PLoS ONE: aktyvinimas transkripcijos faktorius 4 suteikia naviko atsparumą daugeliui fenotipo skrandžio vėžio ląsteles per Transactivation iš SIRT1 Expression

Anotacija

Fonas

naviko atsparumą daugeliui vaistų (MDR) skrandžio vėžys išlieka labai svarbus uždavinys į klinikinę gydymo. Įjungimas transkripcijos faktorius 4 (ATF4) yra stresas atsakas genas dalyvauja Homeostazė ir ląstelių apsaugai. Tačiau pasakymas ir funkcijos ATF4 skrandžio vėžio MDR lieka nežinoma. Šiame tyrime mes ištirti, ar ATF4 vaidinti svarbų vaidmenį skrandžio vėžio MDR ir jos potencialių mechanizmus.

Metodologija /Pagrindinės išvados

parodė, kad ATF4 raiškos confered MDR fenotipą skrandžio vėžio ląstelių, o nokdaunas iš ATF4 į MDR alternatyvius sukeltas naujo alergiją. Šiame tyrime taip pat parodė, kad NAD ^{+ - priklauso histono deacetilazės SIRT1 reikėjo ATF4 sukeltos MDR poveikį skrandžio vėžio ląsteles. Mes parodė, kad ATF4 palengvino MDR skrandžio vėžio ląsteles per tiesioginio privalomą į SIRT1 promotoriaus, todėl SIRT1 iki reglamentavimą. Pažymėtina, slopinimas SIRT1
pagal sirnr (siRNA) arba konkretaus inhibitorių (EX-527) vėl gydomąjį jautrumą. Be to, padidėjusi BCL-2 /Bax santykis ir MDR1 išraiška lygis buvo rasta ATF4 ekspresija ląsteles.}

Išvados /Reikšmė

parodė, kad ATF4 turėjo svarbų vaidmenį MDR reglamento skrandžio vėžio ląstelių atsakas į chemoterapiją ir šių išvadų matyti, kad orientacija ATF4 gali sumažinti gydomąjį atsparumą skrandžio vėžio

nurodomoji dalis:. Zhu H Sia L Zhang Y Wang O Xu W Hu O et Al. (2012) aktyvinimas transkripcijos faktorius 4 suteikia naviko atsparumą daugeliui fenotipo skrandžio vėžio ląsteles per Transactivation iš SIRT1 išraiška. PLoS ONE 7 (2): e31431. Doi: 10,1371 /journal.pone.0031431

redaktorius: Wael El-Rifai, Vanderbilt universiteto medicinos centras, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo rugsėjo 5, 2011 m Priėmė: Sausis 8, 2012 m Paskelbta: Vasario 17, 2012

Visos teisės saugomos: © 2012 Zhu et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis tyrimas parėmė kartu dotacijų iš nacionalinio Gamtos mokslo fondo Kinijos (NO.81090270, NO.81090273 ir NO.81000864), Kinijos Docentas mokslo fondas (NO.20100471776), Nacionalinė raktų ir fundamentalieji moksliniai tyrimai plėtros programa Kinijoje ( 2010CB529302 NR.) ir Nacionalinė savivaldybės mokslo ir technologijų projektas (2009ZX09103-667 ir 2009ZX09301-009-RC06). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

atsparumas daugiskaitos paprastai yra pagrindinė priežastis, dėl gedimo chemoterapijos prieš piktybinių navikų, įskaitant skrandžio vėžio [1] .Sriegines terminas naviko atsparumą daugeliui yra klasikinės naudojamas apibrėžti atsparumo fenotipą, kur ląstelės tampa atsparios vienu metu skirtingų vaistų, kurių nėra akivaizdu, struktūrinis panašumas ir įvairių mobiliojo ryšio tikslų [2]. MDR atsiranda dažniau naujų vaistų, kurie turi daugiau reikšmingą veiksmingumą po jų pirmojo prašymo vėžio gydymo. Klinikinė nauda kelis narkotikus riboja gamtinės ir įgytą naviko atsparumą ląstelių, kurios beveik visada yra daugiaveiksnė į [3] gamtoje. Veiksniai, kurie gali turėti įtakos narkotikų jautrumą apima: pagreitintas narkotikų efliuksą, narkotikų aktyvinimą ir nukenksminimą, keičiant narkotikų tikslą, DNR metilinimas, narkotikų sukeltos žalos apdorojimo ir vengimu apoptozės [4]

Skrandžio vėžio. yra santykinai nejautri chemoterapiniai vaistai. MDR mechanizmai skrandžio vėžio ląstelių buvo plačiai ištirtas mūsų laboratorijoje ir kitur [1], [4], [5], tačiau jie nėra visiškai aiški, nurodant, kad kiti nežinomi molekulės ar keliai gali būti įtrauktos į plėtros MDR.

