Stomach Health > skrandžio sveikatos >  > Gastric Cancer > skrandžio vėžys

PLoS ONE: Pieno fermentuotas Propionibacterium freudenreichii sukelia apoptozę HGT-1 Žmonių Skrandžio vėžio ląsteles

Anotacija

Fonas

Skrandžio vėžys yra viena iš labiausiai paplitusių vėžio formų pasaulyje. Į "ekonomiškai išsivysčiusios šalys" gyvenimo būdas, įskaitant mitybą, yra rizikos veiksnys, palankią šį vėžį. Dieta moduliacija gali sumažinti virškinimo vėžio tikimybę. Tarp perspektyviausių maisto komponentų, pieno propionibacteria buvo įrodyta, kad sukelti apoptozę žmogaus storosios žarnos vėžinių ląstelių, per trumposios grandinės riebalų rūgščių acetato išleidimo ir propionato.

metodika /Principal išvados

fermentuotas pienas , tik fermentuota P. freudenreichii
, neseniai buvo sukurta. Šiuo darbą, proapoptozinis potencialas šiuo nauju rauginto pieno buvo įrodyta HGT-1 žmogaus skrandžio vėžio ląsteles. Fermentuotas pienas paviršinis sukeltas tipiškus bruožus apoptozės įskaitant chromatino kondensacija, formavimo apoptozinių įstaigos, DNR laddering, ląstelės ciklo arešto ir atsiradimo yra subG1 gyventojų, fosfatidilserinas ekspozicija, plazminės membranos išorinės pakuotės lapelio, reaktyviosios deguonies kaupimui, mitochondrijų transmembraniniu galimo sutrikimo, kaspazės aktyvavimo ir citochromo c spaudai. Nuostabiausia, ši nauja fermentuotas pienas, kuriame yra P. freudenreichii
sustiprino kamptotecino citotoksiškumo narkotikų naudojamas skrandžio vėžio chemoterapija.

Išvados /Reikšmė

Toks naujas probiotikai Fermentuotas pienas taip gali būti naudinga kaip prevencinė dietos skirta išvengti skrandžio vėžiu ir /arba kaip maisto papildas siekiant stiprinti vėžio gydymo priemonės

nurodomoji dalis:. pusbrolis FJ, Jouan-Lanhouet S dimanche-Boitrel MT, Corcos L Jan G (2012) Pienas Fermentiniai Propionibacterium freudenreichii
sukelia apoptozę HGT-1 žmogaus skrandžio vėžio ląsteles. PLoS vieną iš 7 (3): e31892. Doi: 10,1371 /journal.pone.0031892

redaktorius: Abesas Belkhiri, Vanderbilt universiteto medicinos centras, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: Lapkričio 15, 2011 m Priimta 19 sausio 2012 m Paskelbta: Kovo 19, 2012

Visos teisės saugomos: © 2012 Cousin ir kt. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas buvo finansuojama Conseil Regional de Bretagne per CBB DEVELOPPEMENT kvietimą teikti projektų ir Centre National Interprofessionnel de l'Economie Laitière (CNIEL) per mokslinis komitetas Syndifrais kvietimą teikti projektų. Tyrimai IRSET grupės parėmė dotacijas iš Ligue Nationale contre le vėžys (Côte d'Armor, Ilis ir Vilenas, Morbihan, Vandėja ir Sarthe komitetai), INSERM universiteto Rennes 1 ir regiono Bretagne. FJC gavo dotaciją iš CNIEL (daktaro bendravimas). SJL parėmė asociacija pour la Recherche sur le vėžys (doktoranto stipendijos). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Dieta moduliuoja susirgti skrandžio vėžiu
riziką

Vėžys yra pagrindinė mirties priežastis ekonomiškai išsivysčiusiose šalyse atsirandančių vėžinių susijusios gyvenimo būdo, įskaitant rūkymas, fizinis neaktyvumas, ir "westernized" dietos [ ,,,0],1]. Iš tiesų, dietos vaidmuo vėžio išsivystymo tvirtai remia epidemiologinių tyrimų, ypač susijusių su vėžio ir virškinamojo trakto. Skrandžio vėžys (GC) atstovauja trečiojo tipo mirtina vėžio vyrams pasaulyje. 2008, 640.600 atvejai GC buvo apskaičiuota, sukelia 464.400 mirčių visame pasaulyje [1]. Ši liga ypač dažna Rytų Azijos, Vidurio ir Rytų Europoje. Svarbiausi etiologiniai faktorių, dalyvaujančių skrandžio kancerogenezėje yra dieta ir Helicobacter pylori
infekcija. Pakankamai įrodymų, daugiausia iš atvejo-kontrolės tyrimuose rodo, kad perkančioji GC rizika padidėja didelio suvartojimo sūdyti, marinuoti arba rūkyta tradiciškai maisto produktų, taip pat džiovintų žuvies ir mėsos. Priešingai, skaidulos, šviežių daržovių ir vaisių, galbūt dėl ​​jų vitamino C kiekį, buvo nustatyta, kad, atvirkščiai susijęs su GC rizikos [2], [3]. Gamtinių /maisto komponentų poveikis kancerogenezėje skrandžio Taigi buvo tiriamas per pastaruosius kelis dešimtmečius [4] - [6]. Tarp jų, probiotikai ir jų gebėjimas slopinti vėžio vystymąsi traukia mokslinį susidomėjimą [7], [8]. Probiotikas paprastai apibrėžiamas kaip "gyvų mikroorganizmų, kurie, kai jis skiriamas pakankamas kiekis, suteikiantis naudos sveikatai priimančiajai" [9]. Nors kai kurie, pavyzdžiui, H mikroorganizmų. pylori
gali skatinti GC, kiti gali turėti teigiamą poveikį, užkertant kelią virškinimo vėžio. Visų pirma, pažymėtus padermių probiotinių bakterijų gali apriboti vėžio vystymąsi gyvūnų modeliais kancerogenezėje [10]. Tai buvo ypač matyti gaubtinės žarnos vėžio o mažiau žinoma apie galimus poveikio probiotikų apie GC. Galimas mechaninė paaiškinimas tokiu apsauginiu poveikiu yra situ
išleidimo anti-kancerogeninių metabolitų, pavyzdžiui, trumpos grandinės riebalų rūgščių (SCFAs).

