journal.pone.0041693

redaktorius: Wael El-Rifai, Vanderbilt universiteto medicinos centras, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: nuo 13 d, 2012 m Priėmė: Gegužės 25, 2012 m Paskelbta: Vasaris 29, 2012

Visos teisės saugomos: © 2012 Wang et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė dotacijas iš nacionalinio Gamtos mokslo fondo Kinijos (Nr. 30872966 ir Nr. 31071135), Nacionalinis gamtos mokslo fondas Kinijos (Nr. 81.000.864, Nr. 81.172.290, Nr. 91.129.723, Nr. 81.090.270 ir 81.090.273 Nr.) ir Kinijos Docentas mokslo fondas (20100471776 Nr.). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys (GC) yra vienas iš labiausiai paplitusių vėžio ir pagrindinių priežasčių vėžio mirties visame pasaulyje, ypač Rytų Azijoje, pagal naujausias pasaulio vertinimo paskelbta 2011 [1]. Nepaisant nepaprasto sumažėjimo GC dažnis daugelyje pasaulio šalių, vis dar yra didelės naštos iš daugelio GC atvejais ir mirčių visame pasaulyje. GC karcinogeneze yra labai sudėtingas procesas [2] - [5], susijusias su daugelio genų reguliacijos sutrikimas [6] - [8], įskaitant onkogenų [9] - [14] ir naviko slopintuvai [15] - [18]. Tačiau molekulinius mechanizmus, reikalingi GC plėtros ir progresavimo reikia toliau nagrinėti.

mikro RNR (miRNAs) yra grupė organizme išreiškiamas, ne kodavimo mažų RNR (20-25 nukleotidų ilgio), kaip žinoma, neigiamai reguliuoti genų ekspresiją slopinimui vertimą arba sumažinant mRNR stabilumą tiesiogiai prisijungdamas prie 3'-neišverstas regione (3'-UTR) tikslinių mRNR [19], [20]. Daugėja įrodymų rodo, kad miRNAs vaidina svarbų vaidmenį kuriant, medžiagų apykaitos, platinimo, diferenciacijos ir apoptozės. Be to, nukrypęs nuo normos, po transkripcijos reguliavimas mRNR pagal miRNAs yra susijęs su tumorigenezei [21]. Nenormalios ekspresijos profiliai iš miRNAs nebuvo aptikta įvairių tipų žmogaus auglių, įskaitant plaučių [22], krūties [23], prostatos [24], kepenų [25], gaubtinės žarnos [26], ir skrandžio vėžys [27]. Be to, kai miRNAs gali veikti kaip onkogenų ar naviko slopintuvai reguliuojant tikslinių genų, kurie vaidina svarbų vaidmenį ląstelių ciklo progresavimo, apoptozės, ar platinimu išraiška. Pasaulis-22 [28], PPN-101 [29], ir Pasaulis-7 [30] visi buvo įrodyta, kad būti downregulated naviko egzempliorių ir veikti kaip naviko slopintuvai; Pasaulis-17 [31] ir Pasaulis-21 [32] buvo įrodyta, kad būti aktyvinama naviko egzempliorių ir veikti kaip onkogenų. Šie tyrimai rodo, kad reguliacijos sutrikimas ir miRNAs dažnai dalyvauja kancerogenezėje ir vėžio progresavimą.

Neseniai atlikti tyrimai parodė, kad Pasaulis-149, gali vaidinti svarbų vaidmenį įvairių ligų, įskaitant piktybinių navikų progresavimo. Pasaulis-149 buvo įrodyta, kad veiktų kaip tiek naviko slopintuvas [33] ir onkogeną [34], jei kelių tipų kietųjų auglių vystymąsi. Pavyzdžiui, nuostolių miR-149 sukelia įgyti funkcijos kai kurių onkogenų ir koreliuoja su naviko laipsnio inkstų ląstelių karcinoma [35], astrocytomas [36], ir prostatos karcinoma [37]. Negimdinis išraiška miR-149 sukelia apoptozę neuroblastoma ir HeLa ląstelių [33]. Padidėjęs išraiška miR-149 buvo pranešta, kad svarbus nosiaryklės karcinomą [38] ir melanomos metastazių [34] progresavimą. Be to, reguliacijos sutrikimas miR-149 yra taip pat susijęs kai kurių ne-neoplastinių ligų. Pavyzdžiui, downregulation miR-149 išraiškos dalyvauja pirminės mielofibroze, policitemija vera, ir esminių trombocitemijos, [39], ir miR-149 praradimas gali slopinti hepatito C viruso (HCV) RNR gausa [40] plėtros. Tačiau pasakymas modelis ir vaidmuo miR-149 į GC plėtros lieka neaiškus.