žinduolių ląstelėse, eukariotinių vertimas inicijavimas factor 2 α subvieneto (eIF2α) yra fosforilinamos skirtingų eIF2α kinazės atsakant į įvairių streso signalus, įskaitant anoksijos /hipoksija, Endoplazminis tinklas streso, aminorūgščių atėmimo, ir oksidacinio stresas. Tai fosforilinimo įvykis sukelia sparčiai mažėja pasaulinės baltymų biosintezė sutampa su indukcijos pritaikymo genų, įskaitant ATF4
kad veiktų sumažinti mobiliojo ryšio žalą nuo streso [6], [7]. Nors ATF4 gali žaisti proapoptozinis vaidmenį sąlygomis sunkaus ar ilgalaikio streso ATF4
yra stiprus stresas reaguoja genas manoma, vaidina apsauginį vaidmenį reguliuojant ląstelių prisitaikymą prie neigiamų aplinkybių, integruotos streso atsaką ( ISR) [8], [9], [10]. Neseniai, raiškos iš ATF4 buvo pranešama, kad ryškus įvairių auglių ir, siekiant apsaugoti auglio ląsteles nuo daugelio sunkumų, taip pat vėžio terapinių agentų spektrą [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Potencialūs mechanizmai atsakingi už šį apsauga apima autofagija indukcija, skatinti DNR žalos atlyginimo, ir up-reguliavimą ląstelėje glutationo [12], [13], [14], [17]. Tačiau pasakymas ir funkcijos ATF4 skrandžio vėžio MDR lieka nežinoma.

Šiame tyrime mes pranešė, kad ATF4 buvo gerokai iki reguliuojama į MDR atsakas skrandžio vėžio ląstelių, palyginti su tėvų kontrolės ląstelių. Nokdaunas iš ATF4
pagal siRNA žymiai įjautrintos ląsteles MDR iki chemoterapiniais preparatais įvairovė, o iki-reguliavimo ATF4 į SGC7901 ir AGS ląstelių lydyti juos vaistams atsparios. Mes taip pat parodė, kad ATF4 skatinama skrandžio vėžys MDR dalies per iki reguliavimo išraišką SIRT1. Ir SIRT1 slopinimas gali iš dalies pakeisti skrandžio vėžys MDR fenotipą procesų, kuriuose ATF4. Šie duomenys rodo, kad orientacija ATF4 gali teikti naujoviškas gydomąjį variantą atbulinės eigos klinikinis skrandžio vėžiu MDR.

Rezultatai

ATF4 moduliuoja MDR fenotipą skrandžio vėžio ląstelių

Norėdami nustatyti, ar ATF4 dalyvauja apie MDR plėtros skrandžio vėžio ląsteles, ATF4 koncentracija buvo aptikta Vakarų dėmė ir qPCR į SGC7901 ląstelių linijos ir jos MDR variantai, SGC7901 /VCR ir SGC7901 /ADR. Abu baltymų ir iRNR lygiai ATF4 buvo daug didesnis į atsparių ląstelių linijų nei tėvų ląstelių (. 1 pav).

Jei ištirti, ar ATF4 raiškos pakanka sukelti MDR fenotipas skrandžio vėžio ląsteles, ATF4
išraiška kDNR buvo stabiliai perkeltų į SGC7901 ir AGS ląsteles. Pirma, CDDP jautrumas išbandytas naudojant kolonija formavimo tyrimą. Kaip matyti iš kolonijos formavimosi tyrime kiekybiškai, ATF4 raišką lėmė beveik 3 kartus padidėjo kolonijas skaičių palyginti su tuščiais užkrato išreikšti ląstelių (1b pav.). MTT tyrimai taip pat parodė, kad IC _{50 vertės SGC7901-ATF4 AGS, VCR, CDDP ir 5-FU buvo gerokai padidėjo, palyginti su tuščiais vektoriaus perkeltų ląstelių (. 1D pav).}

Kaip ATF4 lygiai padidėjusi MDR skrandžio vėžio ląsteles, mes dar norėjome nustatyti, ar nukreipti ATF4 gali iš naujo atkreipti MDR ląstelių linijas. Nokdaunas iš ATF4
pagal siRNA į SGC7901 /ADR ir SGC7901 /VCR ląstelių buvo priimtas nuo 2 iki 3 kartus sumažinti ląstelių skaičius, kai vartojamas kartu su CDDP (pav. 1c). Duomenys Fig. 1E, taip pat rodo, kad žemyn reguliavimo ATF4
žymiai apsisuks SGC7901 /AGS ląstelių atsparumą, reaguojant į chemoterapiją.

Kaip slopinimas apoptozės yra vienas iš svarbiausių mechanizmų MDR, mes taip pat tyrė iš SGC7901 /ADR ląstelių perkeltų su konkrečiomis talpa ATF4
siRNR atlikti CDDP sukeltas apoptozę Hoechst dažymo ir DNR fragmentacijos tyrimus. Gydymas SGC7901-ATF4 ir SGC7901 /ADR SCR ląstelių su nurodytomis koncentracijos CDDP už 36 valandas nesukėlė jokio apoptozę, kaip vertinama Hoechst branduolinės dažymo (1F pav.) Ir DNR fragmentacijos tyrimai (1G pav.). Priešingai, SGC7901 vektoriaus ir SGC7901 /ADR siATF4 ląstelės rodomas didelės apoptozę, su dažnesnio pasirodymo kondensuotas ir susiskaldžiusios branduolių ir DNR kopėčių formavimas. Be to, buvo pastebėta daugiau nei akivaizdi skaldymas procaspase-3 po gydymo CDDP į SGC7901 vektoriaus ir SGC7901 /ADR siATF4 ląstelių, palyginti su SGC7901-ATF4 ir SGC7901 /ADR SCR ląstelių, atitinkamai (1H pav.).