Trumpas grandinės riebalų rūgštys sukelia apoptozę vėžinių ląstelių

SCFA, įskaitant acetatas, propionatas ir butirato, yra svarbūs anijonų žarnyno turinį ir jų koncentracija gali būti moduliuojama dietos. Jie buvo įrodyta, kad vaidinti pagrindinį vaidmenį svarbiausių fiziologinių funkcijų, įskaitant moduliavimo virškinimo epitelio ląstelių proliferaciją /apoptozė pusiausvyrą. Tai reiškia, SCFA sukelto ląstelių ciklo suėmimą, Histonas deacetilazės slopinimo ir apoptozės stimuliacija transformuotų ląstelių, bet ir stimuliuoja diferenciacijos sveikų ląstelių [11], [12]. Ji taip pat buvo pastebėta, kad SCFAs butirato ir propionato tiek sukelti apoptozę žmogaus skrandžio karcinoma ląstelių linijų [13] - [15]. Apoptozė yra natūralus fiziologinis procesas leidžia ląstelių skaičius reguliavimas ir yra tikslo priešvėžiniais chemoterapiniais [16]. Apoptozė leidžia išeikvojimas vėžinių ląstelių per "švarus" būdu. Vėžio ląstelės fragmentas koordinuotai grandininę reakciją ir liekanos sugeria gretimų audinių ir imuninę sistemą [17], [18]. buvo aprašyta du pagrindiniai Apoptozinės keliai: išorinė kelią, kuris yra sąlygotas aktyvavimo mirties receptorius ir kaspazė 8, ir vidinę kelią, kurio veikloje dalyvauja mitochondrijos ir kaspazės 9 [16]. Apskritai, vėžinių ląstelių, apoptozės funkcija trūksta, kuris gali paaiškinti jų ilgalaikį proliferaciją ir, atitinkamai, auglių susidarymą. Gebėjimas sukelti apoptozę vėžinių ląstelių yra tokiu būdu, pripažinta dėl savo terapinę galią [16]. Nuo pieno propionibacteria galime pagaminti naudingus proapoptotinį SCFAs, jie gali būti naudingi vėžio profilaktikai arba gydymui.

, Propionibacterium freudenreichii
gali pirmenybę Apoptozė išeikvojimas virškinimo vėžinių ląstelių

Tai probiotinis pieno Propionibacterium buvo indukuoja ląstelių žūtį įvairių žmogaus gaubtinės žarnos vėžio ląstelių linijas per apoptozė indukcijos, kartu kultūrų [19]. Aktyvių junginių, kurį sekretuoja į terpę, sukelti vidinę mitochondrijų aprotoninį kelią, kultivuojamų žmogaus gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio ląsteles. Visų pirma, SCFAs acetatas ir propionato išleistas P. freudenreichii
sukelti apoptozę veikdamas mitochondrijų adenino nukleotidų translocator, sukelia mitochondrijų depoliarizaciją ir permeabilisation, nutekėjimui citochromo c ir kaspazės aktyvavimo [19], [20]. Tačiau propionibacterial supernatantai dar daugiau proapoptozinis nei SCFAs acetato ir propionato, naudotos išmatuotos koncentracijos į nuopile, tai rodo, kad kiti junginiai gali būti įtrauktas į šį poveikį. Pasirinkti kamienus P. freudenreichii
likti gyventi ir medžiagų apykaitoje per žmonių žarnyne ir žmogaus mikrofloros susijusių žiurkių, kur jie pagaminti SCFAs [21], [22]. Taigi, jie buvo įrodyta, kad padidinti apoptozę transformuotų storosios žarnos epitelio ląstelių tokių žiurkių šertų kancerogenas 1,2-dimetilhidrazinas (DMH), bet negali kontroliuoti sveiki tie [23]. Propionibacteria galėtų būti probiotikai palankesnių gaubtinės žarnos vėžio profilaktika, jeigu jie pasiekti savo tikslinę gyvas ir medžiagų apykaitoje. Atsižvelgiant į tai, vektoriaus, ar probiotiko pristatymo transporto priemonės, buvo įrodyta, kad nustatyti propionibacteria išlikimą ir veikla [21], [24], [25]. Kompleksiniai pieno produktai, kaip antai jogurtas ir sūris, ypač apsaugoti propionibacteria nuo streso, bet yra mišinys, sudarytas iš bakterijų. Todėl neįmanoma priskirti teigiamą poveikį tam tikros padermės.