Šiame tyrime mes nustatėme, kad Pasaulis-149 yra gerokai downregulated GC ląstelių linijų ir klinikinių mėginių, palyginti su normalus skrandžio epitelio ląstelių ir gretimų ne-navikų audiniuose,, atitinkamai. Negimdinis išraiška miR-149 slopina proliferaciją ir indukuoja G0 /G1 areštą AGS ir SGC7901 ląstelės in vitro
nukreipiant ZBTB2
. Be to, išeikvojimas, ZBTB2
pagal siRNA rezultatų slopinimu proliferaciją ir ląstelės ciklo arešto. Sąvoka modelis miR-149 ir ​​ZBTB2 GC ląstelių linijų ir klinikinių mėginių buvo atvirkščiai koreliuoja, toliau rodo, kad ZBTB2
yra tikslinio geno miR-149. Įvadas Pasaulis-149 rezultatų pokyčių į p53 išraiškos, P21, Arfa ir HDM2 nariai ARF-HDM2-P53-P21 keliu, kurią reglamentuoja ZBTB2. Apibendrinant, šie rezultatai patvirtina, kad Pasaulis-149 yra downregulated GC ląstelių ir klinikinių mėginių ir rodo, kad Pasaulis-149 veikia kaip skrandžio vėžio ląstelių augimą slopintuvas slopina platinimo ir ląstelinį ciklą.

Rezultatai

išraiška miR-149 yra downregulated GC ląstelių linijų ir klinikinių mėginių

Jei įvertinti PPN-149 vaidmenį GC kancerogenezėje, mes pirmą kartą panaudotas kiekybinis RT-PGR matuoti išraiška ir miR-149 žmogaus GC ląstelių linijų (MKN45, GC9811, AGS, SGC7901, ir MKN28) ir nustatė, kad miR-149 buvo downregulated GC ląstelių linijų, palyginti su įprastu skrandžio epitelinių ląstelių linija, GES-1 (1A pav.). Visų pirma, raiškos lygis miR-149 buvo teigiamai koreliuoja su diferenciacijos laipsnio GC ląstelių. Būtent, išraiška lygis miR-149 prastai diferencijuotos ląstelių linijų, pavyzdžiui, MKN45, GC9811, ir AGS, yra žymiai mažesnis nei vidutiniškai ir gerai diferencijuotas ląstelių linijos. MiR-149 išraiška, vidutiniškai diferencijuotos ląstelės, SGC7901, yra mažesnis nei, kad gerai diferencijuota ląstelių linija, MKN28 (1A pav.).

siekiant nustatyti, ar lygiai miR-149 taip pat koreliuoja su diferenciacijos laipsnio navikai mes išnagrinėjo PPN-149 išraišką 44 žmogaus GC klinikinių mėginių, įskaitant 13 prastai, 16 saikingai, ir 15 gerai diferencijuotos mėginiai. Mes nustatėme, kad miR-149 išraiška skrandžio navikų yra nepaprastai mažesnis nei suderintų įprastomis gretimuose audiniuose (1b pav.). Be to, miR-149 išraiška daugiau diferencijuotų navikų buvo didesnis nei mažiau diferencijuotų navikų (pav 1C, F = 65,391, P
. ≪ 0,001). Be to, sumažėjo išraiška miR-149 koreliuoja su limfmazgių metastazių (* P
= 0,046) ir TNM stadija (** P
= 0,0011) (1 lentelė).

negimdinis išraiška miR-149 slopina proliferaciją ir indukuoja G0 /G1 suimti AGS ir SGC7901 ląstelės

ištirti PPN-149 vaidmenį GC ląstelių, mes naudojamas prastai ir vidutiniškai diferencijuoti GC ląstelių linijas, MAA ir SGC7901, atitinkamai. MAA ir SGC7901 ląstelės buvo laikinai perkeltų su eithermature Pasaulis-149 imituoja, inhibitorius, maketas perkeltų arba miR-NC. Kaip pavaizduota 2A, 2D, kiekybiniai RT-PGR rezultatai rodo, kad išraiška Pasaulis-149 imituoja arba inhibitorių žymiai upregulate arba downregulate į PPN-149 raišką, atitinkamai AGS ir SGC7901 ląstelių iš pirmojo į penktą dieną posttransfection (Pav . 2A, F = 8,429 p
= 0,003;. pav. 2D, F = 8,595 p
= 0,003), palyginti su NC ir juoktis kontrolės

AGS ir SGC7901 ląstelės transfektuotose Pasaulis-149 imituoja ir inhibitorių parodė žymiai mažesnis ir didesnis ląstelių proliferaciją, atitinkamai, nei NC ar juoktis grupėms, kaip nustatyta MTT (pav 2B, f = 27.47, p. < 0,001; pav. 2E, F = 44,061, p < 0,001). ir transfekciją AGS SGC7901 ląstelių Pasaulis-149 imituoja rezultatus gerokai G1 fazės arešto, palyginti su NC ir juoktis kontrolės ( P
< 0,05). Be to, gydymas MIR-149 inhibitorių atsirado mažiau AGS ir SGC7901 ląstelių G1 arešto palyginti su NC ir juoktis kontrolės ( P
< 0,05). (Pav 2C, F = 134,177 P
< 0,001;. pav. 2F, F = 58,792, p
= 0,003)