"kartu paėmus, šie rezultatai rodo, kad ATF4 suteikia MDR fenotipą skrandžio vėžio ląstelių ir kad orientacija ATF4 suteikia jautrumą atsparias ląstelių cheminio apdorojimo būdą.

ATF4 iki-reguliuoja SIRT1, MDR1 išraiška , BCL-2 ir Bax skrandžio vėžio ląstelių

Ankstesni tyrimai pranešė, kad ląstelės ekspresija SIRT1 rodomas sumažėjęs jautrumas chemoterapijos daugeliu mechanizmų [18], [19], [20], [21]. Mums buvo smalsu, siekiant nustatyti, ar, SIRT1
, kuris yra streso geno lemiamas MDR plėtrą, gali būti tolesnis tikslas ATF4 atsakinga už tarpininkavimo ATF4 sukeltos MDR skrandžio vėžio ląsteles.

SIRT1 lygiai LV-vektoriaus ir KS-ATF4 stabiliai Transfekuoti SGC7901 ląstelės buvo tiriami qPCR ir Vakarų dėmė. Iš ATF4 raiška buvo susijęs su padidėjusia SIRT1 išraiška tiek transkripcijos (pav. 2A, kairėje) ir transliacijos lygių (pav. 2b, kairėje). Priešingai, siRNR nokdaunas iš ATF4
SGC7901 /AGS ląstelių lėmė gerokai sumažinti endogeninio SIRT1
išraiškos (. 2A ir 2B pav, dešinėje). Šie rezultatai rodo, kad ATF4 up-reguliuoja SIRT1
išraišką skrandžio vėžio ląsteles.

toliau tirti molekulinius mechanizmus dalyvauja ATF4 susijusių MDR skrandžio vėžio, mes taip pat išnagrinėjo MDR1, MRP, bCL-2, ir BAX ekspresijos lygis skrandžio vėžio ląstelių aukščiau naudojamas. Kaip parodyta Fig. 2B, ATF4-įgudę ląstelės išreiškė daugiau MDR1, palyginti su kontrolinių ląstelių. Tuo tarpu, ne akivaizdu, skirtumas MRP išraiškos buvo nustatyta, bet kurioje iš šių ląstelių linijų. Įdomu tai, kad abu BCL-2 ir BAX ekspresijos lygis buvo iki-reguliuojami ATF4-įgudę ląstelių, lyginant su kontrolinės ląstelių linijų, o Bax išraiška parodė tik nežymius pakeitimus, nurodant, kad up-reguliavimas BCL-2 į Bax santykis gali slopinti vaistų sukeltas apoptozę ATF4 ekspresija skrandžio vėžio ląsteles.

Šie rezultatai rodo, kad ATF4 skatina MDR gebėjimą skrandžio vėžio ląsteles per keletą mechanizmų.

ATF4 transactivates SIRT1 promotoriaus aktyvumą ir tiesiogiai jungiasi su SIRT1 rengėjas

Norėdami nustatyti, ar ATF4 tarpininkauja SIRT1
genų transkripcija, 293T ląstelės buvo bendrai perkeltų su 1,2 kb SIRT1
rengėjas reporteris plazmidės ir ATF4
išraiška plazmidės. Liuciferazės reporterio testą paaiškėjo, kad SIRT1
rengėjas veikla buvo labai aktyvuota ATF4 dozės priklausomu būdu (3a pav.).

bandant įgyti konkrečią įžvalgų mechanizmų SIRT1
indukcija, mes išnagrinėjo galimus indukcijos kelius iš ATF4. Analizuojant 5'-pagalbines seką SIRT1
genų su bioinformatikos programinės įrangos (Tfsitescan paslaugos, TESS ir Genomatix), du ATF4 spėjamas jungimosi vietų buvo identifikuojamos per -950 iki -600 bp regione SIRT1
rengėjas (3B pav.).

Norėdami nustatyti, ar SIRT1
yra tiesioginis tikslas ATF4, elektroninės su ATF4 antikūnų naudojant SGC7901-ATF4 ląsteles parodė praturtino tiek jungimosi vietų per SIRT1
promotoriaus regione, rodo, kad RNR ir vėliau proteinas lygio padidėjimus SIRT1
ATF4 ekspresija ląstelių linijų yra greičiausiai dėl tiesioginės sąveikos ATF4 su SIRT1
geno promotoriaus (3C pav.).

ištirti dviejų ATF4 privalomas svetainių vaidmenį reguliuojant SIRT1 transactivation, svetainės nukreiptas mutageninis poveikis buvo naudojamas mutuoti šias svetaines. Liuciferazė reporterio testą paaiškėjo, kad nei mutavo prijungimo vietą 1 arba jungimosi vieta 2 sumažino SIRT1 promotoriaus aktyvumą sukeltas ATF4. Be to, mutacija abiejų jungimosi vietų panaikino SIRT1 promotoriaus aktyvumą. Šie rezultatai rodo, kad tiek ATF4 įrišimo svetainių dalyvauja SIRT1 promotoriaus (S1 pav.) Transactivation.