fermentuotas pienas buvo įvertintas kaip propionibacteria pristatymo transporto priemonės į šį kontekstą

Šiame tyrime mes naudojome naują maisto kokybės fermentuotas pienas, kuriame yra tik P. freudenreichii
kaip vienintelis mikrofloros. Kadangi šis produktas yra ir gyvų propionibacteria ir jų aktyvių metabolitų, reikia juos liečiasi su skrandžio gleivinės kai išgertas. Tai fermentuotas pienas buvo tiriama atsižvelgiant į HGT-1 žmogaus skrandžio vėžio ląstelių apoptozė indukcija. Iš tiesų, propionibacteria yra žinoma, kad nužudyti žmogaus storosios žarnos vėžio ląsteles, tačiau jų poveikis skrandžio vėžio ląstelių nežinoma. Fermentuotas pieno žuvo HGT-1 ląsteles laiko ir dozės priklausomu būdu. buvo pastebėtas Tipiški bruožai apoptozė proceso, įskaitant gyvybingumo sumažėjimas, chromatino kondensacija, apoptozės telkinių formavimas, DNR laddering, ROS gamybą, mitochondrijų membranos potencialų sutrikdymo, kaspazės aktyvavimo, ląstelės ciklo arešto ir atsiradimo yra subG1 gyventojų.

rezultatai

P. freudenreichii
fermentuotas pienas žudo žmogaus skrandžio ir storosios žarnos vėžinių ląstelių

, p. freudenreichii
Itg P9 išaugo 72 h 30 ° C papildytas pieno ir papildytas pieno ultrafiltratą pasiekti galutinį gyventojų 9,43 log 10 kolonijas sudarančių vienetų (ksv) /ml ir 9,35 log 10 ksv /ml, atitinkamai. Į SCFA koncentracija buvo 26,21 mmol acetato ir 54,47 mmol propionatas (2,08 propionatas /acetatas santykis) pieno fermentinio nuopilo kadangi jos buvo 24.00 mm, o 53.32 mm (2,22 santykis) į rauginto pieno ultrafiltratas virš nuosėdų. Šie santykiai buvo tikimasi propionibacteria, kurie paprastai gamina dvigubai daugiau propionato acetato pavidalu [26]. Dvylika kitų maisto laipsnio pieno propionibacteria atmainos taip pat buvo išbandytas (žr lentelę S1 ir S1 paveikslą). Naudojant šiuos štamus, buvo gauti dvylika fermentuotų pieno produktų. Propionato koncentracija svyravo nuo 36 iki 67 mm, o propionibacteria gyventojų nuo 9,0 iki 9,7 log 10 ksv /ml, nes mažiau ir efektyviausiu padermės, atitinkamai.