ZBTB2
yra mir-149
tikslas

Buvę duomenys rodo, kad Pasaulis-149 gali būti GC ląstelių augimą slopintuvas nukreipiant genus, kurie kontroliuoja platinimu ir ląstelinį ciklą (33-34) (38). Taigi, mes ieškoma papildomų potencialiems taikiniams PPN-149 iš TargetScanHuman duomenų bazę. Mes rasta daug potencialių Pasaulis-149 tikslines genus, įskaitant ZBTB2
A POK šeimos transkripcijos faktorius ir stiprus represoriaus iš ARF-HDM2-P53-P21 keliu (41). ZBTB2
buvo nustatyta, kad spėjamas Pasaulis-149 privalomus svetaines per savo 3'UTR (. 3A pav). buvo atlikta liuciferazės Reporter tyrimai patikrinti, ar ZBTB2
yra tiesioginis tikslas Pasaulis-149, naudojant AGS ir SGC7901 ląsteles. Mes bendradarbiaujame perkeltų AGS ir SGC7901 ląsteles atitinkamai su psiCHECK-2 vektoriumi, turinčiu arba 3'UTR už ZBTB2 ar mutavo 3'UTR už ZBTB2 ir imituoja PPN-149, arba inhibitorių PPN-149. Laukinio tipo ir mutantas ZBTB2-3'UTR, kurio sudėtyje yra tariamų prijungimo vietą, miR-149 buvo klonuotas į psiCHECK-2 vektoriaus pasroviui nuo liuciferazės geno (S1 pav.). Įvadas miR-149 žymiai sumažino liuciferazės veiklą nuo ZBTB2 3'UTR reporteris vektoriaus (pav 3B-3C P
. ≪ 0,001), tačiau neturėjo įtakos liuciferazės veiklą nuo mutantas ZBTB2-3 "Rytas reporteris vektorius. Šie duomenys rodo, kad Pasaulis-149 tiesiogiai reguliuoja ZBTB2
raiškos lygį. Be to, nėra reikšmingas sumažėjimas santykinio liuciferazės veiklos ląstelių bendrai perkeltų su Pasaulis-149 inhibitoriaus ar 3'UTR-ZBTB2 /psiCHECK-2 vektorių (pav. 3B-3C). Ji yra gal dėl to, kad sąveikos tarp 3'UTR srities iš ZBTB2 ir endogeninio miR-149 stokos, taigi, sumažėjo ir miR-149 išraiška nepadidino liuciferazės veiklą iš ZBTB2-3'UTR reporterio vektorių. Šie rezultatai dar labiau patvirtina, kad Pasaulis-149 slopina ZBTB2 išraišką nukreipiant 3'-UTR iš ZBTB2
iRNR.

Pasaulis-149 ir ​​ZBTB2 išraiška neigiamai koreliuoja GC ląstelių ir klinikinių mėginių

Jei toliau tirti tarp miR-149 ir ​​ZBTB2 santykius, mes išnagrinėjo ZBTB2 išraišką GC ląstelių naudojant Imunoblotingo ir GC audinių naudojant imunohistocheminis. Buvo nustatyta, kad GC ląstelės turi žymiai didesnę ekspresijos lygį ZBTB2, nei normalus skrandžio epitelio ląstelių, GES-1 (pav 4A a-b F = 167,843, P
. ≪ 0,001). ZBTB2 išraiška neigiamai koreliuoja su diferenciacijos laipsnio GC ląstelių; prastai diferencijuotos GC audiniai parodė reikšmingą didesnį ZBTB2 raiškos lygis nei gerai diferencijuotų GC audinių ir suderintų normaliomis skrandžio audinių (pav S2A-b, f = 117,280 P
. < 0,001). ZBTB2
iRNR raiška lygiai sutampa su baltymų koncentracijos (pav 4B A, F = 283,355 P
. ≪ 0,001). Be to, miR-149 ir ​​ZBTB2 išraiška yra atvirkščiai koreliuoja (pav. 4B b, P
= 0,033, R = -0,908). Tada išmatavo raiškos lygį PPN-149 ir ​​ ZBTB2
naudojant kiekybinį RT-PGR 5 GC ląstelių linijas (MKN45, GC9811, AGS, SGC7901 ir MKN28) (pav. 4C A) ir 18 GC klinikinis mėginiai (6 prastai, 6 saikingai, ir 6 gerai diferencijuotos mėginiai) (4C pav., b). Rezultatai patvirtina, kad iRNR lygis ZBTB2
neigiamai koreliuoja su Pasaulis-149 raiškos (Pav 4C A, P
= 0,033, R = -0,847;. Pav. 4C b p
< 0,001 R = -0,908). Be to, AGS (4d pav.) Ir SGC7901 ląstelės (4E pav.), Transfekuota su miR-149 imituoja išraiška ZBTB2 žymiai sumažėjo ne baltymų koncentracijos (Plokštės A-B) ir iRNR lygiui (panelė c), lyginant su maketas arba NC ląstelės ( p
< 0,001). Mūsų išvados rodo, kad Pasaulis-149, gali tiesiogiai reguliuoti ZBTB2
.