Kartu šie rezultatai rodo, kad SIRT1 yra tiesioginis transkripcijos tikslas ATF4.

SIRT1
slopinimo siRNA dalies apsisuks MDR fenotipas ATF4 ekspresija skrandžio vėžio ląstelių

iš ATF4 tarpininkaujant SIRT1
išraiška lygis padidėja skrandžio vėžio ląsteles, paskatino identifikavimas mus analizuoti šiuo būdu skrandžio vėžio MDR vaidmenį. Norėdami išspręsti šią problemą, mes palyginti in vitro
narkotikų jautrumas ATF4 stabiliai perkeltų skrandžio vėžio ląsteles po transfekciją SIRT1
siRNA arba plakta siRNA kolonijų formavimo ir MTT tyrimus. Nokdaunas iš SIRT1
pagal siRNA į SGC7901-ATF4 ląstelių sukėlė a > 40% sumažinti kolonijų skaičius, kai naudojamas kartu su CDDP (pav. 4A, viršutinių). Šis poveikis taip pat buvo pastebėtas AGS-ATF4 ląstelių (pav. 4A, mažesnis). Be to, duomenų MTT taip pat nurodė, kad SIRT1
gali iš naujo atkreipti SGC7901-ATF4 ląsteles cheminių vaistų triuškinantis, tačiau tai neįvyko plakta siRNR perkeltų ląstelių (4b pav.).

Jei norite nustatyti, ar SIRT1 apsaugo ląsteles nuo CDDP sukeltos apoptozės, SGC7901-ATF4 ląstelės transfektuotose SIRT1
siRNA arba plakta siRNA buvo gydomi CDDP ir ženklinamos aneksinu ir PI. Apoptozės ląstelės buvo žymimas ir prie aneksino V ženklinimo. Apoptozės procentas SIRT1 siRNA perkeltų SGC7901-ATF4 ląstelės buvo reikšmingai didesnis negu kontrolinių ląstelių (. 5A pav, 72,8% vs 25,9%). Kondensuoto ir suskaidytų branduolių išvaizda taip pat buvo padidintas SIRT1 siRNR transfekuotų ląstelių, palyginti su kontrolinių ląstelių (5B pav.). Be to, skaldymas procaspase-3 buvo pastebėta anksčiau kaip 12 valandas po gydymo 10 mikrogramų /ml CDDP į SIRT1 siRNA perkeltų SGC7901-ATF4 ląsteles, bet ne plakta siRNR paveiktų ląstelių, net po 24 h CDDP gydymo (pav. 5C ). Šie rezultatai rodo, kad SIRT1 raiškos slopina CDDP sukeltas apoptozę.

Jei studijuoti žemyn reguliavimo SIRT1 efektą siRNA apie MDR susijęs molekulių, mes išanalizavome MDR1, MRP, BCL-2 ir BAX ekspresijos lygis SGC7901-ATF4 ląstelės šie transfekciją su SIRT1 siRNA arba plakta siRNA. Žemyn reguliavimas MDR1 buvo pastebėta SIRT1 siRNR gydytų ląstelių (. 5D pav), palyginti su kontrolinių ląstelių. Priešingai, buvo rasta tarp mėginių nėra aiškaus skirtumo MRP, BCL-2, ir BAX ekspresijos lygį.

Šios pastabos rodo, kad SIRT1 tarpininkauja dėl ATF4 sukeltos MDR poveikį skrandžio vėžio ląsteles.

slopinimas SIRT1 veiklos RE-sensitizes ATF4 Transfekuoti ląstelių DNR pažeidžiančiais preparatais

Jei pateikti įrodymų, kad SIRT1 katalizinis aktyvumas taip pat yra atsakingas už ATF4 sukeltos MDR, SGC7901-ATF4 ląstelių buvo gydytiems su EX 527 , romanas, stiprus ir specifinis mažos molekulės inhibitorius SIRT1 ir po gydymo skirtingų cheminių vaistų. Pirma, mes nustatomas bazinio citotoksiškumo EX-527 KS-vektoriaus ir KS-ATF4 stabiliai Transfekuoti SGC7901 ląsteles. MTT tyrimas atskleidė, kad ex-527 koncentracija iki 10 mikromolių neslopina, o šiek tiek padidėjo, abiejų ląstelių linijas (pav. 6a) gyvybingumas. Be to, mes išnagrinėjo SIRT1, ATF4, MDR1, MRP, BCL-2 ir BAX raiškos lygį po 24 valandų inkubacijos su arba be nurodytas dozes ex 527 skrandžio vėžio ląstelių aukščiau naudojami. Tik MDR1 išraiška buvo žemyn reguliuojama ex-527 nuo koncentracijos priklausomu būdu (6B pav.). Tada mes anksto inkubuojamas SGC7901-ATF4 ląsteles transporto priemonės arba EX-527 (0,5, 1, 2, 4 ir 10 mikromolių) 24 val, ir tada CDDP- ir 5-FU tarpininkaujant ląstelių mirtis buvo matuojamas. Kaip parodyta Fig. 6C, ex-527 daug didesnis abiejų narkotikų citotoksinį poveikį priklausomai nuo dozės priklausomu būdu. Taip pat nustatėme, galimą sinergetinį poveikį ex-527 dėl skirtingų dozių CDDP- ir 5-FU slopinamos ląstelių proliferacijos in SGC7901-ATF4 ląsteles. Kaip ir tikėtasi, 10 mkm EX 527 pakanka stiprinti abiejų vaistų toksiškumą (. 6D pav).