citotoksinis potencialas nuopile pagaminti iš pieno, arba pieno ultrafiltratas, tiek fermentuotas P. freudenreichii
Itg P9, buvo tiriami. HT-29 žmogaus gaubtinės žarnos vėžio ląstelės ir HGT-1 žmogaus skrandžio vėžio ląstelės buvo gydomi šių supernatantų. buvo išbandytas Įvairūs skiedinius svyruoja nuo ½. Be to, iš 15 mm acetato ir 30 mm propionato mišinio citotoksiškumo buvo išbandytas, koncentracija arti tai puse sumažintą nuopile. Kaip teigiami apoptozės indukcija kontrolę, per chemoterapijos vaistai kamptotecino (4 mkm) ir etopozido (100 pM) buvo naudojamas HGT-1 ir HT-29 ląstelių, atitinkamai. buvo lyginami trys skirtingi metodai ląstelių mirties stebėseną. Kaip parodyta S2 figūra, metileno mėlynuoju MTT ir Trypan mėlyna atskirties tyrimai davė panašius kinetiką mirties. Todėl, metileno mėlynojo tyrimas buvo naudojami šiame tyrime toliau vertinti ląstelių gyvybingumo. Ne fermentuotas pieno produktai (pieno arba pieno ultrafiltratas) neturėjo jokio poveikio, nei ant HT-29, nei nuo HGT-1 ląstelių gyvybingumą (1 pav., B). Pieno arba pieno paviršinis ultrafiltratas fermentuotas P. freudenreichii
sukėlė panašų citotoksiškumo tuo metu priklauso nuo būdo, HT-29 ir HGT-1 ląstelių, ir arti citotoksiškumo sukeltos vaistų arba acetatas /propionato mišiniu. Pusė maksimalus žmogžudystė HGT-1 ląstelių įvyko po 24 h ir 26 h gydymo su rauginto pieno ir fermentuoto pieno ultrafiltratas supernatantai atitinkamai po 17 h gydymo kamptotecino ir po 24 h gydymo SCFA mišinio (pav. S3) , Be to, iš fermentuotų pieno produktų supernatantų citotoksiškumo į HGT-1 ląstelių priklausė nuo dozės (pav. 1C). Už kiekvienam tiriamam praskiedimo į HGT-1 ląstelių gyvybingumo, sukelta fermentuotų pieno arba fermentuotų pieno ultrafiltratą lašas buvo labai panašios (pav 1C &. S3 pav.). Štai kodėl tolesni žingsniai Tyrimo mes atliekame tik su rauginto pieno ultrafiltratas virš nuosėdų. Paimti kartu, šie duomenys rodo, kad propionibacteria efektyviai nužudyti žmogaus gaubtinės žarnos ir skrandžio vėžio ląsteles, bent jau iš dalies per propionato ir acetatą (pav. 1) gamybai. Kai kurie kiti rauginto pieno produktai, fermentuoti įvairių pieno propionibacteria padermių, parodė panašius citotoksinių poveikį vėžio ląstelių (lentelė S2). P. freudenreichii
Itg P9 yra žinomas dėl savo metabolinio aktyvumo vivo
[22], atitinkantis fermentuotas pienas buvo toliau tiriamas.

P. freudenreichii
fermentuotas pienas sukelia tipiškus ženklai apoptozę žmogaus skrandžio vėžio ląstelių

branduolys morfologija HGT-1 ląstelių inkubuojama su P buvimą. freudenreichii
fermentuotas pienas ultrafiltratas buvo analizuojami fluorescencijos mikroskopijos po Hoechst 33342 dažymo (2a. pav). Branduolinis fluorescencija neapdorotų ląstelių (kontrolės) metu laikui bėgant eksperimento su mėlynu normalus branduolių (laikas 0 h, 2AA pav.) Išliko nepakitęs. Gydymo metu, HGT-1 ląstelės rodomas sutrumpintas chromatino ir fragmentiški branduolių savybes apoptozinių branduolių (pav. 2AB c), o po to apoptozinių organų išvaizda 72 h (pav. 2AD). "Inter-nucleosomal DNR fragmentacija dėl DNR laddering, tipiškas ženklo apoptozės [27], taip pat buvo stebimi Fermentuotas pienas ultrafiltratas gydymo metu. DNR suskaidymas buvo stebimas nuo 24 h gydymo su fermentuotų pieno ultrafiltratą (2B pav.), Ir mažesniu mastu su kamptotecino (S3 pav.). DNR turinys taip pat buvo įvertintas, tėkmės citometrijos po propidiumo jodido ženklinimo ištirti Fermentuotas pienas ultrafiltratą poveikį HGT-1 ląstelės ciklo paskirstymo (2C pav.). Neapdorotos HGT-1 ląstelės pristatė ląstelės ciklo paskirstymą (2ka pav.) Be subG1 etapą, kuris išliko nepakitęs per visą kursą eksperimente (duomenys neparodyti). Ląstelių procentas subG1 etape, išreiškianti apoptozės procesą, žymiai padidėjo su laiku Fermentuotas pienas ultrafiltratas gydymo (pav 2Cb, CC, CD.) Metu: 24 h (39,24 ± 4,87%), 48 h (91,63 ± 0,28 %) ir po 72 h (94,79 ± 0,45%). 48 h ir 72 h gydymo, visi ląstelės buvo į subG1 ląstelių ciklo fazėje, nurodant užbaigtą mirties HGT-1 ląstelių. Kaip kontrolės, kamptotecino sukeltas panašius apoptozinių požymiai į HGT-1 ląstelių (S4 pav.).

Siekiant patvirtinti, apoptozę indukcija, phosphatdylserine translokaciją nuo vidinio iki išorinio lapelio plazminės membranos buvo įvertintas dažant HGT- 1 ląstelės, kurių aneksino V-FITC (AV) ir 7-AAD kartu, o po to tėkmės citometrijos fluorescencijos analizės (3 pav.). Neapdorotos ląstelių (0 h) pristatė didelę gyvų ląstelių (AV - /7AAD -; 92%) ir tik 5% ląstelių buvo tamsintas su aneksinu (3b pav.). Šios procentinės dalys, nustatytos neapdorotų ląstelių nepakito per visą kursą eksperimente (duomenys neparodyti). iš HGT-1 ląstelių su puse atskiesto Fermentuotas pienas ultrafiltratą į DMEMc gydymo metu, ląstelių procentas tamsintas tik 7-AAD (nurodant nekrozė) buvo labai mažas (pav. 3B). Tačiau ląstelių dažytų su aneksino V, procentas gerokai padidėjo priklausomai nuo laiko, būdu ir po 72 h (3b pav.) Pasiekė 80%. Taigi, HGT-1 ląstelės išgyveno apoptozę po gydymo P. freudenreichii
fermentuotas pienas ultrafiltratas, būdingas pirmąją AV teigiamą dažymo, nurodant fosfatidilserinas ekspoziciją, tada tiek A. ir 7-AAD teigiamas dažymo, nurodant vėliau praradimą membranos vientisumą. Kaip kontroliuoti, kamptotecino sukeltas panašius apoptozinių požymiai (S5 pav.)