Pasaulis-149 slopina GC ląstelių proliferaciją ir ląstelinį ciklą nukreipiant ZBTB2
išraiška

"Kitas mes patvirtino, kad Pasaulis-149 tarpininkaujant platinimo slopinimas ir indukciją ląstelių ciklo arešto GC ląstelių reikia nukreipti į ZBTB2
. ZBTB2
išraiška buvo išjudinti žemyn naudojant siRNAs į AGS ir SGC7901 ląsteles. Imunoblotingo (. 5A pav, A-C) ir kiekybine PGR analizė parodė, kad išeikvojimas, ZBTB2
pagal siRNA transfekciją gali būti žymiai kompensuos Pasaulis-149 inhibitoriaus ir ryškus padidėjimas ZBTB2 buvo pastebėtas ląstelių transfektuotose ir miR-149 inhibitoriai (pav 5B, p
. < 0,001). MTT rodo, kad ląstelės transfektuotose siRNA-ZBTB2 proliferacija slopino ir ląstelių transfektuotose Pasaulis-149 inhibitorių proliferacija labai padidėjo, palyginti su ląstelių transfektuotose siRNA-NC (valdymas) ir siRNA-ZBTB2 + miR-149 (pav. 5C ). Be to, slopinimas ZBTB2
išraiška skatina G0 /G1 suėmimą ir slopina G0 /G1 ląstelės ciklo suėmimą, sukeltą Pasaulis-149 inhibitoriaus gydymo AGS ir SGC7901 ląstelių, palyginti su NC kontrolinių ląstelių (pav. 5D-5E, p
< 0,001). Mūsų rezultatai rodo, kad Pasaulis-149 slopina GC ląstelių proliferaciją ir ląstelinį ciklą slopina ZBTB2
išraiška.

Įvadas miR-149 pakeitė ZBTB2 ir išraiška ląstelių ciklo susijusių baltymų

ZBTB2 buvo pranešta, kad stipriai represoriaus iš ARF-HDM2-p53-p21 keliu, kuris yra svarbus ląstelių ciklo reguliavimas (41). Ištirti šių baltymų reguliavimą miR-149 GC ląstelių, mes perkeltų AGS ir SGC7901 ląsteles Pasaulis-149 imituoja arba miR-NC ir atliko RT-PGR ir Imunoblotingo analizę ZBTB2 tikslinių genų. Kaip parodyta pav 6A-6B, negimdinis išraiška miR-149 downregulates į ZBTB ir HDM2 išraiška, ir upregulates į ARF, p53 ir p21 išraišką ( P
< 0,001). Šie duomenys yra suderinamas su ZBTB2 funkcija represuoti į ARF, p53 ir p21 transkripciją ir aktyvuojant HDM2 išraiška (41). Be to, negimdinis išraiška ZBTB2 transfekuojant atstatomi Mir-149-tarpininkaujant sumažinti HDM2 išraiškos ir padidėjusi ARF, p53 ir p21 raiška AGS ir SGC7901 ląsteles (Pav. 6A-B). . Negimdinis ZBTB2 išraiška buvo patvirtinta Transfekuoti AGS ir SGC7901 ląstelių (pav S3 SGC7901 ląstelės F = 806,365 P
< 0,001; AGS ląstelės F = 1436,300 P
< 0,001). Arfa, p53 ir p21 skatinti ląstelinį ciklą, todėl jų downregulation išraiška PPN-149 imituoja paaiškina G0 /G1 fazės arešto AGS ir SGC7901 ląsteles.