Šie rezultatai rodo, kad SIRT1 veikla taip pat vaidina svarbų vaidmenį ATF4 sukelta skrandžio vėžio MDR ir tai vaidmuo gali būti tarpininkaujant dalies per MDR1 išraiška.

Diskusijos

MDR kelia rimtų klinikinių iššūkių veiksmingai chemoterapijos daugelio žmogaus piktybinių navikų. Mechanizmai, kuriais ląstelės įgyja atsparumą yra daugialypiai ir sudėtingi, todėl plačiau suprasti iš jų, taip pat identifikuoti naujų mechanizmų Atsparumas cheminėms, bus ypač naudinga teikiant geresnes gydymo galimybes. Šis tyrimas yra pirmasis pranešimas, kad aukšto lygio ATF4, dažnai matyti naviko ląstelių pagal stresines aplinkybes, suteikia skrandžio vėžio ląsteles su MDR fenotipo, ir ji nustato, kad šis poveikis yra sąlygotas iš dalies transactivation iš SIRT1 išraiška.

ATF4 parsisiųsti ir SIRT1
yra evoliuciškai konservatyvūs streso atsaką genus plataus spektro biologinių procesų, iš kurių daugelis yra išganingas už Homeostazė ir ląstelių apsaugai [22], [23], [ ,,,0],24]. Abiejų šių genų, yra indukuojamos į reaguojant į įtempimų įvairovė, įskaitant deguonies kiekis (hipoksija /anoksijos), oksidacinio streso, DNR pažeidimai, mitybos trūkumo, ir chemotoksinį streso. Levenson V. , et al.,
Pirmas pranešė, kad pokyčiai išraiška ATF4 galėtų vaidinti svarbų vaidmenį pleiotropic atsparumą įvairių klasių DNR nukreipimą narkotikų [16]. Pastaraisiais metais, rado keletą tyrimų, kurie ATF4 dalyvavo tiesiogiai arba netiesiogiai atsparumo vaistams vystymąsi per autofagija, glutationo priklauso nuo oksidacijos-redukcijos sistema, ir DNR pažeidimai remontas [11], [12], [13], [14] , [15], [16], [17], [25], [26]. Čia mes parodome, kad apsauginis gebėjimas ATF4 tiesų tarpininkauja dėl MDR fenotipas ATF4-ekspresija skrandžio vėžio ląstelių linijų, reaguojant į chemoterapiją. Mūsų išvados aiškiai rodo, kad padidėjusią ATF4 skrandžio vėžio ląstelių buvo susijęs su daugiau atsparumo, o nokdaunas iš ATF4 sukeltas naujo alergiją. Šie duomenys rodo, kad ATF4 tikriausiai svarbi pasroviui tarpininkas atsparumo dėl įvairių mechanizmų ir todėl yra vertingas gydomasis taikiniu. Vis dėlto, kaip vieną iš svarbiausių transkripcijos mediatorių IS, kuris aktyvuoja keletą tikslinių genų, kurie skatina atkūrimą homeostazės įvairovė, ATF4 taip pat gali tarpininkauti atsparumą kitų mechanizmų. Mūsų tyrimo duomenimis, SIRT1 buvo nustatyta, kad iki-reguliuojami ATF4 ekspresija ląstelių, palyginti su vektoriaus perkeltų ląstelių. Priešingai, triuškinantis ir ATF4
su ATF4 konkretaus siRNA lėmė žemyn reguliavimo SIRT1 į MDR skrandžio vėžio ląsteles. Mūsų rezultatai rodo, kad SIRT1 gali būti tolesnis tarpininkas ATF4 sukelta skrandžio vėžio MDR.

kaip ATF pošeimiui pagrindinio regiono leucinas užtrauktuku valstybės (BIP) transkripcijos veiksniai [22], ATF4 turi tą potencialą veikti arba kaip transkripcijos aktyvatorius ar transkripcijos slopinančioje per ATF ar cAMP reaguoja elemento (CRE) jungimosi vietų [22]. Sutarimas jungimosi vietos ATF buvo apibrėžtas kaip TGACGT (C /A) (g /a) [27], kuris seka sutampa su CRE sutarimo elemento (TGACGTCA) [28]. Taip pat, labai konservatyvių šerdis motyvas - ACGT - daugeliu Crès [29] gali prisijungti prie skirtingų BIP veiksnių, atsižvelgiant į iš šalutinių bazių iš pagrindinių motyvas [22], [30], [31]. Mūsų tyrime du spėjamas ATF-CRE jungimosi vietų buvo rasta 1,2 kb SIRT1
rengėjas regionas ir ATF4 tiesiogiai įjungia SIRT1
transkripcija per privalomas abiems privalomas elementais. Tačiau, kaip du privalomi svetainės žaisti savo vaidmenis pagal išsamias streso aplinkybėmis lieka nežinoma ir reikalauja tolesnio tyrimo.