Kaip SCFA veikia tiesiogiai mitochondrijas, trys svarbūs mitochondrijų parametrai taip pat buvo nustatyta:. ΔΨm vidinis membranos potencialo ir ROS karta, naudojant du fluorescencinės zondai, DiOC (6) 3 (kuris yra ΔΨm jautrus) ir DHE (kuris aptinka o 2 - lygmeniu), citochromo C lokalizacija. Neapdorotos ląstelių (0 h) eksponuojama aukštą fluorescenciją (aukštos ΔΨm) ir mažą dhe fluorescenciją (mažas gamyba O 2 -) (pav. 4A, B),. Po gydymo Fermentuotas pienas ultrafiltratą, laikas priklauso nuo sumažėjimas steigimo DiOC6 (3) fluorescencinė zondas buvo pastebėta, atskleisti keletą ΔΨm nuostolių ir todėl mitochondrijų membranos depoliarizaciją (pav. 4A). Apdorotos HGT-1 ląstelių, turinčių procentai sumažėjo vidinį membranos potencialą išaugo priklausomai nuo laiko, taip, kad būtų pasiekti 96% ląstelių 72 h. FCCP gydymas buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė mitochondrijų membranos depoliarizacijos. Šis ΔΨm praradimas buvo patvirtinta būdingą nuostolių raudona fluorescencija po JC-1 dažymo (4B pav.). Dėl ROS gamyba HGT-1 ląstelių, fermentuoto pieno ultrafiltratas gydymo sukeltas kaupimas O 2 - gerokai po 48 val ir 72 val gydymo (pav 4c.). Tai ROS susikaupimas gali būti iš dalies išvengti, jei ląstelės yra iš anksto apdorotas pagal ROS maitėda TEMPOL (S6 pav.). Citochromo c išsiskyrimas iš mitochondrijų į citoplazmą yra pagrindinis ląstelių renginys apoptozės programą. Imunopernašos tyrimas citoplazmoms-praturtintas frakcijos, citochromo c buvimą patvirtino jos pavienių ląstelių tyri- mas lokalizacijos (pav. 4d) kaita. Citochromo c buvo aptikta citoplazmos-praturtintas frakcija 24 valandas nuo gydymo, nurodant perkėlimas šio baltymo (pav. 4d). Tai citochromo C citoplazmoje relocalization buvo patvirtinta imunodažymu, rodo Difuzinis imunodažymu visoje kameroje po gydymo, o žymi dažymo prieš gydymą (pav. 4E).

P. freudenreichii
fermentuotas pienas aktyvuoja kaspazių

Norėdami patvirtinti apoptozės mechanizmai sukeltas Fermentuotas pienas ultrafiltratą į HGT-1 ląstelių, 9 kaspazių 3, 8 ir apdorojimas buvo analizuojami Imunoblotingo ir atitinkami fermentiniai veiklos stebėseną HGT -1 ląstelių ekstraktai (5 pav.). Ne fermentuotas pienas ultrafiltratas nesukėlė kaspaze aktyvinimo HGT-1 ląstelių: tik kaspazės-3 ir -9 proforms buvo aptiktos Vakarų dėmė (. 5A pav) ir ne kaspazės aktyvumas buvo matuojamas (5b pav.). Fermentuotas pieno ultrafiltratas supernatantas, taip pat kamptotecino arba propionato ir acetato mišinį [2: 1] moliniu santykiu, sukeltas, kad pro-kaspazė, 3 skilimo ir veiklias formas kaspazės-3, subvienetų kartos p17 ir p12 (5A pav.). Iš kaspazės-3 aktyvavimo, kuri yra efektoriaus kaspazė, patvirtino apoptozę indukciją. Be to, fermentuotas pieno ultrafiltratas sukeltas skilimas procaspase-9, vedantis į 35 ir 37 kDa perdirbtų formų. Kaspazės-8 nebuvo aptikta kontrolės neapdorotų HGT-1 ląstelių. Tačiau, gydymas su propionibacterial supernatantų arba C2 /C3 mišinio buvo aiškiai aptikimo 54 kDa Proform, po to jo skilimo po 48 h gydymo

iš kaspazės-3, -8 ir kiekybinis įvertinimas. - 9 fermentiniai veikla patvirtino kaspaze aktyvacijos abiejų propionibacterial metabolitų ir kamptotecino. Iš tiesų, kaspazių-9 ir -3 buvo aktyvuota ankstyviausius etapus gydymo, o kaspazės-8 atrodė aktyvuota vėliau (pav. 5B). Kamptotecino ir SCFA mišinys aktyvuota visus tris mokėsi kaspazių. Šie duomenys patvirtino, kad vidinės kelio apoptozės pagal Fermentuotas pienas ultrafiltratas gydymo aktyvavimo, su išankstinio aktyvinimo kaspazės-9, o tada kaspazės-3 ir -8.