Diskusijos

didinimas rodo, kad miRNAs vaidina svarbų vaidmenį kancerogenezėje ir vėžio progresavimą [21]. Altered Mirna ekspresijos lygis buvo susijęs su pradžios ir plėtros navikų; moduliavimas miRNAs, kad veiktų kaip neigiamus reguliatoriai onkogenų ar naviko slopintuvai rezultatų skatinimo vėžio ląstelių dauginimosi ir augimo [28] - [32]. Ankstesni tyrimai parodė, kad miR-149 vaidmuo įvairių tipų auglių progresavimo yra prieštaringas [33] - [36], [38]. Sąvoka modelis ir tikslai miR-149 skirtis įvairių tipų auglių. Pasaulis-149 išraiška downregulated kai navikai, veikianti kaip auglio slopinamojo nukreipiant onkogenų kai vėžiu. Pavyzdžiui, aiškiai ląstelių inkstų ląstelių karcinoma Pasaulis-149 yra downregulated ir galimą tikslai buvo nustatyti kaip KCNMA1 ir LOX (35). Be to, PPN-149 taip pat downregulated į glioblastomos ląstelių ir buvo siūloma veikti kaip naviko slopintuvas nukreipiant RAP1B, CD47, CCN1 ir NXF1 [36]. Priešingai, miR-149 taip pat gali veikti kaip auglio slopinamojo pagal pagal tam tikras onkogenų. Aptikta Mirna ekspresijos profilius skirtingų klinikinių stadijų nosiaryklės karcinomą (NPC) ir NPC limfmazgių metastazių rodo, kad miR-149 išraiška yra aktyvinama per NPC ir išraiška jo taikinio geno Smad2
, sumažėja su iš NPC progresavimo [38]. Panašus onkogeninė vaidmuo Mir-149 taip pat buvo pastebėtas melanomos, kurioje ląstelę miR-149 sukelia downregulation iš GSK3-alfa ir ląstelę MCL-1, todėl apoptozės pasipriešinimo [34]. Iki šiol, mažai žinoma apie miR-149 vaidmens skrandžio vėžio. Čia mes pranešti, kad Pasaulis-149 išraiška nepaprastai sumažintas keliais skrandžio vėžio ląstelių linijų ir klinikinių mėginių, palyginti su įprastomis skrandžio epitelio ląstelių ir suderintų gretimuose normaliuose audiniuose, atitinkamai. Svarbiau, miR-149 raiškos lygis yra susijęs su diferenciacijos laipsnio GC ląstelių ir pavyzdžių; prastai diferencijuotos GC ląstelės ar pavyzdžiai turi mažesnį Pasaulis-149 išraiška, palyginti su gerai diferencijuotų pavyzdžius. Negimdinis išraiška miR-149 slopina ląstelių proliferaciją ir ląstelinį ciklą nukreipiant ZBTB2
į AGS ir SGC7901 ląsteles. Pasaulis-149 ir ​​ZBTB2 išraiška yra neigiamai koreliuoja GC ląstelių ir klinikinių mėginių, o raiška miR-149 sukelia downregulation iš ZBTB2
. Išeikvojimas ZBTB2 rezultatų slopinimu AGS ir SGC7901 ląstelių proliferaciją ir ląstelės ciklo progresavimo. Kaip visuma, šie rezultatai rodo,, pirmą kartą, kad ZBTB2 gali veikti kaip į skrandžio vėžio tumorigenezei onkogeno.

Mūsų duomenys rodo, kad miR-149 įvedimą į GC ląstelių sukelia ląstelės ciklo suimti, tai rodo, kad Pasaulis-149 tikslai gali būti susijęs ląstelių ciklo reguliavimu. ZBTB2 yra POK šeimos transkripcijos faktorius, kurie gali slopinti ARF-HDM2-P53-P21 kelią [41]. Arfa, navikas slopintuvas [42], gali būti sukeltas ilgalaikis mitogeninę stimuliaciją ir vaidina pagrindinį vaidmenį aktyvuojant p53 savarankiškai ir su p53 stabilumą kontroliuoti per sąveiką su HDM2 [43], svarbus reguliatorius p53. Navikas slopintuvas p53 vaidina svarbų vaidmenį ląstelių homeostazės priežiūra per indukuojamojo ląstelių ciklo arešto ir apoptozės, kai ląstelės patiria stresą, pavyzdžiui, hipoksija, DNR pažeidimus, o Telomera disfunkcija [44]. P21 A p53 taikinio geno, tarpininkauja ląstelių G1 ciklas fazių suimti per privalomas ir slopina ciklino CDK2 ar CDK1 kompleksų [45] veiklą. ZBTB2 gali slopinti ARF, p53 ir p21 transkripciją ir sukelti HDM2 išraišką [41]. Norėdami patvirtinti, ar ląstelės ciklo poveikis sukeltų Pasaulis-149 saviraiškos tarpininkaujant ZBTB2 praradimo, mes išnagrinėjo išraišką HDM2, ARF, p53 ir p21 apie AGS ir SGC7901 ląstelių transfektuotose Pasaulis-149 imituoja. Mes nustatėme, kad negimdinis išraiška Pasaulis-149 rezultatų padidėjo išraiška ARF, p53 ir p21 ir sumažėjo išraiška HDM2 ir ZBTB2. Šie rezultatai patvirtina idėją, kad Pasaulis-149 daro savo vaidmenį slopinant GC ląstelių proliferaciją ir ląstelinį ciklą nukreipiant ZBTB2
taip moduliuoja tolesnių reguliuojančių ląstelių ciklo progresavimo išraiška.