Žinduolių SIRT1
yra arčiausiai homologas iš mielių, Sir2 parsisiųsti ir plačiausiai studijavo SIRT šeimos narys. Tai yra labai susijęs su ląstelių procesus, kurie lemia ilgaamžiškumą, įskaitant anti-apoptozės, neuronų apsaugos ir ląstelių senėjimo ar išlaikymo [32] Reglamentas. Neseniai, vis daugiau tyrimų susijęs padidėjo išraiška SIRT1 su atsparumu chemoterapijos ir jonizuojančiosios spinduliuotės [18], [19], [20], [33], [34], [35], [36]. Pavyzdžiui, SIRT1 raiška buvo rasta narkotikų atsparus neuroblastoma, osteosarkoma, pieno, kiaušidžių, prostatos, storosios žarnos, plaučių vėžio ląstelių linijų, palyginti su jų narkotikais jautrus kolegomis. Visi šie narkotikų atsparios poveikis SIRT1 galėtų būti dėl to, kad navikas slopintuvas genų savo kovos su apoptozės poveikio [37], [38] ir nuslopinami [39]. Pagaliau, mes gali prognozuoja, kad, jei SIRT1 dalyvauja ATF4 sukeltas MDR, slopinimas SIRT1 turėtų įtakos ATF4 ekspresija ląstelių jautrumą reaguojant į chemoterapija. Kaip ir tikėtasi, abu siRNR ir farmakologinis slopinimas SIRT1 gali iš naujo atkreipti ATF4 ekspresija ląsteles cheminių vaistų. Be to, mūsų tyrimas rodo, kad SIRT1 apsaugo ląsteles nuo mirties dalies per anti-apoptozės poveikį.

Buvo pranešta, kad MDR1 buvo reguliuojama ląstelėse, kuriems yra padidėjęs SIRT1 išraiška [18], [36]. Šiame tyrime taip pat parodė, kad MDR1 yra up-reguliuojami ATF4 ekspresija ląstelių ir nokdaunas iš SIRT1 su SIRT1 konkretaus siRNA arba slopina savo veiklą su EX-527 gali sukelti žemyn reguliavimo MDR1, kuris yra suderinamas su narkotikų -resistant vaidmuo, kurį SIRT1. Tačiau BCL-2 /Bax santykis, kuris buvo reguliuojamas į ATF4 ekspresija ląsteles, buvo SIRT1 nepriklausoma, o tai rodo, kad SIRT1 nepriklausomas mechanizmai taip pat vaidina svarbų vaidmenį ATF4 sukeltos MDR skrandžio vėžio ląsteles.

Apibendrinant, mes įrodyti, kad ATF4 suteikia MDR fenotipą skrandžio vėžio ląstelių, ir šis poveikis yra iš dalies keisdamas transactivation iš SIRT1 raiškos. Be to, ATF4 yra galiojanti tikslas narkotikų atsparus skrandžio auglių, ir ateityje turėtų būti atsižvelgta kuriant veiksmingą inhibitoriai ATF4. Šie duomenys pateikti naujų įžvalgų ATF4 vaidmens kontroliuojant SIRT1 išraišką ir į jo streso atsparumo funkcijų Tumorigenesis ir chemoterapija. Tai ypač svarbu, kliniškai, nes ATF4 gali būti iki reguliuojama pagal deguonies nepritekliaus, oksidacinio streso, mitybos nepriteklius ir beveik visų neigiamų veiksnių iš naviko mikroaplinkos, kurie gali būti užgrobti vėžinių ląstelių išvengti platinimo slopinimas ir ląstelių mirtį atsakas į chemoterapiją. Todėl intervencijos grindžiamas sutrikdyti streso sukeltos ATF4 išraišką vėžinių ląstelių gali būti veiksminga apeiti ar atbulinės eigos atsparumo vaistams skrandžio vėžio.

Medžiagos ir metodai

išsamių metodus, žr Tekstas S1 .