P. freudenreichii
fermentuotas pienas padidina kamptotecino citotoksiškumo

Campthotecin yra citotoksinis chinolino alkaloidas, kuris slopina DNR enzimų topoizomerazė aš (Topo I) ir yra plačiai naudojamas chemoterapinių gydymo GC. Mes parodyta aukščiau, kad propionibacterial metabolitai sukelia apoptozę HGT-1 ląstelių per mitochondrijų mirties keliu. Mes šalia studijavo apoptozę sukelta tiek kamptotecino ir rauginto pieno ultrafiltratą derinys HGT-1 ląstelių. Padidėjęs koncentracijos kamptotecino (0, 0,25, 0,5, 1, 2 mikromolių) kartu su koncentracijos padidėjimas Fermentuotas pienas ultrafiltratą (0,, ⅛, ž) buvo išbandytas HGT-1 ląstelių gyvybingumui ir tiek sukeltas praradimo HGT-1 gyvybingumo , priklausomai nuo dozės priklausomu būdu (6 pav.). Be to, fermentuoto pieno ultrafiltratą papildymas ženkliai sustiprino kamptotecino citotoksiškumo į HGT-1 ląstelių (6 pav.). Pavyzdžiui, 0,25 mkm kamptotecino ir fermentuotas pieno ultrafiltratas praskiestas iki ⅛ buvo gyvybingumo praradimo 8,6% ir 18,6%, atitinkamai. Šių dviejų junginių derinys sukėlė ląstelių gyvybingumo praradimo 29,8% (6 pav.), O tai rodo pridėtinės citotoksiškumas poveikį, kai kamptotecino buvo kartu su fermentuotų pieno ultrafiltratą į HGT-1 ląstelių. Todėl derinys indeksas (PI), apskaičiuotas kaip anksčiau [28], vertė yra 1, nurodant adityvus poveikis kamptotecino ir fermentuoto pieno ultrafiltratas procedūros.

Diskusijos

Naujas fermentuotas pienas, kuriame yra P. freudenreichii
kaip vienintelis bakterija, buvo sukurta siekiant toliau tirti probiotikai potencialą šioje pieno paruošimo propionibacteria (peržiūrėta [29]). Šiame tyrime mes pranešti, kad vandeninė fazė šio fermentuoto pieno žudo žmogaus gaubtinės žarnos ir skrandžio vėžio ląsteles per metabolitų, įskaitant propionato ir acetato, išleistas šios bakterijos. Ši sąvoka yra grindžiamas nustatytu citotoksinių poveikio P. freudenreichii
Fermentuotas pienas supernatantus apie kultūringas HT-29 ir HGT-1 vėžinių ląstelių. Šis efektas buvo gautas su ultracentrifugavimo nuopile, t.y. Fermentuotas pienas vandeninės fazės, neturinčių kazeinų ir bakterijų, rodanti, kad aktyvūs junginiai išskiriami, kaip anksčiau aprašyta propionibacteria [19]. Dėl šios priežasties, dauguma iš šio darbo bandymai buvo atliekami su fermentuotų pieno ultrafiltratą (1 pav.). Mes parodė pirmą kartą, kad P. freudenreichii
fermentuotas pienas paviršinis sukeltas apoptozę HGT-1 ląstelių nuo laiko ir dozės priklausomu būdu su klasikinių morfologinių ir biocheminių savybių apoptozės (kondensuota ir fragmentišką chromation, DNR laddering ir kaupimo ląstelių atsiradimo subG1 ląstelės ciklo etapas).