santrauka mūsų duomenys rodo, kad Pasaulis-149, gali veikti kaip naviko slopintuvas skrandžio vėžio ląsteles ir vaidina svarbų vaidmenį slopinant ZBTB2
. Todėl downregulation miR-149 skatina GC ląstelių proliferaciją ir ląstelinį ciklą. Be to, mūsų rezultatai rodo, kad ZBTB2 gali veikti kaip į skrandžio vėžio išsivystymo onkogeno. Tačiau, atsižvelgiant į tai, kad kiekvienas Mirna gali reguliuoti daug tikslinių genų, kurie gali turėti įtakos kancerogenezės įvairiais būdais, daugiau tyrimų reikia tirti kitus Pasaulis-149 tikslus, kurie gali turėti kritinių vaidmenis GC Tumorigenesis. Šis tyrimas taip pat suteikia romaną pažvelgti į miR-149 vaidmenį žmogaus skrandžio vėžio progresavimo ir rodo, kad Pasaulis-149, gali tarnauti kaip terapinio tikslo skrandžio vėžio gydymo.

Medžiagos ir metodai

etikos taisyklės

audinių pavyzdžių, parašyta informuotas sutikimas buvo gautas iš pacientų. Naudojami šiame tyrime procedūros buvo patvirtintos pagal institucinius ekspertizės valdyba ketvirtosios Karo medicinos universiteto ir buvo atitiko Helsinkio deklaraciją, ir vietos įstatymus.

Mobilaus ryšio linijų ir auginimo sąlygos

Skrandžio vėžio linijos "AGS, MKN28, MKN45 buvo perkamos iš AGCC ir GC9811 ir SGC7901 ląstelių linijos buvo gauti iš Pekino Onkologijos institutas. Visi ląstelių linijos išliko mūsų institute pagal rekomenduojamus protokolus. Ląstelės buvo auginamos RPMI-1640 terpėje (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), papildytoje su 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), esant 37 ° C temperatūroje, 5% CO 2 inkubatoriuje .

Žmogaus pavyzdžiai

Visi eksperimentiniai procedūros buvo patvirtintos pagal institucinius ekspertizės valdyba ketvirtosios karo medicinos universitete. Parašė informuotas sutikimas buvo gautas visų pacientų samples.Human skrandžio vėžio egzempliorių (n = 44) ir suderinti gretimų ne vėžinių egzempliorių buvo gauti iš pacientų Xijing ligoninės virškinimo sistemos ligos, ketvirtoji Karo medicinos universitetas, informuoto sutikimo kiekvienam pacientui.

RNR gryninimas kDNR sintezės ir kiekybinė realaus laiko PGR (KRL-PGR)

viso RNR auginamų ląstelių ekstrahuojamas TRIzol reagento (Invitrogen, Karlovi Varai, CA, JAV) pagal gamintojo protokolas ir RNR buvo laikomi -80 ° C iki KRL-PGR analizei. Brandaus Pasaulis-149 išraiška buvo aptiktas naudojant mirVana TM KRL-PCR Mirna aptikimo rinkinį (Ambion Inc Ostinas, Teksasas), su U6 kaip vidaus kontrolė. ZBTB2 išraiška buvo aptikta pradmenis F: 5'ACTCGGGCGAGATCCACGGC 3 ', R: 5' ACGCAGGCTGCTCATCGGAG-3 ', ir GAPDH buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. PGR produktai buvo atskirtos dėl etidžio bromido tamsintas 1,5% agarozės gelyje ir vizualizuoti su UV.

Mobilusis transfekcija

žmogaus Pasaulis-149 Dvipusis imituoti ir inhibitorius (MIR-149) ir neigiamos kontrolės oligonukleotidas dvipusis mimikos (mIR-NC) buvo sukurta ir pateikta Ribobio (Guangzhou, Guangdong, Kinija). Sirnr (siRNR) už ZBTB2 ir neigiamos kontrolės RNR (siRNR-NC) buvo susintetinti ir išgrynintas Genepharma (Šanchajus, Kinija). miRNAs, siRNAs ir ZBTB2 kDNR plazmidės (FulenGen Co Kinija) buvo pernešta iki LipofectamineTM 2000 reagento (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV) pagal gamintojo protokolą. ZBTB2 siRNR seka: F: 5 'GCUGGCUUCUUUCCAAGUU dTdT 3', R: 5 'AACUUGGAAAGAAGCCAGC 3'; NC siRNR seka: F: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3 ", R 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT -3"

Mirna tikslas prognozavimas

Jei rasti potencialių Mirna tikslines genus, TargetScanHuman svetainė (. http://www.targetscan.org/) buvo naudojamas, įrišimo laisva energija buvo apskaičiuojamas ir Ofiarowana kaina aukcionuose vietos buvo analizuojami naudojant http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid~~HEAD=dobj svetainėje.