Mobilusis Kultūra ir reagentai

žmogaus skrandžio adenokarcinoma ląstelių linijos SGC7901 (gautas iš karo medicinos mokslo, Pekinas, Kinija akademija) ir MDR variantai, SGC7901 /ADR reikalavimus ir SGC7901 /VCR (užmegzti ir palaikyti mūsų laboratorijoje) ir "AGS (gauti iš ląstelių banko Kinijos mokslų akademijos, Šanchajus, Kinija) buvo auginamos RPMI-1640 terpėje, papildytoje su 10% vaisiaus galvijų serumo (Hyclone) ir penicilino /streptomicino. 293T ląstelės (taip pat gauti iš ląstelių banko Kinijos nano) buvo auginamos DMEM, papildytoje 10% vaisiaus galvijų serumo. Išlaikyti MDR fenotipą, adriamicino (su kad galutinė koncentracija būtų 0,5 g /ml) ir vinkristino (su kad galutinė koncentracija būtų 1 g /ml) buvo pridėta prie terpės SGC7901 /ADR ir SGC7901 /VCR ląstelių, atitinkamai. Ex-527 (Sigma) buvo ištirpintas DMSO pasiektų nurodytą koncentracijos. Adriamiciną (AGS), vinkristino (VCR), cisplatina (CDDP), ir 5-fluorouracilu (5-FU) buvo ištirpinta fiziologinio tirpalo ne nurodytas koncentracijas.

Mobilusis transfekciją ir stabili ląstelių linijos

žmogaus ATF4
išraiška plazmidės (pCMV5-ATF4) buvo maloniai pateikė profesorius Amy S. Lee [25]. Lentiviruso vektorius kodavimas siRNR būdingi ATF4 parsisiųsti ir kontrolės siRNR buvo sukurtas su PLKO.1-TRC (Addgene) naudojimo ir buvo paskirtas LV-siATF4 ir LV-SCR kontrolės, atitinkamai. Lentiviruso vektorius kodavimas žmogaus ATF4 genas buvo pastatytas FUW-teto (Addgene), paskirtos LV-ATF4. O tuščia vektorius buvo panaudotas kaip neigiama kontrolė, paskirtai kaip LV-vektorius. Stabilios ląstelių linijos buvo gautos transfekciją nurodytų lentiviruso konstruoja, po to, pasirenkama puromicino arba zeocin (Invitrogen), atitinkamai. Mobilusis transfekcija ir karta stabilių ląstelių linijų buvo atliekama naudojant standartines procedūras. Iš siRNA konstruktų sekas galima rasti Tekstas S1.

imunoblotas

baltymų ekstraktų rinkimas ir imunoblotingo analizė buvo atliekama naudojant standartines procedūras. Dėl antikūnų šaltinių, žr Tekstas S1.

kolonija formavimas tyrimas

kolonija formavimas tyrimas buvo atliktas, kaip aprašyta anksčiau [40], su nedideliais pakeitimais (Tekstas S1).

aneksinu dažymo ir FACS analizė

aneksinu dažymo ir FACS analizė buvo atliekama naudojant standartines procedūras. Ląstelės neigiami tiek PI ir aneksinu dažymo buvo klasifikuojami kaip gyvų ląstelių, ląstelių, tamsintas teigiamas aneksinu tik buvo klasifikuojami kaip pradžioje apoptozinių ląstelių ir VšĮ teigiami ir aneksinu teigiami ląstelės buvo ląstelės, kuriems atliekama etapus apoptozės.

DNR fragmentacija tyrimas

DNR fragmentai buvo ekstrahuojamas DNR kopėčios gavyba rinkinys su centrifugavimo kolonėlę (C0008, Beyotime Co, Pekinas, Kinija) pagal gamintojo protokolą. DNR fragmentai buvo atskirtos naudojant gelio elektroforezės 1% agarozės gelyje, kuriame 0,1 mikrogramai /ml Etidžio bromidas.

Hoechst dažymo

"Hoechst Dažymo buvo atliekamas pagal gamintojo protokolu (C0003, Beyotime Co ). Ląstelės buvo ryškinamos su DP70 invertuotąjį IMUNOFLUORESCENCIJOS mikroskopu (Olympus). Ląstelės glausta ir susiskaldžiusios branduoliai buvo nuspręsta, kad aprotoninis.

in vitro
narkotikų jautrumas tyrimas

ADR VCR CDDP ir 5-FU visi buvo ruošiamas prieš kiekvienas eksperimentas. Narkotikų jautrumas buvo matuojamas naudojant 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolio bromidas (MTT) Analizės būdas pagal standartinis protokolas (tekstas S1).

Kiekybinė realaus Game PGR (qPCR)

Kiekybiniai realaus laiko PGR buvo atliekama naudojant LIGHTCYCLER 480 II sistemą (Roche) ir SYBR Žalioji aptikimo (TAKARA). Sekos pradmenų galima rasti Tekstas S1.