atrodė tada, jei korinio mechanizmus, HGT-1 ląstelių mirties keliu buvo panašus į mitochondrijų mirties keliu suveiks Caco-2 ir HT-29 žmogaus storosios žarnos vėžinių ląstelių p. freudenreichii
DMEMc kultūrų supernatantai [19], [20]. SUB-ląstelių ir biocheminiai reiškiniai, pastebėti gydytų HGT-1 ląstelių su rauginto pieno ultrafiltratą buvo panašios ir įtraukti bent jau mitochondrijų ΔΨm nuostolių, ROS (O 2 -) karta, kaspazių apdorojimo ir aktyvacijos citochromo c perkėlimas į citoplazmą (3 ir 4 pav.,, 5). Fermentuotas pienas paviršinis sukeltas tvarkymo ir aktyvacijos kaspazės-8, be to, kaspazių -3 ir -9. Be to, 4A pav rodo, kad kaspazės-8 neaptinkamas kontrolės neapdorotų ląstelių ir ląstelių, gydomiems kamptotecino ar ne Fermentuotas pienas ultrafiltratą, atsižvelgiant į jo iRNR (C. Le Jossic-Corcos Medicinos fakulteto, Brest trūksta , Prancūzija, asmeninė komunikacija). Reikėtų pastebėti, kad akivaizdus skirtumas egzistuoja tarp fermentinių rezultatų, tai rodo, kaspazės-8 veiklą kamptotecino-paveiktų ląstelių, o ne kaspazės-8 aptinkamas šių ląstelių Imunoblotingo metodu. Tai gali būti paaiškinamas tuo, specifiškumo, AC-IETD-AMC substrato trūkumo, kurie gali būti tvarkomi kitų fermentų, pavyzdžiui, kaspazių -3 iki -10 ar granzyme B, ypač jei tokių fermentų koncentracija padidėjusi [30], [31]. Priešingai, P. freudenreichii
Fermentuotas pienas ultrafiltratas ir SCFA mišinį ir sukelia išraišką ir aktyvacijos kaspazės-8. Čia dalyvauja mechanizmas nėra išaiškintas; Tačiau, kaspazės-8 yra žinoma, kad pagal-išreikštas kai kurių vėžio ląstelėse kaip DNR metilinimo [32] rezultatas, [33]. Jo išraiška gali būti atkurtas ne RNR ir baltymų lygio demetilinimą veiksnių, tokių kaip decitabino [34] ir HDAC inhibitorių [35], todėl demetilinant reguliavimo seka kaspazės-8, kurio metu kaspazės-8 promotoriaus veikla ir IN RE padidinti -expression kaspazės-8 [32]. SCFA, pavyzdžiui, propionato, yra HDAC inhibitoriai, todėl hyperacetylation iš Histonas [36]. Tai skatina transkripciją per DNR raumeningumo [37] pakeitimo ir gali atkurti kaspazės-8 išraiška. Kiti maisto gimęs junginiai jau buvo įrodyta, kad atkurti kaspazės-8 išraiška. Injekcinius ekstraktas, Spermos coicis
(iš kukurūzų santykinis) ekstraktas rodyti priešnavikinis aktyvumas padidina raišką kaspazės 8 ir indukuoja apoptozę HepG2 ląstelėse [38]. Dialilftalato disulfido nustatė, česnakais, pagerina išraišką kaspazė-8, FPĮ ir FasL į leukemijos K562 ląsteles. todėl toks reguliavimas gali būti įtraukti į proapoptotinį pieno propionibacteria ir fermentuotų produktų, kurių sudėtyje yra jiems. Imunoblotingu liudija atkurta išraišką ir tada vėlai aktyvavimo kaspaze 8-propionibacterial metabolitų gydytiems HGT-1 ląstelių, kurios gali atsirasti dėl kaspazės-8 aktyvavimo rezultatas kurį kitą kaspazė pvz kaspaze 9 d. Iš tiesų, išeiti citochromo c, dalis mitochondrijų keliu, buvo parodyta, kad aktyvuoti kelias kaspazių įskaitant 2, 3, 6, 7, 8 ir 10 [39]. Be to, kaspazės-9 aktyvavimo buvo parodyta rezultatą žemyn upelio kaspazės-8 aktyvacijos [40]. Todėl kaspazės-9 buvo parodyta in vitro
aktyvuoti kaspazės-3, kurios paeiliui įsijungia kaspazės-6, atsakingas už kaspazės-8 aktyvavimo [41]. Iš viso, mūsų rezultatai patvirtina, kad propionibacterial metabolitų Dalyvaujančių P. freudenreichii
fermentuotas pienas sukelia keletą sub-ląstelių mechanizmus palankesnių apoptozę. Toks kaspaze 8 išraiškos atsinaujinimas gali sukelti stambią apoptozės atsako HGT-1 ląstelių gydomi negyvų domenų receptorių agonistų (pvz Trail arba FAS).