Vektorius konstruktai ir liuciferazės reporterio testą

Jei statyti ZBTB2-3'UTR plazmidės, laukinio tipo 3'-UTR fragmentas žmogaus ZBTB2 mRNR (1238-1244 NT, GENBANK prisijungimas Nr. NM_020861.1) kuriame yra spėjamas ir miR-7 privalomas seka buvo amplifikuota RT-PGR ir klonuotas į tarp Xho I vieta, o ne aš pasroviui nuo liuciferazės reporterio geno psiCHECK ™ vektoriaus (Promega, JAV). Iš vieno Pasaulis-7 privalomą svetainėje mutantas (5'-GAGCCAG-3 "į 5'-ACCGCGC-3") į 3'-UTR iš ZBTB2 buvo įtraukta sait-mutagenezes Kit (SBS GENETECH, Pekinas, Kinija ). Laukiniai ir mutantas tipų pmirGLO-ZBTB2-UTR vektoriai buvo patvirtinti DNR sekos

nukleotidų sekos gruntai ZBTB2-3'UTR (MT) Klonas:. MutZBTB2F: 5'GGCCTCACAAGACAAAACAGACCGCGCAAGTAAGGACTGAAGGAGAA 3 "mutZBTB2R: 5 ' TTCTCCTTCAGTCCTTACTTGCGCGGTCTGTTTTGTCTTGTGAGGCC 3 "

nukleotidų sekos gruntai ZBTB2-3'UTR (WT) klonas: ZBTB2XhoIF: 5'CCGCTCGAG ATGTCACTTATCTTTTTAAAAAACTCTCA 3" ZBTB2NotIR: 5'ATAAGAATGCGGCCGC TACTCATTTAATTAAACGTTTATTC 3 "ZBTB2XhoIF2: 5'CCGCTCGAGATGTCACTTATCTTTTTAAAAAACTCTCATTTTTACAAAGACTATC 3" ZBTB2F3: 5'CCGCTCGAG CTGTAGTTCTCCATGGCATGATAC 3 ".

Ląstelės buvo pernešta su mir-149 imituoja, NC ir pmirGLO plazmidžių į 24-duobučių lėkštelėse, naudojant lipofectamine ™ 2000 (INVITROGEN) pagal instrukcijas. 48 val vėliau ląstelės buvo surinktos ir išanalizuotos liuciferazės veiklos naudojant dvejopo liuciferazės reporterio testą sistema (PROMEGA, JAV) ir aptikti GloMaxTM 20/20 aptikimo sistemos (E5331, Promega).

Imunoblotingo

iš viso baltymų iš išaugintų ląstelių buvo lizuojamos lizės buferiniame tirpale, kurių sudėtyje yra PMSF ant ledo. Tada baltymas buvo atliekama elektroforezė per 12% SDS poliakrilamido gelyje ir tada buvo perkeltas į PVDF membrana (Millipore). Membranos buvo užblokuotas su 5% lieso pieno miltelių kambario temperatūroje 1 valandą, o ir inkubuojami per naktį su pirminių antikūnų. Membranos buvo inkubuojami su antrinių antikūnų, ant kurių HRP 1 valandą, o kambario temperatūroje po tris 10 min plauna į TBS-T (triethanolaminebuffered fiziologinis tirpalas su Tween). Galiausiai signalai buvo aptikti naudojant ECL rinkinį (Pierce Biotech., Rockford, IL, JAV) ir membranos buvo nuskaitomi ir analizuojami naudojant Bio-Rad ChemiDoc XRS + vaizdo gavimo sistema su vaizdo programinę įrangą (versija Kiekis 1). Baltymų išraiška buvo normalizuojamas endogeninio nuoroda (aktino) ir, lyginant su kontroliniu. Spectra daugiaspalvis plataus diapazono baltymų kopėčios ( "Fermentas") buvo naudojama kaip molekulinės persekiotoją. Visi antikūnai naudojami Vakarų dėmė tyrimu yra išvardytos lentelėje S1.

imunohistocheminis ir Imunohistocheminis atsakomają

Parafino sekcijos, 4-mkm storio, buvo kepama 2 h 65 ° C ir deparaffinized , Antigenas paieška buvo atlikta naudojant citrato natrio buferio (pH 7.2), esant 95 ° C temperatūroje 15 minučių ir tada skaidres buvo atšaldytas iki kambario temperatūroje 30 minučių. Po to, kai gydomas su 3% vandenilio peroksido 15 minučių, kad blokuoti endogeninę peroksidaze, sekcijos buvo gydomi normalus ožkos serumas, gebančiais skysčio 30 minučių, kad sumažinti nespecifinį ir tada triušis polikloninis anti-ZBTB2 (1:500, Bioss Co . Kinija) buvo inkubavome skyrius 12 valandų, esant 4 ° C.After rewarming 1 valandą, o ir plovimo 5 kartus, dalys buvo inkubuotos su antriniais antikūnais 30 minučių kambario temperatūroje. Diaminobenzidinas (DAB) buvo naudojamas spalvų reakcijų. Po imunohistocheminį dažymo pelnytas, kaip aprašyta anksčiau [46].