Chromatino imunoprecipitacijos (ChIP) Analizės

Chip tyrimai buvo atliekami pagal gamintojo protokolą (P2078, Beyotime Co.) su nežymiais pakeitimais. Chromatino sprendimai susmulkintos ultragarsu ir inkubuojami su anti-ATF4 arba su kontrolės IgG, ir pasukti per naktį 4 ° C temperatūroje. DNR-baltymų kryžminės nuorodos buvo atvirkštinių ir chromatino DNR buvo gryninamas ir veikiamas PGR metodu. Pradmenys 5'-ACC BMT CGT TTT PPK TCT-3 "ir 5'TTT-GGA GTC CTT BMT TTC-3" buvo naudojamas sustiprinti į SIRT1
distalinio promotoriaus seką (A1, nukleotidų -974 iki - 843), ir gruntai 5'-ACC CAA ACC CAT TCT-3 "ir 5'-CCT BMT ggg ARG ACC TTT-3" buvo naudojamas sustiprinti į SIRT1
proksimalinio rengėjas seka (A2, nukleotidai -781 iki -647). Už GAPDH
gruntai, 5'-TAC TAG CGG TTT BLSK ggg CG-3 "ir 5'-TCG AAC AGG AGG AGC" AGA GAG CGA-3 ", buvo naudojami kaip neigiamos kontrolės. Kaip teigiamą kontrolę dėl ATF4-DNR sąveika, pradmenų 5'-TGG TTG GTC BTK GCA GGC AT-3 "ir 5'-CGC TTA BLSK CGA BMT GGC TCC, T-3", kuri buvo sukurta siekiant sustiprinti asparagino sintetazės ( ASNS
) rengėjas regionas, kuriame yra ne mažiau kaip dvi svetaines, pateiktoms įpareigoti ATF4 [41], taip pat buvo naudojami. Po amplifikacijos PGR produktai buvo išspręstas 1,5% agarozės gelyje ir regimos etidžio bromido dažymo

Žurnalistė genų tyrimas

1.2 KB žmogaus SIRT1
rengėjas seka (. - 1100-100 bp) buvo susintetintas ir klonuotas į Xhol ir Hind III vietų pGL3-Pagrindinė vektorių. Gautas konstruktas buvo patvirtinta DNR sekos. 293T ląstelės buvo tada bendrai transfekuota su SIRT1
promotorius reporteris plazmidė, PRL-TK plazmidė (Promega, JAV), ir pCMV5-ATF4 plazmidė naudojant Lipofectamine2000 (Invitrogen). Keturiasdešimt aštuonias valandas po to, kai transfekciją, ląstelės buvo tris kartus plaunamos šaltas fosfatas-buferio druskų tirpalu (PBS). Tada, ląstelės buvo lizuojamos 100 pL Pasyvus lizės buferiniame tirpale (Promega) ir mišinys purtomas 15 minučių. "Firefly liuciferazė ir Renilla liuciferazės veikla buvo matuojamas naudojant dvejopo liuciferazės reporterio testą sistema (PROMEGA) su Varioskan Flash mikroplokštelės skaitytojui (Thermo Scientific). "Santykinio aktyvumo" buvo apibrėžiamas kaip "Firefly liuciferazės veiklos santykis Renilla liuciferazės veiklą ir buvo apskaičiuojamas dalijant liuminescencijos intensyvumas gaunamas su už Firefly liuciferazės pagal ta Renilla liuciferazės tyrimu. Visi matavimai buvo pakartotas tris kartus, o tyrimai buvo pakartoti tris kartus 293 T ląstelių.

statistinę analizę

Kiekvienas eksperimentas buvo pakartotas bent tris kartus. Visi duomenys buvo pateikiami kaip vidutinės vertės ± Š.D. Skirtumas tarp priemonių buvo analizuojami su Stjudento t testą. Visi statistinės analizės buvo atliekamos naudojant SPSS16.0 programinę įrangą (Čikaga, IL). Reikšmė buvo nustatytas 5% lygio.

Parama Informacija
pav S1.
poveikis mutavusių ATF4 jungimosi vietų d ÷ l SIRT1 rengėjo veikla. 293T ląstelės buvo bendrai perkeltų su pCMV-ATF4 ir laukinio tipo SIRT1, SIRT1-MUT1, SIRT1-MUT2 arba MUT1 + MUT2 reporteris ir santykinis liuciferazė veikla buvo nustatytas. Liuciferazės veikla juoktis pCMV-Taq grupės buvo paskirta 1,00. Rezultatai yra vidurkis ± Š.D. trijų eksperimentų atliekama dviem egzemplioriais. * P < 0,05. Kairėje pusėje yra schematiškai pavaizduoti iš reporteris genų konstruoja. Brūkšniniai grafikai dešinėje pusėje atstovauti santykinius lygius liuciferazės veiklos kiekvienoje iš perkeltų mėginių
Doi:. 10.1371 /journal.pone.0031431.s001
(TIF)
Tekstas S1.
Papildoma medžiaga ir metodai.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0031431.s002
(DOC)

Padėka

Mes dėkojame profesoriui Amy S. Lee už maloniai teikia mums su pCMV5-ATF4 plazmidžių , Taip pat dėkojame p Taidong Qiao ir ponia Zheng Chen už puikų techninę pagalbą.

• PLoS ONE: genetinis polinkis į CagA-sistema sąveiką molekulių ir genų-aplinkos Sąveika su fitoestrogenų: dėl tariamų rizikos veiksnys skrandžio vėžio
• PLoS ONE: S100A6 Baltymai Neigiamai Reguliuoja CacyBP /SIP slopinamos skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją ir Tumorigenesis