Mūsų žiniomis, tai pirmas darbas ataskaitų specifinis indukcija skrandžio vėžys ląstelių apoptozės pagal fermentuotą pieno produktas. Fermentuotas pienas, įskaitant jogurto, buvo pasiūlyta, kad būtų naudinga į gaubtinės žarnos vėžio prevencijai. Epidemiologiniai duomenys apie apsaugos poveikio pieno ir pieno produktų žarnos vėžio kursą priėmė prieštaringus rezultatus [42]. Pienas ir viso pieno produktų vartojimas yra susijęs su į gaubtinės žarnos vėžio rizikos mažinimą. Bet tai nėra tiesa visi pieno produktų ir reiškinių rūšys labai skiriasi. Fermentuoti pieno produktai gali būti veiksmingas pristatymo automobilius nukreipti apsaugos molekules ar mikroorganizmus į tam tikras svetaines, pavyzdžiui, virškinimo epitelio [43]. Galvijų laktoferino, iš pieno sudedamoji, sukelia apoptozę dvitaškis [44] ir skrandžio [45] vėžinių ląstelių. Pasirinkti padermių mikroorganizmų, esančių fermentuotų pieno taip pat gali neutralizuoti storosios žarnos kancerogenezės. Taigi, jogurtas ir pieno rūgšties bakterijos eksponuojami priešvėžinių savybių gyvūnų modeliais gaubtinės žarnos kancerogenezėje [46]. Tačiau mažai darbas sutelktas į fermentuotų pieno produktų ir skrandžio vėžio. Mūsų darbas rodo, kad P. freudenreichii
gali vaidinti svarbų vaidmenį šiame kontekste, nes tai duotų tiek gyvų propionibacteria ir proapoptotinį metabolitų skrandžio gleivinę. Atsižvelgiant į tai, reikėtų pastebėti, kad P. freudenreichii
laikosi virškinimo epitelio ląsteles ir gleivių [47], [48]. Ji taip pat buvo parodyta, kad slopinti sukibimą su sukėlėją skrandžio vėžio Helicobacter pylori
virškinimo epitelio ląsteles, taip pat H. pylori
indukuotų nuostolius [49]. Šios savybės rodo, kad P vaidmenį. freudenreichii
fermentuoto pieno į skrandžio vėžio profilaktikai.

Galiausiai, mūsų fermentuotas pienas potentialized į proapoptozinis veiksmų narkotikų kamptotecino skrandžio vėžio ląsteles. Todėl veiklieji mikroorganizmai probiotinių pieno rūgšties bakterijų anksčiau buvo įrodyta, kad atkreipti LS513 kolorektalinio vėžio ląsteles 5-fluorouracyl [50]. Tačiau, šiuo atveju, probiotikų vien neturėjo proapoptotic poveikį. Šiame darbe, mažos dozės narkotikų kamptotecino naudojamas skrandžio vėžio chemoterapijos buvo neefektyvūs žuvo skrandžio vėžio ląsteles. Tačiau, atsižvelgiant į mažų dozių P buvimą. freudenreichii
fermentuoto pieno, jie efektyviai nužudyti tuos pačius ląsteles (6 pav.). Propionibacterial metabolitai sukelia vidinę apoptozę kelią veikdama tiesiogiai mitochondrijas, o kamptotecino veikia ne DNR lygiu. Tai atitinka jų bendrą potencialą apoptozė indukcijos, kai šie proapoptotinių induktoriai yra sudėtinis. Be to, fermentuotas pieno yra SFCAs, žinomas kaip HDAC inhibitorių, galinčių moduliuoti apoptozę ir ląstelių ciklo skrandžio vėžio ląstelių [13], [51], taip pat dėl ​​ląstelių ciklo susijusios ir apoptozinių baltymų ekspresija kitų vėžinių ląstelių [52], [53]. Probiotikai jau buvo naudojami klinikinių tyrimų, siekiant sumažinti šalutinį poveikį chemoterapija nuo vėžio [54]. P. freudenreichii
gali pagal mūsų rezultatus, galima naudoti tokiais klinikiniais tyrimais. Jo sinergetinis poveikis gali padėti sumažinti narkotikų dozę ir pagerinti pacientų komfortą.

Taigi, naują pieno, fermentuoti tik P. freudenreichii
, sukeltos apoptozės į HGT-1 žmogaus skrandžio vėžio ląsteles. Be to, šis fermentuoto pieno sustiprintas kamptotecino citotoksiškumas veiklą, priklausomybės nuo narkotikų naudojamas skrandžio vėžio chemoterapija. Toks naujas probiotinis fermentuotas pienas gali dominti kaip funkcinis maistas išvengti skrandžio vėžiu ir /arba potentialize gydomąsias procedūras.

Medžiagos ir metodai

Chemija

kamptotecino, etopozido , TEMPOL, acetato ir propionato natrio druskų, ir kaspazės substratai AC-DEVD-AMC (N-acetil-Asp-Glu-Val-Asp-7-amido-4-metilkumarino), kintamosios srovės-IETD-AMC (N-acetil-Ile -glu-Thr-Asp-7-amido-4-metilkumarino) ir AC-LEHD-AFC (N-acetil-Leu-Glu-His-Asp-7-amido-4-trifluoromethylcoumarin) buvo įsigytas iš Sigma-Aldrich (Saint -Quentin Fallavier, Prancūzija). Kamptotecino buvo ištirpintas DMSO. Galutinė koncentracija DMSO, ne didesnė kaip 0,01%, koncentracija, kad nesukėlė jokio toksinio poveikio. RNAse A PI (propidiumo jodidas) Hoechst H33342, MitoTracker® Raudona CMXRos, SU-PRO-3 JC-1, 3,3'-dihexyloxacarbocyanine jodido (DiOC6 (3)) ir dihydroethidium (DHE) buvo gauti iš Invitrogen ( Cergy-Pontoise, Prancūzija). Aneksinu-FITC (AV) rinkinys ir 7-aminoactinomycin D (7-PLG) tirpalas buvo pateikta BD biomokslų (Pont-de-klijai, Prancūzija).

Other Languages