MTT

Ląstelės buvo pernešta su 100 nM Pasaulis-149 inhibitoriaus (Genepharma, Šanchajus, Kinija), imituoja (Ribobio, Guangdžou, Guangdong, Kinija), arba 100 nm siRNR-ZBTB2 (Genepharma) .Twenty keturi vėliau ląstelės buvo pasėjamos 96 duobučių lėkštelėse (2 × 103 /gerai). Ląstelių gyvybingumas išnagrinėjo MTT (3-2, 5-difenilo tetrazolio bromido) Analizės (Sigma, JAV) kasdien 6 dienas.

Mobilusis ciklas analizė tėkmės citometrijos

Skrandžio vėžys Mobilaus ryšio linijos, AGS ir SGC7901 buvo auginami RPMI-1640 terpe (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV) papildytas 10% FBS į 6-duobučių lėkštelėse. Transfekcijq buvo atliekamas, kai ląstelės pasiekė 80 %% - 90% susiliejimo. Vėliau, Ląstelės buvo surinktos, du kartus skalaujant PBS, ir nustatoma 70% etanolio, esant 4 ° C temperatūroje per naktį. Tada ląstelės buvo inkubuojamos su propidiumo jodido kambario temperatūroje 1 valandą, o ir buvo analizuojami tėkmės citometrijos naudojant FACScan srautą citometro (BD Biosciences, Mountain View, CA). Šie duomenys buvo analizuojami naudojant Flowjo (Flowjo).

Statistinė analizė

Duomenys buvo pateikti kaip vidurkis ± SEM trijų nepriklausomų eksperimentų. Dėl statistinių testų, SPSS statistiniu programinės įrangos paketas, version17.0 (SPSS, Čikaga, IL, JAV) buvo naudojamas. Studento T-testas, vienas ANOVA ir du ANOVA testas buvo atliekamas MTT tyrimus, kiekybine PGR ir naviko augimo kreivės. Tarp miR-149 ir ​​ZBTB2 koreliacija analizuojami Spearman koreliacijos. P vertes < 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas

Pagalbinė informacija
S1 paveiksle..
laukinio tipo ir mutantas, ZBTB2
-3'UTR kuriame spėjamą prijungimo vietą PPN-149 buvo klonuotas į psiCHECK-2 vektorių. A. ZBTB2
-3'UTR sustiprino iš genomo DNR AGS. B. Lane 1,3, 5: Rekombinaciniai plazmidės iš ZBTB2-1, ZBTB2-2, ZBTB2-3
atitinkamai; Lane 2,4,6: rezultatai fermentų virškinimui rekombinantinių plazmidžių iš ZBTB2-1, ZBTB2-2, ZBTB2-3
atitinkamai. Rezultatai parodė, kad ZBTB2
-1/2/3 buvo sėkmingai įdėta į vektorių (M1:. DL2000 DNR žymuo; M2 DL1 KB DNR žymuo; ZTBT2-1 /2/3 grupės: 1406 BP; vektoriai juostos: 6,1 kB). C. M1: 1 kb DNR Kopėčios žymeklį. Lane 1: stiprinimas Mut ZBTB2
F1 /R1 (neigiamos kontrolės, be Taq fermento); Lane 2: stiprinimas Mut ZBTB2
F1 /R1. Vienas juosta Mut ZBTB2
(7.6 kb) parodė sėkmingas PGR amplifikacijos mutanto. D. sekos rezultatai mases ZBTB2 pervežimas ir MT - ZBTB2
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0041693.s001
(TIF)
S2 pav ,
ZBTB2 išraiška žmogaus skrandžio vėžio egzempliorių ir suderintų gretimuose normaliuose audiniuose. A. Reprezentacinės parodyti vaizdai, kurie yra teigiami imunohistocheminis dažymas ZBTB2 žmogaus skrandžio vėžio egzempliorių (B-C) ir suderinti gretimų sveikų audinių (A) (priartinimu 200 ×). B. imunohistocheminį dažymo pelnytas, kaip aprašyta anksčiau [46]; statistinė analizė Duomenų apie ZBTB2 išraiška skirtumas tarp žmogaus skrandžio vėžio egzempliorių ir suderintų gretimų nevėžinės audinių (One-way ANOVA analizę, F = 117,280, *** P
< 0,001).

Other Languages